Auglio ląstelės nesugeba pateikti MHC-II apribotų epitopų, gautų iš onkogenų, į CD{1}} T ląsteles

CD4+ T ląstelės atlieka svarbų vaidmenį priešnavikiniame imunitete, nes atpažįsta peptidinius antigenus, pateiktus MHC II klasėje (MHC-II). Nors kai kurie kietieji vėžiai gali būti paskatinti ekspresuoti MHC-II, neaišku, kiek tai leidžia tiesiogiai atpažinti navikui specifines CD{4}} T ląsteles. Mes išskyrėme ir apibūdinome T ląstelių antigeno receptorius (TCR) iš natūraliai pradėtų CD4+ T ląstelių, specifinių 2 onkoproteinams, HPV-16 E6 ir aktyvuojančiai KRASG12V mutacijai, iš pacientų, sergančių galvos ir kaklo plokščialąsteline karcinoma. ir kasos latakų adenokarcinoma, ir nustatė jų gebėjimą atpažinti autologines arba žmogaus leukocitų antigeną atitinkančias antigeną ekspresuojančias naviko ląsteles. Abiem atvejais mes nustatėme, kad TCR galėjo atpažinti peptidais pakrautas tikslines ląsteles, ekspresuojančias atitinkamas MHC-II arba B ląstelių antigenus pateikiančias ląsteles (APC), kai antigenai buvo endogeniškai ekspresuojami ir nukreipti į endosominį kelią, bet neatpažino naviko. ląstelės, ekspresuojančios šaltinio baltymą net ir po paviršiaus MHC-II ekspresijos indukcijos IFN- arba transdukcija su CIITA. Šie rezultatai rodo, kad tiek branduolinio (E6), tiek su membrana susijusio (KRAS) onkoproteino pradinis ir funkcinis atpažinimas daugiausia apsiriboja kryžminiu APC pateikimu, o ne tiesioginiu naviko ląstelių, sukeltų MHC-II ekspresijai, atpažinimu.

Cistanche tubulosa-Antitumor pranašumai

Įvadas

Piktybinę somatinių ląstelių transformaciją inicijuoja aktyvuoti onkogenai, kurie sutrikdo ląstelių augimo kelius ir sukelia nekontroliuojamą proliferaciją (1). Su ŽPV susijusio vėžio atveju ŽPV ankstyvųjų genų E6 ir E7 ekspresija prisideda prie onkogenezės slopindama atitinkamai naviko slopinimo genus p53 ir Rb (2). Arba konstitucinis onkogeno aktyvavimas gali įvykti per somatinę mutaciją genuose, reguliuojančiuose ląstelių augimo ir proliferacijos kelius, pvz., RAS šeimą. Iš tiesų, aktyvuojančios KRAS mutacijos, tokios kaip KRASG12V, dažniausiai randamos pacientams, sergantiems kasos, gaubtinės žarnos ir plaučių vėžiu (3). Nors onkogenai skatina ligas, jie taip pat gali būti šeimininko imuninės sistemos taikiniai. Pastaraisiais metais imuninės sistemos vaidmuo kontroliuojant su ŽPV susijusį vėžį tapo plačiai pripažintas. CD8+ ir CD4+ T ląstelės, atpažįstančios ŽPV E6 ir E7, taip pat kitus ŽPV baltymus, buvo aptiktos tiek periferiniame kraujyje, tiek į naviką infiltruojančiuose limfocituose (TIL) pacientams, sergantiems ŽPV. vėžys (4–6). Imunoterapija, nukreipta į šiuos antigenus, įskaitant gydomąsias vėžio vakcinas ir adaptyviąją ląstelių terapiją (ACT) su TIL arba TCR sukurtomis T ląstelėmis, yra aktyvi ikiklinikinių ir klinikinių tyrimų sritis (2). T-ląstelių atsakas prieš onkogenines mutacijas taip pat buvo plačiai aprašytas (7–9). Be to, yra tiesioginių klinikinių įrodymų, kad ACT su TIL, nukreiptais į mutantą KRAS, gali paskatinti objektyvius atsakus (10). Nors CD8+ T ląstelės, atpažįstančios epitopus, gautus iš onkogenų, tiesiogiai veikia citotoksiškai prieš naviko ląsteles (11–13), CD4+ T ląstelių vaidmuo priešnavikiniame imunitete yra mažiau suprantamas. Naujausi tyrimai atskleidė CD4+ T ląstelių pogrupį, išreiškiantį citotoksinius žymenis, tokius kaip granzimas B (GrzmB), sergant žmogaus vėžiu (14, 15). Tačiau šių ląstelių antigenų specifiškumas, taigi ir jų terapinis potencialas, iš esmės nežinomi. Be to, kad šios citotoksinės CD4+ T ląstelės atpažintų ir naikintų naviko ląsteles, ne tik naviko ląstelė turi ekspresuoti MHC-II, bet ir atitinkami antigenai turi būti nukreipti į atitinkamą pateikimo kelią. Šiame tyrime ištyrėme CD4+ T ląstelių, būdingų onkoproteinams HPV-16 E6 ir KRASG12V, gebėjimą atpažinti antigeną ekspresuojančias naviko ląsteles. Nors abu TCR galėjo tiesiogiai atpažinti endogeniškai apdorotus ir pateiktus antigenus, nukreiptus į HLA suderintų B ląstelių endosominį skyrių, nė vienas negalėjo atpažinti antigeną ekspresuojančių naviko ląstelių su sukelta MHC-II ekspresija. Apskritai, mūsų rezultatai rodo, kad tik tam tikri antigenai pateikiami tiesiai ant MHC-II+ naviko ląstelių, o tai gali apriboti CD4+ T ląstelių, galinčių tiesiogiai atpažinti ir pašalinti naviko ląsteles, telkinį.

