Trombomodulinas pagerina transformuojančią augimo faktoriaus b1 sukeltą lėtinę inkstų ligą per G-baltymų susietą receptorių 15 / Akt signalo kelią

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8 , Taro Yasuma1,2,8 , Kota Nishihama1 , Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2 , Toshiaki Totoki4 , Yuko Okano1,2 , Akihiro Wchida1 , Ryo Inoueang6 Valajie 7, 7 Fridmanas D'Alessandro2, Tetsu Kobayashi3, Yoshiyuki Takei4, Akira Mizoguchi5, Yutaka Yano1,9 ir Estebanas C. Gabazza2,9

1 Mie universiteto medicinos mokyklos diabeto, metabolizmo ir endokrinologijos skyrius, Tsu-city, Mie, Japonija; 2 Mie universiteto Medicinos mokyklos Imunologijos skyrius, Tsu-city, Mie, Japonija; 3 Plaučių ir kritinės sveikatos medicinos skyrius, Mie universiteto medicinos mokyklos aukštoji mokykla, Tsu-city, Mie, Japonija; 4 Gastroenterologijos ir hepatologijos katedra, Mie universiteto medicinos mokykla, Tsu-city, Mie, Japonija; 5 Neuronų regeneracijos ir ląstelių komunikacijos katedra, Mie universiteto medicinos mokykla, Tsu-city, Mie, Japonija; 6 Centrinis eksperimentinių gyvūnų institutas, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Japonija; ir 7 Nefrologijos skyrius, Taizhou ligoninė, Venžou medicinos universitetas, Lihai, Džedziango provincija, Kinijos Liaudies Respublika.

Kidney International (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Autorių teisės ª 2020, Tarptautinė nefrologijos draugija. Išleido Elsevier Inc. Tai yra atviros prieigos straipsnis pagal CC BY-NC-ND licenciją (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Korespondencija: Esteban C. Gabazza, Mie universiteto Medicinos mokyklos Imunologijos skyrius, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japonija. El. paštas: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; arba Yutaka Yano, diabetas, metabolizmas ir endokrinologija, Mie universiteto medicinos mokykla, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japonija. El. paštas: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT ir TY vienodai prisidėjo prie šio darbo. 9 YY ir EKG yra vyresnieji autoriai. Gauta 2019 m. rugsėjo 1 d.; peržiūrėta 2020 m. balandžio 24 d.; priimtas 2020 gegužės 7 d

Raktažodžiai: apoptozė; lėtinė inkstų liga; G-baltymu susietas receptorius; rekombinantinis žmogaus trombomodulinas; transformuojantis augimo faktorius-b1

Inkstų fibrozė yra dažna lėtinių inkstų ligų pasekmė, kuri nenumaldomai progresuoja iki paskutinės stadijos inkstų ligos su organų nepakankamumu, gydomu tik taikant pakaitinę terapiją. Kadangi transformuojantis augimo faktorius-b1 yra pagrindinis inkstų fibrozės patogenezės veikėjas, iškėlėme hipotezę, kad rekombinantinis trombomodulinas gali pagerinti transformuojančią augimo faktoriaus b1 sąlygojamą progresuojančią inkstų fibrozę ir nepakankamumą. Norėdami ištirti mūsų hipotezę, sukūrėme naują glomerulams būdingą žmogaus transformuojančią augimo faktoriaus b1 transgeninę pelę, kad įvertintume rekombinantinio trombomodulino terapinį poveikį. Šiai transgeninei pelei išsivystė progresuojanti glomerulų sklerozė ir tubulointersticinė fibrozė su inkstų nepakankamumu. Gydymas rekombinantiniu trombomodulinu keturias savaites reikšmingai slopino inkstų fibrozę ir pagerino organų funkciją, palyginti su negydytomis transgeninėmis pelėmis. Gydymas rekombinantiniu trombomodulinu reikšmingai slopino podocitų apoptozę ir mezenchiminę diferenciaciją, sąveikaudamas su G-baltymu susietu receptoriumi 15, kad suaktyvintų Akt signalizacijos kelią ir padidintų anti-apoptotinių baltymų, įskaitant surviviną, ekspresiją. Taigi mūsų tyrimas tvirtai rodo galimą terapinį rekombinantinio trombomodulino veiksmingumą gydantlėtinė inkstų ligair vėlesnis organų nepakankamumas.

cistanchegaligydyti inkstų ligaspagerinti inkstų funkciją

Vertimo pareiškimas

Fibrozė ir jos funkcijos sutrikimasinkstusšiuo metu yra pagrindinės sveikatos problemos visame pasaulyje. Šiuo metu nėra patvirtintų antifibrozinių vaistų, skirtų inkstų fibrozei gydyti. Transformuojantis augimo faktorius-b1 yra pagrindinis ir dažnas inkstų fibrogenezės veiksnys sergant lėtine inkstų liga, kurią sukelia daugybė sutrikimų. Čia mes nustatėme, kad rekombinantinis trombomodulinas, vaistas, patvirtintas Japonijoje, skirtas gydyti išplitusią intravaskulinę koaguliaciją, slopina glomerulų sklerozės, tubulointersticinės fibrozės ir inkstų nepakankamumo, kurį sukelia per didelė žmogaus transformuojančio augimo faktoriaus b1 ekspresija, progresavimą, o tai rodo galimą jo gydomąją vertę gydymui. apielėtinės inkstų ligos.

Lėtinė inkstų ligayra didelė visuomenės sveikatos problema, susijusi su dideliu sergamumu ir mirtingumu, kuri paveikia apie 13 procentų suaugusiųjų išsivysčiusiose šalyse.1 Pasaulio sveikatos organizacija pranešė, kadlėtinė inkstų liga(CKD) 2012 m. visame pasaulyje sukėlė 1,5 proc. mirčių.1 Be to, naujausi epidemiologiniai duomenys rodo, kad visame pasaulyje nuolat auga sergančiųjų CKD skaičius.2,3 Daugeliu atvejų patologinis procesas progresuoja laipsniškai ir galiausiai baigiasi. stadijos inkstų nepakankamumas, kuris gydomas tik taikant visą gyvenimą trunkančią dializę arba persodinant inkstą.4,5 Cukrinis diabetas (DM) ir arterinė hipertenzija yra dažniausios ŠKL priežastys, vėliau – išemija, nežinomos etiologijos glomerulosklerozė, urologinės obstrukcijos ir lėtinės infekcijos. Nepriklausomai nuo pagrindinio sutrikimo, galutinė ir dažna patologinė ŠKL pasekmė yra inkstų fibrozė.7 Inkstų fibrozė – tai nenormalus inkstų parenchiminių struktūrų, patyrusių ilgalaikį ar pasikartojantį pažeidimą, gijimas ir remodeliavimas, kuriam būdinga tubulointersticinė fibrozė, glomerulosklerozė ir kanalėlių atrofija.8 Pagrindinis inkstų fibrogenezės veiksnys yra transformuojantis augimo faktas arba (TGF)-b1.8,9 TGFb1 gali skatinti fibrozę, skatindamas ekstraląstelinės matricos baltymų sekreciją ir chemotaktinius faktorius arba fibroblastų dauginimosi faktorius, slopindamas metaloproteinazes ir skatindamas epitelio-mezenchiminį perėjimą.10 Be pagrindinės ligos gydymo. , šiuo metu nėra patvirtinto vaisto, skirto konkrečiai inkstų fibrozei gydyti.6

Trombomodulinas (TM) yra transmembraninis glikoproteinas, turintis daugybę biologinių funkcijų, įskaitant krešėjimo sistemos moduliavimą, imuninį atsaką, uždegimines reakcijas ir ląstelių išgyvenimą.11 TM molekulinėje struktūroje yra į lektiną panašus domenas, 6 į epidermio augimo faktorių panašūs domenai. , daug serino/treonino turintis domenas, transmembraninė dalis ir citoplazminė uodega.12 Trombinas, prokoaguliacinis faktorius, susidarantis krešėjimo sistemos aktyvinimo metu, prisijungęs prie TM tampa antikoaguliantu ir antifibrinoliziniu faktoriumi.13 TM-trombino kompleksas padidina generaciją. aktyvuoto baltymo C (APC), antikoagulianto, turinčio priešuždegiminį ir citoprotekcinį poveikį, aktyvindamas baltymą C. Be to, vien TM gali tiesiogiai sumažinti uždegiminį atsaką, nes slopina didelio mobilumo grupės baltymo B aktyvumą{10}} (HMGB1), slopindamas imunogenines dendritines ląsteles, eozinofilus, putliąsias ląsteles ir komplemento sistemą.13–18

Paskelbti rezultatai, rodantys prevencinį TM poveikį sergant diabetine renopatija ir išeminiu reperfuziniu inkstų pažeidimu.{1}} Tačiau jokiame tyrime nebuvo įvertintas rekombinantinės TM poveikis progresuojančiai inkstų fibrozei, kurią sukelia TGFb1, dažnas inkstų fibrozės veiksnys kelios ligos, sukeliančios ŠKL. Iškėlėme hipotezę, kad TM gali pagerinti TGFb1-sukeliamą inkstų fibrozę ir inkstų nepakankamumą. Norėdami ištirti šią hipotezę, įvertinome rekombinantinio TM terapinį poveikį naujai sukurtoje glomerulams specifinėje TGFb1 transgeninėje (TG) pelėje, kuri vystosi progresyviai.inkstų fibrozė ir inkstų nepakankamumas.

