Cistanosido A terapinis poveikis pelių, kurių kiaušialąstės pašalintos, kaulų metabolizmui

1. Įvadas

Osteoporozė, sisteminė skeleto „tylioji žudikė“, tapo dideliu pavojumi sveikatai, pastaraisiais metais kenčiančia daugiau nei 2000 milijonų žmonių visame pasaulyje. Jam būdingas mažas kaulų masės tankis (KMT) ir mikroarchitektūros pablogėjimas, atsirandantis dėl per didelio kaulo rezorbcijos, o ne kaulo formavimosi, ir galiausiai dėl osteoporozinio lūžio. Šiais laikais vaistų, blokuojančių osteoklastų diferenciaciją ir rezorbciją, nustatymas yra įprasta ir sėkminga terapinių vaistų nuo osteoporozės kūrimo strategija, ir iš tiesų yra daug sintetinių medžiagų, įskaitant estradiolio valeratą ir natrio alendronatą, kurie galėtųosteoporozės profilaktikai ir gydymui. Tačiau vaistai nuo ligų toli gražu nėra idealūs; kai kurie iš šių vaistų gali padidinti endometriumo ir krūties vėžio riziką, taip pat turėti tam tikrą šalutinį poveikį, pvz., hiperkalcemija, hiperkalciurija ir kt., kurie riboja jų klinikinį pritaikymą. Todėl jau daugiau nei tūkstantmetį tradiciniai kinų vaistai (TCM), ypač valgomieji TCM su izoliuotais bioaktyviais junginiais ir frakcijomis, buvo plačiai naudojami saugiai ir efektyviai Azijos šalyse, siekiant užkirsti kelią ir gydyti įvairias ligas, įskaitant osteoporozę.

NATŪRALŪS CISTANCHE TUBULOSA, SKIRTAS OSTEOPOROZĖS LIGAI GYDYTI IR PREVENCIJAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Osteoporozė apibūdinama kaip sustiprėjusi kaulų rezorbcija dėl padidėjusios osteoklastogenezės, o šis procesas apima hematopoetinių monocitų įsisavinimą į osteoklastų pirmtakus, kurie susilieja ir sudaro daugiabranduolius osteoklastus, nukreiptus į remodeliuojamas kaulų vietas [4]. Branduolinio faktoriaus-κB ligando (RANKL), pagrindinio faktoriaus, išskiriamo iš osteoblastų, receptorių aktyvatorius skatina monocitų diferenciaciją į osteoklastus [8,9]. RANKL sąveika su jo receptoriumi RANK sukelia tarpląstelinių įvykių, įskaitant NF-κB, PI3K/Akt ir nuo kalcio / kalmodulino priklausomą kinazę, kaskadą, įdarbinant adapterio signalo baltymo TNF receptorių susijusį faktorių (TRAF6). Dėl to kai kurie su osteoklastais susiję žymenų genai, įskaitant TRAP, katepsiną K ir DPD, yra reguliuojami, o kaulų rezorbcijos procesas pagreitėja.

Feniletanoidiniams glikozidams būdingos cinamono rūgšties ir hidroksilfeniletilo dalys, kurios glikozidine jungtimi yra prijungtos prie gliukopiranozės (apiozės, galaktozės, ramnozės, ksilozės ir kt.), kurios plačiai paplitusios vaistiniuose augaluose [10]. Cistanosidas A (Cis A) yra aktyvusfeniletanoido glikozidasCistanche deserticola YC Ma. Remiantis Kinijos farmakopėjos įrašais, C. deserticola tradiciškai buvo naudojama inkstų yin trūkumo, raumenų silpnumo, juosmens silpnumo ir kt. gydymui, o feniletanoidiniai glikozidai yra pagrindinės šios žolelės biologiškai aktyvios sudedamosios dalys [11]. Remiantis TCM „inkstų“ teorija, inkstai gali valdyti kaulų sistemą, o tai reiškia, kad kaulų vystymasis ir funkcijos priklauso nuo inkstų esmės, o ši inkstų esencija gali transformuotis į kaulų čiulpus, kad maitintų kaulus. skatina skeleto augimą ir taisymą bei stiprina skeletą [12]. Kadangi C. deserticola gali sustiprinti inkstus, manėme, kad Cis A gali užkirsti kelią osteoporozei ir ją gydyti. Todėl šis tyrimas buvo skirtas patvirtinti potencialąCis A užkertant kelią osteoporozeinaudojant pelių, iš kurių buvo pašalintos kiaušidės, modelį, buvo nustatyti kaulų formavimosi ir rezorbcijos žymenys bei susiję galimi mechanizmai, siekiant įvertinti šio agento antiosteoporozinį biologinį aktyvumą.

2. Rezultatai ir aptarimas

2.1. Rezultatai

2.1.1. Cis A poveikis kaulų trijų taškų lenkimo tyrimui

Norėdami išanalizuoti, ar gydymas Cis A sustiprina kaulą, šlaunikaulius atlikome trijų taškų lenkimo testu. Kaip parodyta 1 paveiksle, didžiausia apkrova, taikoma lūžus kaulams, buvo 21,5 % ir 22.0 % didesnė gyvūnams, gydytiems 20 mg/kg ir 80 mg/ kg Cis A, atitinkamai, palyginti su gyvūnais, kuriems atlikta kiaušidžių pašalinta (OVX) grupė (p < 0.05). Tuo tarpu gydymas Cis A taip pat sustiprino kaulų standumą; visų Cis A gydytų pelių standumas žymiai padidėjo – atitinkamai 121.0 ± 12,1 (p < 0,05), 124,1 ± 16,2 (p < 0,05) ir 127,7 ± 9,6 (p < 0,01). palyginti su 102,2 ± 10,7 OVX pelių. Rezultatai rodo, kad OVX pelių, gydytų Cis A, kaulų stiprumas padidėjo dėl padidėjusio kaulo kiekio ir pagerėjusios kaulų kokybės.

2.1.2. Cis A poveikis kaulų mikroarchitektūrai

Trimatė pelių trabekulinio kaulo mikroarchitektūra, išmatuota mikro-KT (2 pav. ir 1 lentelė), intuityviai rodo, kad OVX grupės pelėms, palyginti su fiktyviąja grupe, žymiai sumažėjo trabekuliarinis plotas ir trabekulų skaičius, o tai rodo, kad buvo atlikta kiaušidžių pašalinimas. gali žymiai sumažinti kaulų masės tankį (KMT, -46%), kaulų mineralų kiekį (BMC, -66%), audinių mineralų kiekį (TMC, -85%), kaulų tūrio dalį (BVF, -82%), trabekulinis skaičius (Tb. N, –76%) ir trabekulinio atsiskyrimo padidėjimas (Tb. Sp, +80%), nepakeitus bendro audinio mineralinio tankio (TMD) ir trabekulinio storio (Tb. Th) po operacija 12 savaičių. Tačiau OVX pelėms, gydytoms Cis A, nuo dozės padidėjo KMT (+43%~57%), KMC (+65%~73%), TMC (+83%~). 90%), BVF (+80%~88%), didesnis Tb sumažėjimas. Sp (−79% ~ 88%) ir dar labiau sustiprintas Tb. N (+73%~82%), palyginti su OVX grupe. Atrodė, kad TMD neturėjo įtakos kiaušidžių pašalinimas, tačiau jis žymiai padidėjo gydant estradiolio valeratu (EV).

2.1.3. Cis A poveikis kaulų formavimosi ir rezorbcijos žymenims

Cis A poveikis kaulų rezorbcijos žymenims, įskaitant TRAP, DPD, katepsino K kaulų formavimosi indeksą ALP ir kaulo Gla baltymą (BGP), parodytas 3 paveiksle. Po 12 savaičių kiaušidžių pašalinimo operacijos TRAP, DPD aktyvumas. , o katepsino K OVX grupėje žymiai padidėjo, ypač DPD, kuris padidėjo beveik 55,6 %; TRAP ir katepsinas K padidėjo atitinkamai 43,5% ir 38,1%, palyginti su fiktyviąja grupe. Cis A, vartojamas per burną 12 savaičių, parodė didelį potencialą užkirsti kelią visiems aukščiau paminėtiems kaulų rezorbcijos žymenims, ypač didelės dozės (80 mg/kg), turinčios reikšmingą poveikį DPD aktyvumui slopinti. atitinkamai 45.0%, TRAP 49.0% ir katepsinas K - 44.0% (p < 0,01), palyginti su OVX grupė (3 pav.). Nors OVX grupėje buvo įrodyta ALP ir BGP aktyvumo didėjimo tendencija, statistiškai reikšmingų pokyčių nepastebėta. Tačiau reikšmingas ALP aktyvumo pagerėjimas buvo pastebėtas mažo ir didelio Cis A gydytose grupėse, palyginti su fiktyviąja grupe (p < 0,01).

NATŪRALŪS CISTANCHE TUBULOSA OSTEOPOROZĖS LIGŲ PREVENCIJAIPHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.1.4. Cis A poveikis TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG ir RANKL baltymų ekspresijos lygiams

Western blot analizė atskleidė, kad, palyginti su fiktyviąja grupe, TRAF6, NF-κB ir RANKL baltymų kiekis OVX grupėje buvo reikšmingai padidėjęs (p < 0.05), o OPG, PI3K ir Akt žymiai sumažėjo (4 pav.). Cis A (20 mg/kg arba 80 mg/kg) reikšmingai sumažino TRAF6 ekspresiją (p < 0,05), po to sumažėjo RANKL ekspresija ir padidėjo OPG, o tai reiškia, kad OPG/RANKL santykis buvo padidintas. Todėl NF-κB signalizacijos kaskados buvo sumažintos, o PI3K / Akt buvo padidintas gydant Cis A (p < 0, 05).

2.2. Diskusija

Atsižvelgiant į dabartinių osteoporozės gydymo galimybių ribotumą, reikia alternatyvių maisto produktų ar natūralių valgomųjų vaistinių augalų. Vykdydami nuolatines pastangas atrasti veiksmingus antiosteoporozinius agentus iš TCM, radome daugybę ekstraktų, frakcijų ir junginių, kurie turi antiosteoporozinių savybių [13, 14]. Cistanche deserticola yra svarbus klasikinis TCM, kuris, kaip nustatyta, turi palankų saugumo profilį [15] ir turi plačias medicinines funkcijas gydant inkstų nepakankamumą ir kt. [16]. Remiantis TCM teorija, TCM, turintis inkstus gaivinantį poveikį, dažniausiai buvovartojamas osteoporozei gydyti; feniletanoidiniai glikozidai yra pagrindinės šios žolelės biologiškai aktyvios sudedamosios dalys, todėl tai reiškia, kadfeniletanoidiniai glikozidaiesantys C. deserticola gali turėti antiosteoporozinių savybių. Įrodyta, kad C. deserticola ekstraktas gali reikšmingai slopinti KMT sumažėjimą ir užkirsti kelią trabekulinės mikroarchitektūros pablogėjimui, kurį sukelia OVX [17]. In vitro eksperimento metu jis taip pat žymiai padidino ALP, kaulų morfogenetinį baltymą-2 ir osteopontino mRNR, taip pat kultivuotų osteoblastų kaulų mineralizaciją [18]. Echinakozidas, pagrindinis biologiškai aktyvus C. deserticola komponentas, oficialiai įrašytas į Kinijos farmakopėją [11], parodė antiosteoporozinį aktyvumą, kai buvo vartojama didelė 30–270 mg/kg kūno svorio per parą dozė [19], o kiti in vitro rezultatai parodė, kad gali skatinti kaulų regeneraciją padidindamas OPG/RANKL racioną MC3T3-E1 subklono 14 ląstelėse [20]. Cis A buvo vienas iš feniletanolio glikozidų, išskirtų iš C. deserticola, ir keli pranešimai atskleidė, kad šis junginys pasižymėjo antioksidaciniu aktyvumu [21] ir priešuždegiminėmis savybėmis [22, 23]. Neseniai paskelbtame dokumente buvo nustatyta, kad Cis A apsaugo nuo CCl4 ir alkoholio sukelto hepatotoksiškumo pelėms, taip pat parodė apsauginę savybę nuo etanolio sukeltų pažeidimų pirminiuose pelių hepatocituose in vitro [24]. Mūsų dabartinio tyrimo rezultatai parodė, kad Cis A pasižymėjo antiosteoporoziniu aktyvumu mažomis dozėmis (20–80 mg/kg kūno svorio per dieną), naudojant pelių, iš kurių buvo pašalintos kiaušidės, modelį, ir šis biologinis aktyvumas buvo pasiektas sumažinant TRAF6 lygį, slopinant RANKL ir NF-κB ekspresija ir stimuliuojantis OPG, PI3K ir Akt, o tai reiškia, kad terapinis Cis A poveikis OVX pelėms buvo per TRAF6-tarpininkaujantį NF-kappaB inaktyvavimo ir PI3K/Akt aktyvinimo mechanizmą.

Gerai žinoma, kad kiaušidžių pašalinimas gali sukelti osteoporozę, akivaizdžiai sumažėjus KMT, biomechaniniam stiprumui, kaulų kokybei ir trabekulinio kaulo mikroarchitektūrai, o minėti pokyčiai iš dalies atsiranda dėl estrogenų trūkumo [25]. Dabar, šiame in vivo eksperimente, mūsų tyrimas rodo, kad dėl kiaušidžių pašalinimo sukeltos osteoporozės žymiai sumažėjo biomechaninis stiprumas ir trabekuliniai struktūriniai parametrai, įskaitant KMT, BMC, TMC ir Tb. N ir didėjantis Tb. Sp; ir Cis A gydymas žymiai pagerino kaulų mechanines savybes, įskaitant didžiausią apkrovą ir standumą, padidino KMT ir pagerino daugumą kaulų trabekulinės mikroarchitektūros struktūrinių parametrų, palyginti su OVX grupės pelėmis, o tai rodo, kad Cis A veiksmingai pagerino kaulų kokybę. ir trabekulinė mikroarchitektūra OVX pelėse.

Be bendro KMT, trijų taškų lenkimo testas ir trabekulinio kaulo mikroarchitektūros matavimas galėjo tiesiogiai diagnozuoti osteoporozę, taip pat buvo naudojami kaulų formavimosi žymenys, įskaitant ALP ir BGP, ir kaulų rezorbcijos indeksas, įskaitant TRAP, DPD ir katepsiną K. Išsiaiškinti susijusius antiosteoporozinius Cis A mechanizmus. Mūsų tyrime ALP aktyvumas OVX grupės pelėms parodė nereikšmingą didėjimo tendenciją, o tai rodo padidėjusį kaulų apykaitos greitį [26,27] sergant osteoporoze po menopauzės; didelės (80 mg/kg kūno svorio per dieną) ir mažos (20 mg/kg kūno svorio per parą) Cis A dozės parodė reikšmingą ALP aktyvumo padidėjimą, palyginti su fiktyviąja grupe, o BGP aktyvumui įtakos neturėjo kiaušidžių pašalinimas visose gydomose grupėse; TRAP, DPD ir katepsinas K žymiai padidėjo OVX grupėje, o Cis A vartojimas žymiai sumažino visus tris kaulų rezorbcijos žymenis. Aukščiau pateikti duomenys reiškė, kad Cis A turėjo galimą antiosteoporozinį aktyvumą, o šį poveikį padarė kaulų metabolizmo reguliavimas, įskaitant kaulų rezorbcijos slopinimą ir kaulų susidarymo didinimą.

Koordinavimas tarp osteoblastų ir osteoklastų yra esminis veiksnys palaikant skeleto vientisumą. Osteoklastai, ekspresuojantys TRAP, prisitvirtina prie kaulo paviršiaus sudarydami su aktinu susijusias sandarinimo zonas, kuriose išsiskiria proteolitiniai fermentai, tokie kaip katepsinas K, todėl susidaro rezorbcijos duobės. Osteoklastogenezės moduliavimą nesubrendusios osteoblastinės linijos ląstelės skatina RANKL ir OPG [28]. OPG yra apgaulės receptorius, kuris slopina RANKL osteoklastogenezės aktyvaciją, taip sumažindamas kaulų rezorbciją. RANKL, teikiantis svarbų signalą osteoklastų pirmtakams, yra su membrana susieta naviko nekrozės faktoriaus ligandų šeimos molekulė, skatinanti osteoklastų susidarymą. Manoma, kad OPG/RANKL ekspresijos santykis yra pagrindinis osteoklastogeninio aktyvumo parametras, o RANKL aktyvuojamos signalizacijos kaskados apima NF-κB ir PI3K kelius [29]. NF-κB kelio svarbą osteoklastogenezei įrodo faktas, kad NF-κB ištrynimas pelėse lėmė subrendusių osteoklastų nebuvimą [30]. Įrodyta, kad TRAF6 yra perspektyvus naujų vaistų nuo osteoporozės tikslas. TRAF6-trūkumo turinčios pelės, kurių osteoklastogenezė buvo sutrikusi ir sunki osteopetrozė, parodė TRAF6 svarbą kaulų metabolizme. Nauji įrodymai rodo, kad RANKL / RANK tarpininkaujamose signalizacijos kaskadose yra svarbi TRAF6 reguliavimo funkcija [4,31]. Dabartinio tyrimo duomenys parodė, kad OVX pelių gydymas Cis A sumažino TRAF6 baltymų ekspresijos lygį, sumažino RANKL ir padidino OPG ekspresiją, taip užkertant kelią RANKL aktyvavimui pasroviui NF-κB ir suaktyvinant PI3K / Akt signalo kelius. leidžia manyti, kad Cis A slopina osteoklastų diferenciaciją dėl TRAF6-tarpininkaujamos NF-kappaB inaktyvacijos ir PI3K/Akt aktyvinimo bei padidina OPG/RANKL santykį, vėliau slopindama osteoklastogenezę ir skatindama kaulų formavimąsi.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA UŽANTIOSTEOPOROTINĖ VEIKLAPHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

3. Medžiagos ir metodai

3.1. Augalinės medžiagos, paruošimas ir nustatymas

Cistanche deserticola stiebaiYC Ma, identifikuotas Ningxia medicinos universiteto Farmacijos katedros prof. Xue-yan Fu, buvo surinktas rugsėjo 2015 d. Yongning grafystėje, Ningxia provincijoje, Kinijoje. Vaučerio pavyzdys (nr. 20150901) buvo išsaugotas vaistinės skyriaus herbariume. Iš viso 30,0 kg ore išdžiovintų C. deserticola stiebų 3 kartus ekstrahuota su grįžtamu šaldytuvu 70 % etanoliu (180 l, 3 × 2 val.). Filtratai buvo sujungti ir dedami į makroporinės dervos (AB-8) kolonėlę su laipsniško gradiento tirpiklių sistema, didinant etanolį vandenyje (0%, 20% ir 60%, kiekvienas po 60 l), kad gautųsi trys frakcijos, tada 60 % frakcijos buvo toliau išgryninta naudojant Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech Co., Upsala, Švedija) ir pusiau paruošiamąja didelio efektyvumo skysčių chromatografija (Agilent 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Vokietija), kad būtų gauta šviesiai geltona. cistanozido A 4,5 g (Cis A; išeiga 0,015%). Struktūra buvo išaiškinta daugiausia BMR (Bruker Avance, 400 MHz, Vokietija) ir MS spektrų (Agilent 6540, Agilent Technologies) duomenų analizėmis, kurios atitiko pateiktus duomenis [19]. Jo grynumas buvo nustatytas HPLC srities normalizavimo metodu (5 pav.). Eksperimentuose su gyvūnais, remiantis mūsų preliminariu eksperimentu, Cis A dozė buvo 20–80 mg/kg per dieną.

3.2. Cheminės medžiagos ir tirpikliai

Buvo naudojami: viso baltymo ekstrahavimo rinkiniai ir BCA baltymų kvantavimo rinkiniai (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, Nanjing, Kinija), pirminiai TRAF6, NF-κB, PI3K, Akt, RANKL, OPG, aktino ir tubulino antikūnai ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA, JAV), antriniai krienų peroksidaze konjuguoto ožkos anti-triušio IgG antikūnai (ZSGB-BIO, Pekinas, Kinija), estradiolio valeratas (1 mg, Delpharm Lille SAS, Paryžius, Prancūzija), kaulas Gla -baltymų ir deoksipiridinolino kryžminių ryšių ELISA rinkiniai (Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Šanchajus, Kinija) ir katepsino K ELISA rinkinys (Biovision, Mountain View, CA, JAV). Visos kitos naudojamos cheminės medžiagos ir biocheminės medžiagos buvo AR analitinio lygio reagentai.

3.3. Eksperimentai su gyvūnais

Šešiasdešimt 8 savaičių Kunmingo kamieno pelių patelių, kurių kūno svoris 26.0 ± 1,62 g, buvo įsigytos iš Ningxia medicinos universiteto, o 1 0 pelių buvo laikomos viename narve su standartine laboratorine dieta. ir vandentiekio vandenį kontroliuojant oru (24.0 ± 0,5 ◦C, 45%–50% drėgmė ir 12 h/12 ​​h šviesos ir tamsos apšvietimo ciklai). Aklimatizavus 1 savaitę, operacija buvo atlikta aseptinėmis sąlygomis ir visos pelės buvo anestezuotos chloro hidratu (100 mg/kg, ip); pelės, kurioms buvo atlikta operacija nepašalinus kiaušidžių, buvo fiktyvi grupė (n=10); kitiems buvo atlikta dvišalė kiaušidžių pašalinimas kaip OVX grupės (n=50). Pirmiau minėti eksperimentai su gyvūnais buvo atlikti pagal laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą ir buvo patvirtinti Ningxia medicinos universiteto Bioetikos komiteto.

Po kito {{0}}savaitės atsigavimo laikotarpio pirmiau minėtos 50 OVX pelių buvo atsitiktinai ir lygiomis dalimis suskirstytos į 5 grupes: per burną gydomos estradiolio valeratu (1 mg/kg per dieną), kaip teigiamą kontrolę (EV); su 20, 40 ir 80 mg/kg per dieną Cis A atitinkamai mažų, vidutinių ir didelių dozių grupėmis; su transporto priemone (0,5 % karboksimetilceliuliozės ()-Na) kaip modelių grupės (OVX). Visoms pelėms buvo skiriamas vienodas tūris 1 ml/100 g kūno svorio nešiklio, EV arba Cis A, kuris prasidėjo antrą savaitę po operacijos ir tęsėsi 12 savaičių. Kūno svoris buvo matuojamas kas dvi savaites, atitinkamai koreguojant dozę. Po paskutinio geriamojo vartojimo kraujo mėginiai buvo paimti iš anestezuotų pelių šlaunikaulio arterijos, jiems leista krešėti ir centrifuguoti 3000 × g 10 min., kad būtų gautas serumas; buvo išpjaustytas dešinysis šlaunikaulis ir blauzdikaulis. Visi mėginiai buvo laikomi –80 ◦C temperatūroje, kad būtų galima toliau įvertinti kaulų mikroarchitektūrą ir su osteoporoze susijusius serumo biocheminius parametrus.

3.4. Trijų taškų lenkimo bandymas

Pelės dešiniojo šlaunikaulio biomechaninė savybė buvo nustatyta naudojant trijų taškų lenkimo tvarką. Lenkimo strypas turi V formos atramą, kuri bandymo metu pritvirtina distalinius ir proksimalinius šlaunikaulio galus. Šlaunikaulis buvo išdėstytas horizontaliai, priekine puse į viršų, o apkrova buvo taikoma žemyn šlaunikaulio vidurio centre. Atstumas tarp atramų buvo 8 mm. Kaulai buvo apkrauti pastoviu poslinkio greičiu 0,02 mm/s, kol nepavyko, naudojant BOSE testavimo mašiną (3220) (Bose Corporation, Endura TEC Systems Group, Minnetonka, MN, JAV). Apkrovos ir poslinkio kreivės buvo gautos ir panaudotos apskaičiuojant konstrukcines ir medžiagų savybes, įskaitant didžiausią apkrovą, didžiausią apkrovą, tamprumo modulį, lenkimo stiprumą ir kt.

3.5. Mikrokompiuterinės tomografijos analizė

Visų pelių dešinieji šlaunikauliai buvo išvalyti nuo prilipusių minkštųjų audinių, o aukščiau nurodyto dešiniojo distalinio šlaunikaulio metafizikos trabekulinio kaulo mikroarchitektūra buvo nustatyta mikro-KT skaitytuvu (eXplore Locus SP, GE Healthcare, London, ON, Kanada) su izotropinė skiriamoji geba nustatyta 8 µm visuose trijuose erdviniuose matmenyse. Dominantis regionas (ROI) buvo parinktas naudojant tas pačias koordinates šlaunikaulio augimo plokštelėje. Kaulų morfometriniai parametrai, įskaitant KMT, kaulų mineralų kiekį (KMC), audinių mineralų kiekį (TMC), audinių mineralinį tankį (TMD), kaulų tūrio frakciją (BVF), trabekulinį atsiskyrimą (Tb. Sp), trabekulinį skaičių (Tb. N). ) ir trabekulinio storio (Tb. Th), buvo įvertinti analizuojant IG naudojant ABA kaulų analizės programinę įrangą.

3.6. Biocheminių parametrų analizė

Serumo šarminės fosfatazės (ALP) aktyvumas buvo matuojamas automatiniu analizatoriumi (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, JAV)); serumo DPD, BGP ir katepsino K lygiai buvo nustatyti atitinkamais reagentų rinkiniais, o tartratui atspari rūgštinė fosfatazė (TRAP) buvo analizuojama pagal susijusią literatūrą [32].

3.7. Western blot analizė

TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG ir RANKL baltymų ekspresijos lygiai skirtingose ​​grupėse buvo nustatyti Western blot analize. Trumpai tariant, baltymas buvo ekstrahuotas iš dešiniojo pelių blauzdikaulio, naudojant lizės buferį, kuriame yra 0,5 mM fenilmetilsulfonilfluorido, proteazės ir fosfatazės inhibitorių. Lizatai buvo centrifuguojami 10 minučių esant 12, 000 × g, kad būtų gauti supernatantai tolesnei analizei. Lizatų baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant bicinchonino rūgšties kiekybinio nustatymo testą. Baltymai (50–100 µg) buvo atskirti naudojant 10% SDS-PAGE, perkelti į polivinilideno difluorido membraną ir inkubuoti su monokloniniais pirminiais antikūnais, nukreiptais į TRAF6, NF-κB RANKL, PI3K, Akt, OPG ir -aktiną (1:500). Ta pati membrana buvo nuimta ir pakartotinai patikrinta, naudojant chemiliuminescencinius signalus, kuriuos aptiko „Image Lab“ programinė įranga. -aktinas arba tubulinas buvo vidinė kontrolė.

3.8. Statistinė analizė

Visi duomenys, gauti iš eksperimentų su gyvūnais, buvo išanalizuoti naudojant vienpusę dispersijos analizę su Dennetto testu SPSS (22 versija.0, IBM SPSS Statistics, IBM Corp., Armonk, Niujorkas, NY, JAV). ) programinė įranga; reikšmė p < 0,05 buvo laikoma statistiškai reikšminga, o visi rezultatai pateikti kaip vidurkis ± SD.

4. Išvados

Apibendrinant, Cis A,aktyvūs feniletanoidiniai glikozidaiišskirtas iš C. deserticola, pasižymėjo reikšmingu antiosteoporoziniu poveikiu OVX pelėms, o molekulinis mechanizmas gali būti susijęs su TRAF6-tarpininkaujama NF-kappaB inaktyvacija ir PI3K/Akt aktyvacija, todėl tikėtina, kad tai yra perspektyvi priemonė osteoporozei gydyti. liga.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA UŽANTIOSTEOPOROTINĖ VEIKLAPHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %