Inkstų fibrogenezės programą kontroliuoja mikroRNR, reguliuojančios oksidacinį metabolizmą

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob, Diego Rodríguez-Puyolc, d

Santiago Lamesa,**

fiziologinių ir patologinių procesų programa, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madridas, Ispanija

b Genominis objektas, Madrido parkas, Madridas, Ispanija

c Patologijos skyrius, Hospital Universitario "Ramn y Cajal", IRYCIS, Madridas, Ispanija

d Medicinos ir medicinos specialybių skyrius, Universitetinės ligoninės "Principe de Asturias" tyrimų fondas, IRYCIS, Alkalos universitetas, Alcala' de Henares, Madridas, Ispanija

Raktiniai žodžiai: mikroRNR, inkstų fibrozė, riebalų rūgščių oksidacija, ekstraląstelinė matrica, CPT1A, mitochondrijos

Cistanche kultūrizmas yra labai geras inkstų funkcijai

A B S T R A C T

Per didelis ekstraląstelinės matricos (ECM) kaupimasis yra fibrozinių ligų požymis. Inkstuose tai yra paskutinis dažnas vyraujančių ligų, sukeliančių lėtinį inkstų nepakankamumą, kelias. Nors citokinai, tokie kaip TGF-, atlieka esminį vaidmenį miofibroblastų transformacijoje, neseniai atliktas darbas parodė, kad mitochondrijų disfunkcija ir riebalų rūgščių oksidacijos defektai (FAO), kurie pažeidžia pagrindinį inkstų kanalėlių epitelio ląstelių energijos šaltinį, yra pagrindiniai veiksniai. inkstų fibrozės vystymuisi ir progresavimui. Buvo pranešta, kad mikroRNR (miRNR), kurios reguliuoja genų ekspresiją po transkripcijos, kontroliuoja inkstų fibrogenezę. Norėdami nustatyti miRNR, dalyvaujančias inkstų fibrozės metaboliniame sutrikime, atlikome miRNR matricos ekraną vienpusio šlapimtakio obstrukcijos (UUO) modelyje. MiR-150-5p ir miR-495-3p buvo atrinkti dėl jų sąsajos su žmogaus patologija, vaidmens mitochondrijų metabolizme ir jų taikymą į riebalų rūgštis pernešantį fermentą CPT1A. Tiek UUO, tiek folio rūgšties sukeltos nefropatijos (FAN) modeliuose nustatėme atitinkamai 2- ir 4-kartinį miR-150-5p ir miR-495-5p reguliavimą. , o TGF- 1 padidino jų ekspresiją žmogaus inkstų kanalėlių epitelio ląstelių linijoje HKC-8. Šios miRNR sinergijose su TGF- dėl jo profibrozinio poveikio sustiprindamos su fibroze susijusius žymenis Acta2, Col{16}} ir Fn1. Bioenergetikos tyrimai parodė su FAO susijusio deguonies suvartojimo greičio (OCR) sumažėjimą HKC-8 ląstelėse esant abiem miRNR. Nuosekliai su mitochondrijomis susijusių tikslinių genų CPT1A, PGC1 ir mitochondrijų transkripcijos faktoriaus A (TFAM) ekspresijos lygiai inkstų epitelio ląstelėse, veikiamose šiomis miRNR, sumažėjo perpus. Priešingai, mes neaptikome mitochondrijų masės ir transmembraninio potencialo (ΔѰm) ar mitochondrijų superoksido radikalų anijonų gamybos pokyčių. Mūsų duomenys patvirtina, kad miR-150 ir miR- 495 gali prisidėti prie inkstų fibrogenezės, pablogindami metabolinį nepakankamumą, labai susijusį su kanalėlių epitelio ląstelėse, ir galiausiai sukelti fibrozę.

1. Įvadas

Lėtinė inkstų liga (LŠL) yra klinikinė būklė, kai inkstų funkcija išlieka susilpnėjusi. Paprastai jis laikomas negrįžtamu ir progresuojančiu. Tai yra svarbi visuomenės sveikatos problema, galinti paveikti 12–14 procentų visų gyventojų [1]. Jis gali būti apie 30–40 procentų pacientų, sergančių labai paplitusiomis patologijomis, tokiomis kaip cukrinis diabetas ir hipertenzija, kur jis prisideda prie evoliucijos ir prognozės diktavimo. Nepriklausomai nuo ligos etiologijos, CKD progresavimas sukelia kanalėlių intersticinę ir glomerulinę fibrozę [2]. Tubulo-intersticinė fibrozė apima erdvės tarp kanalėlių bazinės membranos ir peritubinių kapiliarų išsiplėtimą dėl matricos baltymų (ECM) (daugiausia I ir III tipo kolageno ir fibronektino) nusėdimo kartu su uždegiminėmis ląstelėmis, kanalėlių ląstelių praradimu ir miofibroblastų kaupimu. [3].

Transformuojantis augimo faktorius (TGF-) laikomas itin svarbiu visur esančiu profibrotiniu citokinu ir pagrindiniu miofibroblastų diferenciacijos reguliatoriumi sergant fibroze [4]. Naujausi tyrimai parodė, kad visuotinis riebalų rūgščių oksidacijos (FAO) defektas, dėl kurio pažeidžiamas pagrindinis kanalėlių epitelio ląstelių energijos šaltinis, vaidina svarbų vaidmenį vystant inkstų fibrozę [5,6]. TGF- slopina FAO priklausomai nuo SMAD3-ir PGC1A, todėl veikia transkripcijos riebalų rūgščių įsisavinimo ir oksidacijos reguliatorius, įskaitant CPT1A [5]. FAO pokyčiai galiausiai lemia tarpląstelinį lipidų kaupimąsi ir ATP išeikvojimą, dėl kurio atsiranda fibrozė [5, 7]. Taigi strategijos, kuriomis siekiama atkurti metabolinius sutrikimus, veikiančius sergant CKD, gali suteikti terapinių galimybių [8].

MikroRNR (miRNR) tapo svarbiais genų ekspresijos reguliatoriais, veikdamos potranskripcijos reguliavimą. Įrodyta, kad inkstuose miR vaidina svarbų vaidmenį nefrogenezėje, homeostazėje ir ligose [9]. MiRNR taip pat gali reguliuoti fibrozinius procesus ir buvo vadinamos „fibroze“ [10]. Be to, dėl to, kad trūksta veiksmingos terapijos, skirtos inkstų fibrogenezės prevencijai arba atstatymui [11], kaip perspektyvi LKL gydymo strategija buvo pasiūlytas manipuliavimas miRNR ekspresija in vivo tiekiant miRNR imitatorius arba inhibitorius [12]. Be to, cirkuliuojančios miRNR gali būti diagnostiniai ir net prognostiniai biomarkeriai [13].

MiRNR sukelta inkstų fibrozės kontrolė daugiausia vyksta reguliuojant TGF- 1 signalizaciją priklausomai nuo ląstelės ir konteksto, naudojant Smad kelią kaip vieną iš pagrindinių taikinių [14]. Ankstesniame darbe mes nustatėme keletą miRNR, kurios turi įtakos inkstų fibrozei, reguliuodamos specifinius metabolizmo kelius [15, 16]. Pernelyg didelė miR-9-5p ekspresija apsaugo nuo kanalėlių epitelio inkstų ląstelių dediferenciacijos ir perprogramuoja su fibroze susijusį metabolinį sutrikimą [16], o dėl genetinės ar farmakologinės miR{12}} funkcijos praradimo padidėja FAO ir lipidų kaupimosi kanalėlių epitelio ląstelėse prevencija. Tai siejama su padidėjusiu energijos tiekimu, pagerėjusia mitochondrijų bioenergetika ir eksperimentinės inkstų fibrozės prevencija [15]. Taigi miRNR, reguliuojančios ląstelių bioenergetiką, taip pat gali reguliuoti inkstų fibrogenezę. Šiame tyrime mes panaudojome miRNR matricą pagrįstą strategiją vienašalio šlapimtakio obstrukcijos (UUO) lėtinio inkstų pažeidimo modelyje, kad nustatytų miRNR, susijusias su inkstų fibroziniu fenotipu, modifikuojant metabolinius kelius. Pasirinkę kelis su mitochondrijų funkcijomis susijusius genus (CPT1A, TFAM, PGC1A), identifikavome ir miR-150, ir miR-495 kaip miRNR, galinčias sumažinti su FAO susijusį deguonies suvartojimo greitį (OCR) ir skatinti TGF{ {21}}sukelta fibrogeninė transformacija žmogaus inkstų kanalėlių epitelio ląstelių linijoje HKC-8. Mūsų išvados pabrėžia miRNR, kaip mitochondrijų metabolizmo reguliatorių, dalyvaujančių inkstų fibrogenezėje, svarbą.