cistanche nauda vyrams - stiprina imuninę sistemą

Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus

【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Rezultatai

ŽPV-16 E6-specifinių CD4+ ir CD8+ T ląstelių atsakų iš galvos ir kaklo plokščialąstelinės karcinomos TIL identifikavimas. Mes patikrinome keletą atskirų TIL kultūrų, išskirtų iš 2–4 mm naviko fragmentų iš paciento (Hu-56), sergančio HPV-16+ galvos ir kaklo plokščialąsteline karcinoma (HNSCC) (1 papildoma lentelė; papildoma medžiaga galima rasti internete su šiuo straipsniu; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) naudojant IFN-ELISPOT tyrimus, siekiant nustatyti T ląstelių atsaką, nukreiptą prieš ŽPV-16 viruso onkoproteinus E6 ir E7, naudojant peptidų telkinius, kuriuos sudaro persidengiantys 15-merai, apimantys E6 ir E7 baltymų ilgį. Pažymėtina, kad 12 ir 29 TIL fragmentai sukūrė daug dėmių virš fono, kai buvo pakartotinai stimuliuojami E6 peptidų telkiniu, ir juose buvo ir CD4+, ir CD8+ T ląstelės (1A pav. ir 1A papildomas paveikslas). Norėdami nustatyti atitinkamus T ląstelių pogrupius, išanalizavome šias TIL kultūras, naudodami citokinų sekrecijos tyrimą. Tai atskleidė, kad 29 TIL fragmente (F29) buvo E6-reaktyvių CD8+ T ląstelių, o 12 fragmente (F12) buvo ir CD4+, ir CD8+ T ląstelių, galinčių atpažįstant E6 peptidų telkinį (1B pav.). Nė viena iš CD4+ T ląstelių negamina IL-5, reaguodama į pakartotinį E6 stimuliavimą, patvirtinantį Th1-panašų fenotipą. Norėdami nustatyti E6-specifinių TIL TCR kloniškumą, surūšiavome atskiras IFN išskiriančias CD4+ T ląsteles iš F12 ir CD8+ T ląsteles iš F12 ir F29. TCR seka atskleidė vieną TCR, išreikštą IFN išskiriančių CD4+ T ląstelių (n=31 iš 31 sekvenuotos ląstelės), taip pat vieną TCR kloną, kurį dalijasi IFN išskiriantis CD{53. }} T ląstelės iš F12 ir F29 (n=40 atitinkamai iš 41 ir 37 iš 38 ląstelių) (2 papildoma lentelė). Šie rezultatai rodo, kad šio paciento TIL yra monokloninių CD{61}} ir CD8+ T ląstelių, reaguojančių į E6. HLA-A*02:01 – apribotos CD8+ T ląstelės iš TIL atpažįsta E6, pateiktą iš paciento gautos naviko ląstelių linijos. TIL iš F29 gamino IFN, kai buvo pakartotinai stimuliuojamas E629-38 peptidu, o tai rodo, kad F29 TCR atpažino šį anksčiau aprašytą HLA-A*02:01 ribotą epitopą (papildomas 1B paveikslas) (11). Tai patvirtino tetramero surišimo tyrimai, naudojant E629-38/HLA-A*02:01, kad būtų pažymėtos TCR nepakankamos J76 ląstelės, ekspresuojančios žmogaus CD8, ir naudojant anksčiau aprašytą E628-38-specifinį TCR kaip teigiamą. valdiklis (2A pav.) (11). Abu TCR pasižymėjo panašiu funkcinio avidiškumo lygiu, kaip rodo J76 ūminio aktyvinimo žymens CD69 reguliavimas po stimuliacijos autologinėmis B limfoblastoidinių ląstelių linijomis (B-LCL), pulsuojančiomis titruota E629-38 peptido koncentracija (2 pav. B ir C). Šie duomenys patvirtina CD8+ T ląstelių klono, būdingo žinomam E6 epitopui, buvimą, kurio funkcinės savybės panašios į TCR, kuris buvo išbandytas klinikinėje aplinkoje (16). Toliau siekėme nustatyti, ar E6-specifinis CD8+ TCR gali atpažinti endogeniškai išreikštus antigenus ir taip tarpininkauti priešnavikiniam citotoksiškumui. Norėdami tai padaryti, panaudojome gerai apibūdintą HLA-A*02:01+ HPV-16+ naviko liniją CaSki, taip pat autologinę naviko ląstelių liniją HNSCC{105}}, sukurtą naudojant pirminio naviko audinio ląstelių perprogramavimas, kaip aprašyta anksčiau (17) citotoksiškumo tyrimams in vitro. RNR-Seq analizė patvirtino ankstyvųjų ŽPV{108}} genų, įskaitant E6, ekspresiją tiek pirminiame naviko mėginyje, tiek autologinėje ląstelių linijoje (papildomas 1C paveikslas). Pirminės žmogaus CD{111}} T ląstelės, ekspresuojančios F29 TCR, gali tarpininkauti ir CaSki, ir HNSCC-56 naikinimui esant įvairiems efektoriaus ir taikinio santykiams in vitro (2 pav., D ir E). Kartu šie duomenys patvirtina, kad F29 TCR atpažįsta endogeniškai išreikštą E6 antigeną. HLA-DQ apribotos, E6-specifinės CD4+ T ląstelės identifikavimas iš TIL. Norėdami išplėsti specifinius E6-TIL tolesnei funkcinei analizei, naudojome anksčiau aprašytą greito išplėtimo kultūros protokolą su OKT{123}} ir apšvitintus alogeninius PBMC, kad išplėstume TIL iš F12. Nors pirminėje F12 kultūroje iš pradžių buvo ir CD8+, ir CD{4+ E6 reaktyvumo T ląstelių, galutiniame ląstelių produkte po greito išsiplėtimo buvo 99 % CD4+ T ląstelių, iš kurių maždaug 38,33 % parodė reaktyvumą prieš E6, kaip parodyta ląstelėje esantis citokinų dažymas IFN- (3A pav.).

Kinijos žolė cistanche augalas-Antitumor

Be IFN-, stimuliuojami E6-specifiniai CD4+ TIL gali išskirti TNF-, bet ne IL-2 (papildomas 2A paveikslas). Nors bendras GrzmB+ ląstelių dažnis nepadidėjo stimuliuojant antigeną, TNF išskiriančių ląstelių tikrinimas atskleidė, kad E6-specifiniuose CD4+ TIL yra daugiau saugomų intracelulinio GrzmB nei nespecifinių TIL (papildomas 2B paveikslas). ). IFN išskiriantys CD4+ TIL taip pat išreiškė koinhibitorinį žymenį užprogramuotą ląstelių mirtį 1 (PD-1), atitinkantį paskelbtus navikams reaktyvių CD4+ TIL parašus (papildomas 2C paveikslas) ( 18, 19). E6-specifiniai CD4+ TIL pasižymėjo dideliu funkciniu avidiškumu, nes šios ląstelės galėjo išskirti citokinus, kurių peptidų koncentracija mažesnė nei 1 ug/ml (3B pav.). Norėdami nustatyti F12 TIL kultūros specifiškumą, mes pulsavome autologinius B-LCL su atskirais peptidais, atitinkančiais kiekvieną iš 37 peptidų, esančių pradiniame E6 telkinyje (3 papildoma lentelė). CD4+ TIL iš F12 išskyrė IFN, kai buvo stimuliuojami peptidais E61-15 ir E65-19, kurie turi 11 aminorūgščių branduolio seką (papildomas 2D paveikslas). Kultūros eksperimentai su HLA blokuojančiais Abs atskleidė reikšmingai sumažėjusį IFN sekreciją TIL, kai B-LCL buvo blokuoti anti-HLA-DQ Abs, bet ne anti-HLA-DR arba izotipo kontrolės Abs (3C pav.). Norėdami nustatyti, kurie HLA-DQ aleliai yra atsakingi už šio epitopo pateikimą, mes impulsavome B-LCL, ekspresuojančius žinomus HLA-DQ alelius (4 papildoma lentelė) su E61-15 ir nustatėme, kad KAS011 ląstelės, ekspresuojančios HLA-DQA1*01. :02 ir DQB1*05:02, bet ne Hu-195 B-LCL, išreiškiantys DQA1*05:05 ir DQB1*03:01, galėtų pateikti antigeną TIL panašiai kaip autologinis Hu{63} } B-LCL (3D pav.). Galiausiai siekėme patikrinti, ar anksčiau nustatyta TCR seka iš tikrųjų buvo atsakinga už E6 atpažinimą. F12 TCR ekspresija pirminėse sveiko žmogaus donoro CD4+ T ląstelėse buvo pakankama, kad paskatintų E61-15 peptido atpažinimą, kaip rodo CD69 ir PD-1 padidėjęs reguliavimas (3E pav. ). Visi šie rezultatai rodo, kad buvo nustatytas HLA-DQ apribotas E6 epitopas, atpažįstamas monokloninių CD{75}} TIL. E6-specifinės CD4+ T ląstelės neatpažįsta ir nežudo autologinių naviko ląstelių, ekspresuojančių MHC-II. Naujausi tyrimai atskleidė genetinius citotoksinių CD{79}} TIL požymius sergant kai kuriomis žmogaus vėžio formomis (14, 15). Tačiau nežinoma, ar citotoksinės CD4+ T ląstelės turi įtakos ŽPV sukeltam vėžiui. Norėdami nustatyti, ar E6-specifinės CD4+ T ląstelės iš TIL gali tiesiogiai atpažinti HNSCC-56, pirmiausia ištyrėme jo MHC-II ekspresijos būseną. Nors auglio ląstelės kultūroje neišreiškė aptinkamo paviršiaus MHC-II, gydymo IFN- 72 valandas pakako MHC-II reguliavimui sukelti (4A pav.). Tada mes išauginome HNSCC{93}} su CD4+ F12 TIL. Svarbu tai, kad MHC-II+ naviko ląstelės, iš anksto kondicionuotos IFN-, nesugebėjo stimuliuoti CD4+ TIL, matuojant pagal IFN sekreciją (4B pav.).

1 pav. E6-reaktyvaus CD4+ ir CD8+ TIL iš HPV-16+ HNSCC identifikavimas. (A)

2 pav. HLA-A*02:01 – riboto, E6-specifinio TCR iš Hu-56 TIL funkcinės charakteristikos. (A)

Tačiau IFN apdorotos naviko ląstelių linijos, pulsuotos E61-15 prieš pridedant TIL, galėjo paskatinti T ląstelių atsaką, o tai rodo, kad ribojančių HLA-DQ alelių paviršiaus ekspresija ląstelių linijoje, kuri endogeniškai ekspresuoja. E6 nepakako navikui atpažinti, tačiau reikėjo eksogeninio tikslinio peptido pakrovimo. Toks pat egzogeninio tikslinio peptido įkrovimo reikalavimas buvo pastebėtas naudojant CIITA transdukuotas naviko ląsteles (HNSCC-56 CIITA), kurios iš esmės išreiškia aukštą paviršiaus MHC-II kiekį (4B pav.). Norėdami patikrinti, ar CD4+ TIL gali atpažinti endogeniškai apdorotą ir pateiktą E6 epitopo versiją APC, retrovirusiniu būdu transdukavome autologinius B-LCL su ekspresijos konstrukcija, koduojančia pirmąsias 50 E6 aminorūgščių, sujungtų su MHC- I transmembraninis domenas (E6-MITD), kuris skatina susilietų aminorūgščių sekos lokalizaciją plazmos membranoje ir palaiko MHC-II pateikimą per endosominę prekybą (20). B-LCL, ekspresuojantys E6-MITD konstrukciją, gali stimuliuoti E6-specifinius CD4+ TIL, o tai rodo, kad šių TIL atpažįstamas peptido epitopas gali būti natūraliai apdorotas ir pateiktas MHC-II, kai nukreiptas į atitinkamą kelią (4C pav.).

