Ištirti Cur-indukuotos autofagijos poveikį CBMSC senėjimui

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

2.5. Autofagijos inovolai, naudojant apsauginį Cur poveikį cBMSC senėjimo metu

Norint ištirti Cur sukeltos autofagijos poveikį cBMSC senėjimui, autofagijos lygis buvo moduliuojamas naudojant RAP (200 nM) arba 3-MA (5 mM).3-MA daro reikšmingą slopinamąjį poveikį. dėl autofaginio aktyvumo, pasireiškiančio reikšmingu su mikrotubulu susijusio baltymo 1 lengvosios grandinės 3 (LC3), su autofagija susijusio geno (ATG)7, ATG12 ir unc51-panašios į autofagiją aktyvinančios kinazės mRNR ekspresijos reguliavimu. {14}}(ULK1); sumažėjęs su mikrotubuliais susijusio baltymo 1 lengvosios grandinės 3 tipo Ⅱ/I (LC3-I/I) ekspresijos santykis; ir padidėjusi p62 ekspresija, palyginti su kontroline grupe (5A, B pav.). Atitinkamai, palyginti su Cur grupe, autofaginio aktyvumo sumažėjimas buvo pastebėtas 3-MA ir Cur grupėje (5A, B pav.). Priešingai, autofaginio aktyvumo padidėjimas buvo pastebėtas RAP grupėje, kaip rodo padidinta LC3, ATG12 ir ATG7 mRNR ekspresija; padidėjęs LC3-I konvertavimas į LC3-II; ir p62 degradacija (5A, B pav.).

Pirma, autofaginis aktyvumas buvo sistemingai tiriamas. Autofaginių vakuolių (taip pat vadinamų autofagosomomis) susidarymas buvo įvertintas morfologiniu stebėjimu ir rezultatai parodė, kad Cur grupėje ir RAP grupėje buvo daugiau autofaginių vakuolių ir LC3 taškų, palyginti su kontroline grupe, o autofaginių vakuolių skaičius sumažėjo ir mažiau LC3 taškų buvo pastebėta 3-MA ir 3-MA plius Cur grupėse (5C pav., E). Be to, LysoTracker dažymas parodė, kad lizosomų rūgštėjimas buvo sustiprintas RAP ir Cur cBMSC ir sumažėjo grupės 3-MA ir 3-MA plus Cur (5D pav.). Rezultatai rodo, kad Cur ir RAP daro panašų teigiamą poveikį autofagijos aktyvacijai ir kad autofaginį aktyvumą slopina 3-MA.cistanche varpos dydis,Tačiau 3-MA slopinamąjį poveikį autofagijai galima iš dalies išgelbėti naudojant Cur.

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

Norėdami patvirtinti, ar autofagija dalyvauja reguliuojant CB MSc senėjimą, toliau tyrėme su senėjimu susijusius fenotipus, skatindami arba slopindami autofagiją farmakologiniu gydymu. Rezultatai parodė, kad Cur ir RAP grupėse buvo mažesnis SA- -gal-teigiamų ląstelių skaičius, o padidėjęs SA- -gal-teigiamų ląstelių skaičius {{5} }MA grupė, palyginti su kontroline grupe. Pažymėtina, kad SA- -gal-teigiamų ląstelių skaičius žymiai padidėjo 3-MA plius Cur grupėje, palyginti su Cur grupe (pav.). RT-qPCR analizės rezultatai parodė, kad gydymas RAP ir Cur padidino SOX-2 ir Nanog ekspresijos lygį ir sumažino IL-6, TNF-a, p21 ir p16 ekspresijos lygį. su kontroline grupe. Tačiau autofagijos slopinimas 3-MA padidino p16, p21, TNF- ir IL-6 ekspresiją (6C-E pav.). Be to, palyginti su kontroline grupe, cBMSC kolonijų formavimo efektyvumas buvo padidintas Cur ir RAP grupėse, o CFU-F skaičius ir dydis žymiai sumažėjo 3-MA grupėje. Be to, buvo parodyta, kad sustiprintas Cur poveikis kolonijas formuojančių cBMSC skaičiui gali būti panaikintas iš anksto kondicionuojant 3-MA (6B pav.).cistanche milteliaiŠie įrodymai rodo, kad RAP ir Cur gali pagerinti cBMSC senėjimą, o 3-MA apsunkina cBMSC senėjimą ir susilpnina Cur daromą teigiamą poveikį.