2. Medžiaga ir metodai

Ląstelių linijos ir auginimo sąlygos. Žmogaus inkstų proksimalinės kanalėlių epitelio ląstelės (HKC{0}}) buvo kultivuojamos DMEM/F12 (Dulbecco modifikuota Eagle terpė 1:1 (v/v)) (Corning, Niujorkas, NY), papildyta 15 mM HEPES, 5 proc. (tūris/tūris) galvijų vaisiaus serumas (FBS)

(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x insulino-transferrin-selenas (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0,5 ug/ml hidrokortizono (Sigma, Sent Luisas, MO), 50 vnt. ml penicilino ir 50 ug/mL streptomicino (Gibco, Rockville, MD), esant 37 ◦ C temperatūrai ir 5 procentams CO2. Šią ląstelių liniją maloniai suteikė dr. Susztak laboratorija (Filadelfija, Pensilvanija, JAV). Gydymas žmogaus rekombinantiniu 10 ng/ml TGF- 1 (R&D Systems, Mineapolis, MN) buvo atliktas 12 val. badavus HKC-8 ląsteles be serumo.

Transfekcijos procedūra. Ląstelės buvo pasėtos į 60 mm auginimo lėkštes, kad būtų pasiekta 70 procentų santaka. Jie buvo transfekuoti 40 nM mirVana™ miRNR, imituojančios miR-150, miR-495 arba mirVana™ miRNR imituojančią neigiamą kontrolę (Ambion kompanija, JAV), naudojant lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). . Ląstelės buvo inkubuojamos su lipofektaminu-pre-miRNR 37 ◦ C 6 valandas. Vėliau į auginimo indus buvo įpilta 5 ml šviežios terpės, kurioje yra 10 procentų FBS, ir ląstelės buvo laikomos kultūroje 6 valandas, kol buvo panaudotos tolesniems eksperimentams. Derinant su TGF- 1, jis buvo naudojamas ląstelėms po miRNR per didelės ekspresijos, kaip nurodyta ankstesniame skyriuje.

Imunoblotas. Ląstelės buvo plaunamos PBS, homogenizuojamos ir lizuojamos 100 μL RIPA lizės buferyje, kuriame yra 150 mM NaCl, 0,1 proc. SDS, 1 proc. natrio deoksicholato, 1 proc. NP-40 ir 25 mM Tris- HCl pH 7,6, dalyvaujant proteazei (Complete, Roche Diagnostics, Manheimas, Vokietija) ir fosfatazės inhibitoriams (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO) ir nuimamas grandant. Ketvirtadalis kiekvieno inksto mėginio gabalėlio (gautas išskaidžius per pusę išilgai ir skersai) buvo homogenizuotas 300 ul RIPA buferyje su 5 mm nerūdijančio plieno rutuliukais (Qiagen, Valencia, CA), naudojant TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA), vibruojant 50 Hz 15 min 4 ◦ C temperatūroje. Mėginiai buvo nuskaidrinti centrifuguojant 10, 000 g 15 min 4 ◦ C temperatūroje. Tada nuosėdos buvo išmestos, o supernatantas buvo laikomas kaip baltymų lizatas. Baltymų koncentracija buvo nustatyta BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL) ir buvo matuojama Glomax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI). Vienodas baltymų kiekis (10–50 ug) iš viso ekstrakto buvo atskirtas 8–10 procentų SDS-poliakrilamido geliais ir perkeltas ant nitroceliuliozės blotingo membranų (GE Healthcare, Chicago, IL) esant 12 V įtampai 20 minučių pusiau sausame. Trans-Blot Turbo sistema (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija).

Membranos buvo užblokuotos inkubuojant 1 valandą su 5 procentų neriebiu pienu PBS, kuriame yra 0,5 procento Tween-20, ir per naktį blotuojamos specifiniais antikūnais: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{). {26}}; 4 ◦ C per naktį), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦ C per naktį), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15 000; 1 val., kambario temperatūra ). Po inkubacijos su IRDye 800 ožkų anti-triušių ir IRDye 600 ožkų anti-pelės (1:15 000, LI-COR Biosciences, Linkolnas, NE) antriniais antikūnais, membranos buvo vaizduojamos trimis egzemplioriais naudojant Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences). Linkolnas, NE). Juostos densitometrija buvo atlikta naudojant ImageJ 1.48 programinę įrangą (//rsb.info.nih.gov/ij), o santykinė baltymų ekspresija buvo nustatyta normalizuojant į GAPDH. Sulenkimo pokyčiai buvo normalizuoti pagal kontrolinės būklės vertes.

RNR ekstrahavimas. Bendra RNR buvo išskirta iš HKC{0}} ląstelių arba pelių inkstų naudojant miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) pagal gamintojo instrukcijas. RNR kiekis ir kokybė buvo nustatyti esant 260 nm nanodrop-1000 spektrofotometru (Thermo Scientific, Rockford, IL).

iRNR ekspresijos analizė. Atvirkštinė transkripcija (RT) buvo atlikta su 500 ng visos RNR, naudojant iScript™ cDNA sintezės rinkinį (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT-PGR buvo atlikta su iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA), naudojant 96-šulinėlių Bio-Rad CFX96 RT-PCR sistemą su C1000 terminiu cikleriu (Bio-Rad, Hercules, CA) pagal gamintojų instrukcijas. Ct vertė buvo gauta iš kiekvienos amplifikacijos kreivės, naudojant gamintojo pateiktą CFX96 analizės programinę įrangą. Santykinė mRNR ekspresija buvo nustatyta naudojant 2 − ΔΔCt metodą [17]. 18S genas buvo naudojamas normalizavimo tikslais. Pradmenų sekos, naudotos iRNR kiekybiniam nustatymui, buvo šios: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGTFGAA- TAGCCACGCTCAG, RV: GAAGTFGAA- TAGCCACGCTCAG), CGTGGGTCC1, CGTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTT:1A1 GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGCCATGWTTGGCAAGCCATGWTTCATCTCATTCATCCATC,WW: CCACTCCTAGCTACATCATCCATC, RV: CCACTCCTAGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG) Sulenkimo pokyčiai buvo normalizuoti pagal kontrolinės būklės vertes.

MiRNR ekspresijos kiekybinis nustatymas. MiRNR ekspresijos kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT rinkinį (Exiqon, Feedback, Danija). Po RT, cDNR šablonas buvo amplifikuotas naudojant mikroRNR specifinius LNA pradmenis, skirtus subrendusiems miR150-5p arba miR-495-3p (Exiqon, Feedback, Danija). qRT-PGR buvo atlikta 96-šulinėlio Bio-Rad CFX96 realaus laiko PGR sistemoje su C1000 terminiu cikleriu, naudojant iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) pagal gamintojo instrukcijas. . Trijų šulinių Ct vertė buvo gauta iš kiekvienos amplifikacijos kreivės, naudojant CFX Manager Bio-Rad programinę įrangą (Bio-Rad, Hercules, CA). Ct vertės buvo normalizuotos iki endogeninės kontrolinės 5S rRNR. Plazmos miRNR lygis buvo normalizuotas iki miR-103a-5p. Santykinė miRNR ekspresija buvo nustatyta naudojant 2 − ΔΔCt metodą [17]. Sulenkimo pokyčiai buvo normalizuoti pagal kontrolinės būklės vertes.

Inkstų fibrozės pelių modeliai. Pelės buvo laikomos specifinių patogenų neturinčioje (SPF) gyvūnų patalpoje CBMSO pagal ES reglamentus visoms procedūroms. Gyvūnai buvo tvarkomi pagal Europos Parlamento direktyvoje 2010/63/ES pateiktą laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą. Patvirtinimą suteikė Madrido Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" vietinė etikos peržiūros taryba, CSIC etikos komitetas ir Madrido bendruomenės gyvūnų eksperimentų procedūrų reguliavimo skyrius.