3 pav. Kloniniu būdu išplėstų, HLA-DQ apribotų, E6-specifinių CD4+ TIL funkcinės charakteristikos. (A)

Toliau siekėme nustatyti, ar F12 E6-specifiniai CD4+ TIL gali turėti tiesioginį naviko citotoksiškumą. Remiantis mūsų atpažinimo tyrimų duomenimis, E6-specifiniai CD4+ TIL nesugebėjo apriboti HNSCC-56 naviko ląstelių, kurios neišreiškia MHC-II, augimo (4D pav.) . Be to, HNSCC-56 CIITA naviko ląstelės taip pat nestabdomos augo esant CD4+ TIL. Tačiau HNSCC-56 CIITA naviko ląstelių, impulsuotų E61-15 peptidu, augimas buvo slopinamas priklausomai nuo efektorinių ląstelių dozės. Apskritai šie duomenys rodo, kad nors HNSCC-56 gali pateikti E6 epitopus CD8+ T ląstelėms, E6-specifiniai CD4+ TIL negali tiesiogiai atpažinti ir lizuoti MHC- II+ autologinės naviko ląstelės. Genai, susiję su antigenų pristatymu, dažnai mutuoja sergant vėžiu, o tai gali užkirsti kelią T ląstelių atpažinimui (21). Norėdami nustatyti, ar HNSCC-56 naviko ląstelėse yra kokių nors somatinių mutacijų, neleidžiančių atsirasti antigenui MHC-II, atlikome viso egzomo naviko ląstelių ir PBMC iš Hu-56 seką kaip etaloninį mėginį. Iš 104 nustatytų nesinoniminių somatinių mutacijų MHC-II pateikimo kelio komponentuose, įskaitant HLADMA, HLADMB ir CD74, akivaizdžių mutacijų nebuvo (5 papildoma lentelė). HLA-DRB5*01:01 apriboto, KRASG12V specifinio TCR identifikavimas iš paciento, sergančio kasos latakų adenokarcinoma, kraujo. Remdamiesi šiais rezultatais, nusprendėme nustatyti, ar naviko ląstelių nesugebėjimas pateikti antigeno MHC-II buvo teisingas kitiems onkogenams. Atsižvelgiant į tai, kad vėžiu sergantiems žmonėms buvo nustatytos cirkuliuojančios navikui būdingos T ląstelės (8, 22), mes stimuliavome PBMC iš paciento (Hu-66), sergančio kasos latakų adenokarcinoma (1 papildoma lentelė) peptidų rinkiniu. atitinkančias įprastas onkogenines mutacijas (6 papildoma lentelė) 14 dienų prieš pakartotinį stimuliavimą atskirais peptidais, kad būtų galima nustatyti atitinkamus T ląstelių atsakus ELISPOT. Šie rezultatai parodė, kad yra T-ląstelių atsakas, nukreiptas prieš KRASG12V, kaip rodo padidėjęs IFN dėmių skaičius fone, reaguojant į KRASG12V 1–15 aminorūgštis (5A pav.). Norėdami nustatyti atitinkamus su šiuo atsaku susijusius TCR, mes vėl panaudojome citokinų sekrecijos tyrimą, kad rūšiuotume IFN išskiriančias ląsteles. Citokinų sekrecijos tyrimas atskleidė specifinę IFN gamybą CD4+ T ląstelėse, reaguojant į pakartotinį stimuliavimą KRASG12V (5B pav.). Lyginant TCR grandines iš surūšiuotų IFN išskiriančių ląstelių su tomis, kurios yra neišsiplėtusiuose šio paciento PBMC, paaiškėjo, kad vienas TCR klonotipas, esantis didžiausiu dažniu abiejose populiacijose (5C pav. ir 2 papildoma lentelė). Šie rezultatai rodo, kad šio T ląstelių klono dažnis buvo išplėstas pradiniame PBMC, o tai rodo natūraliai atsirandantį in vivo atsaką, o ne in vitro pradėjimą mūsų plėtimosi kultūroje. Norėdami patikrinti šio TCR antigeno specifiškumą, mes jį ekspresavome pirminėse žmogaus CD4+ T ląstelėse retrovirusinės transdukcijos būdu ir kultivavome šias ląsteles su autologiniais B-LCL, pulsuojančiais mutantu KRASG12V arba atitinkamu WT peptidu. Sukurtos T ląstelės išskyrė IFN, kai buvo stimuliuojamos mutantu, bet ne WT, KRAS peptidu, patikrinant, ar šis TCR yra specifinis KRASG12V (5D pav.). Remiantis mūsų E6 TCR rezultatais, sukurtos T ląstelės, ekspresuojančios KRASG12V specifinį TCR, taip pat galėjo atpažinti B-LCL, ekspresuojančius KRASG12V fragmentą, bet ne WT KRAS, nukreiptus į endosomą įtraukiant MITD, o tai rodo, kad tai. TCR atpažįsta endogeniškai apdorotą ir pateiktą antigeną (5D pav.).

4 pav. Autologinės naviko ląstelės nerodo endogeninio E61-15 ant MHC-II į CD4+ T ląsteles. (A)

5 pav. HLA-DRB5*01:01 apriboto, KRASG12V specifinio TCR identifikavimas iš paciento, sergančio kasos latakų adenokarcinoma, kraujyje. (A)