cistanche inkstams

REZULTATAI

Padidėjęs cirkuliuojančių TM fragmentų kiekis koreliuoja su inkstų funkcijos sutrikimu

TM, su endotelio ląstelių membrana susietas glikoproteinas, yra suskaidomas į fragmentus ir praranda savo apsaugines funkcijas endotelio pažeidimo metu.22 Diabetinė nefropatija yra susijusi su endotelio pažeidimu.23,24 Pacientų, sergančių DM su nefropatija, palyginti su pacientais be nefropatijos, rodikliai buvo labai dideli. cirkuliuojantys TM (4,4 ir 3,3 pg/ml) ir aktyvaus TGFb1 (0,28 ir 0,24 ng/ml) lygiai (papildoma S1 lentelė, papildomas S1A paveikslas). TM reikšmingai koreliuoja su kreatininu, aktyviu TGFb1 ir tirpiu podocinu (papildomas S1B paveikslas). Šie stebėjimai rodo, kad funkcinės membranos surišto TM praradimas yra susijęs su padidėjusiu aktyvaus TGFb1 išsiskyrimu ir inkstų funkcijos sutrikimu.

TG pelė su glomerulams būdinga viso ilgio žmogaus TGFb1 geno ekspresija

Sukūrėme TG pelę, per daug ekspresuojančią viso ilgio žmogaus TGFb1 geną podocituose. Pelė buvo sukurta žmogaus TGFb1 kontroliuojant podocino promotorių ant bakterinės dirbtinės chromosomos (BAC) konstrukcijos (papildomas S2 paveikslas; papildomas S3 paveikslas). Gavome 5 peles įkūrėjas, ekspresuojančias 3 kopijas, ir 3 įkūrėjas, išreiškiančias 1 žmogaus TGFb1 transgeno kopiją. Transgeno ekspresija buvo specifinė inkstams, o įkūrėjų palikuonys buvo gyvybingi (papildomas S3 paveikslas). Pelės pastojo visą laiką, o vados buvo normalaus dydžio. Pelės gimė laukiamu Mendelio santykiu.

Norėdami apibūdinti TG peles, išmatavome keletąinkstų parametraikas 4 savaites 16 savaičių (papildomas S4 paveikslas). TGFb1 koncentracija plazmoje ir šlapime TGFb 1- TG pelėms buvo reikšmingai padidėjusi, palyginti su laukinio tipo (WT) pelėmis nuo pirmųjų savaičių po gimimo, o tada išliko stabili ir aukšta (1a pav.). TGFb1-TG pelėms nustatytas reikšmingas hidroksiprolino inkstų audinio kiekio padidėjimas 20-ą savaitę (190.5, palyginti su 96.0 mg inkstuose). ), mezangijaus išsiplėtimas nuo 4-osios savaitės (1,9 balo ir 1,1 balo) ir kolageno nusėdimas nuo 12-osios savaitės (0,9 proc., palyginti su 0,1 proc.) po gimimo, palyginti su jų WT analogais (1a–f pav. ). Įprasta optinė mikroskopija parodė Bowman kapsulės pamatinės membranos išsiplėtimą, glomerulų bazinės membranos sustorėjimą, padidėjusį kolageno nusėdimą mezangialinėse ir intersticinėse erdvėse ir kanalėlių atrofiją (1bd pav.). Perdavimo elektronų mikroskopija parodė glomerulosklerozę, įskaitant podocitų mikrovillinę transformaciją ir pėdos proceso išnykimą, sumažėjusią glomerulų kapiliarų endotelio fenestraciją, glomerulų bazinės membranos sustorėjimą ir padidėjusį mezangialinės matricos nusėdimą (2a – i pav.). Ankstyvųjų nefropatijos žymenų, riebalų rūgštis surišančių baltymų, koncentracijos šlapime (185,1 vs. 87,0 pg/ml) irinkstų pažeidimas1 molekulė (441,9 ir 256,9 pg/ml) buvo žymiai sustiprinta TGFb1-TG pelėms atitinkamai nuo 4 ir 8 savaičių amžiaus, palyginti su jų amžių atitinkančiomis WT pelėmis (papildomas S5 paveikslas). Bendra proteinurija ir bendras baltymų ir kreatinino santykis šlapime žymiai padidėjo 4, 8, 12, 16 ir 2 0 TGFb1-TG pelių savaitę, palyginti su jų WT atitikmenimis (3a pav.). . TGFb1-TG pelių karbamido azoto kiekis plazmoje buvo reikšmingai padidėjęs nuo 4-osios savaitės (5,1 ir 4,1 mg/dl), o kreatinino koncentracija nuo 8-osios savaitės (1,1 ir 0,4 mg/dl). palyginti su jų WT kolegomis (3b pav.).

rhTM slopina glomerulosklerozę ir tubulointersticinę fibrozę

Lyginant su TGFb{0}}TG pelėmis, gydomomis fiziologiniu tirpalu (SAL) ir WT pelėmis, gydomomis rekombinantiniu žmogaus (RH) TM arba SAL, TGFb1-TG pelėms, gydomoms ritmu, žymiai sumažėjo mezangialas. išsiplėtimas / ląsteliškumas (1,3, palyginti su 3.{{30}} balas) ir labai mažas kanalėlių intersticinis kolageno nusėdimas ir glomerulosklerozė (121,3 proc., palyginti su 139,7 proc.) (4a–e pav.). Remiantis šiais stebėjimais, hidroksiprolino kiekis (11,7 ir 19,9 mg/g), kolageno I (101,3 ir 196,7 ng/mg baltymo) ir periostino (21,7 ir 40,8 ng/g) koncentracijos inkstų audiniuose. mg baltymo), o santykinė kolageno I mRNR ekspresija reikšmingai sumažėjo TGFb1-TG pelių, gydytų rhTM, inkstų audiniuose, palyginti su kontrolinių pelių inkstų audiniais (4f pav., S2 ir S3 papildomos lentelės). Perdavimo elektronų mikroskopija parodė, kad pelių, gydytų rhTM, žymiai sumažėjo podocitų pėdų išnykimas ir glomerulų bazinės membranos sustorėjimas, palyginti su pelėmis, gydomomis vien SAL (papildomas paveikslas S6AB ir B). Be to, profibrotinių citokinų monocitų chemoattraktanto baltymo -1 (45,0 ir 76,1 pg/mg baltymo), interleukino-13 (612,1 ir 1002,0 pg/mg baltymo) ir aktyvaus TGFb1 koncentracijos inkstų audiniuose. (131,0 ir 151,5 pg/mg baltymo) buvo žymiai sumažintas TGFb1-TG pelėms, gydomoms rhTM, palyginti su kontrolinėmis pelėmis (papildomas S7 paveikslas). HMGB1 koncentracija inkstų audiniuose taip pat reikšmingai sumažėjo TGFb1-TG pelių, gydytų rhTM, inkstų audiniuose, palyginti suinkstų audiniaiiš kontrolinių pelių (papildomas S7 paveikslas). Trombino antitrombino komplekso koncentracija plazmoje buvo reikšmingai padidėjusi TGFb1-TG/SAL grupėje, palyginti su WT/SAL grupe, tačiau skirtumo tarp TGFb1-TG/rhTM ir WT/rhTM grupių nenustatyta. (papildomas paveikslas S8A). Kaip ir tikėtasi, TGFb1-TG ir WT pelių, gydytų rhTM, plazmoje buvo didelė TM koncentracija. APC/antitripsino komplekso koncentracija plazmoje buvo žymiai mažesnė TGFb1-TG/SAL grupėje, palyginti su WT/SAL ir TGFb1-TG/rhTM grupėmis (280,5 ir 384,6 pg/ml). , ir nebuvo reikšmingo plazminogeno aktyvatoriaus inhibitoriaus -1 lygio skirtumo (papildomas S8A paveikslas). C5a kiekis plazmoje, šlapime irinkstų audinys(630.1, palyginti su 1075,0 pg/mg baltymo) ir plazmoje tirpaus podocino kiekis buvo reikšmingai mažesnis TGFb1-TG pelėms, gydomoms rhTM, palyginti su TGFb1-TG pelėmis, gydytomis SAL. (papildomas paveikslas S8B). Podocino kiekis šlapime buvo didesnis TGFb1-TG/SAL grupėje nei WT/SAL ir TGFb1-TG/rhTM grupėse (papildomas paveikslas S9A–C).