Vienašalė šlapimtakio obstrukcija (UOO): UUO operacijos procedūra buvo atlikta taip, kaip aprašyta anksčiau [18]. Trumpai tariant, pelės buvo anestezuotos izofluranu (3–5 procentai indukcijai ir 1–3 procentai priežiūrai) ir suskirstytos į dvi eksperimentines grupes: UUO grupę ir fiktyvių operacijų grupę. UUO grupėje pelėms buvo nuskustas kairėje pilvo pusėje, skalpeliu per odą padarytas vertikalus pjūvis ir oda atitraukta. Antrasis pjūvis buvo atliktas per pilvaplėvę, kad būtų atskleistas inkstas. Kairysis šlapimtakis buvo perrištas du kartus 15 mm žemiau inkstų dubens chirurginiu šilku, o šlapimtakis buvo nutrauktas tarp dviejų raiščių. Tada perrištas inkstas buvo švelniai grąžinamas į tinkamą anatominę padėtį ir buvo pridėtas sterilus fiziologinis tirpalas, kad būtų kompensuotas skysčių praradimas. Pjūviai buvo susiūti, o pelės buvo atskirtos narveliuose. Apsimetinė operacija buvo atlikta panašiai, bet be šlapimtakių perrišimo. Buprenorfinas buvo naudojamas kaip analgetikas. Pirmoji dozė buvo švirkščiama likus 3 0 min. iki operacijos, o vėliau kas 12 val. 72 val. po oda po 0,05 mg/kg. Šiame modelyje inkstų kraujotaka ir glomerulų filtracijos greitis žymiai sumažėja per 24 valandas, o intersticinis uždegimas (pikas 2–3 dienas), kanalėlių išsiplėtimas, kanalėlių atrofija ir fibrozė pasireiškia po 7 dienų. Užkimštas inkstas pasiekia didžiausią disfunkciją maždaug po 2 savaičių po procedūros. Pelės buvo numarintos perdozavus CO2, o kontroliniai, o užsikimšę inkstų ir kraujo mėginiai buvo paimti po perfuzijos su PBS 3, 5, 7, 10 ir 15 dienų po UUO.

Folio rūgšties sukelta nefropatija (FAN): Šiame modelyje inkstų fibrozė buvo sukelta intraperitonine (ip) injekcija su 250 mg folio rūgšties (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kilogramui kūno svorio, ištirpintos 0.3 M natrio bikarbonatas (nešiklis), kaip aprašyta anksčiau [19]. Kontroliniai gyvūnai gavo 0,3 ml nešiklio (ip). Pelės buvo nužudytos perdozavus CO2, o inkstų ir kraujo mėginiai buvo paimti po perfuzijos su PBS po 15 dienų FA vartojimo.

mikroRNR profiliavimas. Norint nustatyti specifines miRNR, reguliuojančias fibrotinį rezultatą, kaip mikroRNR profiliavimo platforma buvo pasirinkta Custom miRCURY LNA mikroRNR matrica (Exiqon, Feedback, Danija). Šią platformą iš viso sudarė 175 unikalūs tyrimai, būdingi pelių miRNR, esančioms Sanger miRBase v22.1 (//microrn a.sanger.ac. JK). Kiekvienai mikroRNR analizei buvo pasirinkta vyraujanti grandinė. MiR pasirinkimas buvo pagrįstas numatomais tiksliniais genais, susijusiais su inkstų fibroze, mitochondrijų metabolizmu, redokso procesais ir cirkadiniu ritmu. Ši analizė buvo atlikta naudojant bioinformatikos įrankius, skirtus seka pagrįsti miRNR taikinio numatymui, mikrokosmui [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) ir miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). Po RNR ekstrahavimo iš 7 dienų UUO inkstų mėginių, miRNR frakcija, esanti 20 ng visos RNR, buvo atvirkštinė transkripcija naudojant miRCURY LNA RT rinkinį (Exiqon, Feedback, Danija) pagal gamintojo instrukcijas. Gautos cDNR buvo analizuojamos naudojant miRCURY miRNA PCR paneles Roche LightCycler 480 Real-Time PGR sistemoje, naudojant miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Feedback, Danija). Kiekvienas mėginys buvo analizuojamas dviem egzemplioriais. Ši procedūra buvo atlikta Fundacion Parque Científico de Madrid (Madridas, Ispanija) Genomikos centre. LC480 programinė įranga buvo naudojama Cq vertėms (Cq) gauti kiekvienai miRNR. Delta Ct (ΔCt) vertė buvo apskaičiuota normalizuojant Ct vertes į endogeninį namų ruošos snRNAU6. Šilumos žemėlapis buvo sukurtas naudojant realaus laiko PGR duomenis, pateiktus kaip ΔCt. Hierarchinis klasterizavimas buvo sudarytas pagal ΔCt reikšmes. Delta Ct (ΔΔCt) vertė buvo apskaičiuota atėmus etaloninės mėginių grupės (kontrolinio inksto) ΔCt iš kiekvieno užsikimšusio inksto mėginio ΔCt. Kiekvienos miRNR santykinis kiekybinis įvertinimas (RQ) arba kartotinis pokytis buvo sukurtas naudojant 2 − ΔΔCt metodą [17]. Skirtingai išreikštos miRNR buvo identifikuotos parametriniu Limma testu. Kad būtų atsižvelgta į kelių hipotezių testavimą, P reikšmės buvo pakoreguotos (koreguojamos) naudojant Benjamini-Hochberg klaidingų atradimų dažnio (FDR) korekciją [25]. Rezultatai buvo pavaizduoti ugnikalnio sklype.

miRNR analizė CKD pacientų kraujo plazmoje. Pasirinktų miRNR lygiai buvo analizuojami plazmos mėginiuose iš 1 00 LIL sergančių pacientų grupės, kuri išsamiai aprašyta toliau. Periferinis veninis kraujas buvo paimtas į EDTA purškiamus vakuuminius indus (BD, Franklin Lakes, NJ). Norint gauti plazmą, kraujas buvo centrifuguojamas 400 g 20 min., supernatantas buvo perkeltas į naują mėgintuvėlį ir centrifuguojamas 800 g 20 min. Plazma buvo surinkta ir laikoma užšaldyta alikvotose –80 ◦ C temperatūroje. Plazma miRNR buvo išskirta iš kraujo naudojant miRCURYTM RNA Isolation Kit-Biofluids ir UniSp2 Spike-in RNR (Exiqon, Vedbaeck, Danija). MiR-150 lygių analizė šiuose mėginiuose buvo atlikta, kaip aprašyta miRNR ekspresijos procedūros kiekybinio įvertinimo skyriuje. Deguonies suvartojimo greičio matavimai. Su riebalų rūgščių oksidacija susijęs deguonies suvartojimo greitis (OCR) (susijęs su oksidaciniu fosforilinimu) ir ekstraląstelinio rūgštėjimo greitis (ECAR) (susijęs su laktato gamyba ir glikolize) buvo tiriamas naudojant Seahorse Bioscience medžiagų apykaitos analizatorių pagal gamintojo instrukcijas [26]. HKC-8 ląstelės buvo pasėtos į p60 plokštelę ir mikroRNR transfekcija buvo atlikta, kaip aprašyta aukščiau, kai po 48 valandų jos pasiekė 70 procentų santaką, HKC-8 ląstelės buvo apdorotos 10 ng/ml TGF{{ 18}} 48 val. Tada ląstelės buvo pasėtos po 2 × 104 ląstelių viename šulinyje Seahorse Bioscience XFe24 ląstelių kultūros mikroplokštelėje (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Po ląstelių prilipimo auginimo terpė buvo pakeista terpe, kurioje yra ribojamas substratas, Dulbecco modifikuota erelio terpe (DMEM), papildyta 0,5 mM gliukozės ir 1 mM glutamato. Likus valandai iki tyrimo matavimo, ląstelės buvo inkubuojamos su Krebs-Henseleit buferio (KHB) tyrimo terpe, papildyta 0,2 procento karnitino 37 ◦ C temperatūroje be CO2. Penkiolika minučių prieš tyrimą į atitinkamas šulinėles buvo įpiltas CPT1 inhibitorius Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 μM ir ląstelės buvo inkubuojamos 37 ◦ C temperatūroje be CO2. Galiausiai, prieš pat tyrimą, buvo pridėtas BSA arba 200 μM Palmitate-BSA FAO substratas (Agilent Technology, Santa Clara, CA, JAV). Nedelsiant XF Cell Mito streso testas buvo atliktas Seahorse XFe24 energijos analizatoriumi, nuosekliai pridedant kelis mitochondrijų funkcijos moduliatorius. Pirma, po bazinio matavimo buvo naudojamas ATP sintazės inhibitorius oligomicinas (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). Tai sumažina elektronų srautą per ETC, todėl sumažėja mitochondrijų kvėpavimas. Tada buvo pridėtas atjungiamasis agentas cianidas 4-(trifluormetoksi) fenilhidrazonas (FCCP) (SigmaAldrich, Sent Luisas, MO) (3 μM), kuris suardo protonų gradientą ir sutrikdo mitochondrijų membranos potencialą. Dėl to elektronų srautas per ETC yra neslopinamas, o deguonies suvartojimas komplekse IV pasiekia maksimalų. Trečioji ir paskutinė injekcija yra III ir I komplekso inhibitorių antimicino/rotenono (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) mišinys (1 μM). Šis derinys išjungia mitochondrijų kvėpavimą ir leidžia apskaičiuoti ne mitochondrijų kvėpavimą, kurį lemia procesai už mitochondrijų ribų. Substratai / inhibitoriai buvo paruošti toje pačioje terpėje, kurioje buvo atliktas eksperimentas, ir automatiškai įšvirkščiami iš reagento prievadų nurodytu laiku. Matavimai buvo registruojami 3-min laikotarpiais (iš viso 2 val.), o vertės buvo normalizuotos pagal bendrą baltymų kiekį. Baltymai buvo ekstrahuoti iš šulinių 0,1 procento NP-40-PBS tirpalu ir kiekybiškai įvertinti naudojant BCA baltymų tyrimą (Thermo Scientific, Rockford, IL). Kiekvienai eksperimentinei grupei buvo naudojami keturi šuliniai. Jūrų arkliuko XFp ląstelių mito streso testas buvo naudojamas pagrindiniams mitochondrijų funkcijos parametrams nustatyti: bazinis mitochondrijų kvėpavimas, su ATP susietas kvėpavimas, protonų nutekėjimas (su ATP nesusietas deguonies suvartojimas), maksimalus kvėpavimas, nemitochondrinis kvėpavimas. , ir rezervinis kvėpavimo pajėgumas, kaip aprašyta anksčiau [27].