Norėdami nustatyti ribojantį HLA alelį, pakartojome šiuos peptidų stimuliavimo eksperimentus, naudodami B-LCL, ekspresuojančius skirtingus HLA genų derinius. B-LCL, išreiškiantys bendrą HLA-B7-DR15-DQ6 haplotipą, galėtų stimuliuoti sukurtas T ląsteles, o B-LCL be šių alelių negalėtų (5E pav.). Galiausiai šių ląstelių stimuliavimas peptidais impulsuojama IHW03304, pelės DAP3 ląstelių linija, transfekuota žmogaus HLA-DRB5*01:01, patvirtino, kad tai yra ribojanti HLA molekulė (5F pav.). MHC-II+ NCI-H2444 ir DAN-G naviko ląstelės nepateikia iš KRASG12V gauto epitopo CD4+ T ląstelėms. Toliau ištyrėme naviko ląstelių gebėjimą tiesiogiai pateikti KRASG12V gautus epitopus MHC-II. Norėdami sukurti su HLA suderintas MHC-II+ ląstelių linijas šiems tyrimams, mes transdukavome KRASG12V+ ląstelių linijas NCI-H2444 ir DAN-G, gautas atitinkamai iš žmogaus plaučių ir kasos vėžio, su CIITA ir HLA-DRB5*01 koduojančia konstrukcija: 01 su sutrumpintu CD34 reporterio genu (6A pav.). Remiantis ankstesniais rezultatais, MHC-II+ naviko ląstelės, ekspresuojančios ribojantį HLA alelį, negalėjo stimuliuoti TCR sukurtų T ląstelių, nebent tikslinės ląstelės pirmą kartą buvo impulsuojamos egzogeniniu peptidu (6B pav.). Svarbu tai, kad viešai prieinamuose sekos nustatymo duomenyse nebuvo išvardytų somatinių mutacijų MHC-II pateikimo genuose (būtent HLADMA, HLADMB, CD74) nei NCI-H2444, nei DAN-G (23). NCI-H2444 CIITA ląstelės augo neslopinamos esant TCR inžinerinėms T ląstelėms, o NCI-H2444 CIITA ląstelės, pulsuotos KRASG12V peptidu, patyrė uždelstą auglio augimą (6C pav.). Remiantis HNSCC-56 gautais rezultatais, CD8+ T ląstelės, ekspresuojančios HLA-A*03:01 – apribotą, KRASG12V specifinis TCR (24) galėjo atpažinti NCI-H2444 ląsteles, bet ne. CaSki ląstelės, ekspresuojančios HLA-A*03:01, bet ne KRASG12V (6D pav.). Šie rezultatai rodo, kad atskiro citozolyje esančio onkogeno taip pat negali pateikti MHC-II+ naviko ląstelės, nepaisant to, kad jis veiksmingai pateikiamas MHC-I. Koinhibuojančių ligandų, pvz., užprogramuoto ląstelių mirties ligando 1 (PD-L1), ekspresija naviko ląstelėse riboja TCR signalizaciją T ląstelėse (25). Norėdami nustatyti, ar šis mechanizmas gali trukdyti CD4+ T ląstelėms atpažinti MHC-II+ naviko ląsteles, kultivavome CD4+ T ląsteles, ekspresuojančias mūsų KRASG12V specifinį TCR arba E6-specifinį. F12 TCR su atitinkamai NCI-H2444 CIITA ir HNSCC{90}} CIITA, su anti-PD-L1 blokuojančiais Abs arba be jų. PD-L1/PD-1 sąveikos blokavimo nepakako, kad būtų skatinamas naviko ląstelių atpažinimas (3 papildomas paveikslas). Panašiai anti-CD28 agonisto Ab pridėjimas nepakeitė naviko ląstelių atpažinimo. Šie rezultatai rodo, kad už šį fenotipą atsakingas antigeno pateikimo trūkumas, o ne atitinkamai slopinančių ar kostimuliuojančių signalų buvimas ar nebuvimas. Kai kurie tyrimai rodo, kad endogeniniai baltymai, internalizuoti iš plazmos membranos, pirmenybę teikia MHC-II pateikimui, palyginti su kitais tarpląsteliniais skyriais (26). Nors KRAS baltymai dažnai yra susiję su membranomis dėl lipidų modifikacijų, jie neišreiškia transmembraninio domeno ir šios sąveikos nėra stabilios (3, 27). Todėl samprotavome, kad imunogeninio KRASG12V fragmento pritvirtinimas prie naviko ląstelių plazminės membranos gali leisti CD4+ T ląstelėse tiesiogiai atpažinti antigeną. Tačiau naviko ląstelės, ekspresuojančios KRASG12V-MITD konstrukciją, kaip rodo su P2A susieto EGFP reporterio ekspresija, taip pat negalėjo stimuliuoti TCR sukurtų CD{109}} T ląstelių (4 papildomas paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad tarpląstelinio onkogeno lokalizacija nėra vienintelis veiksnys, lemiantis tiesioginį MHC-II pateikimą naviko ląstelėse. Be to, šie rezultatai rodo, kad pernelyg didelė antigeno ekspresija nėra pakankama MHC-II pristatymui skatinti. Iki šiol mūsų rezultatai rodo, kad navikui specifinės CD{114}} T ląstelės gali labiau atpažinti antigenus, kuriuos pateikia APC, o ne pačios naviko ląstelės. Todėl įvertinome HLADRB5*01:{117}} DC gebėjimą pateikti antigenus, gautus iš egzogeninių baltymų. Su HLA suderintos DC, sukurtos in vitro, galėjo stimuliuoti TCR sukurtas CD{120}} T ląsteles, ekspresuojančias KRASG12V specifinį TCR, kai nesubrendusios DC buvo pulsuojamos KRASG12V 20-mer peptidu arba buvo maitinamos visu KRASG12V baltymu. ne KRAS WT baltymas (6E pav.). Šie rezultatai rodo, kad nors TCR negali atpažinti naviko ląstelių pateiktų endogeninių antigenų, jis gali atpažinti kryžmiškai pateiktus egzogeninius antigenus DC kontekste.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Diskusija

Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti, ar TCR, išskirtos iš natūraliai paruoštų T ląstelių, gautų iš vėžiu sergančių pacientų, gali atpažinti naviko ląsteles, ekspresuojančias onkogenus. Kalbant apie I klasės (HLA-A*02:01) – apribotą, HPV-16 E629-38 TCR, gautą iš HNSCC TIL, atpažinimas, ko gero, nenuostabu buvo patvirtintas abiem autologinėms naviko ląstelių linijoms. ir gerai apibūdinta HLA atitinkanti ir E6-išreiškianti naviko ląstelė CaSki (svarbu, žr. 2 pav.). Tuose pačiuose TIL (1 pav.) taip pat buvo daug IFN gaminančių E6-specifinių CD4+ T ląstelių (3 pav.), kurios, priešingai, neatpažino E6- ekspresuojančias naviko ląsteles, net kai jos buvo paskatintos ekspresuoti pakankamai paviršiaus MHC II klasės teisingai pateikiančio alelio (DQA1*01:02/DQB1*05:02) naudojant IFN arba CIITA transdukciją (4 pav.). CIITA ekspresija sukelia ne tik MHC-II baltymų paviršinę ekspresiją, bet ir HLA-DM bei nekintamų grandinių molekules, kurios reikalingos antigenų apdorojimui ir pateikimui (28). Priešingai, šis TCR atpažino su HLA suderintas B ląsteles, kai antigenas buvo nukreiptas į MHC-II kelią. Panaši situacija buvo pastebėta KRASG12V specifinio, HLA-DRB5*01:01 riboto TCR, galinčio atpažinti HLA atitinkančias B ląsteles, bet ne MHC-II ekspresuojančias naviko ląsteles, atveju, kai antigenas buvo nukreiptas į MHC-II pristatymo būdas. Abu TCR pasižymėjo pakankamu funkciniu avidiškumu, kad galėtų tarpininkauti endogeniškai išreikštų antigenų atpažinimui aukščiau aprašytomis sąlygomis, ir abu galėjo tarpininkauti peptidais pakrautų tikslinių ląstelių citotoksiškumui. Pastarasis stebėjimas atspindi aplinkybę, pateiktą keliose ataskaitose apie citotoksines CD4+ T ląsteles, nors mūsų duomenys išplečia šio stebėjimo kontekstą, parodydami, kad endogeninė šaltinio antigeno ekspresija ir MHC-II indukcija IFN- yra mažai tikėtina. gauti fiziologinį tikslą ant epitelio gautų navikų ląstelių TCR prieš branduolinius arba su membranomis susijusius antigenus. Naujausi žmogaus šlapimo pūslės vėžio ir melanomos tyrimai atskleidė genetinius požymius, atitinkančius citotoksines CD4+ T ląsteles tarp TIL (14, 15). Funkciniu požiūriu šie citotoksiniai CD4+ TIL gali tiesiogiai atpažinti nuo MHC-II priklausomą naviką, o tai galiausiai lemia tikslinę granzimų lizę, panašiai kaip jų CD8+ analogai. Tačiau terapinį šių radinių vertimą gali apriboti tai, kad keli solidūs navikai ekspresuoja MHC-II. Iš tiesų, 2 nepriklausomų tyrimų rezultatai rodo, kad tik maždaug trečdalis pacientų, sergančių melanoma, turi MHC-II+ naviko ląstelių, o šių ląstelių dažnis navike dažnai yra mažesnis nei 10 % (15, 29). Atrodo, kad vyraujantis MHC-II ląstelių šaltinis naviko mikroaplinkoje yra infiltruojantys leukocitai (26).

6 pav. MHC-II+ KRASG12V+ naviko ląstelės nepateikia KRASG12V išvestų epitopų CD4+ T ląstelėms. (A)

