RNA M6 A skaitytuvas YTHDF2 kontroliuoja NK ląstelių priešnavikinį ir antivirusinį imunitetą, 3 dalis

YTHDF2 reikalingas IL-15 tarpininkaujamų NK ląstelių išgyvenimui, proliferacijai ir efektorinėms funkcijoms

IL-15 yra vienas iš, jei ne pats svarbiausių, NK ląstelių pleiotropinių funkcijų citokinų. Mes ir kiti anksčiau atradome, kad IL{1}} atlieka pagrindinį vaidmenį reguliuojant NK ląstelių homeostazę, išgyvenimą ir efektorines funkcijas (Becknell ir Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson ir kt., 1994; Wang ir kt., 2019b; Yu ir kt., 2013).

Ląstelių pleiotropija reiškia jų gebėjimą atlikti įvairias funkcijas skirtingose ​​aplinkose. Ląstelių pleiotropija yra glaudžiai susijusi su imunitetu, nes daugelis imuninės sistemos ląstelių gali atlikti įvairius vaidmenis.

Imuninėje sistemoje T ląstelės yra labai svarbi ląstelių rūšis. Jie atpažįsta ir atakuoja patogenus, taip pat reguliuoja kitų imuninių ląstelių veiklą. T ląstelių pleiotropija yra labai svarbi, nes kai imuninė sistema susiduria su nauju patogenu, T ląstelės turi atlikti skirtingus vaidmenis per trumpą laiką, kad galėtų veiksmingai reaguoti. Pavyzdžiui, kai imuninė sistema susiduria su bakterine infekcija, T ląstelės turi atlikti bakterijų žudymo vaidmenį, o kai imuninė sistema susiduria su virusine infekcija, T ląstelės turi atlikti kitų imuninių ląstelių reguliavimo vaidmenį.

Be to, imuninėje sistemoje ląstelių, vadinamų makrofagais, klasė taip pat turi pleiotropinį poveikį. Jie gali fagocituoti ir suskaidyti svetimus patogenus, taip pat gali suaktyvinti kitas imunines ląsteles, kad atakuotų patogenus. Makrofagų pleiotropija yra svarbi, nes skirtingose ​​aplinkose jie turi atlikti skirtingus vaidmenis. Pavyzdžiui, sergant virusinėmis infekcijomis, makrofagai turi išskirti kai kurias medžiagas, kad galėtų kovoti su virusu, o esant bakterinėms infekcijoms makrofagai turi įsisavinti ir suvirškinti bakterijas, kad pašalintų patogeną.

Apibendrinant galima pasakyti, kad tarp ląstelių pleiotropijos ir imuniteto yra glaudus ryšys. Pleiotropinės ląstelės gali atlikti skirtingus vaidmenis skirtingų patogenų užkrėstoje aplinkoje, taip sustiprindamos imuninės sistemos gebėjimą reaguoti ir pagerinti organizmo imunitetą įvairiems patogenams. Todėl turėtume atkreipti dėmesį į ląstelių pleiotropiją, taip pat stiprinti imuniteto auginimą, kad išlaikytume žmogaus sveikatą. Matyti, kad turime pagerinti atmintį, o Cistanche deserticola gali žymiai pagerinti atmintį, nes Cistanche deserticola taip pat gali reguliuoti neuromediatorių pusiausvyrą, pavyzdžiui, padidinti acetilcholino ir augimo faktorių kiekį. Šios medžiagos labai svarbios atminčiai ir mokymuisi. Be to, Cistanche deserticola taip pat gali pagerinti kraujotaką ir skatinti deguonies tiekimą, o tai gali užtikrinti, kad smegenys gautų pakankamai maistinių medžiagų ir energijos, taip pagerinant smegenų gyvybingumą ir ištvermę.