Visi šie rezultatai rodo, kad autofagijos slopinimas naudojant 3-MA pagreitina cBMSC senėjimą, o autofagijos aktyvinimas naudojant Cur ir RAP sumažina cBMSC senėjimą (6F pav.). Pažymėtina, kad Cur sukeliamas apsauginis poveikis buvo susilpnintas iš anksto apdorojant 3-MA (6F pav.), o tai rodo, kad Cur sukelta autofagija yra galimas molekulinis mechanizmas, padedantis pagerinti cBMSC senėjimą.

3. Diskusija

Organizmai nuolat taiso sužalotus audinius ir lėtina su senėjimu susijusius procesus dėl išskirtinių funkcinių MSC savybių, kurios plačiai gyvena įvairiuose audiniuose ir organuose [15]. Deja, amžius ir liga yra pagrindiniai MSC senėjimo in vivo veiksniai, o vidiniai ir išoriniai ląstelių aplinkos skirtumai pagreitina MSC senėjimą in vitro kultūroje, o tai abu neigiamai veikia jų imunosupresijos, diferenciacijos ir migracijos gebėjimą, galiausiai sumažindami savęs veiksmingumą. -remontas ir transplantacija MSC [7,14,49-51].cistanche salsos ekstraktasOja ir kolegos nurodė, kad žmogaus BMSC nustojo daugintis nuo penkto iki devintojo klinikinio laipsnio kultūrų perėjimo ir pasižymėjo tipiniais senėjimo fenotipais, tokiais kaip hipertrofinė ir plokščia morfologija, ląstelių ciklo kinazės inhibitorių p16 ir p21 aktyvacija, sumažėjęs proliferacijos greitis. , ir sustiprintas SA- -gal [52] aktyvumas. Akivaizdu, kad plėtra in vitro neišvengiamai sukelia priešlaikinį senėjimo atsiradimą MSC, kurie laikomi svarbia ląstelių senėjimo tyrimų in vitro modelio sistema [42, A4, A5]. Mūsų dabartiniame tyrime nustatyta, kad cBMSC prieš 3-ąjį perėjimą turėjo vienodą morfologiją, tačiau buvo pastebėta, kad po 6-ojo pasėjimo įvyko daugybė ląstelių morfologijos, fiziologijos ir genų ekspresijos pokyčių (2 ir 7 paveikslai), atitinkantys priešlaikinį senėjimą. .

Cistanche gali kovoti su senėjimu

Vis daugiau įrodymų rodo, kad farmakologinė stimuliacija yra perspektyvus būdas išgelbėti MSC nuo senėjimo [53, 54]. Atsižvelgiant į tai, daugelis natūralių ir sintetinių junginių buvo plačiai ištirti, siekiant nustatyti jų priešuždegiminį, antioksidacinį ir senėjimą stabdantį potencialą in vivo ir in vitro [15,55]. Kaip natūraliai atsirandantis fenolio junginys, Cur sulaukė didelio dėmesio dėl savo teigiamo poveikio MSC biologijai [36,37,56,57]. Tačiau prieš atliekant įvairius biomedicininius tyrimus reikia atidžiai apsvarstyti sudėtingą Cur poveikio poveikį MSC. Yang ir jo kolegos pranešė, kad didelės Cur koncentracijos (50 ir 100 uM) gali sukelti ūmų toksinį poveikį žmogaus BMSC in vitro, o nuolatinis 10 uM Cur poveikis (7 d.) slopina žmogaus BMSC proliferaciją ir sukelia ląstelių apoptozę [58]. Įdomu tai, kad kitas tyrimas parodė, kad gydymas Cur<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