Nors kai kurios kietojo naviko ląstelės ekspresuoja arba konstitucinį, arba indukuojamą MHC-II, mūsų rezultatai rodo, kad nepaisant onkogenui specifinių CD4+ T ląstelių tarp TIL ir PBMC, šios ląstelės negali tiesiogiai atpažinti ir lizuoti antigeną ekspresuojančių ląstelių. MHC-II+ naviko ląstelės, o to paties baltymo epitopai gali būti veiksmingai pateikti CD8+ T ląstelėms ant MHC-I (13). Tai rodo, kad vien tik tikslinio antigeno ekspresijos gali nepakakti, kad CD4+ T ląstelės atpažintų navikų, ekspresuojančių MHC-II, pogrupį. Be to, atrodo, kad šie rezultatai yra nuoseklūs daugeliui navikų tipų, nes šiame tyrime tiriamos ląstelių linijos apima tas, kurios buvo gautos iš HNSCC, plaučių adenokarcinomos ir kasos vėžio. Dviejuose tyrimuose buvo pranešta apie tiesioginį melanomos ląstelių linijų, ekspresuojančių MHC-II natūraliai arba po CIITA transdukcijos, CD{12}} T ląstelių atpažinimą (30, 31). Tačiau abiejuose šiuose tyrimuose didelė dalis tirtų TCR tiesiogiai neatpažino naviko ląstelių. Neaišku, ar šie TCR yra „šališki“ klonotipai, kurie neatpažįsta naviko antigenų, ar specifiniai navikui būdingi TCR, kurie negali atpažinti savo giminingo antigeno dėl antigeno pateikimo trūkumų, tokių kaip šiame tyrime. Oliveira ir kt. (31) parodė, kad tiesioginis CD4+ T ląstelių atpažinimas apsiribojo 2 melanomomis, turinčiomis itin didelę naviko mutacijų naštą, o tai rodo, kad šis fenotipas gali sukelti papildomų būtinų pakitimų, leidžiančių MHC-II pateikti naviko antigenus. Nors prijungus MITD prie imunogeninio KRASG12V fragmento CD4+ T ląstelės tiesiogiai neatpažino naviko ląstelių, tyrimais buvo aprašytas endogeninių peptidų, gautų iš su membrana susietų baltymų, išplautų iš MHC-II, šališkumas. dėl membranų perdirbimo (26, 32). Plazmos membranoje yra melanomos antigenas Trp1, kuris gali palengvinti B16 naviko ląstelių tiesioginį pristatymą CD4+ T ląstelėms (33). Kitą su melanoma susijusį antigeną gp100 auglio ląstelės pristato CD4+ T ląstelėms tokiu būdu, kuris priklauso nuo gp100 transmembraninio domeno (34). Naujausiame darbe, tiriančio neoantigenui specifinių CD4+ T ląstelių vaidmenį pelių sarkomos modelyje, epitopai, gauti iš mutavusio integrino subvieneto, taip pat su membrana susieto baltymo, buvo išplauti iš MHC-II ant CIITA transdukuoto naviko. ląstelės (35). Mūsų rezultatai rodo, kad nors prie membranos surišti baltymai gali būti pirmiausia perduodami į endosomas, kad būtų galima tiesiogiai pateikti MHC-II, vien imunogeninio membraninio baltymo buvimo nepakanka šiam pristatymui skatinti. Buvo aprašyti kiti neklasikiniai pateikimo būdai, kurie gali leisti citozoliniams arba branduoliniams baltymams patekti į MHC-II, įskaitant su autofagija susijusį intracelulinių baltymų ir transporterio pateikimą, susijusį su nuo antigeno apdorojimo priklausomu pateikimu CD4+ T ląstelėms, todėl antigeninis poveikis peptidai tikriausiai perkeliami iš MHC-I į MHC-II membranos perdirbimo metu (36, 37). Buvo pranešta apie tiesioginį nuo MHC-II priklausomą autologinių navikų ląstelių atpažinimą pagal CD4+ T ląsteles, specifines E7 epitopams (38, 39); tačiau abu šie tyrimai buvo susiję su E7 baltymais, išreikštais mažiau paplitusių onkogeninių ŽPV potipių (būtent ŽPV-33 ir ŽPV-59), kuriuos pateikia gimdos kaklelio vėžio ląstelės HLA-DR molekulėse. Todėl gali būti, kad ŽPV potipis, naviko histologija ir ribojantys HLA aleliai taip pat gali būti svarbūs veiksniai diferencijuojant branduolinių ŽPV antigenų pateikimą MHC-II+ naviko ląstelėse. Nors mūsų duomenys rodo, kad tiesioginis naviko citotoksiškumas nėra tikėtinas E6- ir KRASG12V specifinių CD4+ T ląstelių mechanizmas, buvo aprašyti kiti priešnavikiniai CD4+ T ląstelių mechanizmai. navikui būdingų CD{70}} T ląstelių perkėlimas vėžiu sergantiems pacientams parodė priešnavikinį aktyvumą (7, 40, 41). Todėl MHC-II apriboti TCR, pvz., nustatyti šiame tyrime, gali būti naudingi ACT žmonėms, atsižvelgiant į tai, kad tokie TCR nukreipti į epitopus, gautus iš vairuotojų onkoproteinų, apribotų HLA haplotipais, 1,27 % ir 16,10 % JAV baltųjų. gyventojų atitinkamai HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 ir HLA-DRB5*01:01 (42). Pažymėtina, kad CD4+ T ląstelės padeda sukurti navikui specifines CD8+ T ląsteles, licencijuojant antigenus turinčius DC priklausomai nuo CD40L (43–45). Mes parodome, kad šiame tyrime nustatytas KRASG12V specifinis TCR atpažįsta kryžmiškai pateiktus antigenus DC kontekste, o tai rodo, kad šios ląstelės gali prisidėti prie priešnavikinio imuniteto per šią funkciją. CD4+ T ląstelės taip pat gali teikti vietinę pagalbą CD8+ T ląstelėms augliuose, nes išskirdamos citokinus, tokius kaip IL-2 ir IFN-, palaikančios CD8+ T ląstelių išgyvenimą ir įdarbinimas į naviką (46). Be to, CD{106}} TIL gali atpažinti antigenus naviko mikroaplinkoje ant mieloidinių ląstelių, pvz., makrofagų. Iš tiesų, ikiklinikiniai tyrimai parodė, kad nesant MHC-II ant naviko ląstelių, perkeltos Trp1 CD{109}} T ląstelės vis tiek gali turėti priešnavikinį imunitetą, priklausantį nuo IFN- ir koreliuoti su padidėjusiu makrofagų citotoksiniu aktyvumu (47). Tačiau atrodo, kad šis reiškinys priklauso nuo naviko antigeno sekrecijos, kuri, mūsų manymu, yra minimali daugumos onkogenų atveju. Apskritai mūsų tyrime pabrėžiamas MHC-II+ naviko ląstelių tiesioginio endogeninių antigenų pateikimo selektyvumas ir parodoma, kad vien CIITA ekspresijos ar su membrana susieto antigeno buvimo nepakanka, kad CD būtų skatinamas tiesioginis naviko ląstelių atpažinimas.{115} } T ląstelės. Reikia daugiau tyrimų, kad būtų galima apibūdinti, kokius antigenus gali tiesiogiai pateikti MHC-II+ naviko ląstelės, kokiomis sąlygomis, kad būtų galima visiškai suprasti nuo konteksto priklausomą CD4+ T ląstelių vaidmenį sergant vėžiu.