Liuciferazės tyrimas. Norint apibūdinti miRNR-150 ir miRNR-495 kandidatų surišimo vietas žmogaus CPT1A 3′-UTR, naudojamas luciferazės reporterio tyrimas, kuriame yra CPT1A 3′-UTR (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, produktas ID S814347) buvo naudojamas. Į vietą nukreiptos mutacijos numatytų miR-150 ir miR-495 vietų pradiniuose regionuose 3′ – UTR buvo sukurtos naudojant Multisite-QuikChange nukreiptos mutagenezės rinkinį (Stratagene, La Jolla, CA) pagal pagal gamintojo protokolą. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), Visos konstrukcijos buvo suskirstytos prieš naudojimą, siekiant patvirtinti, kad jų struktūra yra tinkama. HKC-8 ląstelės buvo pasėtos į ap24-šulinėlių plokštelę ir buvo laikinai bendrai transfekuotos 200 ng pLightSwitch_CPT1A_3′-UTR (nepažeistos arba mutavusios konstrukcijos) ir 4 ng pGL3-Promoteris (žievės luciferazė, kontroliuojama SV40 promotoriaus) (Promega Corporation, Madison, WI, JAV) reporterių plazmidžių ir 40 nM bet kurios mirVana™ miRNR miR-150, miR imitacijos -495 arba mirVana™ miRNR imituoja neigiamą kontrolę (Ambion kompanija, JAV), naudojant lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), kai jie pasiekė 70 procentų santaką, kaip aprašyta aukščiau. Kiekvienai eksperimentinei grupei buvo naudojami keturi šuliniai. Liuciferazės tyrimai buvo atlikti po 24 valandų, naudojant Dual-Luciferase reporterių sistemą (Promega, Madison, WI). Vanilės ir ugniagesių luciferazės signalai buvo aptikti naudojant Glomax daugiafunkcinę aptikimo sistemą (Promega Corporation, Madison, WI, JAV). Renilinės luciferazės aktyvumą normalizavo ugniagesių luciferazės aktyvumas.

Mitochondrijų membranos potencialas (MMP). MMP pokyčiai buvo nustatyti kaip tetrametilrodamino metilo esterio (TMRM) fluorescencijos skirtumai (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV). Jis kaupiasi neigiamo krūvio poliarizuotose mitochondrijose ir fluorescuoja oranžine spalva. Kai mitochondrijų membranos potencialas žlunga apoptotinėse arba metabolinio streso paveiktose ląstelėse, TMRM reagentas pasklinda po visą ląstelės citozolį ir fluorescencijos lygis smarkiai sumažėja. HKC-8 ląstelės buvo kultivuojamos ir transfekuotos, kaip aprašyta ląstelių kultūros ir transfekcijos procedūrų skyriuose. Tada auginimo terpė buvo pakeista fenolio neturinčiu Hanko subalansuotu druskos tirpalu (HBSS) su 10 mM Hepes. Gydymas oligomicinu (5 μM) ir FCCP (4 μM) 5 minutes buvo naudojamas kaip teigiamos ir neigiamos kontrolės sąlygos. Tada ląstelės buvo dažomos 250 nM TMRM 30 minučių 37 ◦ C temperatūroje. Ląstelės buvo surenkamos naudojant tripsiną, centrifuguojamos (3000 aps./min., 5 min.) ir nuosėdos pakartotinai suspenduotos 200 µl HBSS su 1 proc. Galvijų serumo albuminas (BSA) ir 5 mM etilendiaminotetraacto rūgštis (EDTA). Fluorescencijos intensyvumas buvo matuojamas srauto citometrija, naudojant TMRM (FL2) [28] emisijos bangos ilgį 570 nm BD FacsCantoTM II sistemoje (BD Bioscience, San Jos, CA) ir analizuojamas naudojant FlowJo 10.2 programinę įrangą (FlowJo, LLC, Ashland). , ARBA). Kiekvienai eksperimentinei būklei buvo ištirta mažiausiai 20 000 vienetų trimis egzemplioriais.

Mitochondrijų superoksido radikalų anijonų gamyba. Superoksido radikalų anijonų gamybos įvertinimas atliktas naudojant Mito-SOX™ Red mitochondrijų superoksido radikalų anijonų indikatorių (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV), labai selektyvų fluorogeninį dažą mitochondrijų superoksido radikalų anijonui gyvose ląstelėse, remiantis gamintojo pateikta informacija. nurodymus. HKC-8 ląstelės buvo kultivuojamos ir transfekuotos, kaip aprašyta ląstelių kultūros ir transfekcijos procedūrų skyriuose. Tada auginimo terpė buvo pakeista fenolio neturinčiu Hanko subalansuotu druskos tirpalu (HBSS) su 10 mM Hepes. Gydymas antimicinu A (150 μM) ir karbonilo cianido m-chlorfenilhidrazonu (CCCP) (50 μM) 5 minutes buvo naudojamas kaip teigiamos ir neigiamos kontrolės sąlygos. Tada ląstelės buvo nudažytos 5 μM MitoSOX™ Red 30 min. 37 ◦ C temperatūroje. Ląstelės buvo surenkamos taip, kaip aprašyta skyriuje apie mitochondrijų membranos potencialą. Fluorescencijos intensyvumas buvo matuojamas srauto citometrija, naudojant 580 nm spinduliuotės bangos ilgį MitoSOX™ Red (FL2) BD FacsCantoTM II sistemoje (BD Bioscience, San Jos, CA) ir analizuojamas naudojant FlowJo 10.2 programinę įrangą (FlowJo, LLC, Ashland). ARBA). Kiekvienai eksperimentinei sąlygai buvo ištirta mažiausiai 20,{18}} vienetų trimis egzemplioriais.