Pastaruoju metu buvo plačiai pranešta apie Cur biologinį aktyvumą įvairiuose in vitro arba in vivo modeliuose, ypač kalbant apie MSC biologinių savybių moduliavimą. Cur anti-senėjimo aktyvumas buvo dažnai aptariamas, ir buvo nustatyta, kad Cur turi teigiamą poveikį senėjimui ir su amžiumi susijusioms ligoms organizmo ir ląstelių lygiu. Tačiau jo reguliavimo mechanizmas yra sudėtingas dėl skirtingų Cur dozių ir formų, taip pat dėl ​​senėjimo mechanizmo [19]. Kaip pagrindinis tarpląstelinis molekulių skilimo ir organelių apykaitos mechanizmas, autofagija atlieka svarbų vaidmenį apsaugant MSC nuo streso sąlygų ir palaikant ląstelių homeostazę. Manoma, kad autofagijos moduliavimas yra nauja strategija MSC funkcijoms pagerinti [59]. Remiantis reikšmingų tyrimų duomenimis, autofagijos skatinimas arba slopinimas Cur įvairiuose ląstelių modeliuose turi patenkinamą citoprotekcinį poveikį [38-40].cistanche stiebasMūsų duomenys parodė, kad po Cur poveikio buvo pastebėtas padidėjęs autofaginis aktyvumas, kaip nustatyta su autofagija susijusių genų (LC3, ULK1, Atg7 ir Atg12) reguliavimu, LC3-II generavimu, padidėjusiu autofaginės vakuolės ir rūgštinės vezikulinės organelės bei reikšmingas p62 baltymo lygio sumažėjimas (4 pav.). Be to, lizosoma yra laikoma nepakeičiama autofagijos organele, o lizosomų pH sutrikimas ir vakuolinio H plius -ATPazės (v-ATPazės) aktyvumo pakitimas buvo pastebėtas MSC senėjimo procese, taip skatinant lizosomų rūgštėjimą ir autofagiją bei prisidedant. atidėti MSC senėjimą [60]. Yan ir kolegos nurodė, kad Cur gali suaktyvinti pelių embrioninių fibroblastų (MEF) lizosomų funkciją ir sukelti autofagiją, kuri yra esminis išgyvenimo signalas [38]. Panašiai mes pastebėjome, kad gydymas Cur padidina lizosomų rūgštėjimą cBMSC (4 pav.), o tai rodo, kad Cur gali dalyvauti aktyvuojant lizosomų funkciją, kuri yra būtina norint sustiprinti autofaginį aktyvumą.

Autofagija daugiausia yra citoprotekcinis mechanizmas, ir vis daugiau įrodymų rodo, kad natūralių ir sintetinių junginių senėjimą stabdančios savybės yra susijusios su autofagijos moduliavimu [29, 54, 61, 62]. Tačiau autofagijos moduliacijos poveikis MSC senėjimui ir atitinkamiems mechanizmams dar nebuvo iki galo įvertintas ir ištirtas. Pirminės ataskaitos parodė, kad autofagija yra daugiausia citoprotekcinis mechanizmas ir kad padidėjęs autofagijos lygis gali sulėtinti ląstelių senėjimą, sumažindamas toksinių metabolitų kaupimąsi ir atkurdamas organelių funkciją [63]. Įdomu tai, kad naujausi tyrimai taip pat parodė, kad MSC senėjimo metu buvo pastebėtas padidėjęs autofaginių vakuolių ir su autofagija susijusių baltymų (LC3-II, ATG7 ir ATG12) skaičius, o autofagijos slopinimas naudojant bafilomiciną A1 ir {{11 }}Įrodyta, kad MA sumažina SA- -gal teigiamų ląstelių procentą ir p16 bei p21 ekspresiją [35]. Siekiant dar labiau išsiaiškinti ryšį tarp Cur sukeltos autofagijos ir jos poveikio cBMSC senėjimui, autofagija buvo moduliuojama iš anksto apdorojant rapamicinu arba 3-MA. Akivaizdu, kad autofaginį aktyvumą susilpnino 3-MA, o RAP ir Cur (1 uM) žymiai sustiprina autofagiją (5 pav.). Remiantis ankstesnėmis ataskaitomis [5], mūsų išvados taip pat rodo, kad autofagijos slopinimas 3-MA pagreitino cBMSC ląstelių senėjimą. Beveik nuoseklų poveikį autofagijos aktyvacijai darė Cur(1uMand RAP, o analogiškas citoprotekcinis poveikis Atitinkamai, kai autofagiją slopino 3-MA, Cur veikiamas apsauginis poveikis sumažėjo (pav. ), o tai rodo, kad Cur sukelta autofagija yra galimas molekulinis mechanizmas, padedantis pagerinti cBMSC senėjimą (7 pav.).

Fiziologinėmis sąlygomis autofagija vyksta baziniu lygiu visose eukariotinėse ląstelėse, kad būtų palaikoma ląstelių homeostazė. Tačiau įvairios streso sąlygos gali sukelti nenormalią autofagiją, kuri turi įtakos ląstelių likimui, nebent autofagija būtų atkurta iki optimalaus lygio [41, 44, 64]. Mūsų įrodymai patvirtino, kad Cur sukelta autofagija turi teigiamą poveikį cBMSC senėjimo reguliavimui. Pagal šį scenarijų prieš gydymą Cur reikėtų atidžiai apsvarstyti įvairius stresą sukeliančius dirgiklius ir tarpląstelinius parametrus, ir būtų įdomu ištirti, ar Cur sukelta autofagija gali selektyviai pagerinti MSC funkciją iš anksto nustatyta doze ir trukme. Be to, nanotechnologijomis pagrįsta kurkumino tiekimo sistema pasižymėjo geresniu tirpumo vandeninėje fazėje ir biologinio prieinamumo lygiais [65,66]; tai gali būti daug žadanti priemonė, padedanti atidėti ir užkirsti kelią MSC senėjimui. Atsakymas į klausimą, ar autofagija yra pagrindinis MSC senėjimo atidėjimo mechanizmas, vis dar reikalauja daugiau informacijos, kurią pateiks būsimi tyrimai.

4. Medžiagos ir metodai

4.1.Gyvūnai

Kaulų čiulpų mėginiai buvo paimti iš 6 sveikų suaugusių kinų kaimo šunų patelių (12-mėn. amžiaus). Visi tyrimai buvo patvirtinti Sičuano žemės ūkio universiteto Fakulteto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto (patvirtinimo Nr. 2020-0608) ir atlikti laikantis Kinijos Liaudies Respublikos gyvūnų apsaugos įstatymų etikos standartų.

4.2. Kurkumino tirpalo paruošimas

Cur (HPLC Didesnis arba lygus 98 proc., CAS numeris:458-37-7; Solar Science& Technology Co., Ltd., Pekinas, Kinija) buvo ištirpintas DMSO iki pradinės koncentracijos 20 mmol/ L. filtruojamas per 0,22 μm organinę mikroporinę filtro membraną ir laikomas -80 laipsnių temperatūroje. Įvairūs Cur tirpalai buvo paruošti terpėje in vitro tyrimams.

4.3. Ląstelių kultūra ir plėtra

cBMSC buvo gauti iš kaulų čiulpų. Ląstelės buvo kultivuojamos pilnoje terpėje, susidedančioje iš mažai gliukozės turinčios Dulbecco modifikuotos erelio terpės (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, JAV), 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Pekinas, Kinija). ) ir 1 procentas penicilino / streptomicino. Esant 80-90 procentų santakai, prilipusios ląstelės buvo išlaisvintos naudojant Tripsino virškinimo tirpalą (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Šanchajus, Kinija) ir toliau išsiplėtė santykiu 1:2-1:3 [67 ].

4.4. Ląstelių augimo Curie

Norint nustatyti cBMSC proliferacinį gebėjimą (P)3, 6 ir 9 pasažuose, ląstelės buvo pasėtos į tris 48-šulinėlių plokšteles (2500 ląstelių/šulinėlių). Po 48 valandų inkubacijos ląstelės buvo išleistos tripsino virškinimo tirpalu ir suskaičiuotos hemocitometru. Ląstelių skaičiavimo procedūra buvo kartojama kas 48 valandas ir tęsiama 14 dienų.

4.5. CBMSC imunofenotipo aptikimas srauto citometrija

Trečiajame ištraukoje cBMSC buvo plaunami PBS ir tripsinizuojami. Ląstelės (3 × 105 ląstelės / ml) buvo pakartotinai suspenduotos dažymo buferyje, o ląstelių suspensijos (100 μL) buvo inkubuojamos su FITC, PE arba APC fluorescenciniu būdu pažymėtais monokloniniais antikūnais prieš paviršiaus antigenus CD45, CD34 ir ITGB1 („eBioscience“, San Diegas, Kalifornija, JAV) ir nefluorescenciniu būdu pažymėti CD31, CD90 ir CD105 (Biosynthesis biotechnology Co.Ltd. Pekinas, Kinija) 15 minučių 4 laipsnių temperatūroje. Ląstelės buvo plaunamos PBS ir inkubuojamos su FITC konjuguotu ožkos anti-triušio IgG 15 minučių 4 laipsnių temperatūroje. Paviršiaus antigenai buvo aptikti srauto citometrija (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Chosė, CA, JAV). Duomenų analizė atlikta naudojant CytExpert programinę įrangą.

4.6. In vitro diferenciacijos tyrimas

cBMSC buvo padengtos 5 × 104 ląstelių/ml tankiu į 6-šulinėlių plokšteles. Esant 70-80 procentų santakai, visa terpė buvo pakeista osteogenine arba adipogenine diferenciacijos indukcine terpe ir keičiama kas 3 dienas (Cvagen, Sudžou, Kinija). Kalcio nusėdimas buvo aptiktas Alizarin Red S dažymu (Solarbio, Pekinas, Kinija) po 3 savaičių osteogeninės indukcijos, o lipidų lašelių kaupimasis buvo pastebėtas naudojant Oil Red O dažymą (Solarbio, Pekinas, Kinija) po 2 savaičių adipogeninės indukcijos.

4.7. Cur poveikis ląstelių gyvybingumui

CBMSC ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant CCK{0}} rinkinį (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nankinas, Kinija).cistanche tubulosa nauda ir šalutinis poveikiscBMSC buvo iš anksto kultivuojami 96-šulinėlių plokštelėje 24 valandas. cBMSC buvo apdoroti Cur skirtingomis koncentracijomis (0.1, 0.5, 1, 5 ir 1{ {14}} umol/L) 12 val., 24 val., 48 val. ir 72 val. Ląstelės buvo apdorotos 0,1 procento DMSO, kuris buvo naudojamas kaip kontrolė Po inkubacijos su 10 μL CCK-8 tirpalo vienoje duobutėje 2 valandas, optinis tankis buvo išmatuotas mikroplokštelių skaitytuvu esant 450 nm (Thermo Scientific, Waltham, MA, JAV). Santykinis ląstelių gyvybingumas buvo apskaičiuotas pagal gamintojo instrukcijas.

4.8. Kolonijų susidarymo tyrimas

CBMSC savaiminio atsinaujinimo efektyvumas buvo nustatytas naudojant kolonijas formuojančių vienetų-fibroblastų (CFU-F) tyrimą. cBMSC buvo sėjami (3 × 10² ląstelių/šulinėlių) į 6-šulinėlių plokšteles. Po dviejų savaičių kultivavimo ląstelės buvo fiksuotos 4 procentų paraformaldehidu 30 minučių ir stebimos apverstu mikroskopu (LX73, Olympus Corporation, Tokijas, Japonija) po 10 minučių dažymo 1 procento kristaliniu violetiniu. CFU-F buvo suskaičiuota daugiau nei 50 ląstelių. CFU-F efektyvumas buvo apskaičiuotas taip:

KSV-F efektyvumas=KSV-F skaičius/sėklų skaičius (300 ląstelių)[68].

4.9. Beta-galaktozidazės dažymo tyrimas

Su senėjimu susijusios -galaktozidazės (SA- -gal) aktyvumas cBMSC buvo įvertintas naudojant SA- -gal dažymo rinkinį (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Šanchajus, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. . Po dažymo ląstelės buvo tiriamos apverstu mikroskopu. Teigiamai nudažytos ląstelės buvo suskaičiuotos, kad būtų galima įvertinti ląstelių senėjimą.

4.10. Atvirkštinė transkripcija realiuoju laiku kiekybinė PGR (RT-qPCR)

Visa RNR buvo išskirta iš ląstelių granulių naudojant Trizol reagento metodą. cDNR buvo susintetinta naudojant PrimeScriptTM RT reagentų rinkinį su gDNA Eraser (Takara, Shiga, Japonija). PGR pradmenys (2 lentelė), be GAPDH, remiantis ankstesniais tyrimais [67], buvo sukurti naudojant Primer Express programinę įrangą (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV), pagrįstą cDNR sekomis. qPCR buvo atlikta naudojant TB Green PCR Mix (Takara, Shiga, Japonija) naudojant CFX96 Touch realaus laiko PGR aptikimo sistemą (Bio-Rad, Richmond, CA, JAV). Reakcijos sąlygos buvo tokios: 95 laipsniai 3 0 s, o tada 39 ciklai po 95 laipsnių 5 s ir 60 laipsnių 30 s. Lydymosi kreivės analizė buvo atlikta pradedant nuo 95 laipsnių 10 sekundžių, tada nuo 65 iki 95 laipsnių, kiekvieną ciklą didinant 0,5 laipsnio. GAPDH buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė norint normalizuoti visus duomenis, o santykinė išraiška buvo apskaičiuota taikant lyginamąjį ciklo slenksčio (Ct) metodą.

4.11. Lusosomal UIsing LysoTracker sekimas

Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Šanchajus, Kinija) buvo naudojamas lizosomoms sekti, kurios gali padidinti fluorescencijos intensyvumą lizosomų rūgštėjimo metu. Mes pasėjome cBMSC į 12-šulinėlių plokšteles ir 24 valandas apdorojome jas Cur, tada ląstelės 20 minučių buvo apdorotos Lyso-Tracker (60 nM) ir Hoechst 33 342 (2 ug/ml). Fluorescencija buvo stebima naudojant apverstą fluorescencinį mikroskopą po plovimo PBS.

4.12. Imunofluorescencija

CBMSC (2 × 104 ląstelės / skaidrė) buvo pasėtos ant stiklelių ir fiksuojamos 4 procentais paraformaldehidu 30 min. Po 5 min. inkubacijos su 0,5 proc. Triton X-100 (Solarbio, Pekinas, Kinija), sekcijos buvo panardintos į blokuojantį tirpalą 30 min. Uždarytas skystis buvo pašalintas ir ląstelės buvo inkubuojamos su anti-LC3B antikūnais (1:1000, Abcam, Kembridžas, MA, JAV) per naktį 4 laipsnių temperatūroje, tada inkubuojamos su fluorochromu konjuguotais antriniais antikūnais (Abcam, Kembridžas, MA, JAV) 50 min. 37 °C temperatūroje. Galiausiai ląstelės buvo priešdažytos DAPI (Beyotime Biotechnology, Šanchajus, Kinija) ir stebimos konfokaliniu mikroskopu.

4.13. Vakarų blotingo analizė

Ląstelių mėginiai buvo lizuojami audiniu ir ląstelių lizatu (Solarbio, Pekinas, Kinija), turinčiu proteazės inhibitorių, po plovimo lediniu PBS. Ląstelių lizatai, kurių viename mėginyje yra 15 ug baltymų, buvo įkelti į natrio-dodecilsulfato-poliakrilamido (SDS-PA) (Solarbio, Pekinas, Kinija) gelius ir atskirti elektroforezės būdu. Perkėlus baltymus ant polivinilidenfluorido (PVDF) membranos, pastaroji buvo nespecifiškai užblokuota 5 procentų neriebiu sausu pienu (Solarbio, Pekinas, Kinija) 1 valandą kambario temperatūroje. Membranos buvo inkubuojamos per naktį su pirminiais antikūnais anti-LC3B (1:2000, Abcam, Cambridge, MA, JAV), anti-p62/SQSTM1 (1:4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, JAV). ) ir anti- -aktino (1:1000, Abcam, Kembridžas, MA, JAV) 4 laipsnių temperatūroje, o blotai buvo plaunami TBST (Solarbio, Pekinas, Kinija), prieš inkubuojant juos su antriniu antikūnu (1 :2000, Abcam, Kembridžas, MA, JAV) 37 laipsnių temperatūroje 1 val. Vėliau membranos buvo sukurtos veikiant chemiliuminescenciniais reagentais (Millipore, Billerica, MA, JAV) ir vizualizuotos naudojant ChemiDocTM Imaging Systems (Tanon{24}}, Šanchajus, Kinija). Juostos tankis buvo kiekybiškai įvertintas naudojant „Image-Pro Plus 6.0“ programinę įrangą („Media Cybernetics“, „Silver Spring“, MD, JAV) kiekvienai grupei ir normalizuotas su -aktinu.

4.14. Transmisijos elektronų mikroskopija (TEM)

Ląstelių nuosėdos buvo suardytos ir surenkamos į 1, 5 ml centrifugos mėgintuvėlį, po to fiksuojamos 2, 5 procento glutaraldehidu (Solarbio, Pekinas, Kinija) 2 valandas kambario temperatūroje. Mėginiai buvo fiksuoti 1 procento osmio tetroksidu 1 valandą po plovimo PBS, tada laipsniškai padidinome dehidrataciją acetono tirpaluose ir įterpėme juos į 812 epoksidinę dervą (Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd., Pekinas, Kinija). Vėliau iš ultramikrotomo (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelbergas, Vokietija) buvo paimtos 50 nm pjūviai. Pjūviai buvo nudažyti uranilo acetatu (Zhongjingkevi, Pekinas, Kinija) 10-15 min. ir švino citratu (Zhongjingkei, Pekinas, Kinija) 2 min. Visi egzemplioriai buvo peržiūrėti naudojant TEM (EM-1400PLUS, JEOL, Akishima, Tokijas, Japonija).

4.15. Statistinė analizė

Rezultatai buvo gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų ir visi duomenys buvo parodyti kaip vidurkiai ± standartiniai nuokrypiai (SD). Statistinės reikšmės buvo analizuojamos naudojant IBM SPSs Statistics 25 ir iliustruotos naudojant GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software, San Diego, CA, JAV). Statistiškai reikšmingi skirtumai buvo nustatyti naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA) ir Stjudento t-testą. p reikšmės<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Išvados

Mūsų išvados atskleidė ryšį tarp Cur, cBMSC senėjimo ir autofagijos. Mūsų tyrimo duomenys rodo, kad Cur gali palengvinti cBMSC senėjimo būseną, tuo pačiu suaktyvindamas autofagiją ir skatindamas lizosomų rūgštėjimą. Be to, papildomi įrodymai parodė, kad Cur sukelta autofagija yra galimas mechanizmas, padedantis pagerinti cBMSC senėjimą. Cur galėtų būti perspektyvus aktyvatorius ir konservatorius, gerinantis MSC funkciją. Mūsų nuomone, negalima nepaisyti teigiamo Cur poveikio senėjimui. Būsimuose tyrimuose daugiausia dėmesio turėtų būti skiriama Cur reguliavimo poveikiui MSC likimui, siekiant sustiprinti MSC terapinį potencialą sergant įvairiomis ligomis, tokiomis kaip audinių pažeidimai ir degeneracinės bei uždegiminės ligos.

Šis straipsnis yra ištrauktas iš Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms