Herba Cistanches apsauginis poveikis statinų sukeltam miotoksiškumui in vitro

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Elaine Wat a,b,1, Chun Fai Ng a,b,1, Chi Man Koon a,b, Ericas Chun Wai Wong a,b, Brian Tomlinson c, Clara Bik San Lau a,b,n

Kinijos medicinos institutas, Honkongo Kinijos universitetas, Šatinas, Naujosios teritorijos, Honkongas

b Valstybinė pagrindinė fitochemijos ir augalų išteklių laboratorija Vakarų Kinijoje, Kinijos Honkongo universitetas, Šatinas, Naujosios teritorijos, Honkongas

c Klinikinės farmakologijos skyrius, Medicinos ir terapijos departamentas, Honkongo Kinijos universitetas, Šatinas, Naujosios teritorijos, Honkongas

Santrauka:

Etnofarmakologinė reikšmė: HerbaCistanches(HC,Cistanchedeserticola, arbaCistanchekanalėlių) yra kinų žolė, tradiciškai naudojama raumenų problemoms gydyti. Ankstesni tyrimai parodė, kad HC ekstraktas gali sumažinti raumenų pažeidimus ir pagerinti ATP saugojimą žiurkėms po treniruotės. Tačiau jo poveikis statinų sukeltam toksiškumui raumenims niekada nebuvo ištirtas.

Tikslas:Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti, ar vandeninis HC (HCE) ekstraktas gali užkirsti kelią simvastatino sukeltam toksiškumui L6 žiurkių skeleto raumenų ląstelėse ir ar verbaskozidas yra pagrindinė biologiškai aktyvi sudedamoji dalis, prisidedanti prie poveikio.

Medžiagos ir metodai:MTT buvo atlikta siekiant nustatyti HCE ({0}}–2000 mg/ml) arba verbaskozido (0–160 mM) poveikį simvastatinu (10 mM) apdorotoms L6 ląstelėms. Aneksino V-FITC / PI apoptozės tyrimas ir kaspazės 3 tyrimas buvo atlikti siekiant nustatyti apsauginį HCE vaidmenį simvastatino sukeltai ląstelių žūčiai ir įvertinti, ar HCE padarė apsauginį poveikį per kaspazės kelią. ATP gamyba buvo matuojama siekiant ištirti, ar HCE gali užkirsti kelią simvastatino sukeltam ATP gamybos sumažėjimui in vitro.

Rezultatai:Simvastatinas žymiai padidino apoptozinę ląstelių mirtį L6 ląstelėse. HCE reikšmingai sumažino nuo dozės priklausomą simvastatino sukeltų apoptotinių ląstelių skaičių, galbūt per kaspazės -3 kelią. Simvastatinas sumažino ATP gamybą L6 ląstelėse, o tai, priklausomai nuo dozės, užkirto kelią HCE. Buvo tik tendencija, bet ne reikšmingas verbaskozido poveikis (išskyrus didelę dozę) apsaugai nuo simvastatino sukelto toksinio poveikio raumenims.

Išvados:Apibendrinant, pirmą kartą parodėme, kad HCE gali turėti nuo dozės priklausomą apsauginį poveikį simvastatino sukeltam toksiškumui in vitro, o tai mažai tikėtina dėl verbaskozido buvimo. Mūsų tyrimas pasiūlė galimą HC naudojimą simvastatino sukelto toksiškumo raumenims atveju.

Raktiniai žodžiai:HerbaCistanches, statinas, cholesterolis, hiperlipidemija, toksiškumas raumenims, verbaskozidas, kaspazė-3

HerbaCistanches

1. Įvadas

HMG-CoA reduktazės inhibitoriai (statinai), kurie yra geriausiai parduodamų receptinių vaistų klasė pasaulyje, yra gerai dokumentuota, kad yra naudingi abiejų lyčių skirtingo amžiaus pacientams, kuriems yra vidutinė ir didelė širdies ir kraujagyslių ligų (ŠKL) rizika (Golomb ir Evansas, 2008). Tada buvo sukurti ir kliniškai patvirtinti įvairūs statinai, įskaitant pravastatiną, atorvastatiną, fluvastatiną, lovastatiną, pitavastatiną, rozuvastatiną ir simvastatiną. Apskritai, visi statinai veikia slopindami HMG-CoA redukciją į mevalono rūgštį ankstyvoje mevalonato kelio stadijoje, kad sumažintų cholesterolio gamybą (Kromer ir Moosmann, 2009; Thompson ir kt., 2003). Nors statinai paprastai yra gerai toleruojami, vienas iš svarbiausių ir labiausiai žinomų klinikinių nepageidaujamų poveikių yra toksiškumas skeleto raumenims (rabdomiolizė) (Kobayashi ir kt., 2008). Skeleto raumenų anomalijos gali būti nuo gerybinės mialgijos iki sunkios miopatijos. Nors siūloma daugybė mechanizmų, kurie gali būti atsakingi už neigiamą statino poveikį raumenims, manoma, kad mitochondrijų mechanizmai atlieka svarbų vaidmenį (Golomb ir Evans, 2008). Mevalonatas yra ne tik cholesterolio, bet ir kitų junginių, įskaitant selenoproteinus, dolicholį ir ubichinoną, pirmtakas (Kaufmann ir kt., 2006; Vaklavas ir kt., 2009). Todėl statinų gebėjimas slopinti mevalonatą taip pat slopintų selenoproteinų, tokių kaip glutationo peroksidazė (GPx), gamybą, kurie yra svarbūs fermentai palaikant antioksidacinį gynybos mechanizmą (Kromer ir Moosmann, 2009). Statinai taip pat gali sukelti ubichinono išeikvojimą, dėl to sumažėja deguonies suvartojimas ir ATP sintezė (Beltowski ir kt., 2009). Be to, vis daugiau tyrimų in vitro ir in vivo parodė, kad statinas taip pat gali tiesiogiai veikti audinių mitochondrijas, kad sukeltų nuo Ca2þ priklausomą membranos pralaidumo perėjimą (MPT) priklausomai nuo dozės (Beltowski ir kt., 2009; Velho ir kt., 2006). ). Jis taip pat yra susijęs su padidėjusiu reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) ir mitochondrijų oksidaciniu stresu, dėl kurio miršta ląstelės ir todėl pažeidžiamos kepenys ir raumenys (Beltowski ir kt., 2009; Velho ir kt., 2006).

HerbaCistanchesVisas džiovintas Cistanche deserticola YC Ma arba Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (Orobanchaceae šeima) augalas yra parazitiniai augalai, daugiausia augantys šiaurės ir šiaurės rytų Kinijos dykumose (Siu ir Ko, 2010).HerbaCistanchesyra Yang gaivinanti kinų tonizuojanti žolė, kuri visų pirma naudojama inkstų nepakankamumui gydyti, kai pasireiškia tokie simptomai kaip impotencija, nevaisingumas, priešlaikinė ejakuliacija. Sunki ir tiršta žolė taip pat drėkina žarnyną ir padeda palengvinti vidurių užkietėjimą. Tai taip pat kiniška žolė, kuri tradiciškai skiriama pacientams nuo juosmens ir kelių skausmų, ir yra žolė, dažniausiai naudojama kinų preparatuose raumenų problemoms gydyti (Siu ir Ko, 2010; Xiong ir kt., 1998). Įdomu tai, kad tai taip pat atitinka šiuolaikinius mokslinius tyrimus, kurie parodė, kad ekstraktas, kuriame gausu polisacharidų ir feniletanoidų, veikia nuo nuovargio.HerbaCistanchesžiurkėms po treniruotės sumažinant raumenų pažeidimus ir pagerinant ATP saugojimą (Cai ir kt., 2010). Neseniai atliktas darbas parodė, kad metanolio Herba Cistanches ekstraktas gali sustiprinti mitochondrijų ATP susidarymą (Leung ir Ko, 2008). Siu ir Ko (2010) tai pademonstravoHerbaCistanchestaip pat galėtų sustiprinti mitochondrijų glutationo būklę tarpininkaujant glutationo sintezei ir GPx, taip apsaugant audinius nuo oksidacinio streso žiurkių širdyse. Siu ir Ko (2010) taip pat parodė taiHerbaCistanchesgali sumažinti mitochondrijų Ca2 kiekį, taip sumažinant nuo Ca2 priklausomą MPT. Be to,HerbaCistanchestaip pat buvo įrodyta, kad jis yra stiprus antioksidantas ir laisvųjų radikalų gaudytojas įvairiuose organuose, mažinantis oksidacinį stresą ir ROS aktyvumą in vivo tyrimais (Lu ir kt., 1995; Sui ir kt., 2011). Dar įdomiau, bandant nustatyti aktyvią frakciją, kuri prisideda prie nuovargio slopinimoHerbaCistanches, buvo nustatyta, kad verbaskozidas buvo pagrindinė veikliosios frakcijos sudedamoji dalis (Cai ir kt., 2010). Taip pat buvo įrodyta, kad verbaskozidas sumažina rupūžių raumenų nuovargį, galbūt dėl ​​savo antioksidacinio aktyvumo (Liao ir kt., 1999), o tai rodo, kad verbaskozidas gali būti biologiškai aktyvus komponentas, prisidedantis prie teigiamo Herba Cistanches poveikio.

Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti, ar vaistažolių Cistanches vandens ekstrakto (HCE) naudojimas gali sumažinti simvastatino sukeltą toksiškumą raumenims in vitro. Buvo iškelta hipotezė, kad HCE vartojimas gali ištaisyti šalutinį simvastatino sukeliamo toksiškumo raumenims poveikį. Taip pat buvo bandoma nustatyti, ar teigiamas poveikisHerbaCistanchesyra priskiriami verbaskosido buvimui.

Cistanche žolelių ekstraktas

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Žolinių medžiagų autentiškumo nustatymas ir paruošimas

Žaliava augalinė medžiaga išHerbaCistanchesbuvo įsigytas iš žinomo tiekėjo Guangdžou, Kinijoje.HerbaCistanchesbuvo chemiškai autentiškas naudojant plonasluoksnę chromatografiją (TLC) pagal Kinijos farmakopėją (CP), 2010 m., naudojant verbaskozidą ir echinakozidą kaip cheminius žymenis (duomenys nerodomi). Atlikus cheminį autentifikavimą, herbariumo kvito pavyzdysHerbaCistanchesbuvo deponuotas Honkongo Kinijos universiteto (CUHK) Kinų medicinos instituto muziejuje su kvito egzemplioriaus numeriu 2014–3434.

Trumpai tariant, 1 kg žalios žolės buvo mirkoma 1 valandą, po to du kartus ekstrahuojama, kaitinant 1 valandą su grįžtamu šaldytuvu 100 laipsnių temperatūroje, naudojant 10 l distiliuoto vandens kiekvienam ekstrahavimui. Vandeniniai ekstraktai (HCE) buvo sujungti ir filtruojami. Filtratas koncentruojamas sumažintame slėgyje 60 laipsnių temperatūroje. Koncentruotas ekstraktas liofilizuojamas iki sausumo. Išeiga buvo 50,1 % m/m. Nedidelis kiekis buvo naudojamas verbaskozido ir echinakozido kiekiui nustatyti naudojant itin efektyvią skysčių chromatografiją (UPLC). Visi ekstrahuoti milteliai buvo supakuoti vakuume ir laikomi iki naudojimo.

2.2. Vandeninio ekstrakto UPLC analizė

UPLC analizė buvo atlikta naudojant Waters Acquity Ultra Performance LC sistemą (Waters, JAV). Visi tirpikliai, reikalingi UPLC analizei, buvo įsigyti iš Kinijos Honkongo universiteto Chemijos katedros. Verbaskozidas ir echinakozidas buvo įsigyti iš Nacionalinio farmacijos ir biologinių produktų kontrolės instituto, Kinijoje. Mėginio tirpalas buvo įšvirkščiamas į Waters Acquity UPLC BEH C18 kolonėlę (10{{20}} 2,1 mm2 id, dalelių dydis 1,7 mm) su Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard prieškolonėle ( 5-2.1 mm2 id, dalelių dydis 1,7 mm). Visi tirpikliai buvo iš anksto nufiltruoti su 0,45 mm Millipore filtro disku (Millipore) ir pašalinti dujas. Gradientinis eliuavimas atliktas naudojant šias tirpiklių sistemas: judrioji fazė A – acetonitrilas; judrioji fazė B – dvigubai distiliuotas vanduo/skruzdžių rūgštis (99,9/ 0.1; v/v). Eliuavimas atliktas taikant gradiento procedūrą: 0–5 min., 88 procentai B; 5–10 min., nuo 88 procentų B iki 83 procentų B. Naudotas tėkmės greitis buvo 0,4 ml/min., o aptikimas atliktas esant 331 nm pagal CP (2010). Kiekvienas mėginys (5 ul) buvo įšvirkščiamas į kolonėlę po filtravimo per 0,2 mm filtro diską. Cheminių žymenų identifikavimas buvo atliktas lyginant nežinomų smailių sulaikymo laiką ir UV absorbciją su standartų smailėmis. Kalibravimo kreivė buvo nubraižyta pagal verbaskozido ir echinakozido koncentracijų serijas (40, 20, 10, 5, 2,5 ir 1,25 mg/ml) kiekybiniam įvertinimui. Verbaskozido ir echinakozido kiekybinis nustatymas žolelių ekstrakte buvo atliktas trimis egzemplioriais. Sistema buvo stebima kompiuteriu su Waters MassLynx programine įranga duomenų rinkimui, integravimui ir analizei.

2.3. Ląstelių kultūros

L6 žiurkės skeleto raumenų ląstelių linija buvo įsigyta iš American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, JAV). Ląstelės buvo palaikomos subkonfluentiniu tankiu Dulbecco modifikuotoje Erelio terpėje (DMEM, ATCC, Manasas, VA, JAV), papildytos 10 tūrio procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS) ir 1 procento penicilino-streptomicino (P/S), ir inkubuojamas 37 laipsnių temperatūroje drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5 procentai CO2 ir 95 procentai oro.

Norint nustatyti HCE poveikį statinų sukeltam toksiškumui raumenims, L6 ląstelės buvo apdorotos simvastatinu 10 μM 48 valandas, kad sukeltų toksiškumą. Norint nustatyti, ar vaistažolių ekstraktas galėtų užkirsti kelią statinų sukeltam toksiškumui skeleto raumenų ląstelėse ir kad jei verbaskozidas galėtų turėti panašų apsauginį poveikį kaip ir žolelių vandeninis ekstraktas.

Herba Cistanche ekstrakto apsauginis poveikis simvastatino sukeltam toksiškumui in vitro

2.4. Citotoksiškumas in vitro

L6 ląstelės (1x10⁵/ šulinėlis) per naktį buvo pasėtos į {{0}}šulinėlių plokščiadugnes auginimo plokšteles (Iwaki, Japonija), po to apdorotos 10 μM simvastatino, kartu su įvairiomis HCE dozėmis arba be jų ( 0–2000 ug/ml) arba verbaskozido (0–160 μM), 48 val. Paprasta terpė (DMEM) buvo pridėta prie kontrolinių šulinėlių. Žolelių ekstraktas ir junginys buvo ištirpinti DMEM.

Po 48 valandų apdorojimo terpė iš visų ląstelių buvo išmesta ir 30 ul 5 mg/ml 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{ 8}}difenil-tetrazolio bromidas (MTT; Sigma, JAV) fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) buvo pridėtas į kiekvieną šulinėlį ir plokštelės toliau inkubuojamos 3 valandas 37 laipsnių temperatūroje. Tada supernatantas buvo pašalintas ir į kiekvieną šulinėlį įpilama 100 ul DMSO, kad ištirptų purpuriniai formazano kristalai (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. JAV). Kiekvieno mėginio absorbcija buvo nuskaityta esant 540 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (Biotek μ-Quant, JAV). Rezultatai buvo išreikšti MTT absorbcijos procentine dalimi, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis.

2.5. Aneksino-V FITC/PI dažymo tyrimas

L6 ląstelės (3 x 10⁵/ šulinys) buvo gydomi simvastatinu kartu su įvairiomis HCE arba verbaskozido dozėmis arba be jų. Tada ląstelės buvo surinktos, plaunamos ir nudažytos aneksino-V FITC rinkiniu pagal gamintojo protokolą (Trevigen, MD, JAV). Trumpai tariant, ląstelės buvo du kartus plaunamos 1 x surišimo buferiu ir inkubuojamos 100 ul ženklinimo tirpale, kuriame yra 1 ul aneksino-V FITC konjugato ir 10 ul PI tamsoje 15 minučių kambario temperatūroje. Mėginių fluorescencija buvo aptikta srauto citometrija (Becton Dickinson FACSCanto II, JAV).

2.6. Kaspazės 3 aktyvumo tyrimas

Kaspazės 3 aktyvumas buvo nustatytas naudojant fluorometrinį imunosorbento fermento tyrimą (Sigma) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, L6 ląstelės (3 105 / šulinėlis), apdorotos simvastatinu, kartu su įvairiomis HCE verbaskozido dozėmis arba be jų, buvo lizuojamos naudojant lizės buferį. Laisvas 7-amino-4-metilkumarinas (AMC), susidaręs proteolitiškai skaidant substratą kaspazei 3, buvo išmatuotas ir kiekybiškai įvertintas fluorometriškai, kai sužadinimo bangos ilgis yra 360 nm, o emisijos bangos ilgis - 460 nm, naudojant BMG cropmimari skaitytuvas (BMG LABTECH GmbH, Vokietija).

2.7. Ląstelių ATP tyrimas

L6 ląstelės (3x10⁵/ šulinys) buvo gydomi simvastatinu kartu su įvairiomis HCE arba verbaskozido dozėmis arba be jų. Po apdorojimo ląstelės buvo surinktos ir ATP kiekis buvo išmatuotas naudojant komerciškai prieinamą kolorimetrinį rinkinį (Abcam, JK), matuojant lizuotų ląstelių glicerolio fosfato kiekį ir nuskaitant 570 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (Biotek μ-Quant, JAV). ). ATP gamybos matavimas buvo išreikštas procentais, palyginti su kontroline grupe.

2.8. Statistinė analizė

Duomenys pateikti kaip mean7SD, statistinei analizei buvo naudojama Prism 5 for Window (5 versija.{3}}c, GraphPad Software, Inc., JAV). Reikšmingi visų grupių skirtumai buvo įvertinti naudojant vienpusį ANOVA, o po to buvo atliktas Bonferroni kelių palyginimo testas. Po0.05 tikimybė buvo laikoma statistiškai reikšminga.