Mitochondrijų žymėjimas. Mitochondrijų kiekis buvo įvertintas naudojant MitoTracker™ green FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), kuris pagal gamintojo nurodymus pasyviai difunduoja per plazmos membraną ir kaupiasi aktyviose mitochondrijose, nepaisant mitochondrijų membranos potencialo. HKC-8 ląstelės buvo kultivuojamos ir transfekuotos, kaip aprašyta ląstelių kultūros ir transfekcijos procedūrų skyriuose. Tada auginimo terpė buvo pakeista fenolio neturinčiu Hanko subalansuotu druskos tirpalu (HBSS) su 10 mM Hepes. Ląstelės buvo nudažytos 150 nM naudojant MitoTracker™ žalią FM 30 min. 37 ◦ C temperatūroje. Srauto citometrijos analizei ląstelės buvo paimtos taip, kaip aprašyta mitochondrijų membranos potencialo skyriuje. Fluorescencijos intensyvumas buvo matuojamas naudojant 516 nm spinduliuotės bangos ilgį su MitoTracker™ žaliu FM (FL1) BD FacsCantoTM II sistemoje (BD Bioscience, San Jos, CA) ir analizuojamas naudojant FlowJo 10.2 programinę įrangą (FlowJo, LLC). , Ashland, OR). Kiekvienai eksperimentinei sąlygai buvo ištirta mažiausiai 20,{14}} vienetų trimis egzemplioriais. Fluorescenciniam vaizdavimui branduoliai taip pat buvo dažomi DAPI (Sigma, St. Louis, MO) 5 minutes kambario temperatūroje. Gyvos ląstelės buvo vizualizuotos apverstu Zeiss LSM 710 konfokaliniu mikroskopu su stebima ląstele, 63X/1.2 Water C-Apochromat Corr UV-VIS-IR M27 objektyvu ir analizuojamos naudojant Zeiss Zen2010B sp1 programinę įrangą (Zeiss, Oberkochen, Vokietija). .

Mitochondrijų kopijų skaičiaus nustatymas. Genominė DNR buvo išskirta iš HKC{0}} ląstelių naudojant DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) pagal gamintojo instrukcijas. Mitochondrijų gausa buvo nustatyta žmogaus mitochondrijų DNR kopijų skaičiaus tyrimo rinkiniu (Detroit R&D, Detroit, MI). Santykinis mtDNR kopijų skaičius buvo pateiktas kaip mtDNR ir branduolinės DNR santykis.

Žmogaus CKD paciento mėginiai. MiRNR koncentracijos plazmoje analizei buvo atrinkta 100 LIL pacientų (3–4 stadijos) grupė iš Asturias Principe de Asturias ligoninės. Ji apėmė du skirtingus pogrupius, suskirstytus pagal jų inkstų funkcijos raidą pagal GFR MDRD rodiklį [29] per 24 mėnesius: 50 pacientų pasireiškė mažiau nei 10 proc.inkstasfunkcijos pablogėjimas, o likusiems jų inkstų funkcija susilpnėjo bent 40 proc. arba buvo pradėtainkstųpakaitinė terapija (dializė). Mes taip pat kiekybiškai įvertinome fibrozės laipsnįinkstasbiopsijos iš skirtingos 26 pacientų, kuriems po to buvo sutrikusi transplantato funkcija, kohortosinkstastransplantacija iš Ramn y Cajal ligoninės. Visos biopsijos buvo įvertintos pagal Banff 2007 kriterijus [30].

Statistinė analizė. Duomenys buvo analizuojami naudojant neparametrinius testus, išskyrus atvejus, kai nurodyta. Skirtumas tarp dviejų nepriklausomų grupių buvo tiriamas naudojant Mann-Whitney testą, o daugiau nei dvi grupės buvo palygintos su Kruskall-Wallis testu. P reikšmė 0.05 ar mažesnė buvo laikoma statistiškai reikšminga (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0,001).="" duomenys="" buvo="" analizuojami="" naudojant="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca).="" duomenys="" pateikiami="" kaip="" vidurkis="" ±="" standartinė="" vidurkio="" paklaida="">

3. Rezultatai

miRNR ekspresijos duomenys UUO sukeltoje fibrozėjeinkstus. Iššifruoti miRNR indėlį į medžiagų apykaitos reguliavimąinkstųfibrogenezė, 7 dienų UUO modelis buvo atliktas WT pelėms. RNR buvo išskirta iš kontrolinės ir fibrozinėsinkstasmėginiai ir miRNR ekspresijos profilis buvo analizuojami pritaikytoje mikroRNR matricoje. MiRNR parinkimas buvo pagrįstas galimu jų nukreipimu į pagrindinius fermentus, dalyvaujančius mitochondrijų metabolizme, redokso procesuose ir cirkadiniame ritme po „in silico“ analizės (daugiau informacijos skyriuje Metodai). Šilumos žemėlapis atskleidė aiškiai skirtingus kai kurių miRNR ekspresijos modelius, lyginant fibrotinę ir kontrolęinkstasmėginių (1A pav.). Vulkano sklypo analizė parodė, kad 73 iš 175 miRNR buvo skirtingai išreikštos, 17 aukštyn ir 56 žemyn reguliuojamos, fibroziniuose inkstų mėginiuose, palyginti su kontroliniais (1B pav., 1 papildoma lentelė). Tarp jų buvo pasirinktos specifinės miRNR, galinčios reguliuoti fibrozinį rezultatą inkstuose per metabolinius kelius. Tuo tikslu buvo atlikta specifinių genų, dalyvaujančių medžiagų apykaitos ir mitochondrijų funkcijose, CPT1A, TFAM, PGC1A 3′UTR (neišversto regiono) in silico analizė naudojant tris nepriklausomus numatymo įrankius (Targetscan, miRWalk ir miRanda). Atrankos kriterijai taip pat apėmė inkstų ekspresijos lygį, taikinių naujumą, žinių apie metabolizmo būdą laipsnį ir biologinę reikšmę. Ryšys su žmogaus patologija, inkstų audinio ekspresijos lygiu, jų vaidmeniu mitochondrijų metabolizme ir galimu riebalų rūgštis pernešančio fermento CPT1A taikymu paskatino mus sutelkti dėmesį į tris miRNR, miR-150-5p, miR-495-3p ir miR-33-5p, kaip kandidatai, galintys reguliuoti metabolinius pokyčius, susijusius su inkstų fibrogeneze (1C pav.). Pažymėtina, kad CPT1A 3′-UTR turi vieną miR-150 ir dvi miR-495 pradėjimo vietas. Pastebėjome, kad miR-150 ir miR-495 sumažino liuciferazės reporterio tyrimo, kuriame yra CPT1A 3′-UTR, aktyvumą atitinkamai ~15 ir 25 proc. Šis sumažinimas buvo visiškai panaikintas taškinių mutacijų (PM) atveju CPT1A 3′-UTR miR-150 surišimo vietoje (PM2) ir iš dalies nebuvo abiejose miR-495 surišimo vietose (PM1). ir PM3) (papildomi 1A ir B pav.). Šie duomenys rodo tiesioginę CPT1A sąveiką su miR-150 ir miR-495. MiR-33-5p buvo atskiro tyrimo objektas [15]. Fibrozinių inkstų mėginių MiR-150-5p ir miR-495-3p reguliavimas, palyginti su kontroliniais, buvo didesnis, pokytis kartojamas 3,69 (P reikšmė: 0.012 ) ir 1,95 (P reikšmė: 0,012).

MiR{0}} ir miR-495 sustiprina TGF-profibrozinį atsaką žmoguiinkstųkanalėlių epitelio ląstelės. Buvo atlikta kiekybinė atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija (qRT-PCR), siekiant patvirtinti miR-150-5p ir miR-495-3p ekspresijos pokyčius, kurie buvo nustatyti miRNR ekspresijos profiliavimu UUO.inkstasmėginių (2A ir B pav.). Be to, miR-150-5p ir miR- 495-3p ekspresijos kinetika inkstuose praėjus 3, 5, 7, 10 ir 15 dienų po UUO procedūros, buvo analizuojama naudojant qRT-PGR. Šių miRNR ekspresija žymiai padidėjo 2- kartus po 5 dienų po UUO ir išliko padidėjusi 15 dienų po UUO (2C ir D pav.). Šių miRNR ekspresijos lygis taip pat buvo įvertintas folio rūgšties nefropatijos (FAN) modelyje. Mes nustatėme atitinkamai 4- ir 2-kartinį miR-495-3p ir miR-150-5p reguliavimą sergant fibrozeinkstaspavyzdžiai iš FAN modelio (2E pav.). TGF- 1, vienas iš pagrindinių fibrogenezės reguliatorių, taip pat sukėlė miR-150 ir miR-495 ekspresiją HKC-8 ląstelėse daugiau nei 2- karto ir {{ 6}} kartus, atitinkamai, po 48 valandų, patvirtinant galimą šių miRNR vaidmenį su TGF signalizavimu susijusiuose įvykiuose (3A ir B pav.). Norint įvertinti, ar miR-150 ir miR-495 dalyvavo profibrotinėje kanalėlių epitelio ląstelių transformacijoje TGF- 1, žmogaus ląstelių linija HKC-8 buvo transfekuota miR. -150-5p arba miR-495-3p ir gydyti TGF- 1 skirtingą laiką. Padidėjus miR-150-5p ir miR-495-3p lygiams, žymiai pagerėjo TGF- 1-sukeltas su fibroze susijusių žymenų Acta2, Col1 1 ir Fn1 mRNR ekspresija ( 3C ir D pav.). Panašiai, pernelyg didelė miR-150-5p arba miR-495-3p ekspresija stipriai sumažino CPT1A ir padidino -SMA baltymų gausą (3E ir F pav.). Šie duomenys rodo, kad šios miRNR gali dalyvauti patogenezėjeinkstųfibrozę, skatindama nuo TGF{0}}priklausomą kanalėlių ląstelių epitelio dediferenciaciją, taip pat pažeidžiant svarbiausio fermento, dalyvaujančio FAO, ekspresiją.

MiR-150 ir miR-495 sukelia mitochondrijų bioenergetikos pokyčius ir sumažina genų, dalyvaujančių svarbioje mitochondrijų funkcijoje, ekspresiją. Norėdami suprasti medžiagų apykaitos pasekmes, kurias sukelia miR-150-5p arba miR-495-3p vartojimas, ištyrėme žmogaus bioenergetinį profilį.inkstųkanalėlių epitelio ląstelės.

1 pav. miRNR ekspresijos duomenys UUO sukeltos fibrozės atveju. (A) Šilumos žemėlapis, rodantis santykinę priešingos ir užblokuotos miRNR ekspresijąinkstusC57/BL6-J pelių, kurioms UUO procedūra buvo atlikta 7 dienas (n=6). Skalės juosta svyruoja nuo žalios iki raudonos (nuo didelės iki mažos išraiškos), o skaičiai rodo ΔCt reikšmes. Kairėje pusėje nurodytos tyrimui pasirinktos miRNR. (B) UUO moduliuotų miRNR vulkano sklypo analizė. Log10 santykinis kiekybinis įvertinimas (RQ) ir neigiamas (- ) log10 pakoreguotas (adj.) P reikšmės atitinkamai pavaizduotos x ir y ašyse. Kiekviena miRNR pavaizduota tašku. 73 iš 175 miRNR parodė pakitusią ekspresiją fibroziniuose mėginiuose (adj. P vertė Didesnė arba lygi 0,05). Pasirinktos miRNR tolesnei analizei yra paryškintos. (C) miR-150-5p ir miR-495-3p buvo atrinkti pagal jų galią in silico nukreipti į genus CPT1A, TFAM ir PGC1A. Kiekvienai pasirinktai mikroRNR nurodomos konservuotos sėklos tikslinės vietos šių genų 3'UTR, jų lenkimo pokytis ir reikšmė (adj. P reikšmė).

2 pav. miR-150-5p ir miR-495-5p išraiškos lygiai ininkstusiš UUO ir FAN modelių. (A, B) miR-150-5p (A) ir miR-495- 3p (B) ekspresijos qRT-PCR analizėinkstusiš pelių, praėjus 7 dienoms po UUO, mėginiuose, anksčiau analizuotuose su mikroRNR matrica. (C–E) miR-150-5p ir miR-495-3p išraiškos qRT-PCR analizė po FAN modelio (C) ir 3, 5, 7, 10 ir 15 dienų po UUO miR-150-5p (D) ir miR{{10}}p (E). Stulpelinės diagramos rodo 6 (A, B, E) ir 3 (C ir D) pelių raiškos lygių ± sem vidurkį. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" palyginti="" su="" atitinkamomis="" kontrolinėmis="" sąlygomis;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" lyginant="" su="">inkstusiš pelių su tokiu pačiu eksperimentiniu būdu.

TGF{0}} buvo naudojamas kaip pavyzdinis citokinas, susijęs su profibrotiniais pokyčiais. Norint nustatyti šių ląstelių bioenergetinę būklę, su FAO susijęs deguonies suvartojimo greitis (OCR) ir HKC-8 ląstelių ekstraląstelinio rūgštėjimo greitis (ECAR) buvo išmatuotas nuoseklaus apdorojimo junginiais, kurie moduliuoja mitochondrijų aktyvumą esant palmitatui. , naudojant Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer (daugiau informacijos skyriuje Metodai). Po 48 valandų su TGF- 1, HKC-8 ląstelėse, esant miR-150-5p, nuosekliai sumažėjo bazinis, OCR, susietas su ATP generavimu, su ATP susietas kvėpavimas ir maksimalus kvėpavimas. yra susijęs su FCCP jautriu OCR (4A pav.). OXPHOS sutrikimą atspindėjo ATP kiekio sumažėjimas HKC-8 ląstelėse, kurios per daug išreiškia miR-150-5p (4C pav.). Mes nepastebėjome, kad šios miRNR sukėlė ECAR pokyčius (duomenys nerodomi). Atsižvelgiant į tai, jų mitochondrijų mRNR ekspresijos lygiai

giminingi tiksliniai genai CPT1A, PGC1 ir mitochondrijų transkripcijos faktorius A (TFAM) sumažėjo perpus ląstelėse, apdorotose miR-150 imitacija, palyginti su miRNR imituojančiomis NC apdorotomis ląstelėmis (4E pav.). Tyrimai taikant tą patį eksperimentinį metodą su miR-495-3p davė panašių rezultatų (4B, D, F pav.). Tačiau mitochondrijų masė, nustatyta pagal mtDNR kopijų skaičių ir mitochondrijų dažymą MitoTrackerTM green FM, nebuvo reikšmingai modifikuota miRNR-150 ir miRNR- 495 tiek bazinėmis sąlygomis, tiek gydant TGF. Iš esmės buvo pastebėta šio parametro mažėjimo tendencija (papildomi 2A, B, C pav.). Apskritai šie duomenys patvirtina, kad miR{11}} ir miR-495 skatina a

pro-fibrotinis poveikis kanalėlių epitelio ląstelėse dėl mitochondrijų funkcijos sutrikimo.

MiR-150 ir miR-495 nekeičia mitochondrijų transmembraninio potencialo (ΔѰm) ir mitochondrijų superoksido radikalo

3 pav. MiR-150 ir miR-495 sustiprina TGF- 1- priklausomą profibrozinį žmogaus atsakąinkstųkanalėlių epitelio ląstelės. (A, B) RT-PCR analizė miR{{0}}p (A) ir miR-495-3p (B) raiškos HKC-8 ląstelėse, apdorotose 1{{24 }} ng/ml TGF- 1 nurodytu laiku. (C, D) mRNR lygiai alfa lygiųjų raumenų aktino (-SMA), alfa 1 tipo -1 kolageno (Col1 1), fibronektino (FN) iš ląstelių, transfekuotų miR-NC ir imituojančiu miR -150-5p (C) arba miR-495-3p (D) buvo nustatyti qRT-PGR, naudojant Sybr green. Ląstelės buvo apdorotos TGF- 1 (10 ng/ml) po miRNR per didelės ekspresijos, kur nurodyta (taip pat žr. skyrių Metodai). (E, F) Imunoblotai, vaizduojantys CPT1A ir -SMA lygio baltymų lygį ląstelėse, transfekuotose miR-NC, ir imituoja miR-150-5p (E) arba miR{{20}}p (F) nurodytus laiko taškus. GAPDH buvo naudojamas normalizavimo tikslais. Juostinės diagramos (dešinės plokštės) rodo lenkimo pokyčio išraiškos vidurkį ± sem iš 3 nepriklausomų eksperimentų. *P < {{30}},05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" palyginti="" su="" atitinkamomis="" kontrolinėmis="" sąlygomis;="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01, ###p=""><0,001, palyginti="" su="" ląstelėmis,="" apdorotomis="" mir-nc,="" esant="" tokioms="" pat="" eksperimentinėms="">

4 pav. MiR-150 ir miR-495 sustiprina TGF 1-sukeltas FAO represijas HKC-8 ląstelėse. (A, B) HKC-8 ląstelių, transfekuotų

40 nM miR-NC ir imituojantis miR-150-5p (A) arba miR-495-3p (B) ir veikiamas 10 ng/ml TGF{{5} } po miRNR per didelės ekspresijos (taip pat žr. skyrių Metodai). Juostinės diagramos (dešiniosiose plokštėse) rodo OCR, susijusio su baziniu, protonų nutekėjimu, su ATP, maksimaliu ir rezerviniu pajėgumu, ir ne mitochondrijų kvėpavimo būsenomis. Duomenys pateikiami normalizavus baltymų kiekiu. (C, E) ATP lygiai HKC-8 ląstelėse, transfekuotose miR-NC ir imituojančiose miR-150-5p (C) arba miR-495-3p (E). (D, F) CPT1A, PGC1A ir TFAM mRNR lygiai HKC-8 ląstelėse, transfekuotose miR-NC ir miR-150-5p (D) arba miR-495-3p (F), buvo nustatytas qRT-PGR, naudojant Sybr green. Juostinės diagramos rodo 4 nepriklausomų eksperimentų vidurkį ± sem. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001,="" palyginti="" su="" atitinkamomis="" kontrolinėmis="" sąlygomis;="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01, ###p=""><0,001, palyginti="" su="" ląstelėmis,="" apdorotomis="" mir-nc,="" esant="" tokioms="" pat="" eksperimentinėms="">

anijonų gamyba. Mitochondrijų membranos potencialas (ΔΨm), kurį sukuria protonų siurbliai (I, III ir IV kompleksai), yra esminis energijos kaupimo proceso komponentas oksidacinio fosforilinimo metu. Padidėjęs ΔѰm gali sukelti mitochondrijų redokso sutrikimus, o jo sumažėjimas sumažina ATP gamybą, pakenkdamas ląstelių gyvybingumui [254]. Superoksido radikalo anijonas (O2•−) yra laisvasis radikalas, kuris gali susidaryti mitochondrijose dėl elektronų nutekėjimo, kuris gali įvykti per kelis ETC etapus. O2•− susidarymas mitochondrijų matricoje taip pat labai priklauso nuo NADH/NAD plus ir CoQH2/CoQ santykio bei vietinės O2 koncentracijos [255]. Jo perprodukcija gali sukelti mitochondrijų redokso homeostazės praradimą dėl skirtingų mechanizmų, o tai yra būklė, susijusi su daugeliu patologinių būsenų, įskaitant AKI ir CKD [201]. ΔѰm buvo tiriamas naudojant TMRM dažus, o superoksido radikalų anijonų gamyba su MitoSOX dažais. Pirma, mes patvirtinome šiuos tyrimus apdorojant ląsteles FCCP ir CCCP kaip neigiamą kontrolinę medžiagą atitinkamai TMRM ir MitoSOX, o oligomiciną ir antimiciną A kaip teigiamus kontrolinius TMRM ir MitoSOX, atitinkamai, žmogaus ląstelių linijoje HKC{{7} }. TMRM tyrimo atveju gydymas oligomicinu sukėlė 3- kartų didesnį TMRM fluorescencijos vidurkį, palyginti su kontroliniu dažikliu, o gydymas FCCP sumažino 9- kartus. MitoSOX tyrime antimicinas A ir CCCP padidino atitinkamai 35-kartą ir sumažino 2-kartą (papildomi 3A ir B pav.). Norint nustatyti, ar miR-150 ir miR-495 poveikis mitochondrijų metabolizmui sukėlė šių parametrų pokyčius, HKC-8 ląstelės buvo transfekuotos miR-150-5p arba miR{{17} }p mimic arba atitinkamas miR-NC. Nerasta statistiškai reikšmingų skirtumų nustatant TMRM arba MitoSOX zondų fluorescenciją tarp gydymo sąlygų su pasirinktais miR ir miR-NC (papildomas 3C pav.).

LIL sergančių pacientų plazmos ir inkstų mėginiuose MiR-150 ir miR-495 lygiai įtakos neturi. Mes įvertinome pasirinktų miRNR ekspresiją pacientų, sergančių CKD, plazmos ir inkstų biopsijose. 26 pacientų inkstų biopsijų analizė (Ramn y Cajal ligoninė) neparodė koreliacijos tarp fibrozės laipsnio ir atitinkamai miR-150-5p ir miR-495-3p lygių (papildomi 4A ir B pav.) . Cirkuliuojantis miR-150-5p, miRNR, turinčios didžiausią inkstų ekspresiją, lygis plazmoje taip pat buvo nustatytas 100 pacientų, sergančių lėtine inkstų liga (Hospital Príncipe de Asturias). Dėl ribotų mėginių prieinamumo šioje grupėje negalėjome nustatyti miR- 495-3p serumo verčių. Šie pacientai anksčiau buvo suskirstyti į du pogrupius, atsižvelgiant į jų inkstų funkcijos raidą per 24 mėnesius, todėl 50 pacientų inkstų funkcija pablogėjo mažiau nei 10 proc., o likusių pacientų inkstų funkcija sumažėjo bent 40 proc. funkcija. qRT-PGR kiekybinis miR-150-5p koncentracijos plazmoje nustatymas neparodė aiškios tendencijos į skirtingą išraišką dviejuose pacientų pogrupiuose (papildomas 4C pav.).

4. Diskusija

MiRNR, kaip pagrindinių patofiziologinių procesų reguliatorių, atradimas paskatino jų, kaip terapinių medžiagų, naudojimo beveik visose klinikinėse situacijose, įskaitant inkstų ligas, tyrimus [31]. Inkstų fibrozė yra labai paplitusi lėtinės inkstų ligos (CKD) pasekmė, kurios etiologija nepriklauso, ir jos buvimas yra aiškus evoliucijos pranašas. Taigi, buvo skirta daug pastangų, siekiant nustatyti miRNR, susijusias su inkstų fibroze [32, 33]. Šiame tyrime daugiausia dėmesio skyrėme vis svarbesniam medžiagų apykaitos sutrikimo vaidmeniuiinkstųžaląir mes nustatėme dvi miRNR, miR-150 ir miR-495, kurios anksčiau buvo nežinomos scenos veikėjos. Be to, mes nustatėme, kad jie daro didelį poveikį ląstelių bioenergetikai, sinerguodami su TGF ir modifikuodami pagrindinius metabolizmo būdus, susijusius su riebalais.rūgšties oksidacija.

Epitelio pažeidimas egzistuoja kartu su riebalų trūkumurūgštiesoksidacija, pagrindinis kanalėlių epitelio ląstelių energijos šaltinis [5]. Tai lemia jų dediferenciaciją, sukeliančią kanalėlių funkcijos sutrikimą, sustabdant ląstelių ciklą ir skatinant svarbių profibrozinių citokinų, kurie gali prisidėti prie intersticinių miofibroblastų aktyvavimo, išsiskyrimą [5, 34]. MiR-150 ir miR-495 išraiška buvo padidinta pelėjefibrozinisinkstusir įžmogus inkstasepitelio ląsteles (HKC{0}}) po gydymo TGF-, o tai rodo, kad jos dalyvauja profibroziniame atsake. Įdomu tai, kad miR-150 ir miR-495 koduojančių genominių regionų in silico analizė leidžia nustatyti transkripcijos faktorių, susijusių su TGF-signalavimu ir kitais būdais, susijusiais su UUO pažeidimu, surišimo vietas (paieškos genecards.org, skirta miR-150 ir miR-495). Tiek miR-150, tiek miR-495 sumažino tikslinių genų CPT1A, PGC1 ir TFAM ekspresijos lygį, o tai atsispindėjo sumažėjusiu baziniu, su ATP susietu ir maksimaliu OCR ir ATP kiekiu po gydymo miR-150 ir miR-495. Šį poveikį lydėjo sustiprėjęs TGF-profibrozinis atsakas HKC-8 ląstelėse. Mes nustatėme, kad TGF sumažino mitochondrijų masę ir mitochondrijų DNR. Po gydymo miRNR-150 ir miRNR-495 pastebėta mitochondrijų kiekio mažėjimo tendencija bazinėmis sąlygomis, nors ir nepasiekė reikšmingumo. Tai rodo mechanizmą, nepriklausomą nuo PGC1 ar TFAM vaidmens ir greičiausiai susijusį su metaboliniu poveikiu, susijusiu su CPT1A reguliavimo sumažėjimu, kaip pagrindiniu kintamuoju, kuriam įtakos turi miRNR buvimas. Mitochondrijų bioenergetikos pokyčiai yra labai svarbūs inkstų ligai [35]. Neseniai parodėme, kad CPT1A yra labai svarbus fermentas, padedantis išsaugoti sveiką kanalėlių skyrių, nes jo per didelė ekspresija apsaugo nuo inkstų fibrozės [6]. Tačiau PGC1

ir TFAM genai taip pat glaudžiai susiję su mitochondrijų funkcija ir biogeneze [36]. Sutrikusi šių genų ekspresija yra susijusi su CKD, o jos išsaugojimas prisideda prie inkstų vientisumo, kaip parodyta keliuose pažeidimo modeliuose. Taigi Han ir kt. nustatė, kad PGC1 kanalėlių funkcijos padidėjimas apsaugojo peles nuo Notch sukeltos inkstų fibrozės ir pakeitė su šiuo modeliu susijusią mitochondrijų disfunkciją [37]. Panašiai, pakartotinė Tfam ekspresija kanalėlių ląstelėse užkirto kelią Notch sukeltam metaboliniam ir profibroziniam perprogramavimui [38]. Taigi galima įsivaizduoti, kad sumažėjusi šių mitochondrijų genų mRNR ekspresija, kurią sukelia miR-150 ir miR-495, taip pat prisideda prie pažeisto epitelio fenotipo.

OCR sumažėjimas, susijęs su epitelio ląstelių pažeidimu, atitinka ankstesnes ataskaitas, įskaitant mūsų tyrimus su miR-33 ir miR-9 [15,16]. Tuo tarpu Kang ir kt. taip pat pranešė, kad gliukozės oksidacija buvo mažesnė žmogaus ir pelių inkstų fibrozės modeliuose [5], mūsų duomenys rodo, kad mikroRNR sukeltas OCR sumažėjimas per se nesukelia ECAR pokyčių, o tai rodo, kad glikolitinis išjungimas fibrozinėmis sąlygomis greičiausiai priklauso. dėl fibrotinių dirgiklių, o ne dėl sutrikusio oksidacinio fosforilinimo. Keletas miRNR buvo identifikuoti kaip pagrindiniai mitochondrijų funkcijos modifikatoriai, įskaitant archetipinę profibrozinę miRNR miR-21 [39]. PPAR ekspresijos slopinimas miR-21 buvo panaudotas kaip mechanizmas, kuriuo ši miRNR atlieka savo fibrozinį poveikį. Be FAO slopinimo, tiksliniai miR-21 genai parodė, kad ši miRNR nutildo daugybę mitochondrijų procesų. Kiti pavyzdžiai: mir-9 [16], miR-33 [15] ir miR-30e [40,41]. Tačiau, mūsų žiniomis, yra nedaug pranešimų apie CPT1A, PGC1 ir TFAM genų mikroRNR reguliavimą inkstų fibrozės kontekste. Įdomu tai, kad mikroRNR{22}}, kuri skatina epitelio-mezenchiminį perėjimą (EMT) inkstų fibrozės metu, yra tiesiogiai nukreipta į TFAM gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse [42]. Apie šias represijas taip pat pranešta miR-590-3p [43]. MiR-29 šeima, viena geriausiai apibūdintų ECM gamybos reguliatorių sergant organų fibroze, tiesiogiai nukreipta į PGC1 , išsaugodama širdies homeostazę. Taigi, patologinis miR-29 nutildymas sukelia PGC1 reguliavimą ir sukelia didelius mitochondrijų biogenezės pokyčius, kurie prisideda prie širdies ligų [44]. Nors mūsų duomenys aiškiai patvirtina miR-150 ir miR-495 vaidmenį sergant inkstų fibroze, norint patvirtinti šį teiginį, reikia atlikti tolesnius in vivo tyrimus.

Norėdami įvertinti mitochondrijų elektronų transportavimo grandinės (ETC) vientisumą, mes sutelkėme dėmesį į dvi savybes: ΔѰm ir superoksido radikalų anijonų gamybą. Pastebėjome, kad miR-150 ir miR-495 šių parametrų nepakeitė. Ląstelių gyvybingumui reikalingas stabilus ΔѰm, o jo dydis skiriasi priklausomai nuo ląstelių tipų [45]. Jo priežiūra yra griežtai sureguliuota, nes ΔѰm padidėjimas gali sukelti redokso būsenos sutrikimus, o jo sumažėjimas sumažina ATP gamybą ir gali sukelti apoptozę. Mūsų tyrime ΔѰm pokyčiai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant katijoninį fluorescencinį dažą TMRM, o mitochondrijų superoksido radikalų anijonų gamyba buvo matuojama naudojant fluorogeninį dažą MitoSOX Red. Šių priemonių naudojimas esant sąlygoms, turinčioms įtakos inkstų funkcijai, literatūroje nėra pastebimas. Nepaisant to, nesant pokyčių mūsų tyrime, mes nesiėmėme išsamių kitų redokso hormezės įvertinimo strategijų, todėl negalime atmesti galimybės, kad šios miRNR gali pakeisti nukleofilinį toną arba kelių komponentų funkciją. ETC.

Klinikinėje aplinkoje miR-150 buvo pasiūlyta kaip profibrozinė miRNR sergant vilkligės nefritu, moduliuojant TGF signalizaciją [46,47], o miR{5}} buvo susijęs su apsauginiu vaidmeniu sergant diabetu širdies liga. fibrozė [48]. Norėdami išsiaiškinti jų galimą dalyvavimą CKD, įvertinome jų serumo ir parenchiminį lygį dviejose skirtingose ​​pacientų grupėse. MiRNR koncentracija serume buvo pasiūlyta kaip galimi CKD progresavimo biomarkeriai [49, 50]. Taigi, serume cirkuliuojantis miR-21 lygis ir miR-29c gausa šlapimo egzosomose koreliuoja su inkstų fibroze, o tai rodo galimą jų, kaip biožymenų, vaidmenį [51, 52]. Tačiau miR-150 ir miR-495 lygiai nesiskyrė nei plazmos, nei inkstų mėginiuose, gautuose iš LIL sergančių pacientų. Skirtingi mikroRNR ekspresijos modeliai tarp rūšių ir ląstelių tipų gali paaiškinti, kad fibroziniame audinyje nėra skirtumo miR-150 ir miR-495 lygiuose [53]. Nors kai kuriais atvejais pranešta apie mikroRNR koncentraciją plazmoje, gali atspindėti koncentraciją inkstų audinyje, reikėtų atsižvelgti ir į kitus mechanizmus, susijusius su miRNR sekrecija į kraujotakos sistemą arba šios sekrecijos atsvarą kituose organuose [13,54].

Apskritai mūsų rezultatai palaiko miR{0}} ir miR-495 reklamavimąinkstųepitelioląstelėdediferenciacija greičiausiai dėl energijos trūkumo, kurią perteikia su CPT1A, PGC1 ir TFAM mitochondrijų funkcija susijusių genų slopinimas. Jie taip pat suteikia pagrindą vykdyti savo vaidmenį in vivo, taip pat galimą jų naudingumą kaip diagnostinius ar prognostinius biomarkerius.

Autoriaus indėlis

SL sumanė ir vadovavo tyrimui. VM sukūrė, atliko ir išanalizavo daugumą eksperimentų. RR padėjo atlikti mikroRNR matricos analizę. DRP ir LGB atliko tyrimus su dviem skirtingomis CKD pacientų grupėmis. Visi autoriai padėjo aptarti rezultatus, o SL ir VM parašė rankraštį.

Konkuruojančių interesų deklaracija

Autoriai neturi interesų konfliktų.

Padėkos

Šis darbas buvo paremtas Ispanijos mokslo ministerijos SAF2015-66107-R ir PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/01513 (DRP) dotacijomis, kurias bendrai finansavo Europos Regioninės plėtros fondas, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 ir RD16/ 0009/0016 (SL ir DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Madrido bendruomenė „NOVELREN“ B2017/BMD3751, (SL) Ispanijos nefrologijos draugijos (Fundacin Senefro 2017) dotacija SL ir FundacionInkstų„Iigo Alvarez de Toledo“ (SL) iš Ispanijos. CBMSO gauna institucinę paramą iš Fundacion "Ramn Areces". VM parėmė Ispanijos mokslo ministerijos FPI programos (BES{0}}) ikidoktorantūros stipendija.