Spustelėkite žinoti būdus, kaip pagerinti atmintį

Dabartiniame tyrime parodome, kad IL-15 padidino YTHDF2 mRNR ir baltymų kiekį NK ląstelėse (6 pav. A; ir 1 pav., D–F). Todėl spėliojome, kad YTHDF2 reikalingas IL-15 tarpininkaujamam NK ląstelių išgyvenimui ir efektorinėms funkcijoms.

Pirmiausia bandėme nustatyti galimus transkripcijos veiksnius po IL{0}} signalizacijos, kurie tiesiogiai reguliuoja YTHDF2 raišką. Mes išanalizavome DNR elementų enciklopediją naudodamiesi Kalifornijos universiteto Santa Kruzo genomo naršyklės duomenų baze (https://genome.ucsc.edu), kurioje pateikiamos surišimo vietų visame genome prognozės kartu su JASPAR (http://jaspar.genereg). .net).

Mes nustatėme, kad STAT5, kuris yra pagrindinis IL-15 pasroviui veiksnys NK ląstelėse, turi keturias surišimo vietas 2 kb atstumu prieš Ythdf2 transkripcijos pradžios vietą (TSS), o tai rodo, kad IL-15 gali turėti teigiamą poveikį. reguliuoti Ythdf2 transkripciją pelių NK ląstelėse per STAT5.

Naudodami STAT5 inhibitorių STAT5-IN-1 (Müller ir kt., 2008), parodėme, kad dėl STAT5 slopinimo pelių NK ląstelėse sumažėjo Ythdf2 tiek mRNR, tiek baltymų lygiu (S4 pav., A). ir B). Norėdami dar labiau patvirtinti, kad YTHDF2 yra STAT5 reguliuojamas veiksnys, naudojome Stat5fl/fl Ncr1-iCre peles (toliau vadinamos Stat5ΔNK pelėmis), kur STAT5 yra konkrečiai ištrintos pelės NK ląstelės (Wiedemann ir kt. al., 2020).

Stat5WT ir Stat5ΔNK pelių blužnies NK ląsteles apdorojome IL-15. Mes nustatėme, kad YTHDF2 iš esmės sumažėjo NK ląstelėse iš Stat5ΔNK pelių, palyginti su NK ląstelėmis iš Stat5WT pelių tiek RNR, tiek baltymų lygiu (6 pav., B ir C; ir S4, C ir D pav.).

Liuciferazės reporterio tyrimas parodė, kad ir STAT5a, ir STAT5b tiesiogiai aktyvavo Ythdf2 geno transkripciją (6 pav., D ir E). Chromatino imunoprecipitacijos (ChIP) – qPCR rezultatai parodė, kad STAT5 yra reikšmingai praturtintas keturiose vietose, palyginti su normalia IgG kontrole, o tai rodo tiesioginį prisijungimą prie pelių NKląstelių (6 pav. F). Kartu mūsų rezultatai rodo, kad YTHDF2 ekspresiją reguliuoja STAT5 pasroviui nuo IL-15 signalizacijos NK ląstelėse.

Tada pasidomėjome, ar Ythdf2-trūkusios NK ląstelės nereaguoja į IL-15. Išskyrėme blužnies NK ląsteles iš Ythdf2ΔNK pelių ir Ythdf2WT pelių ir kultivavome themin vitro dalyvaujant IL-15. Mes nustatėme, kad NK ląstelių augimas buvo žymiai sumažintas Ythdf2ΔNK pelėms, palyginti su Ythdf2WT pelėmis (6 pav. G). CellTrace Violet (CTV) ženklinimo tyrimai parodė, kad Ythdf2 trūkumas sutrikdė NK ląstelių dauginimąsi (6 H pav.).

 Ląstelių ciklo pasiskirstymo analizė atskleidė žymiai padidintą NK ląstelių dalį iš Ythdf2ΔNK pelių G0/G1 fazėje, bet žymiai sumažėjusią NK ląstelių dalį iš Ythdf2ΔNK pelių S fazėje (6 pav. I), o tai rodo, kad Ythdf2 trūkumo rezultatai. esant G0/G1 fazės sustabdymui NK ląstelėse.

Be to, Ythdf2ΔNK pelių apoptozinių (aneksino V+Sytox-Blue+/−) NK ląstelių skaičius padidėjo du ar tris kartus, palyginti su Ythdf2WT pelių (6 J pav.), o tai rodo, kad NK ląstelės išgyveno netekus Ythdf2. Šie rezultatai rodo, kad YTHDF2 reguliuoja NKląstelių reakciją į IL-15 in vitro. Kadangi IL-15 yra prastai verčiamas ir išskiriamas in vivo esant pastoviai būsenai (Corbel ir kt., 1996; Fehniger ir kt., 2001), norint ištirti, ar Ythdf2-trūkusios NK ląstelės nėra atsakingos. į IL-15 in vivo, mes gydėme peles IL-15.

Mes nustatėme, kad Ythdf2-trūkumo, palyginti su WT NK ląstelėmis, žymiai sumažėjo ląstelių proliferacija ir padidėjo ląstelių apoptozė, kai pelės buvo gydomos IL-15 (6 K pav. ir S4 pav., E–J). Šie duomenys rodo, kad YTHDF2 reguliuoja NK ląstelių reakciją į IL-15, ypač kai kuriomis sąlygomis, kai IL-15 yra aukštas. Taip pat nustatėme, kad IFN-, granzimo B ir perforino mRNR ir baltymų kiekis Ythdf2ΔNK NK ląstelėse buvo žymiai sumažintas, palyginti su Ythdf2WT NK ląstelėmis reaguojant į IL-15 (6 pav., L–N), o tai rodo, kad YTHDF2 taip pat prisideda prie IL-15 tarpininkaujamų NK ląstelių efektorių funkcijų in vitro.

Visi mūsų duomenys rodo, kad YTHDF2 reikalingas IL-15 tarpininkaujamų NK ląstelių išgyvenimui, proliferacijai ir efektorinėms funkcijoms. Be to, ištyrėme pasroviui taikomus mechanizmus, kuriais YTHDF2 reguliuoja IL-15 sukeltą NK išgyvenimą, proliferaciją ir efektoriaus funkciją. Mes nustatėme, kad Ythdf2ΔNKpelių ir Ythdf2WT pelių NK ląstelės turėjo panašų IL-15 receptorių CD122 (IL-15R) ir CD132 (IL-15R c; S4 K pav.) lygį. IL-15 signalizaciją NK ląstelėse perduoda mažiausiai trys pasroviui esantys signalizacijos keliai: Ras – Raf – MEK – ERK, PI3K – AKT – mTOR ir JAK1/3 – STAT3/5 (Mishra ir kt., 2014).

Norėdami ištirti, kurį signalizacijos kelią NK ląstelėse reguliuoja YTHDF2, ištyrėme Ythdf2ΔNK pelių arba Ythdf2WT pelių ERK, AKT, S6, STAT3 ir STAT5 inNK ląstelių fosforilinimo lygius po stimuliacijos IL-15.

Rezultatai parodė, kad Ythdf2 trūkumas nepaveikė ERK, AKT, S6 ir STAT3 fosforilinimo stimuliuojant IL-15 (S4, L ir M pav.), tačiau reikšmingai slopino STAT5 aktyvaciją, kaip rodo sumažėjęs STAT5 fosforilinimo lygis Ythdf{{ 7}}trūko NK ląstelių nei Ythdf2WT pelių NK ląstelėse (6 O pav.), o tai rodo, kad YTHDF2 reikalingas optimaliam IL-15/STAT5 signalizavimui aktyvuotose NK ląstelėse.

Kadangi parodėme, kad fosforilintas STAT5 pasroviui nuo IL-15 jungiasi su Ythdf2 promotoriumi (6 pav., D–F), ir čia parodėme, kad YTHDF2 reikalingas optimaliam STAT5 fosforilinimui, mūsų duomenys rodo, kad pasroviui yra STAT5 – YTHDF2 teigiamo grįžtamojo ryšio kilpa. IL-15, kuris gali kontroliuoti NK ląstelių išgyvenimą, dauginimąsi ir efektorines funkcijas.

Transkripto masto analizė identifikuoja Tardbp kaip YTHDF2 taikinį NK ląstelėse

Norėdami išspręsti molekulinį mechanizmą, kuriuo YTHDF2 reguliuoja NK ląsteles, pirmiausia atlikome RNR seką (seq) IL-2 išplėstose Ythdf2WT ir Ythdf2ΔNK NK ląstelėse. Dėl Ythdf2 ištrynimo NK ląstelėse atsirado 617 skirtingai išreikštų genų, įskaitant 252 reguliuojamus genus ir 365 sumažintus genus (S5 pav. A).

Genų ontologijos (GO) analizė parodė, kad skirtingai išreikšti genai buvo žymiai praturtinti ląstelių ciklo, ląstelių dalijimosi ir su ląstelių dalijimusi susijusiuose procesuose, įskaitant mitocitokinezę, chromosomų segregaciją, verpstę, nukleosomą, vidurinę kūno dalį ir chromosomą (7 pav.). A).

Genų rinkinio sodrinimo analizė (GSEA) parodė reikšmingą E2F tikslų, G2/Mcheckpoint ir mitozinio veleno bruožų genų rinkinių praturtėjimą Ythdf2ΔNKNK ląstelėse (S5 pav. B). Su ląstelių ciklu ir ląstelių dalijimusi susiję genai, įskaitant Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 ir Plk1 (Bertoli ir kt., 2013), Ythdf2ΔNK B7 pelių NK ląstelėse žymiai sumažėjo (1 pav.). ).

Verpstės ir chromosomų segregacijos genai, tokie kaip Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 ir Tpx2 (Gorbsky, 2015), taip pat buvo žymiai sumažėję Ythdf2ΔNK pelių NK ląstelėse, palyginti su NK ląstelėmis iš Ythdf2ΔNK pelių, palyginti su NK ląstelėmis iš Ythdf2ΔNK.

Be to, Ythdf2ΔNK pelių NK ląstelėse žymiai sumažėjo ląstelių išgyvenimo genų, įskaitant Birc5 (Niu ir kt., 2010), Septin4 (Larisch ir kt., 2000) ir Rffl (Yanget al., 2007). 7 D). NK ląstelių efektoriaus funkcijos genai, įskaitant Klrk1, Ncr1, CD226 ir Gzma (Bezman ir kt., 2012), taip pat buvo žymiai sumažėję Ythdf2ΔNK pelių NK ląstelėse (7 pav. D).

Šie duomenys patvirtina mūsų apibūdintą YTHDF2 vaidmenį reguliuojant NK ląstelių dauginimąsi, išgyvenimą ir efektoriaus funkcijas. Tada atlikome m6A-seq IL-2 išplėstose NK ląstelėse iš Ythdf2WT ir Ythdf2ΔNK pelių. Pagrindinių komponentų analizė parodė, kad trys kiekvieno genotipo biologiniai pakartojimai susitelkė kartu (duomenys nerodomi), o tai rodo gerą m6A-seq mėginių pakartojamumą.

Hipergeometrinė optimizavimo motyvų sodrinimo (HOMER) analizė nustatė m6A konsensuso motyvą (GGAC), rodantį sėkmingą m6A modifikuotų transkriptų sodrinimą (7 pav. E). m6A modifikacijos daugiausia buvo išdėstytos baltymus koduojančiuose nuorašuose, o smailės buvo praturtintos 59 neverčiamuose regionuose (UTR) ir 39UTR, ypač apie pradžios ir pabaigos kodonus (7 pav. F ir S5 C pav.).

GO praturtinimo analizė genų su m6A smailių atskleidė, kad dauguma m6A pažymėtų nuorašų NK ląstelėse buvo praturtintas keliais, dalyvaujančiais ląstelių cikle ir ląstelių proliferacijoje (S5 pav. D).

For more information:1950477648nn@gmail.com