cistanche augalą stiprinanti imuninė sistema

Metodai

Ląstelių kultūros. TIL buvo surinkti ir auginami, kaip aprašyta anksčiau (48). Trumpai tariant, pirminis naviko audinys buvo išpjaustytas į 2–3 mm fragmentus, kurie dedami į 24-šulinėlių plokštelę ir kultivuojami RPMI-1640, papildytu 1{{102}} %. žmogaus AB serumas, penicilinas-streptomicinas, HEPES, gentamicinas ir 6,000 TV/mL IL-2. Ekstravazuoti TIL buvo kultivuojami keičiant pusę terpės kas 2–3 dienas. Pirminės žmogaus T ląstelės iš periferinio kraujo buvo kultivuojamos 50:50 terpėje, susidedančioje iš 50 % AIM V ir 50 % RPMI-1640, papildyto 10 % žmogaus AB serumu, penicilinu-streptomicinu (100 V/). ml; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 TV/mL IL-2, 5 ng/mL IL-7 ir 5 ng/ml IL-15. Iš pacientų gautos naviko ląstelių linijos buvo sukurtos ir kultivuojamos, kaip aprašyta anksčiau (17). Trumpai tariant, pirminis naviko audinys buvo supjaustytas į mažesnius nei 2 mm fragmentus ir atskirtas naudojant GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Auglio ląstelės buvo resuspenduotos F-Media, turinčioje 5 μM Rho kinazės inhibitoriaus, ir padengtos ant apšvitintų 3T3 fibroblastų (30 Gy) sluoksnio. Po pradinio kultivavimo naviko ląstelės buvo padaugintos 3:1 apšvitintos 3T3-kondicionuojamos terpės ir F-terpės, turinčios 5 μM Rho kinazės inhibitoriaus, mišinyje. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L ir B-LCL buvo palaikomi RPMI terpėje, papildytoje l-glutaminu ir HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1 mM natrio piruvato (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1 × MEM neesminių aminorūgščių (Gibco, Thermo Fisher Scientific) ir penicilino-streptomicino (100 U/ ml; Gibco). Mes palaikėme 293GP (ATCC) DMEM terpės priede su 10% FBS ir penicilinu-streptomicinu (kiekviena po 100 V / ml; Gibco, Thermo Fisher Scientific). IHW03304, GM3107, KAS011, D8 ir D66 ląstelės buvo Alessandro Sette (La Jolla imunologijos instituto) dovanos. ELISPOT tyrimai. TIL arba PBMC buvo padengti 100 000 ląstelių viename duobutėje ELISPOT plokštelėse, padengtose antiIFN-Abs (1-D1K, Mabtech). Ląstelės buvo pakartotinai stimuliuojamos naudojant HPV-16 E6 ir E7 PepMix (JPT) peptidų telkinius, peptidų telkinius, vaizduojančius pasirinktas onkogenines mutacijas, arba nurodyti atskiri peptidai 5 ug/mL telkiniams arba 10 ug/ml peptidams 22 valandas prieš vystant. ELISPOT plokštės pagal gamintojo instrukcijas (Mabtech). Teigiamai kontrolei buvo naudojamas 5 ug/mL fitohemagliutinino-L. Ex vivo ekspansijos kultūra. PBMC buvo padengti peptidų telkiniu, vaizduojančiu pasirinktas onkogenines mutacijas 5 ug / ml. 4, 7 ir 10 dienomis buvo pridėta šviežia terpė, turinti 10 TV/mL IL-2. 14 dieną PBMC buvo iš naujo stimuliuojami, kad būtų galima naudoti ELISPOT arba citokinų sekrecijos tyrimuose. TCR sekos nustatymas. TIL arba PBMC buvo pakartotinai stimuliuojami 5 ug/mL HPV -16 E6 PepMix (JPT) arba KRASG12V peptidu, o IFN išskiriančios ląstelės buvo fluorescenciniu būdu pažymėtos naudojant Human IFN- Secretion Assay rinkinį pagal gamintojo instrukcijas (Miltenyi Biotec). . Pavienės IFN- + ląstelės buvo surūšiuotos į 96-šulinėlių plokštelę, naudojant FACSAria (BD Biosciences), o RNR-Seq buvo atlikta naudojant Illumina Miseq, siekiant nustatyti suporuotą TCR ir grandines. Norint identifikuoti E6-specifinį CD4+ TCR kloną, IFN išskiriančios ląstelės buvo surūšiuotos taip, kaip nurodyta aukščiau, o TCR ir TCR sekos amplifikuotos įdėtuoju, multipleksuotu PGR, kaip aprašyta anksčiau (49). PGR produktai buvo pateikti Sangerio sekvenavimui (ETON Biosciences). TCR dažnio analizei PBMC prieš ir po 14-dienos ex vivo išplėtimo nurodytais peptidais buvo išsiųsti į Adaptive Biotechnologies. ŽPV ekspresijos analizė. RNR buvo išskirta iš Hu-56 pirminių naviko ląstelių ir naviko ląstelių linijos ir pateikta masinei RNR-Seq. Suporuotų galų sekos rodmenys buvo susieti naudojant BWA (v0.7.12) (50) su pilnu ŽPV genomu (GenBank registracijos Nr. NC_001526.2) ir atitinkamu jo transkriptu. Gautas sekos derinimo žemėlapio failas buvo konvertuotas į surūšiuotą dvejetainį derinimo žemėlapį ir indeksuojamas, o po to skaičiuojami susieti skaitymai naudojant SAMtools (v1.2) (50). Viso egzomo sekos nustatymas. Viso egzomo sekos nustatymas ir RNR-Seq buvo atlikti La Jolla imunologijos sekos branduolio institute, naudojant atitinkamai Agilent viso egzomo fiksavimo ir Illumina rinkinius. Mooreso vėžio centras išplatino FFPE biopavyzdžius „Tempus“ naujos kartos sekos nustatymui kartu su suderinta etalonine DNR, naudojant periferinio kraujo mėginius. Sekos skaitymai iš auglio egzomo sekos nustatymo ir normalūs mėginiai buvo suderinti su etaloniniu genomu GRCh38 naudojant SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Exome variantai buvo nustatyti naudojant SpeedSeq Somatic, o variantai anotuoti naudojant SNPeff (v4.3i) (52). Šio rankraščio RNA-Seq ir viso egzomo sekos duomenys buvo įkelti į NCBI BioProject, registracijos numeris PRJNA924789. T ląstelių retrovirusinė transdukcija. TCR nukleotidų sekos buvo susintetintos ir klonuotos į MSGV1 retroviruso pagrindą naudojant BioXP 3200 (Codex). Seka buvo optimizuota ekspresijai žmogaus ląstelėse. Žmogaus TCR pastovios sritys buvo pakeistos į pelės TCR pastovias sritis su pakeitimais, siekiant sustiprinti paviršiaus ekspresiją ir skatinti pirmenybinį poravimą (53, 54). Žmogaus PBMC buvo išskirti iš buffy coats. CD4+ arba CD{8+ T ląstelės buvo pašalintos magnetinės atrankos būdu, o neigiama frakcija, kurioje buvo visi likę limfocitai, buvo kultivuojama T ląstelių terpėje su 50 ng/ml anti-CD3 Ab (OKT3) 2 dienų.