3. Rezultatai

3.1. Herba Cistanches vandeninio ekstrakto UPLC analizė

Pav. S1A parodytas standartinio mišinio, kuriame yra echinakozido ir verbaskozido, UPLC profilis. Kiekvieno iš šių žymenų sulaikymo laiko taškai buvo lyginami su UPLC profiliuHerbaCistanchesvandeninis ekstraktas (S1B pav.). Echinakozido ir verbaskozido kiekis vidujeHerbaCistanchesvandeninio ekstrakto buvo atitinkamai {{0}},45 % m/m ir 0,085 % m/m.

3.2. HCE ir verbaskozido poveikis simvastatino citotoksiškumui in vitro L6 skeleto raumenų ląstelėse

Kaip parodyta 1A pav., simvastatinas sukėlė reikšmingą citotoksiškumą L6 ląstelėms, kaip rodo reikšmingas L6 ląstelių gyvybingumo sumažėjimas, esant 10 mM simvastatino. Gydymas HCE, priklausomai nuo dozės ir reikšmingai užkirto kelią simvastatino sukeltam citotoksiškumui, kai dozė buvo 500, 1000 ir 2000 mg/ml. Verbascoside parodė tendenciją pagerinti L6 ląstelių, kartu gydomų simvastatinu, gyvybingumą. Tačiau nė viena iš koncentracijų nepasiekė statistinio reikšmingumo (1B pav.).

1 pav. (a) HCE apsauginis poveikis; ir (b) verbaskozidas dėl simvastatino sukelto citotoksiškumo L6 ląstelėse. Reikšmės reiškia vidurkį7SD (n¼3). Reikšmingas skirtumas tarp gydymo vien simvastatinu ir kontrolinės grupės naudojant Stjudento t testą: ### po0.{{10}}01. Reikšmingas skirtumas tarp visų grupių, gydytų simvastatinu, kartu gydant HCE verbaskozidu arba be jo, naudojant vienpusę ANOVA: ** po0,01,*** po0,001.

3.3. HCE ir verbaskozido poveikis simvastatino sukeltai ląstelių žūčiai L6 skeleto raumenų ląstelėse

Norint ištirti simvastatino sukeltos ląstelių mirties būdą ir nustatyti apsauginį HCE arba verbaskozido vaidmenį simvastatino sukeltai ląstelių mirčiai, apoptozinių ląstelių dalis buvo aptikta dažant propidžio jodidu (PI). Rezultatai parodė, kad simvastatinas sukėlė reikšmingą ankstyvų apoptozinių ląstelių (Aneksino V-FITC teigiamų ir PI neigiamų, Q4–2) ir vėlyvųjų apoptotinių / negyvų ląstelių (Aneksino V-FITC teigiamų ir PI teigiamų, Q2– 2) lyginant su kontroline grupe. Gydymas kartu su HCE sumažino ankstyvų apoptozinių ir vėlyvųjų apoptozinių / negyvų ląstelių dalį, priklausomai nuo dozės, iki 1000 mg/ml (2A pav.). Šis apsauginis poveikis taip pat buvo pastebėtas kartu gydytų verbaskozidu grupėse. Tačiau nė viena iš tirtų koncentracijų nepasiekė statistinio reikšmingumo (2B pav.).

2 pav. Simvastatino su arba be HCE arba verbaskozido poveikis fosfatidilserino eksternalizacijai L6 ląstelėse. Ląstelės buvo nudažytos aneksino-V FITC ir I ir aptiktos srauto citometrija

3.4. HCE ir verbaskozido poveikis kaspazės 3 aktyvumui L6 skeleto raumenų ląstelėse, gydomose simvastatinu

Kaip parodyta 3A pav., 10 mM simvastatinas reikšmingai sukėlė kaspazės 3 aktyvumą L6 ląstelėse, o tai rodo, kad simvastatinas sukėlė L6 ląstelių apoptozę per kaspazės kaskadą. Tačiau L6 ląstelėse, kurios buvo gydomos kartu simvastatinu ir HCE, HCE priklausomai nuo dozės ir žymiai sumažino kaspazės 3 aktyvumą, o tai rodo, kad HCE gali užkirsti kelią simvastatino sukeltai apoptozei per kaspazės kaskadą. Kita vertus, nors verbaskozidas taip pat turėjo tendenciją mažinti simvastatino sukeltą kaspazės 3 fermento aktyvumo padidėjimą, tik 160 mM koncentracija pasiekė statistinę reikšmę (3B pav.).

3 pav. Apsauginis (a) HCE poveikis; ir (b) verbaskozidas dėl simvastatino sukeltos kaspazės 3 fermentinio aktyvumo L6 ląstelėse. Reikšmės reiškia vidurkį7SD (n¼3–5). Reikšmingas skirtumas tarp gydymo vien simvastatinu ir kontrolinių grupių naudojant Stjudento t testą: ###po0.001. Reikšmingas skirtumas tarp visų simvastatinu gydytų grupių su HCE arba be bendro gydymo HCE arba be verbaskozidu, naudojant vienpusę ANOVA: *po0.05, **p o0.01, ***po0.001.

3.5. HCE poveikis simvastatino sukeltam ATP gamybos sumažėjimui L6 skeleto raumenų ląstelėse

Simvastatinas (10 mM) reikšmingai sumažino ATP gamybą L6 ląstelėse maždaug 60 procentų, palyginti su kontroline grupe (4A pav.). Gydymas HCE, priklausomai nuo dozės, sumažino ATP gamybos sumažėjimą simvastatinu gydomose ląstelėse, iš kurių tik 500, 1000 ir 2000 mg/ml koncentracijos pasiekė statistinį reikšmingumą. Kita vertus, nors verbaskozidas turėjo tendenciją atkurti ATP gamybą esant 50 mg/ml, jis nepasiekė statistinio reikšmingumo (4B pav.).

4 pav. Apsauginis (a) HCE ir (b) verbaskozido poveikis simvastatino sukeltam ATP gamybos sumažėjimui L6 ląstelėse. Reikšmės reiškia vidurkį7SD (n¼3–5). Reikšmingas skirtumas tarp gydymo vien simvastatinu ir kontrolinių grupių naudojant Stjudento t testą: ###po0.001. Reikšmingas skirtumas tarp visų simvastatinu gydytų grupių su HCE arba be kartu gydytų verbaskozidu, naudojant vienpusę ANOVA: *po0,05, **po0,01.

4. Diskusija

Pasaulyje didėjant širdies ir kraujagyslių ligų (ŠKL) paplitimui ir pacientams, kuriems diagnozuota hipercholesterolemija, statinų vartojimas tapo vis dažnesnis. Nors statinai apskritai yra labai gerai toleruojami, raumenų pažeidimai yra dažnai pranešamas šalutinis poveikis, susijęs su statinų vartojimu, kuris gali pasireikšti ūmiai praėjus savaitėms ar mėnesiams po vaisto vartojimo pradžios (Fine, 2003). Raumenų simptomai gali skirtis nuo lengvų problemų, pavyzdžiui, skausmo, jautrumo ar silpnumo su kreatinkinazės (CK) padidėjimu arba be jo, iki sunkiausios rabdomiolizės būklės (Armitage, 2007; Hu ir kt., 2012). Dėl šių šalutinių poveikių ir dėl to, kad nėra veiksmingo statinų sukelto toksiškumo raumenims gydymo, statinai vis dar nepakankamai naudojami. Plačioje apklausoje, kurioje dalyvavo 10 409 prancūzų tiriamieji, pokalbio telefonu metu 10 procentų pacientų, gydytų statinais, pranešė apie raumenų simptomus, iš kurių 30 procentų šių simptominių pacientų gydymas buvo nutrauktas (Rosenbaum ir kt., 2013).

Pirmą kartą įrodėme, kad vandens ekstraktas išHerbaCistanches, dažniausiai naudojama tradicinė kinų žolė, gali turėti apsauginį poveikį nuo simvastatino sukelto toksiškumo in vitro L6 skeleto raumenų ląstelėse, o tai rodo, kadHerbaCistanchesvandeninis ekstraktas (HCE) dėl savo apsauginio vaidmens statinų sukeltas toksiškumas raumenims, kuris yra pripažintas dažnas šalutinis poveikis pacientams, vartojantiems statinus. Todėl stiprus HCE gebėjimas apsaugoti nuo statinų sukelto toksiškumo raumenims turėtų didelį potencialą.

Remiantis tradicine TCM teorija, Yang yra susijęs su mitochondrijų energijos apykaita organizme, ir buvo nustatyta, kad Yang gaivinančių žolelių receptas sustiprina mitochondrijų ATP susidarymą (Ko ir Leung, 2007). Įdomu tai, kad mes stebėjome ATP gamybos sumažėjimą simvastatinu gydomose L6 skeleto raumenų ląstelėse, ir šis ATP gamybos sumažėjimas buvo žymiai pagerėjęs kartu gydant HCE. Savo tyrime, naudodami L6 žiurkių skeleto raumenų ląsteles, parodėme simvastatino sukeltą ląstelių gyvybingumo sumažėjimą. Šis ląstelių gyvybingumo sumažėjimas buvo žymiai pagerintas kartu gydantHerbaCistanchespriklausomai nuo dozės. Nors tikslus statinų sukelto toksiškumo raumenims mechanizmas nebuvo iki galo išaiškintas, buvo manoma, kad statinų sukelta sveikų skeleto miocitų apoptozė yra veiksnys, sukeliantis miopatiją – dažniausiai pasitaikantį šalutinį poveikį, kurį patiria statinų vartotojai (Dirks ir Jones, 2006). . Savo tyrime pastebėjome reikšmingą simvastatino sukeltų apoptotinių ląstelių padidėjimą, kuris buvo susijęs su žymiai padidėjusiu kaspazės 3 aktyvumu. Šie duomenys taip pat atitinka ankstesnius tyrimus, kurie parodė, kad įvairūs statinai gali sukelti apoptozę skeleto mioblastuose, miotubuose ir diferencijuotose pirminėse žmogaus skeleto raumenų ląstelėse, aktyvindami kaspazės{5}} ir kaspazės-3 veiklą (Dirksas). ir Jonesas, 2006). Mūsų HCE galėjo užkirsti kelią šiam simvastatino sukeltam kaspazės -3 aktyvuotos apoptozės padidėjimui priklausomai nuo dozės.

HerbaCistanches

Be to, ankstesnėje literatūroje buvo teigiama, kad verbaskozidas yra viena iš pagrindinių aktyvių sudedamųjų daliųHerbaCistanches. Verbaskozidas, taip pat žinomas kaip akteozidas, priklauso feniletanoidinių glikozidų, natūraliai pasitaikančių vandenyje tirpių polifenolinių junginių grupei, nariui (Liao ir kt., 1999). Anksčiau buvo įrodyta, kad verbaskozidas yra stiprus antioksidantas, galintis turėti stiprią ROS šalinimo ir antioksidacinę veiklą (Liao ir kt., 1999). Atlikdami tyrimą, norėdami nustatyti, ar verbaskozidas yra pagrindinis mūsų HCE komponentas, prisidedantis prie pastebėto teigiamo poveikio, mes išbandėme verbaskozido poveikį esant 0–160 mM koncentracijai. Kadangi įrodėme, kad mūsų HCE yra aktyvus esant 250–2000 mg/ml koncentracijos diapazonui, remiantis mūsų HPLC rezultatais, kurie rodo, kad mūsų HCE sudėtyje yra verbaskozido, kurio koncentracija yra 0,085 % masės. /wt, aktyvi verbaskozido koncentracija turėtų svyruoti tarp 0,2125–1,7 mg/ml (ty 0,34–2,72 mM), ar verbaskozidas turėtų būti aktyvioji sudedamoji dalis? Nepaisant to, mums nepavyko pastebėti reikšmingo teigiamo verbaskozido poveikio tiriant koncentracijos diapazoną, nors pastebėjome nuo dozės priklausomą teigiamo verbaskozido poveikio L6 skeleto raumenų ląstelėms tendenciją. Šie duomenys rodo, kad mūsų HCE teigiamas poveikis, pastebėtas L6 skeleto ląstelėse, greičiausiai nebus siejamas su vien tik verbascoside poveikiu, o tai rodo, kad už pastebėtą teigiamą poveikį gali būti kiti komponentai, išskyrus verbascosidą. Taip pat gali būti, kad verbaskozidas gali sąveikauti su kitais ekstrakte esančiais bioaktyviais junginiais, kad prisidėtų prie teigiamo poveikio. Papildomi eksperimentai, naudojant biologinio tyrimo vadovaujamą frakcionavimą, bus naudingi suteikiant daugiau informacijos apie biologiškai aktyvių komponentų, atsakingų už pastebėtą HCE apsauginį poveikį simvastatino sukeltam toksiškumui raumenims, atradimą.

Apibendrinant, šis tyrimas rodo, kad HCE gali turėti stiprų apsauginį poveikį simvastatino sukeltam raumenų ląstelių gyvybingumo sumažėjimui in vitro. Šie rezultatai yra preliminarūs įrodymai, leidžiantys manyti, kad mūsų HC vandeninis ekstraktas gali turėti terapinę vertę kaip funkcinis maistas arba maistinė medžiaga hiperlipideminiams pacientams, kuriems dėl statinų sukelto miotoksiškumo reikia nutraukti gydymą statinais.

Padėka Šį tyrimą finansiškai parėmė Maisto ir sveikatos biuras HKSAR, Sveikatos ir medicinos tyrimų fondas Nr. 11120831.

Nuorodos
Armitage, J., 2007. Statinų saugumas klinikinėje praktikoje. Lancetas 370, 1781–1790.
Beltowski, J., Wojcicka, G., Jamroz-Wisniewska, A., 2009. Statinų neigiamas poveikis – mechanizmai ir pasekmės. Curr. Narkotikų Safas. 4, 209–228.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC, Qi, Y., 2010. Cistanche deserticola ekstrakto, kuriame gausu feniletanoidų, nuovargį mažinantis aktyvumas. Fitoteris. Res. 24, 313–315.
Dirks, AJ, Jones, KM, 2006. Statinų sukelta apoptozė ir skeleto miopatija. Esu. J. Physiol. Ląstelių fiziol. 291, C1208–C1212.
Fine, DM, 2003. Su statinu susijęs toksiškumas raumenims. Clin. Pharmacol. 3 554.
Golomb, BA, Evans, MA, 2008. Statinų neigiamas poveikis: literatūros apžvalga ir mitochondrijų mechanizmo įrodymai. Esu. J. Cardiovasc. Narkotikai 8, 373–418.
Hu, M., Cheung, BM, Tomlinson, B., 2012. Statinų sauga: atnaujinimas. Ten. Adv. Narkotikų Safas. 3, 133–144.
Kaufmann, P., Torok, M., Zahno, A., Waldhauser, KM, Brecht, K., Krahenbuhl, S., 2006. Statinų toksiškumas žiurkės skeleto raumenų mitochondrijoms. Ląstelė. Mol. Life Sci. 63, 2415–2425.

Ko, KM, Leung, HY, 2007. ATP generavimo pajėgumų, antioksidacinio aktyvumo ir imunomoduliacinio aktyvumo didinimas naudojant Kinijos Yang ir Yin tonizuojančias žoleles. Smakras. Med. 2, 3.
Kobayashi, M., Kagawa, T., Narumi, K., Itagaki, S., Hirano, T., Iseki, K., 2008. Bikarbonato papildymas kaip prevencinis būdas statinų sukeltam raumenų pažeidimui. J. Pharm. Pharm. Sci. 11, -8.
Kromer, A., Moosmann, B., 2009. Statinų sukeltas kepenų pažeidimas apima kryžminį cholesterolio ir selenoproteinų biosintezės takų pokalbį. Mol. Pharm. 75, 1421–1429.
Leung, HY, Ko, KM, 2008. Herba Cistanche ekstraktas pagerina mitochondrijų ATP susidarymą žiurkių širdyse ir H9C2 ląstelėse. Pharm. Biol. 46 418.
Liao, F., Zheng, RL, Gao, JJ, Jia, ZJ, 1999. Skeleto raumenų nuovargio stabdymas dviem fenilpropanoidiniais glikozidais: verbaskozidu ir martensitu iš Pedicularis plicata Maxim. Fitoteris. Res. 13, 621–623.
Lu, KG, Liu, HB, Gu, QQ, 1995. Cistanche deserticola Ma cheminių sudedamųjų dalių tyrimas. ir Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Smakras. Tradit. Žolė. Narkotikai 26, 143.
Pharmacopoeia Commission, 2010. Kinijos Liaudies Respublikos farmakopėja. Chemijos pramonės spauda, ​​Pekinas.
Rosenbaum, D., Dallongeville, J., Sabouret, P., Bruckert, E., 2013. Statinų terapijos nutraukimas dėl raumenų šalutinio poveikio: apklausa realiame gyvenime. Nutr. Metab. Širdies ir kraujagyslių. Dis. 23, 871-875.
Siu, AH, Ko, KM, 2010. Herba Cistanche ekstraktas pagerina mitochondrijų glutationo būklę ir kvėpavimą žiurkių širdyse, sukeldamas atsijungiančių baltymų indukciją. Pharm. Biol. 48, 512–517.
Sui, ZF, Gua, TM, Liu, B., Peng, SW, Zhao, ZL, Li, L., Shi, DF, Yang, RY, 2011. Vandenyje tirpus angliavandenių junginys iš kūnųHerbaCistanches: izoliacija ir jos laisvųjų radikalų šalinimo poveikis odoje. Angliavandeniai. Polym. 85, 75.
Thompson, PD, Clarkson, P., Karas, RH, 2003. Su statinu susijusi miopatija. JAMA 289, 1681–1690.
Vaklavas, C., Chatzizisis, YS, Ziakas, A., Zamboulis, C., Giannoglou, GD, 2009. Molecular basic of statin-associated myopathy. Aterosklerozė 202, 18–28.
Velho, JA, Okanobo, H., Degasperi, GR, Matsumoto, MY, Alberici, LC, Cosso, RG, Oliveira, HC, Vercesi, AE, 2006. Statinai skatina nuo kalcio priklausomą mitochondrijų pralaidumo perėjimą. Toksikologija 219, 124–132.
Xiong, Q., Hase, K., Tezuka, Y., Tani, T., Namba, T., Kadota, S., 1998. Cistanche deserticola feniletanoidų hepatoprotekcinis aktyvumas. Planta Med. 64, 120–125.