1 pav|Žmogaus transformuojančio augimo faktoriaus b1 (TGFb1) transgeninei (TG) pelei išsivysto progresuojanti inkstų fibrozė. a ) TGFb1 baltymo koncentracijos plazmoje ir šlapime buvo išmatuotos fermento imuniniu tyrimu, o audinių hidroksiprolino kiekis - kolorimetriniu tyrimu. (b–d) Inkstų audinio pjūviai buvo nudažyti (b) periodine rūgštimi-Schiff (stulpeliai ¼ 20 mm) ir (c, d) Masson trichromu (stulpeliai ¼ 10{{ 40}} mm), o po to (e, f) kiekybiškai įvertinta naudojant balų sistemą arba „WinROOF“ vaizdo gavimo programinę įrangą („Mitani Corporation“, Tokijas, Japonija). Pelių skaičius inkstų audinių vertinimui: laukinio tipo (WT) pelėms, n ¼ 4 po 4, 12 ir 20 savaičių; TG pelėms – n ¼ 7 po 4 savaičių, n ¼ 8 – 16 savaičių ir n ¼ 9 – 20 savaičių amžiaus. Pelių skaičius plazmai ir šlapimui įvertinti: WT pelėms n ¼ 12 po 4 savaičių, n ¼ 8 po 8 savaičių, n ¼ 7 po 12 savaičių ir n ¼ 4 po 16 ir 20 savaičių; TG pelėms n ¼ 24 po 4 savaičių, n ¼ 17 po 8 ir 12 savaičių ir n ¼ 9 po 16 ir 20 savaičių. Duomenys išreiškiami kaip vidutinis tarpkvartilinis diapazonas. Statistinė analizė Mann-Whitney U testu. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****p="">< 0,0001.="" ns,="" nereikšminga.="" norėdami="" optimizuoti="" šio="" vaizdo="" peržiūrą,="" žr.="" šio="" straipsnio="" internetinę="" versiją="" adresu="">

2 pav|Transformuojančio augimo faktoriaus b1 sukeltos inkstų fibrozės modelio perdavimo elektronų mikroskopiniai radiniai. Inkstų fiksavimas, tvarkymas ir pašalinimas iš pelių buvo atlikti taip, kaip aprašyta metoduose. (a,b) Podocitų mikrovillinė transformacija ir (a,b,d,e,g) pėdos proceso išnykimas (baltos rodyklės), (c–e) sumažėjęs glomerulų kapiliarų endotelio išsidėstymas (geltonos rodyklės), (f) sustorėjimas yra glomerulų bazinė membrana (žvaigždutės) ir (h,i) padidėjęs mezangialinės matricos nusėdimas (baltos rodyklės). CL, kapiliarų spindis. Norėdami optimizuoti šio vaizdo peržiūrą, žr. šio straipsnio internetinę versiją adresu www.kidney-international.org.

rhTM pagerina inkstų funkciją

L-riebalų rūgštis surišančio baltymo kiekis (197.0 palyginti su 313,4 pg/ml),inkstų pažeidimo molekulė1 (299,9 ir 596,2 pg/ml), kraujyje šlapalo azoto (12,9 ir 34,8 mg/dl), kreatinino (0,5 ir 1,4 mg/dl) bei albumino ir kreatinino santykis buvo žymiai sumažėjęs. TGFb1-TG pelės, sergančios inkstų fibroze, gydomos rhTM, palyginti su negydytomis TG pelėmis (5 pav.). Bendras baltymų kiekis šlapime ir viso baltymo kreatinino santykis taip pat sumažėjo TGFb1-TG pelėms, gydomoms rhTM, palyginti su negydytomis jų kolegomis (5 pav.).

rhTM sumažina glomerulų ląstelių apoptozę

Galutinis deoksinukleotidiltransferazės sukeltas dUTP slapyvardžio galų žymėjimo dažymas parodė, kad TGFb1-TG pelių, gydytų rhTM, glomeruluose žymiai sumažėjo apoptozinių ląstelių skaičius, palyginti su TGFb1- TG pelių, gydytų SAL (papildomas) glomerulais. S10A ir B pav.). Kaspazės{5}} skilimas taip pat buvo reikšmingai sumažintas TGFb1-TG pelių, gydytų rhTM, inkstų audiniuose, palyginti su inkstų audiniais iš TGFb1-TG pelių, gydytų SAL (papildomas S10C paveikslas). Theinkstų audiniaiiš TGFb1-TG pelių, gydytų rhTM, lyginant su TGFb1-TG, gydytų SAL, nustatytas reikšmingas B ląstelių limfomos 2 (Bcl-2), B mRNR lygio padidėjimas. - ląstelių limfoma – itin didelė (Bcl-XL), bakulovirusinis apoptozės kartojimo inhibitorius, turintis 5 (BIRC5, taip pat žinomas kaip survivinas) ir BIRC6 (Apollon) su padidintu Bcl-2–Bax santykiu (papildomas S11 paveikslas). ).

3 pav|Žmogaus transformuojančio augimo faktoriaus b1 (TGFb1) transgeninės (TG) pelės inkstų funkcija sutrikusi. (a) Bendras baltymų ir (b) kraujo karbamido azotas (BUN) buvo matuojamas kolorimetriniais metodais, o kreatininas - fermentiniu metodu. Pelių skaičius plazmai ir šlapimui įvertinti: laukinio tipo (WT) pelėms, n ¼ 12 po 4 savaičių, n=7 po 8 ir 12 savaičių ir n=4 po 16 ir 2{ {21}} sav.; TG pelėms n =24 po 4 savaičių, n=17 po 8 ir 12 savaičių ir n=9 po 16 ir 20 sav. Duomenys išreiškiami kaip mediana ± interkvartilis diapazonas. Statistinė analizė Mann-Whitney U testu. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****="" p=""><>

rhTM slopina podocitų apoptozę

Išankstinis podocitų apdorojimas rhTM reikšmingai sumažino podocitų, kultivuotų dalyvaujant TGFb1, apoptozę, įvertintą pagal subG1 fazės ląstelių skaičių (3,2 proc., palyginti su 5,2 proc.), galinės deoksinukleotidiltransferazės sukeltos dUTP slapyvardžio pabaigos ląstelės (teigiamos ląstelės). 1.0 ir 5,4 ląstelės / Fifield) ir kaspazės-3 skilimo laipsnis (0,9 ir 1,1 santykis) (6a–e pav.). Antiapoptotinių faktorių atranka auginamuose podocituose parodė, kad rhTM žymiai padidina antiapopotinio faktoriaus Bcl -2 mRNR ekspresiją, palyginti su ekspresija neapdorotose ląstelėse (papildomas S12 paveikslas). Antiapoptotinio faktoriaus BIRC5 mRNR ekspresija taip pat padidėjo ląstelėse, apdorotose rhTM, palyginti su ekspresija neapdorotose ląstelėse (papildomas S12 paveikslas). Proapoptotinio faktoriaus Bax mRNR ekspresija buvo žymiai sumažinta gydant rhTM, palyginti su negydymu (papildomas S12 paveikslas). Gydymas rhTM taip pat reikšmingai slopino aneksino V ekspresiją ir galinio deoksinukleotidiltransferazės sukeltą dUTP slapyvardžio galų žymėjimą podocituose, auginamuose esant vandenilio peroksidui (papildomas S13A – E paveikslas) ir esant didelei gliukozės koncentracijai (papildomas – E paveikslas S14A). ) dar labiau patvirtina antiapoptotinę rhTM savybę podocituose. Antiapoptozinio baltymo kinazės B (Akt) kelio tyrimas parodė, kad rhTM sustiprino Akt fosforilinimą žmogaus pirminiuose podocituose, auginamuose esant vandenilio peroksidui arba TGFb1 (papildomas S15A ir B paveikslas). Tada mes išskyrėme podocitus iš kiekvienos pelių grupės ir įvertinome Akt fosforilinimą Western blot metodu. Podocituose, išskirtuose iš TGFb{{30}}TG/rhTM grupės, Akt fosforilinimas žymiai sustiprėjo, palyginti su podocitais iš neapdorotos grupės (santykis 1,1 ir 0,7) (papildomas S16A ir B paveikslas).

GPR15 tarpininkavimas

Ankstesni tyrimai pranešė, kad TM aktyvuoja tarpląstelinius kelius, sąveikaudamas su fibroblastų augimo faktoriaus receptoriumi 1 (FGFR1) irG-baltymu susietas receptorius15 (GPR15).26,27 Podocitai ekspresuoja FGFR128, bet neaišku, ar jie ekspresuoja GPR15. Čia išskyrėme podocitus iš kiekvienos pelių grupės ir parodėme, kad podocitai taip pat išreiškia GPR15 (papildomas paveikslas S17A – E). Mes nustatėme, kad podocitai iš sveikos kontrolės ir paciento, sergančio glomeruloskleroze, taip pat išreiškia GPR15 (papildomas S18 paveikslas). Norėdami išsiaiškinti, ar FGFR1 arba GPR15 tarpininkauja rhTM slopinamajam aktyvumui podocitų apoptozei, įvertinome rhTM antiapopotinį aktyvumą TGFb{12}}gydytuose podocituose esant FGFR1 inhibitoriui arba po ląstelių transfekavimo maža trukdančia RNR (siRNR). prieš FGFR1 arba GPR15. Išankstinis podocitų apdorojimas FGFR1 inhibitoriumi (papildomi S19A ir B paveikslai) arba FGFR1 siRNR (13,2 proc., palyginti su 7,9 proc.) (7a ir b paveikslai) negalėjo panaikinti rhTM slopinamojo aktyvumo podocitų apoptozei. Tačiau ląstelių transfekcija GPR15 siRNR visiškai panaikino rhTM slopinamąjį aktyvumą (14,6 proc., palyginti su 13,8 proc.)podocitų apoptozė(7a–c pav.).

4 pav|Rekombinantinis žmogaus trombomodulinas (rhTM) slopina glomerulosklerozę ir tubulointersticinę fibrozę. Inkstų audinio sekcijos buvo nudažytos (a, b) periodine rūgštimi-Schiff ir (c, d) su Masson trichrome ir (e) tada kiekybiškai įvertintos naudojant balų sistemą arba WinROOF vaizdo gavimo programinę įrangą. (e) Laukinio tipo (WT) / fiziologinio tirpalo (SAL) grupės vidutinė vertė buvo 100 proc. Statistinė analizė Mann-Whitney U testu. (f) Audinių hidroksiprolino kiekis buvo matuojamas kolorimetriniu metodu, kolageno I-a1 (Col1a1) ir periostino koncentracija buvo išmatuota fermento imunologiniu tyrimu, o mRNR ekspresija - atvirkštinės transkriptazės-polimerazės grandinine reakcija. Statistinė analizė Kruskal Wallis dispersijos analizė ir pataisytas Dunn testas. n=8 kiekvienoje grupėje. Strypai {{10}} (a,c) 50 mm ir (d) 20 mm. Duomenys išreiškiami kaip mediana ± interkvartilis diapazonas. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001.="" tg,="" transgeninis;="" tgfb1,="" transformuojantis="" augimo="" faktorius="" b1.="" norėdami="" optimizuoti="" šio="" vaizdo="" peržiūrą,="" žr.="" šio="" straipsnio="" internetinę="" versiją="" adresu="">

rhTM slopina podocitų EMT

TGFb1-TG/SAL pelėms, palyginti su TGFb1-TG, žymiai padidėjo podocino ir a-lygiųjų raumenų aktino (a-SMA) dažymas (1,4 proc., palyginti su 11,2 proc.). / rhTM pelėms (8a ir b pav.). Tada mes kultivavome in vitro pirminius žmogaus podocitus, iš anksto apdorotus rhTM, prieš pridėdami TGFb1 baltymą į auginimo terpę. Į fibroblastus panaši morfologija ir sustiprinta a-SMA ekspresija buvo slopinama podocituose, apdorotuose rhTM, palyginti su neapdorotomis ląstelėmis (papildomas paveikslas S20A). Be to, rhTM slopino fibronektino ir vimentino mRNR ekspresiją, nors padidino E-kadherino mRNR ekspresiją podocituose, palyginti su ekspresija neapdorotose ląstelėse (papildomas paveikslas S20B). SMAD šeimos nariai 2 (Smad2) ir Smad3 vaidina svarbų vaidmenį TGFb1-tarpininkaujant epitelio-mezenchiminiam perėjimui (EMT).29 Gydymas rhTM reikšmingai slopino Smad2 ir Smad3 aktyvavimą TGFb1-TG pelėse. palyginti su neapdorotomis TG pelėmis (8c pav.) ir žmogaus podocitais, auginamais esant TGFb1 (papildomas S20C paveikslas).29 TG pelėms, gydomoms rhTM (TGFb1-TG/rhTM), taip pat pasireiškia mažesnė a-SMA ekspresija. (3,7 proc., palyginti su 17,2 proc.) kanalėlių epitelio ląstelėse, palyginti su jų negydytomis kolegomis (papildomi paveikslai S21A ir B).

5 pav|Rekombinantinis žmogaus trombomodulinas (rhTM) pagerina inkstų pažeidimą ir inkstų funkcijos sutrikimą. Kreatininas buvo matuojamas fermentiniu metodu; bendras baltymas kolorimetriniu metodu; ir kraujo šlapalo azotas (BUN) ir albuminas, inkstų pažeidimo molekulė 1 (KIM-1), L-riebalų rūgštis surišantis baltymas (L-FABP) ir bendras transformuojantis augimo faktorius b1 (TGFb1) naudojant fermentinį imuninį tyrimą. n=8 kiekvienoje grupėje. Duomenys išreiškiami kaip mediana±interkvartilis diapazonas. Statistinė analizė pagal Kruskal-Wallis dispersinę analizę ir nekoreguotą Dunn testą. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****="" p="">< 0,0001,="" #p="0.06." ns,="" nereikšminga;="" sal,="" fiziologinis="" tirpalas;="" tg,="" transgeninis;="" wt,="" laukinis="">

GPR15 tarpininkauja slopinančiam rhTM aktyvumą EMT

Podocitų transfekcija su FGFR1 siRNR negalėjo panaikinti rhTM slopinamojo aktyvumo tiek kolageno I-a1, tiek a-SMA santykinei mRNR ekspresijai TGFb 1- apdorotuose podocituose (papildomas S22 paveikslas). Tačiau ląstelių transfekcija GPR15 siRNR reikšmingai panaikino rhTM slopinamąjį aktyvumą tiek kolageno I-a1, tiek a-SMA santykinei mRNR ekspresijai TGFb{10}}apdorotuose podocituose (papildomas S22 paveikslas).

DISKUSIJA

TGFb1 ir glomerulų ląstelių pažeidimas

Dažna sutrikimų, sukeliančių ŠKL, pasekmė yra inkstų fibrozė.8,30,31 TGFb1 yra dažnas su ŠKL sukeliamos inkstų fibrogenezės variklis, kurį sukelia ligos, įskaitant DM, arterinę hipertenziją ir autoimuninius sutrikimus.10 Ląstelės iš glomerulų ir tubulointersticinių erdvių. gali išskirti latentines TGFb1 formas, kurios, pernelyg suaktyvinus audinių pažeidimo metu, gali sukelti inkstų randus.32 Kadangi TGFb1 gali stimuliuoti savo sekreciją, fibrozinis procesas paprastai tampa užburtu ratu.8 Ankstyvas patogeninio TGFb proceso įvykis. 1- tarpininkavoinkstų fibrozėyra podocitų ir glomerulų endotelio ląstelių pažeidimas.33–35 Tirpiojo TM lygis plazmoje yra endotelio pažeidimo žymuo. Atsižvelgiant į TGFb1 vaidmenį inkstų ląstelių pažeidime, čia mes nustatėme reikšmingą aktyvaus TGFb1 koreliaciją su tirpiu TM, tirpiu podocinu ir kreatininu pacientų, sergančių DM, plazmoje. Kryžminimas tarp glomerulų endotelio ląstelių ir podocitų per ainkstų pažeidimassukelia vietinę proteazių ekspresiją, sukeliančią glomerulų bazinės membranos degradaciją.34–36 Tai gali paaiškinti tirpaus podocino aptikimą ir reikšmingą jo koreliaciją su tirpia TM mūsų pacientams, sergantiems DM.

6 pav|Rekombinantinis žmogaus trombomodulinas (rhTM) slopina podocitų apoptozę, kurią sukelia transformuojantis augimo faktorius b1 (TGFb1). (a) rhTM buvo pridėta prie podocitų auginimo terpės 1 valandą prieš sukeldama apoptozę 10 ng/ml TGFb1 48 valandas. (b) Ląstelių procentas subG1 fazėje buvo aptiktas kolegų citometrija. (a,b) n=3 kiekvienoje grupėje. (c, d) Ląstelių su DNR suskaidymu skaičius buvo išmatuotas naudojant terminalo deoksinukleotidiltransferazės sukeltą dUTP slapyvardžio žymėjimo (TUNEL) analizę (n=3 fiziologinio tirpalo [SAL]/SAL ir rhTM/SAL grupėse; n=6 SAL/TGFb1 ir rhTM/TGFb1 grupėse) ir (e) kaspazės-3 skilimo laipsnis buvo išmatuotas Western blot metodu (n=4 kiekvienoje grupėje). Strypai=100 mm. Duomenys išreiškiami kaip mediana ± interkvartilis diapazonas. Statistinė analizė Mann-Whitney U testu. *P < 0,05.="" dapi,="" 40,="" 6-diamidino-2-fenilindolas;="" hpf,="" didelio="" galingumo="" laukas;="" ns,="" nereikšminga.="" histogramos="" rodomos="" procentais="" maks="" (procentais="" nuo="" didžiausios="" vertės),="" kiekvienai="" kreivei="" mastelio="" keitimas="" į="" režimą="100" proc.="" norėdami="" optimizuoti="" šio="" vaizdo="" peržiūrą,="" žr.="" šio="" straipsnio="" internetinę="" versiją="" adresu="">

Podocitų specifinė žmogaus TGFb1 ekspresija, susijusi su inkstų fibroze

Vaistas, galintis neutralizuoti TGFb1 poveikį, būtų idealus inkstų fibrozės blokavimui. Čia mes sukūrėme TG pelę, per daug ekspresuojančią žmogaus TGFb1 geną glomeruluose, kuriai išsivysto spontaniška ir progresuojanti glomerulų sklerozė ir tubulointersticinė fibrozė su inkstų nepakankamumu jau praėjus 4 savaitėms po gimimo. Modelis rodo pažengusią glomerulopatiją su podocitų ir glomerulų endotelio ląstelių pažeidimu; glomerulų bazinės membranos sustorėjimas ir mezangialinis išsiplėtimas su intersticiniais randais; padidėję inkstų audinio pažeidimo ir inkstų funkcijos sutrikimo žymenys; ir padidėjęs TGFb1 plazmoje,inkstų audinys, ir šlapimas. Baltymų, TGFb1, išskyrimo su šlapimu padidėjimas ir komplemento sistemos aktyvacija gali paaiškinti tuo pat metu vykstantį intersticinių randų vystymąsi mūsų dabartiniame modelyje.37–40 Tolesni eksperimentai atskleidė, kad inkstų audinyje iš neapdoroto TGFb{ yra padidėjęs apoptozinių ląstelių skaičius ir Smad baltymų aktyvacija. {3}}TG pelės, palyginti su WT pelėmis. Apskritai šios išvados rodo, kad ši nauja TGFb1-TG pelė yra tinkamas modelis vaistams atrastiinkstų fibrozė.

7 pav|G-baltymu susietas receptorius (GPR15) tarpininkauja apoptozės rekombinantinio žmogaus trombomodulino (rhTM) slopinimui podocituose. Žmogaus pirminės podocitų ląstelės buvo transfekuotos fibroblastų augimo faktoriaus receptoriaus 1 (FGFR1) maža trukdančia RNR (siRNR), GPR15 siRNR arba sumaišyta siRNR 48 valandas, o po to rhTM buvo pridėta prie ląstelių kultūros 1 valandą prieš apdorojimą transformuojančiu augimo faktoriumi b1. (TGFb1). Apoptotinės ląstelės buvo (a) įvertintos kolegų citometrija ir (b) tada kiekybiškai įvertintos. c ) Ląstelių lizatai buvo paruošti Western blotting. n{{10}} kiekvienoje grupėje. Duomenys išreiškiami kaip mediana ± interkvartilis diapazonas. Statistinė analizė Mann-Whitney U testu. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="" fiziologinis="">

8 pav|Epitelio-mezenchiminio perėjimo slopinimas rekombinantiniu žmogaus trombomodulinu (rhTM). a ) Podocinas ir lygiųjų raumenų aktinas (a-SMA) buvo nudažyti, kaip aprašyta metoduose. (b) Plotas, kuriame teigiamas a-SMA dažymas, buvo kiekybiškai įvertintas „WinROOF“ vaizdo apdorojimo programine įranga. n=3 laukinio tipo (WT)/fiziologinio tirpalo (SAL) ir WT/rhTM grupėse ir n=5transformuojantis augimo faktorius-b1-transgeninis(TGFb{{0}}TG)/SAL ir TGFb1-TG/rhTM grupės. (c) Bendras (t) ir fosforilintas (p) SMAD šeimos narių (Smad) baltymų kiekis buvo įvertintas Western blot metodu. n=8 kiekvienoje grupėje. Duomenys išreiškiami kaip mediana ± interkvartilis diapazonas. Statistinė analizė pagal Kruskal-Wallis dispersinę analizę ir pataisytą Dunn testą. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0,08." norėdami="" optimizuoti="" šio="" vaizdo="" peržiūrą,="" žr.="" šio="" straipsnio="" internetinę="" versiją="" adresu="">

rhTM palengvina inkstų fibrozę

Mes parodėme, kad rhTM palengvina plaučių fibrozę, susidariusią pelėms, kurios plaučiuose per daug ekspresuoja žmogaus TGFb1, nes slopina alveolių epitelio ląstelių apoptozę.41 Klinikiniai tyrimai taip pat parodė idiopatinės plaučių fibrozės pagerėjimą po gydymo rhTM. organų fibrozės gydymui. Iškėlėme hipotezę, kad rhTM būtų veiksmingas sergant TGFb{4}} susijusia inkstų fibroze. Norėdami patikrinti šią hipotezę, inkstams specifines TGFb1-TG peles gydėme rhTM.44 Vartodami rhTM 4 savaites, reikšmingai susilpnino inkstų pažeidimą, disfunkciją ir fibrozę. Pelėms, gydytoms rhTM, šlapime buvo mažas bendro baltymo, albumino, TGFb1, C5a kiekis ir sumažėjęs profibrotinių citokinų, C5a ir HMGB1, kiekis inkstuose.45 Gydymas rhTM taip pat slopino ir podocitų apoptozę, ir EMT. Tačiau rhTM nepadarė jokio poveikio trombino antitrombino kompleksui, krešėjimo aktyvinimo žymeniui, nors padidino APC, antikoaguliacinio faktoriaus, turinčio priešuždegiminį ir antiapoptotinį poveikį, susidarymą.23 Verta paminėti, kad trombinas, prokoaguliantas fermentas, gali paradoksaliai skatina antikoaguliaciją esant žemo laipsnio protrombozinėms būsenoms, sudarydamas TM / trombino kompleksą, kuris padidina antikoagulianto APC susidarymą. Tačiau trombinas daugiausia veikia kaip prokoaguliantas esant pernelyg didelėms protrombozinėms būsenoms (pvz., sepsiui).46 Šis dvigubas ir paradoksalus trombino poveikis gali paaiškinti akivaizdų rhTM neveiksmingumą slopinti krešėjimo aktyvavimą mūsų modelyje, kuris yra žemo laipsnio protrombozinės būklės. . Apskritai šie stebėjimai rodo, kad rhTM palengvina progresuojančią fibrozę irinkstusprailginant glomerulų ląstelių EMT išgyvenimą arba užkertant kelią EMT ir slopinant uždegimą, komplemento aktyvaciją ir augimo faktoriaus aktyvumą tiesiogiai arba netiesiogiai aktyvinant C baltymo kelią ir sumažinant HMGB1 ekspresiją. Diabetinės nefropatijos pagerėjimas pelėms, turinčioms padidėjusį cirkuliuojantį TM lektino tipo domeną, ir ligos pablogėjimas pelėms, kurioms trūksta į lektiną panašaus domeno, patvirtina teigiamą rhTM poveikį inkstų fibrozei.20,21

Podocitų apoptozės slopinimas

Podocitai atlieka svarbų vaidmenį palaikant glomerulų filtracijos barjerą ir formuojant plyšinę diafragmą, kad būtų išvengta būtinų cirkuliuojančių baltymų praradimo.Inkstų pažeidimassukeltas reaktyviųjų deguonies rūšių, didelio gliukozės kiekio ar uždegiminių mediatorių, įskaitant TGFb1, sukelia podocitų apoptozę, dėl kurios sumažėja podocitų kiekis, kuris galiausiai gali sukelti inkstų funkcijos sutrikimą.47 Sujungus ir suaktyvinus serino/treonino kinazės transmembraninį heteromerinį I ir II tipo receptorių kompleksą , TGFb1 skleidžia intraląstelinius signalus per Smad transkripcijos faktorių šeimą arba per nuo Smad nepriklausomus signalizacijos kelius.48 Nuo Smad priklausomo kelio aktyvacija įvyksta, kai aktyvuotas TGFb1 receptorius fosforilina Smad2 ir Smad3, kurie kartu su Smad4 persikelia į branduolį.49 Smad2/ Smad3/Smad4 kompleksas stimuliuoja proapoptotinių faktorių transkripciją ir sumažina antiapopotinių faktorių, sukeliančių ląstelių apoptozę, transkripciją.49 Atsižvelgiant į tai, mes nustatėme aukštą proapoptotinio faktoriaus Bax lygį inkstuose ir žemą antiapopotinių faktorių Bcl2 ir Bcl-XL lygį. TGFb1- TG pelėse. TM gali slopinti skirtingų ląstelių tipų apoptozę.21,41,49 Atsižvelgiant į tai, čia mes nustatėme, kad rhTM slopina podocitų apoptozę, kurią sukelia vandenilio peroksidas, didelis gliukozės kiekis arba TGFb1, ir šis atradimas gali paaiškinti teigiamą rhTM poveikį sergant CKD. . Be to, rhTM pakreipė pusiausvyrą apoptozės slopinimo link, sumažindamas Bax ekspresiją, padidindamas Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 ir BIRC6 ekspresiją ir padidindamas Akt kelio aktyvavimą.inkstų audiniai. Apskritai šie stebėjimai rodo, kad rhTM skatina podocitų išgyvenimą, skatindamas Akt aktyvaciją ir antiapopotinio faktoriaus ekspresiją.

cistanche nuo lėtinės inkstų ligos

EMT slopinimas

Podocitų EMT taip pat prisideda prie inkstų fibrozės. Podocitai, kuriems atliekama EMT, išskiria ekstraląstelinės matricos baltymus, kurie kaupiasi ir nusėda su TGFb{0}}susijusios inkstų fibrogenezės metu.50 TGFb1 skatina EMT per receptorių sukeltą Smad2/Smad3/Smad4 komplekso aktyvavimą. Fosforilintas Smad3 skatina EMT, skatindamas matricos baltymų transkripciją ir sumažindamas epitelio žymenų ekspresiją.51 Atsižvelgiant į tai, mes nustatėme padidėjusį podocitų EMT TGFb1-TG pelėse ir podocituose, auginamuose esant TGFb1 arba mažesniam kiekiui. oksiduojančios arba didelės gliukozės sąlygos. Ankstesnėse ataskaitose buvo teigiama, kad rhTM slopina EMT.52,53 Čia mes nustatėme, kad rhTM slopina podocitų ir tubulointersticinių epitelio ląstelių EMT TGFb1-TG pelėse. Atrodo, kad Smad baltymų aktyvacijos slopinimas yra teigiamo rhTM poveikio EMT mechanizmas, nes TGFb1-TG pelėms ir pirminiams podocitams, apdorotiems rhTM, buvo pavaizduotas žymiai sumažintas Smad2 ir Smad3 fosforilinimas, palyginti su negydytomis sąlygomis. Šie atradimai patvirtina slopinamąjį TM aktyvumą EMT.

Receptorių tarpininkavimas rhTM apsauginėje veikloje

Ankstesni tyrimai parodė, kad GPR15 arba FGFR1 tarpininkauja citoprotekciniam TM.26,27,54 aktyvumui. Mes išbandėme, ar šie receptoriai tarpininkauja apsauginiam rhTM aktyvumui nuo apoptozės ir EMT. Nors siRNR sumažintas GPR15 baltymo reguliavimas, visiškai panaikino rhTM slopinamąjį aktyvumą TGFb1-sukeltai podocitų apoptozei, nei FGFR1 siRNR, nei jos inhibitorius jo nepanaikino, o tai rodo, kad GPR15 tarpininkauja rhTM apsauginiam aktyvumui. Po gydymo rhTM buvo sustiprintas Akt fosforilinimas kultivuotuose podocituose ir podocituose, išskirtuose iš TGFb1-TG pelių, o tai rodo, kad dalyvauja tarpląstelinis Akt kelias. Darbas, rodantis, kad rhTM aktyvuoja Akt kelią endotelio ląstelėse, patvirtina šią išvadą.55 Akt signalizacijos kelio aktyvinimas gali dar labiau sustiprinti rhTM efektą, padidindamas GPR15 paviršiaus ekspresiją.56 Šie stebėjimai rodo, kad rhTM apsaugo podocitus nuo apoptozės mūsų TGFb{ {13}}TG pelės, aktyvindamos GPR15/Akt ašį, dėl to pagerėja antiapoptotinių faktorių ekspresija ir sumažėja proapoptotinių faktorių ekspresija.57 Kita vertus, ankstesni tyrimai parodė, kad anafilatoksinai C3a ir C5a per savo GPR gali prisidėti prie CKD pažeidžiant podocitus ir kad APC gali slopinti podocitų apoptozę ir inkstų fibrozę per savo endotelio baltymo C receptorius ir proteazės aktyvuotus receptorius 1.23,58–61 Čia mes nustatėme, kad rhTM slopina komplemento sistemą ir padidina APC susidarymą. Todėl, be GPR15/Akt kelio aktyvavimo, komplemento faktorių slopinimas ir padidėjęs baltymo C bei jo receptorių aktyvavimas taip pat gali paaiškinti teigiamą rhTM poveikį su mūsų TGFb{25}}inkstų fibrozės modelis.

Be to, GPR15, bet ne FGFR1, reguliavimas blokavo slopinamąjį rhTM poveikį EMT, o tai rodo, kad GPR15 taip pat tarpininkauja šiam rhTM apsauginiam aktyvumui. Smad baltymų slopinimas yra susijęs su EMT slopinimu, nes gydymas rhTM slopino Smad2 ir Smad3 fosforilinimą TGFb1-TG pelėse ir kultivuotuose podocituose. Tačiau tikslus Smad baltymų slopinimo per GPR15 mechanizmas yra neaiškus. Kai kurie įrodymai rodo, kad Akt kelias gali susijungti su Smad signalizacijos keliu ir jį reguliuoti, 62–64 ir kad Akt gali užkirsti kelią Smad3 fosforilinimui, tiesiogiai sąveikaudamas su nefosforilintu Smad3, kad atskirtų jį už branduolio, o tai slopina transkripciją ir EMT. 64 Remiantis šiomis ataskaitomis, galima įsivaizduoti, kad Akt, suaktyvintas po rhTM prisijungimo prie GPR15, išskiria nefosforilintą Smad3, dėl kurio atsiranda podocitų EMT slopinimas. Verta paminėti, kad šis Akt sukeltas teigiamas poveikis pastebimas tik nepiktybinėse ląstelėse.65–67 Piktybinėse ląstelėse TGFb1 sąveika su jo receptoriais gali tiesiogiai suaktyvinti fosfoinozitido 3-kinazės/Akt/sraigės kelią ir sukelti EMT.65–67 Apskritai mūsų tyrimo rezultatai patvirtina GPR15, kaip receptoriaus, tarpininkaujančio teigiamam rhTM poveikiui podocitams, vaidmenį.

Išvada

Apibendrinant, čia pirmą kartą pranešame apie naują transgeninę TG pelę, kuri per daug išreiškia viso žmogaus TGFb1 geno ilgį, būtent glomeruluose, kuriuose išsivysto spontaniška ir progresuojanti glomerulų sklerozė, tubulointersticinė fibrozė irinkstų nepakankamumas, ir nustatytos inkstų fibrozės / inkstų nepakankamumo pagerinimas rhTM sąveika su GPR15, kuris slopina podocitų apoptozę ir mezenchiminį perėjimą.

METODAI

TGFb1 BAC TG pelės generavimas

TGFb1-BAC-TG pelė, ekspresuojanti viso ilgio žmogaus TGFb1 geną, kontroliuojant pelės podocino promotorių, buvo sukurta pronukleariniu būdu įpurškiant į 392 C57BL/6J pelių embrionus (CLEA Japan, Inc., Tokijas, Japonija). Mes įvertinome BAC TG konstrukcijos TG įkūrėjus ir lytinių ląstelių perdavimą Southern blot būdu (papildomos medžiagos ir metodai).

Eksperimentiniai gyvūnai

Prieš naudojant eksperimentuose, TGFb1-TG pelės buvo veisiamos daugiau nei 10 kartų C57BL/6 fone. WT vados draugai buvo naudojami kaip kontroliniai gyvūnai. Visi gyvūnai buvo laikomi konkrečioje aplinkoje, kurioje nėra patogenų, ir jiems buvo taikomas 12-valandų šviesos-tamsos ciklas, esant aplinkos temperatūrai ir drėgmei nuo 22 laipsnių iki 26 laipsnių ir 40 procentų iki 70 procentų, o prieiga prie ad libitum į maistą ir vandenį Mie universiteto gyvūnų namuose (papildomos medžiagos ir metodai).

Etinis pareiškimas

Rekombinantinės DNR eksperimento saugos komitetas (patvirtinimo Nr. I-629; data: 2013 m. rugsėjo 19 d.) ir Mie universiteto Gyvūnų tyrimų komitetas (patvirtinimo Nr. 27-4; data: 2015 m. rugpjūčio 19 d.) patvirtino tyrimo protokolus. Visos procedūros su gyvūnais buvo atliktos pagal Mie universiteto institucines gaires ir laikantis tarptautiniu mastu patvirtintų laboratorinių gyvūnų priežiūros principų, paskelbtų Nacionalinio sveikatos instituto (//olaw.nih.gov/).

Klinikiniam tyrimui visi pacientai ir sveiki tiriamieji davė raštišką sutikimą, o tyrimo protokolą patvirtino Mie universiteto klinikinių tyrimų etikos komitetas (patvirtinimo Nr. 1043 ir 2194).

Eksperimentinis dizainas

Norėdami apibūdintiinkstasFibrozės modelio TGFb{{0}}TG pelių patinus (n=24) ir WT pelių patinus (n=12) 4 savaičių amžiaus ir sveriančias nuo 20 iki 23 g paskirstėme į 3 grupėse su 8 TGF b1-TG pelėmis ir 4 WT pelėmis kiekvienoje grupėje. Pelės iš kiekvienos WT ir TGFb1-TG grupės buvo eutanazuotos 0, 8 arba 16 savaitę, kad būtų paimti šlapimo, kraujo ir inkstų mėginiai, siekiant įvertinti fibrozės ir inkstų funkcijos parametrų pokyčius laikui bėgant.

Norint įvertinti rhTM terapinį efektyvumą (rhTM maloniai suteikė Asahi Kasei Pharma Corporation, Tokijas, Japonija) sergant inkstų fibroze, TGFb1-TG pelėms (n= 8) arba WT vados draugams (n {{2) }}) buvo gydomi rhTM (3 mg/kg) ip injekcijomis 3 kartus per savaitę 4 savaites prieš žudant peles. TGFb1-TG pelės (n =8) arba WT vados (n= 8), gavusios vienodą kiekį fiziologinio SAL ip injekcijomis, buvo naudojamos kaip neigiamos kontrolės pelės.

Šio tyrimo protokolas buvo parengtas pagal gyvūnų tyrimų gaires: In vivo eksperimentų ataskaitų teikimas (ARRIVE). Pelės buvo suskirstytos atsitiktinai, o tyrėjai, kurie matavo parametrus, buvo apakinti nuo gydymo grupių.

Biocheminė analizė

Bendro baltymo (BCA baltymų tyrimo rinkinys; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Mineapolis, MN), monocitų chemoattraktanto baltymo -1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), trombino antitrombino komplekso koncentracijos (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Kanada) buvo išmatuoti naudojant komercinius fermentų imunologinio tyrimo rinkinius pagal gamintojo instrukcijas (papildomos medžiagos ir metodai).

Ląstelių kultūros

Žmogaus podocitų pirminės ląstelės buvo įsigytos iš CELPR OGEN (Torrance, CA). Žmogaus podocitų pirminės ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje drėgnoje 5 procentų CO2 atmosferoje 37 laipsnių temperatūroje. Terpė buvo papildyta 10 procentų karščiu inaktyvuotu galvijų vaisiaus serumu (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 TV/ml penicilino, 100 mg/ml streptomicino ir L-glutamino (papildomos medžiagos ir metodai).

Statistinė analizė

Duomenys išreiškiami kaip mediana±interkvartilis diapazonas. Statistinis skirtumas tarp kintamųjų buvo apskaičiuotas Kruskal-Wallis dispersijos analize su post hoc analize, naudojant Dunn testą. Mann-Whitney U testas buvo naudojamas įvertinti skirtumus tarp 2 grupių. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant GraphPad Prism 8 versiją.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). Statistinis reikšmingumas buvo laikomas P <>

ATSKLEIDIMAS

EKG, CND-G ir YY turi TGFb1-TG pelės patentą suinkstų fibrozėnaudojamas šiame tyrime. CND-G ir YY gavo Japonijos švietimo, kultūros, sporto, mokslo ir technologijų ministerijos dotaciją šiam tyrimui. EKG, TY, CND-G ir MT gavo „Shionogi Pharmaceuticals“ dotaciją. Visi kiti autoriai nedeklaravo konkuruojančių interesų.

PADĖKA

Šis tyrimas iš dalies buvo paremtas Japonijos švietimo, kultūros, sporto, mokslo ir technologijų ministerijos dotacijomis (Kakenhi Nr. 17K09824 YY; Kakenhi Nr. 17K08442 CND-G), o iš dalies - Shionogi dotacija. & Co, Ltd., Japonija. Finansuotojai neturėjo jokio vaidmens kuriant tyrimą, analizuojant duomenis, priimant sprendimą publikuoti ar rengiant rankraštį.

Dalis šio darbo buvo paskelbta abstrakčia forma.

AUTORIŲ INSTRUKCIJA

AT parengė ligos modelį ir parašė pirmąjį rankraščio juodraštį. TY, KN, TT, RI ir CND-G parengė ligos modelius ir išmatavo parametrus. AM ir SW atliko perdavimo mikroskopinį tyrimą. MT, YO ir AU išmatavo parametrus ir atliko in vitro eksperimentus. YT, LQ, TK ir VFD suteikė intelektualinį indėlį. YY ir EKG pataisė rankraščio juodraštį ir suplanavo tyrimą.

cistanche inkstų nepakankamumo simptomams gydyti

PAPILDOMA MEDŽIAGA

Papildomo failo (PDF) papildomos medžiagos ir metodai.

S1 lentelė. Tiriamųjų charakteristikos.

S2 lentelė. Pelių audinių RT-PGR pradmenys.

S3 lentelė. Žmogaus podocitų RT-PGR pradmenys.

S1 paveikslas. Tirpūs trombomodulino fragmentai koreliuoja su TGFb1 ir kreatininu pacientams, sergantiems DM.

S2 paveikslas. Žmogaus TGFb1 – bakterinės dirbtinės chromosomos (BAC) konstrukcija. S3 pav. Pelės įkūrėjos, ekspresuojančios viso žmogaus TGFb1 geno ilgį.

S4 pav. Glomerulams būdingos transformuojančios augimo faktoriaus b1 transgeninės pelės apibūdinimas.

S5 pav. Žmogaus TGFb1 transgeninė pelė padidino inkstų pažeidimo žymenis.

S6 pav. Gydymas rekombinantiniu žmogaus trombomodulinu (rhTM) sumažina podocitų išnykimą pėdoje ir glomerulų bazinės membranos sustorėjimą.

S7 pav. TGFb1 transgeninės pelės, gydomos rekombinantiniu žmogaus trombomodulinu (rhTM), turi mažą profibrozinių faktorių ir HMGB1 koncentraciją inkstų audinyje. S8 pav. Gydymas rekombinantiniu žmogaus trombomodulinu (rhTM) padidina aktyvuoto baltymo C susidarymą, slopina komplemento sistemą, sumažina cirkuliuojančio tirpaus podocino kiekį, nors nedaro jokio poveikio TGFb1 transgeninių pelių krešėjimo sistemai.

S9 pav. Gydymas rekombinantiniu žmogaus trombomodulinu (rhTM) sumažina podocino koncentraciją šlapime.

S10 pav. Gydymas rekombinantiniu žmogaus trombomodulinu (rhTM) sumažina glomerulų ląstelių apoptozę.

S11 pav. Inkstų fibrozės, susijusios su TGFb1- per didele ekspresija, gydymas rekombinantiniu žmogaus trombomodulinu (rhTM) slopina apoptozę inkstų audinyje.

S12 pav. Rekombinantinis žmogaus trombomodulinas (rhTM) padidina antiapoptotinių faktorių ekspresiją podocituose.

S13 pav. Rekombinantinis žmogaus trombomodulinas (rhTM) slopina vandenilio peroksido sukeltą podocitų apoptozę.

S14 pav. Rekombinantinis žmogaus trombomodulinas (rhTM) slopina podocitų apoptozę, kurią sukelia didelis gliukozės kiekis.

S15 pav. Rekombinantinis žmogaus trombomodulinas (rhTM) padidina Akt kelių aktyvavimą podocituose.

S16 pav. Gydymas rekombinantiniu žmogaus trombomodulinu (rhTM) padidina Akt fosforilinimą podocituose iš TGFb1-TG pelių.

S17 pav. Kiekvienos pelių gydymo grupės podocitai ekspresuoja GPR15 mRNR.

S18 pav. GPR15 dažymas podocituose iš sveiko asmens ir paciento, sergančio židinine segmentine glomeruloskleroze.

S19 pav. Fibroblastų augimo faktoriaus receptorius{1}} nedalyvauja slopinant rekombinantinio žmogaus trombomodulino (rhTM) aktyvumą podocituose.

S20 pav. Rekombinantinis žmogaus trombomodulinas (rhTM) slopina podocitų epitelio-mezenchiminį perėjimą.

S21 pav. Gydymas rekombinantiniu žmogaus trombomodulinu (rhTM) slopina a-lygiųjų raumenų aktino ekspresiją inkstų kanalėliuose.

S22 pav. G-baltymu susietas receptorius (GPR15) tarpininkauja rekombinantinio žmogaus trombomodulino (rhTM) slopinamajam aktyvumui podocitų epitelio-mezenchiminiam perėjimui.

Papildomos nuorodos.

NUORODOS

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL ir kt. Lėtinė inkstų liga. Lancetas. 2017;389:1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M ir kt. Pasaulinės inkstų sveikatos priežiūros būklės įvertinimas. JAMA. 2017;317:1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J ir kt. Pasaulinė inkstų sveikata 2017 m. ir vėliau: priežiūros, tyrimų ir politikos spragų panaikinimo planas. Lancetas. 2017;390:1888–1917.

4. Ackland P. Lėtinės inkstų ligos paplitimas, nustatymas, įvertinimas ir gydymas. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK ir kt. Lėtinės inkstų ligos gydymas. Kidney Int. 2012;81:351–362.

6. Breyer MD, Susztak K. Naujos kartos vaistai nuo lėtinės inkstų ligos. Nat Rev narkotikų diskas. 2016;15:568–588.

7. Liu Y. Inkstų fibrozė: naujos patogenezės ir gydymo įžvalgos. Kidney Int. 2006;69:213–217.

8. Liu Y. Ląsteliniai ir molekuliniai inkstų fibrozės mechanizmai. Nat Rev Nephrol. 2011;7:684–696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K ir kt. Sumažinti endotelio TGF-beta signalizaciją pakanka endotelio-mezenchiminiam perėjimui ir fibrozei sumažinti sergant CKD. J Am Soc Nephrol. 2015;26:817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE ir kt. TGF-beta1 / p53 signalizacija inkstų fibrogenezėje. Mobilusis signalas. 2018;43:1–10.

11. Conway EM. Trombomodulinas ir jo vaidmuo uždegime. Semino imunopatolis. 2012;34:107–125.

12. Martinas FA, Murphy RP, Cummins PM. Trombomodulinas ir kraujagyslių endotelis: funkcinių, reguliavimo ir terapinių aspektų įžvalga. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. Trombomodulinas susieja krešėjimą su uždegimu ir imunitetu. Curr narkotikų taikiniai. 2012;13:421–431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN ir kt. Trombomodulinas slopina eozinofilų ir putliųjų ląstelių aktyvaciją. Ląstelių imunolis. 2015;293:34–40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M ir kt. Alerginės bronchinės astmos slopinimą trombomodulinu skatina dendritinės ląstelės. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Dual modulating functions of thrombomodulin in the alternative komplement pathway. Biosci tendencijos. 2016;10:231–234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T ir kt. Trombomodulinas moduliuoja dendritines ląsteles per didelio mobilumo grupės baltymo B1 antagonizmą ir nepriklausomą mechanizmą. Allergol Int. 2014;63:57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A ir kt. Į lektiną panašus trombomodulino domenas trukdo aktyvuoti komplementą ir apsaugo nuo artrito. J Thromb Haemost. 2006;4:1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT ir kt. Tirpusis trombomodulinas apsaugo išeminius inkstus. J Am Soc Nephrol. 2009;20:524–534.

20. Wang H, Vinnikovas I, Shahzad K ir kt. Į lektiną panašus trombomodulino domenas pagerina diabetinę glomerulopatiją slopindamas komplementą. Thromb Haemost. 2012;108:1141–1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL ir kt. 1 trombomodulino domenas pagerina diabetinę nefropatiją pelėms per anti-NF-kappaB / NLRP3 uždegiminį uždegimą, sustiprindamas NRF2 antioksidacinį aktyvumą ir slopindamas apoptozę. Diabetologija. 2014;57:424–434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Tirpus trombomodulino aktyvumas ir tirpaus trombomodulino antigenas plazmoje. J Thromb Haemost. 2005;3: 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M ir kt. Egzogeninis aktyvuotas baltymas C slopina diabetinės nefropatijos progresavimą. J Thromb Haemost. 2012;10:337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN ir kt. Cukrinio diabeto pagerinimas baltymu S. Diabetas. 2016;65:1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Apoptozė ir ūminis inkstų pažeidimas. Kidney Int. 2011;80:29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK ir kt. FGFR1 tarpininkauja rekombinantinio trombomodulino domeno sukeltai angiogenezei. Cardiovasc Res. 2015;105:107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S ir kt. Penktasis į epidermio augimo faktorių panašus trombomodulino regionas sušvelnina LPS sukeltą sepsį sąveikaudamas su GPR15. Thromb Haemost. 2017; 117:570–579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W ir kt. Podocitų citoskeletams būtinų genų genomo identifikavimas, pagrįstas vienos ląstelės RNR sekos nustatymu. Kidney Int. 2017;92:1119–1129.

29. Vigolo E, Marko L, Hinze C ir kt. Kanoninis BMP signalizavimas kanalėlių ląstelėse tarpininkauja atsigavimui po ūminio inkstų pažeidimo. Kidney Int. 2019;95:108–122.

30. Nangaku M. Lėtinė hipoksija ir tubulointersticinis pažeidimas: paskutinis bendras kelias iki paskutinės stadijos inkstų nepakankamumo. J Am Soc Nephrol. 2006;17: 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Lėtinė inkstų liga ir jos komplikacijos. Pirminė priežiūra. 2008;35:329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA ir kt. Fibrozinės matricos baltymų ir transformuojančių augimo faktoriaus beta (TGF-beta) izoformų ekspresija inkstuose TGF-beta transgeninėse pelėse. J Am Soc Nephrol. 1999;10:271–280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P ir kt. Motorinis baltymas Myo1c reguliuoja transformuojančius augimo faktoriaus beta signalus ir fifibrozę podocituose. Kidney Int. 2019;96:139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L ir kt. Endotelino receptorius-A tarpininkauja glomerulų endotelio paviršiaus sluoksnio skilimui per patologinį susikirtimą tarp aktyvuotų podocitų ir glomerulų endotelio ląstelių. Kidney Int. 2019;96:957–970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY ir kt. Glomerulų endotelio ląstelių pažeidimas ir kryžminis pokalbis sergant diabetine inkstų liga. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F287– F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA ir kt. Modifikuota skenuojanti elektroninė mikroskopija atskleidžia patologinį endotelio ląstelių ir podocitų susikirtimą membranoproliferacinio glomerulonefrito pelių modelyje. Sci Rep. 2018;8:10276.

37. Abate M, Zoja C, Rottoli D ir kt. Proksimalinės kanalėlių ląstelės skatina fifibrogenezę TGF-beta{2}}tarpininkaujant peritubulinių miofifibroblastų indukcijai. Kidney Int. 2002;61:2066–2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL ir kt. Inkstų kanalėlių pažeidimas: lėtinės inkstų ligos varomoji jėga. Kidney Int. 2018;93:568–579.

39. Loefflfler I, Wolf G. Transformuojantis augimo faktorius-beta ir inkstų ligos progresavimas. Nephrol Dial transplantacija. 2014;29 (1 priedas):i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S ir kt. Šlapimą transformuojantis augimo faktorius-beta pacientams, sergantiems glomerulų ligomis. Pediatr Nephrol. 1997;11:334–336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H ir kt. Ląstelių apoptozės slopinimas ir plaučių fibrozės pagerinimas trombomodulinu. Esu J Patholas. 2017;187:2312–2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y ir kt. Rekombinantinis žmogaus trombomodulinas ūminiam idiopatinės plaučių fibrozės paūmėjimui. Krūtinė. 2015;148:436–443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T ir kt. Trombomodulinas ūminiam idiopatinės plaučių fibrozės paūmėjimui: koncepcijos tyrimo įrodymas. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233–240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Optimalus pacientų pasirinkimas sepsio gydymui antikoaguliantais: įrodymais pagrįstas pasiūlymas iš Japonijos. J Thromb Haemost. 2018;16:462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X ir kt. Didelio mobilumo grupės 1 dėžutės (HMGB1) vaidmuo inkstų ligų patogenezėje. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T ir kt. Nuo dozės priklausomas skirtingas trombino poveikis alerginei bronchinei astmai. J Thromb Haemost. 2013;11:1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL ir kt. Naujos įžvalgos apie podocitų biologiją glomerulų sveikatai ir ligoms. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Nuo Smad priklausomi ir nuo Smad nepriklausomi TGF-beta šeimos signalizacijos keliai. Gamta. 2003;425:577–584.

49. Schuster N, Krieglstein K. TGF-beta-medijuojamos apoptozės mechanizmai. Cell Tissue Res. 2002;307:1–14.

50. Greka A, Mundel P. Ląstelių biologija ir podocitų patologija. Annu Rev Physiol. 2012;74:299–323.

51. Isaka Y. Taikymas TGF-beta signalizacijai sergant inkstų fibroze. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK ir kt. Trombomodulinas įtakoja pacientų, sergančių nemetastazavusiu gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu, išgyvenamumą per epitelio-mezenchiminį perėjimą (EMT). PLoS One. 2016;11:e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B ir kt. Trombomodulinas sumažina navikogeninį ir metastazinį plaučių vėžio ląstelių potencialą padidindamas E-kadherino reguliavimą ir sumažindamas N-kadherino ekspresiją. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C ir kt. G-baltymu susietas receptorius 15 tarpininkauja angiogenezei ir trombomodulino citoprotekcinei funkcijai. Sci Rep. 2017;7:692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH ir kt. Rekombinantinis trombomodulinas daro anti-autofaginį poveikį endotelio ląstelėse ir suteikia anti-aterosklerozės poveikį pelėms, kurioms trūksta apolipoproteino E. Sci Rep. 2017; 7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B ir kt. PI3K/Akt signalizacijos tarpininkaujama baltymo paviršiaus ekspresija, pajunta 14-3-3 sąveikaujančiu motyvu. FEB J. 2009;276:5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. Dvigubas TGF-beta1 vaidmuo apoptozėje. Citokinų augimo faktoriaus peržiūra, 2005; 16:15–34.

58. Griffifin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Aktyvuotas baltymas C, proteazės aktyvuotas receptorius 1 ir neuroprotekcija. Kraujas. 2018;132:159–169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T ir kt. Aktyvuotas baltymas C apsaugo nuo diabetinės nefropatijos, slopindamas endotelio ir podocitų apoptozę. Nat Med. 2007;13:1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO ir kt. Anafilatoksinų vaidmuo sveikatai ir ligoms. Mol Immunol. 2009;46:2753–2766.

61. Morigi M, Perico L, Corna D ir kt. C3a receptorių blokada apsaugo podocitus nuo sužalojimų sergant diabetine nefropatija. JCI įžvalga. 2020;5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA ir kt. Akt tiesiogiai sąveikauja su Smad3, kad reguliuotų jautrumą TGF-beta sukeltai apoptozei. Nat Cell Biol. 2004;6:366–372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Signalizacijos kelio bendradarbiavimas TGF-beta sukeltame epitelio-mezenchiminiame perėjime. Curr Opin Cell Biol. 2014;31:56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB / Akt moduliuoja TGF-beta signalizaciją per tiesioginę sąveiką su Smad3. Nat Cell Biol. 2004;6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N ir kt. TGF-beta skatina PI3K-AKT signalizaciją ir prostatos vėžio ląstelių migraciją per TRAF6-tarpininkaujantį p85alfa ubiquitiliavimą. Mokslinis signalas. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z ir kt. Akt signalizacijos dichotomijos poveikis krūties vėžiui. Mol Vėžys. 2012;11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S ir kt. FAM83A signalizacija sukelia epitelio mezenchiminį perėjimą PI3K / AKT / Sraigės keliu NSCLC. Senėjimas (Albanis, NY). 2019;11:6069–6088.