Cistanche tubulosa-Antitumor pranašumai

TCR retrovirusiniai supernatantai buvo sukurti kotransfekuojant 293GP ląsteles su MSGV1 vektoriumi, turinčiu atitinkamą TCR seką ir RD113 plazmidę. Praėjus dviem dienoms po transfekcijos, retrovirusiniai supernatantai buvo paimti ir naudojami švieži arba užšaldyti –80 laipsnių temperatūroje. Transdukcijos buvo atliktos ant RetroNectin dengtų plokštelių (Takara), kaip aprašyta anksčiau (5). Pelės TCR pastovios srities ekspresija buvo įvertinta srauto citometrija, siekiant nustatyti transdukcijos efektyvumą. TCR sukurtos T ląstelės buvo panaudotos ne anksčiau kaip 7 dieną po pradinės stimuliacijos. T ląstelių funkciniai tyrimai. Mes kartu kultivavome 5 × 104 TIL, transdukuotas T ląsteles arba J76 Jurkat ląsteles su 1 × 105 B-LCL, pulsuotomis per naktį su nurodytomis koncentracijomis peptidų arba 5 × 103 naviko ląstelių, pasėtų praėjusią dieną {{16} } šulinėlių U formos arba plokščiadugnės plokštės, atitinkamai. Kur nurodyta, anti-CD28 agonistų (klonas CD28.2, BioLegend) arba anti-PD-L1 blokuojančių (klonas 29E.2A3, BioLegend) Abs buvo pridėta į T ląstelių ir naviko ląstelių kokultūras atitinkamai 5 ir 10 ug/ml. Citokinų ir aktyvacijos žymenų tyrimams kaip teigiama kontrolė buvo naudojamas 1 × ląstelių aktyvavimo kokteilis (BioLegend), kuriame yra PMA ir jonomicino. Atliekant ŽLA blokavimo tyrimus, 20 ug/mL šių Abs buvo pridėta prie peptidais impulsuojamų B-LCL likus mažiausiai 2 valandoms iki T ląstelių pridėjimo: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR. (L243, BioLegend) arba pelės IgG2a izotipo kontrolė (MOPC-173, BioLegend). Jei nurodyta, naviko ląstelės buvo kultivuojamos 72 valandas su 10 ng/ml rekombinantiniu IFN- prieš pridedant T ląstelių. Supernatantai buvo paimti po 18–24 valandų, IFN buvo išmatuotas ELISA (Thermo Fisher Scientific), o ląstelių granulės buvo nudažytos srauto citometrijai. Citotoksiškumo tyrimai buvo atlikti kartu kultivuojant T ląsteles su naviko ląstelėmis, esant nurodytam efektoriaus ir taikinio santykiui. Trumpai tariant, 5 × 103 naviko ląstelės buvo pasėtos ir kultivuojamos per naktį, prieš pridedant T ląstelių nurodytais santykiais. Tikslinė ląstelių lizė buvo nustatyta naudojant xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences), kuris įvertino elektrinę varžą dėl ląstelių sukibimo kas 30 minučių iki eksperimento pabaigos. Duomenys buvo analizuojami naudojant xCELLigence RTCA programinės įrangos paketą, o rezultatai buvo pateikti kaip ląstelių indeksas, normalizuotas iki 1 tuo metu, kai buvo pridėtos T ląstelės. MHC-II pateikimo tyrimas. Sintetinės DNR konstrukcijos, koduojančios toliau nurodytus dalykus, buvo sukurtos ir klonuotos į MSGV1 naudojant BioXP 3200 (Codex): žmogaus HLA-B geno N-galinės 25 aminorūgštys, po kurių seka pirmosios 50 HPV -16 E6 aminorūgščių arba 25 KRASG12V aminorūgštys, sujungtos su C-galo 55 aminorūgštimis žmogaus HLA-B, T2A savaime skaidančio elemento ir koduojančios EGFP sekos. Virusiniai supernatantai buvo sukurti, kaip aprašyta aukščiau, o autologiniai B-LCL buvo transdukuoti ant RetroNectin dengtų plokštelių po nakties stimuliacijos apšvitintų (0,5 Gy) 3T3 ląstelių, ekspresuojančių žmogaus CD40L (3T3-CD40L), lovoje. Transdukcijos efektyvumas buvo įvertintas srauto citometriniu EGFP ekspresijos kiekybiniu įvertinimu. Transdukuoti B-LCL buvo stimuliuojami 3T3-CD40L, esant 200 TV/mL rekombinantinio žmogaus IL-4 (PeproTech), 2 kartus iš eilės po 2–3 dienas prieš auginimą kartu su autologiniais TIL. DC generavimas antigeno pateikimo tyrimams. DC buvo sukurti naudojant plastiko sukibimo metodą. Sušaldyti PBMC buvo atšildyti ir padengti DC terpėje (RPMI{88}}, papildyta l-glutaminu, 5% termiškai inaktyvuotu žmogaus AB serumu ir 100 V/ml kiekvieno penicilino-streptomicino) 2 valandoms 37 laipsnių temperatūroje. Neprilipusios ląstelės buvo pašalintos plaunant šiltu PBS, o prilipusios ląstelės buvo kultivuojamos DC terpėje, papildytoje 800 V/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) ir 500 V/mL IL-4 (PeproTech) 6 dienas. . Per naktį tiesiai į nesubrendusius DC pridėjome 1 ug/mL KRASG12V peptido arba 20 ug/mL KRASG12V arba WT KRAS baltymo (Abcam). Kitą dieną DC buvo surinkti ir per naktį auginami su TCR sukurtomis T ląstelėmis santykiu 1: 1, prieš įvertinant CD137 padidėjimą srauto citometrija. Retrovirusinė naviko ląstelių transdukcija. Žmogaus CIITA koduojanti seka buvo susintetinta (Integrated DNA Technologies) ir klonuota į MSGV1 Gibson Assembly. Koduojančios HLADRB5*01:01 sekos ir grandinės, atskirtos P2A seka, buvo susintetintos (Integrated DNA Technologies) ir klonuotos į modifikuotą pHAGE lentivirusinį vektorių prieš T2A seką, po to sutrumpintą CD34 reporterio seką Gibson Assembly. Retrovirusiniai supernatantai buvo sukurti naudojant MSGV1, kaip aprašyta aukščiau. Lentivirusiniai supernatantai buvo sukurti kotransfekuojant 293T ląsteles su pHAGE, tat, rev, gag/pol ir vsv-g plazmidėmis. Virusiniai supernatantai buvo surinkti po 24 valandų ir sukoncentruoti centrifuguojant Amicon Ultra 5 mėgintuvėliuose (MilliporeSigma). Auglio ląstelės buvo padengtos ir po 1 dienos terpė buvo pakeista retrovirusiniu arba lentivirusiniu supernatantu, papildytu 10 ug / ml polibreno. Po keturių valandų viruso turintis supernatantas buvo išsiurbtas ir pakeistas auginimo terpe. MHC-II+ ir CD{126}} naviko ląstelės buvo surūšiuotos naudojant FACS Fusion ląstelių rūšiavimo įrenginį (BD Biosciences). Srauto citometrija. Ląstelės buvo paženklintos su fluorochromu konjuguotais monokloniniais antigenais: anti-žmogaus CD3-PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4-PE-Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8-APC (Hit8a, Tonbo). , Cytek Biosciences), CD34 – Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69 – PerCP – Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137 – PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II-APC (Tü39, BioLegend) ir anti-pelės TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Negyvos ląstelės buvo nudažytos DAPI arba LIVE / DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–PE tetrameras buvo surinktas ir paženklintas NIH tetramerio pagrindinio įrenginio. Ląstelės buvo nudažytos 1 ug / ml tetrameru 1 valandą ant ledo. Ab dažymas paviršiaus antigenams buvo atliktas 15 minučių ant ledo. Intraląsteliniam citokinų dažymui (ICS) T ląstelės buvo kultivuojamos kartu su peptidais pulsuojančiais APC 4–6 valandas, dalyvaujant Brefeldin A. Po paviršiaus dažymo ląstelės buvo permeabilizuotos ir nudažytos tarpląsteliniams citokinams naudojant Cytofix/Cytoperm rinkinį (BD Biosciences). , pagal gamintojo instrukcijas. Citokinų dažymui buvo naudojami šie su fluorochromu konjuguoti Abs: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2-FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11). , BioLegend) ir Granzyme B-PE (QA16A02, BioLegend). Duomenys buvo gauti naudojant FACSCelesta srauto citometrą (BD Biosciences) ir analizuojami naudojant FlowJo v10.7 programinę įrangą. Statistika. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant Prism 8 (GraphPad Software). ICS palyginimui buvo naudojamas nesuporuotas 2-tailed t testas. Palyginti HLA blokuojančią Ab–Ab sąlygojamą T ląstelių signalizacijos slopinimą, buvo naudojamas 2-ANOVA metodas. P < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu. Studijų patvirtinimas. Šiame tyrime naudojami neidentifikuoti žmogaus mėginiai buvo gauti gavus informuotą sutikimą pagal UCSD IRB protokolą 101391CX „Naviko aplinkos fenotipų nustatymas ir ląstelių išskyrimas“. Rašytinį sutikimą davė tyrime dalyvavę asmenys.

Nuorodos

1. Hanahan D, Weinberg RA. Vėžio požymiai: nauja karta. Ląstelė. 2011;144(5):646–674.

2. Shamseddine AA ir kt. Auglio imunitetas ir imunoterapija su ŽPV susijusiems vėžiams. Vėžio atradimas. 2021;11(8):1896–1912.

3. Simanshu DK ir kt. RAS baltymų ir jų reguliatorių apžvalga žmonių ligose. Ląstelė. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ ir kt. Netikėtai didelis polikloninis ŽPV specifinių T ląstelių repertuaras yra pasirengęs veikti pacientams, sergantiems gimdos kaklelio vėžiu. Cancer Res. 2010;70(7):2707–2717.

5. Stevanović S ir kt. Imunogeninių naviko antigenų kraštovaizdis sėkmingoje virusų sukelto epitelio vėžio imunoterapijoje. Mokslas. 2017;356(6334):200–205.

6. Bhatt KH ir kt. ŽPV-16-specifinių T ląstelių atsakų profiliavimas atskleidžia platų antigenų reaktyvumą burnos ir ryklės vėžiu sergantiems pacientams. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.

7. Veatch JR ir kt. Į naviką infiltruojančios BRAF V600E specifinės CD4 + T ląstelės koreliavo su visišku klinikiniu atsaku sergant melanoma. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.

8. Veatch JR ir kt. Endogeninės CD4+ T ląstelės atpažįsta plaučių vėžiu sergančių pacientų neoantigenus, įskaitant pasikartojančias onkogenines KRAS ir ERBB2 (Her2) mutacijas. Cancer Immunol Res. 2019;2(13):910–922.

9. Cafri G ir kt. Atminties T ląstelės, nukreiptos į onkogenines mutacijas, aptiktas epitelio vėžiu sergančių pacientų periferiniame kraujyje. Nat Commun. 2019;10(1):449.

10. Tran E ir kt. T-ląstelių perdavimo terapija, nukreipta į mutantą KRAS sergant vėžiu. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.

11. Draper LM ir kt. ŽPV-16+ epitelio vėžio ląstelių taikymas TCR genų inžinerijos būdu sukurtomis T ląstelėmis, nukreiptomis prieš E6. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.

12. Jin BY ir kt. Sukurtos T ląstelės, nukreiptos į E7, tarpininkauja žmogaus papilomos viruso vėžio regresijai pelių modelyje. JCI įžvalga. 2018;3(8):e99488.

13. Bear AS ir kt. Biocheminis ir funkcinis mutantinių KRAS epitopų apibūdinimas patvirtina šį onkoproteiną imunologiniam taikymui. Nat Commun. 2021;12(1):4365.

14. Oh DY ir kt. Intratumorinės CD4+ T ląstelės tarpininkauja priešnavikiniam citotoksiniam poveikiui žmogaus šlapimo pūslės vėžiui. Ląstelė. 2020;181(7):1612–1625.

15. Cachot A ir kt. Specifinės naviko citolitinės CD4 T ląstelės tarpininkauja apsauginiam imunitetui nuo žmogaus vėžio. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.

16. Doran SL ir kt. T-ląstelių receptorių genų terapija su žmogaus papilomos virusu susijusiems epitelio vėžiams: pirmasis žmogaus, I / II fazės tyrimas. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.

17. Liu X ir kt. Sąlyginis perprogramavimas ir ilgalaikis normalių ir navikinių ląstelių išplėtimas iš žmogaus biopavyzdžių. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.

18. Veatch JR ir kt. Žmogaus melanomos neoantigenui specifinės CD{2}} T ląstelės turi įvairias diferenciacijos būsenas ir koreliuoja su CD8+ T ląstelių, makrofagų ir B ląstelių funkcijomis. Vėžio ląstelė. 2022;40(4):393–409.

19. Lowery FJ ir kt. Priešnavikinių neoantigenu reaktyvių T ląstelių iš metastazavusių žmogaus vėžio molekuliniai parašai. Mokslas. 2022;375(6583):877–884.

20. Kreiter S ir kt. Padidėjęs antigenų pateikimo efektyvumas sujungiant antigenus su MHC I klasės prekybos signalais. J Immunol. 2008;180(1):309–318.

21. Zaretsky JM ir kt. Mutacijos, susijusios su įgytu atsparumu PD-1 blokadai sergant melanoma. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.

22. Gros A ir kt. Žmogaus virškinimo trakto vėžio neoantigenų atpažinimas cirkuliuojančiais PD-1+ limfocitais. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.

23. Scholtalbers J ir kt. TCLP: internetinis vėžio ląstelių linijų katalogas, integruojantis HLA tipą, numatomus neoepitopus, virusą ir genų ekspresiją. Genome Med. 2015;7(1):118.

24. Juneja V, Choi J, išradėjai; BioNTech US Inc., perėmėjas. T ląstelių receptorių konstrukcijos ir jų panaudojimas. JAV patentas Nr. US202103040215A1. 2021 m. lapkričio 4 d.

25. Sharpe AH, Pauken KE. Įvairios PD1 slopinimo kelio funkcijos. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.

26. Abelin JG ir kt. HLA-II ligando apdorojimo ir surišimo taisyklių apibrėžimas naudojant masės spektrometriją pagerina vėžio epitopo prognozę. Imunitetas. 2019;51(4):766–779.

27. Silvius JR ir kt. K-ras4B ir preniliuoti baltymai, neturintys „antrųjų signalų“, dinamiškai asocijuojasi su ląstelių membranomis. Mol Biol Cell. 2006;17(1):192–202.

28. Chang CH, Flavell RA. II klasės transaktyvatorius reguliuoja daugelio genų, dalyvaujančių antigeno pateikime, ekspresiją. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.

29. Rodigas SJ ir kt. MHC baltymai suteikia skirtingą jautrumą CTLA-4 ir PD-1 blokadai negydytos metastazavusios melanomos atveju. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.

30. Ahmadzadeh M ir kt. Į navikus įsiskverbiančios žmogaus CD4+ reguliuojančios T ląstelės turi skirtingą TCR repertuarą ir pasižymi naviko ir neoantigeno reaktyvumu. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.

31. Oliveira G ir kt. Pagalbinių ir reguliuojančių priešnavikinių CD4+ T ląstelių kraštovaizdis sergant melanoma. Gamta. 2022;605(7910):532–538.

32. Rokas KL ir kt. Pristatyk save! Pagal MHC I klasės ir MHC II klasės molekules. Trends Immunol. 2016;37(11):724–737.

33. Takechi Y ir kt. Melanosominės membranos baltymas yra ląstelių paviršiaus taikinys melanomos gydymui. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.

34. Lepage S, Lapointe R. Melanosomų nukreipimo sekos iš gp100 yra būtinos MHC II klasės riboto endogeninio epitopo pateikimui ir mobilizacijai į endosominius skyrius. Cancer Res. 2006;66(4):2423–2432.

35. Alspach E ir kt. MHC-II neoantigenai formuoja naviko imunitetą ir atsaką į imunoterapiją. Gamta. 2019;574(7780):696–701.

36. Dengjel J ir kt. Autofagija skatina MHC II klasės peptidų pateikimą iš tarpląstelinių šaltinių baltymų. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.

37. Matsuzaki J ir kt. Neklasikiniai antigeno apdorojimo keliai reikalingi MHC II klasės apribotam tiesioginiam naviko atpažinimui NY-ESO-1- specifinių CD4+ T ląstelių. Cancer Immunol Res. 2009;2(4):341–350.

38. Höhn H ir kt. CD4+ naviką infiltruojantys limfocitai sergant gimdos kaklelio vėžiu atpažįsta ŽLA-DR apribotus peptidus, kuriuos teikia žmogaus papilomos virusas-E7. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.

39. Höhn H ir kt. Žmogaus papilomos viruso 33 tipo E7 peptidai, kuriuos HLA-DR*0402 pateikia naviką infiltruojančioms T ląstelėms sergant gimdos kaklelio vėžiu. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.

40. Lu YC ir kt. Metastazavusiu vėžiu sergančių pacientų gydymas naudojant pagrindinį II klasės riboto histokompatibilumo komplekso T-ląstelių receptorių, nukreiptą į vėžio gemalo linijos antigeną MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.

41. Tran E ir kt. Vėžio imunoterapija, pagrįsta mutacijai specifinėmis CD4+ T ląstelėmis pacientams, sergantiems epitelio vėžiu. Mokslas. 2014;344(6184):641–645.

42. Gonzalez-Galarza FF ir kt. Alelių dažnių tinklo duomenų bazės (AFND) 2020 m. atnaujinimas: aukso standarto duomenų klasifikacija, atviros prieigos genotipo duomenys ir nauji užklausų įrankiai. Nucleic Acids Res. 2020;48(d1): D783–D788.

43. Schoenberger SP ir kt. T-ląstelių pagalba citotoksiniams T limfocitams yra susijusi su CD40-CD40L sąveika. Gamta. 1998;393(6684):480–483.

44. Ahrends T ir kt. CD4+ T ląstelės padeda vykdyti citotoksinių T ląstelių efektorių programą, įskaitant slopinamąjį receptorių reguliavimą ir padidėjusį audinių invaziškumą. Imunitetas. 2017;47(5):848–861.

45. Ferris ST ir kt. cDC1 pirmauja ir yra licencijuotos CD4+ T ląstelių, kad sukeltų priešnavikinį imunitetą. Gamta. 2020;584(7822):624–629.

46. ​​Bos R, Sherman LA. CD4+ T-ląstelių pagalba naviko aplinkoje reikalinga CD8+ T limfocitų įsisavinimui ir citolitinei funkcijai. Cancer Res. 2010;70(21):8368–8377.

47. Haabeth OAW ir kt. CD4+ T ląstelių sukeltas MHC II klasės teigiamų naviko ląstelių atmetimas priklauso nuo antigeno sekrecijos ir netiesioginio pateikimo šeimininko APC. Cancer Res. 2018;78(16):4573–4585.

48. Dudley ME ir kt. Į naviką infiltruojančių limfocitų kultūrų generavimas, skirtas naudoti melanomos pacientų įvaikinimo terapijoje. J Imunother. 2003;26(4):332–342.

49. Dash P ir kt. T-ląstelių receptorių repertuaro vienos ląstelės analizė. Metodai Mol Biol. 2015;1343:181–197.

50. Li H ir kt. Sekos lygiavimo / žemėlapio formatas ir SAM įrankiai. Bioinformatika. 2009;25(16):2078–2079.

51. Chiang C ir kt. SpeedSeq: itin greita asmeninio genomo analizė ir interpretacija. Nat metodai. 2015;12(10):966–968.

52. Cingolani P ir kt. Vieno nukleotido polimorfizmų poveikio anotavimo ir prognozavimo programa, SnpEff: SNPs Drosophila melanogaster padermės w1118 genome; iso-2; iso-3. Skristi (Austinas). 2012;6(2):80–92.

53. Haga-Friedman A ir kt. Transmembraninių hidrofobinių mutacijų įtraukimas į TCR padidina jo paviršiaus ekspresiją ir T ląstelių funkcinį avidiškumą. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.

54. Cohen CJ ir kt. Sustiprintas priešnavikinis T ląstelių aktyvumas, sukurtas ekspresuoti T ląstelių receptorius antruoju disulfidiniu ryšiu. Cancer Res. 2007;67(8):3898–3903.