UMOD mutacijos sergant lėtine inkstų liga Taivane

Santrauka:UMODyra pirmasis identifikuotas ir dažniausiai mutavęs genas, sukeliantis autosominį dominavimątubulointersticinė inkstų liga(ADTKD). Naujausi tyrimai parodė, kad ADTKD-UMODyra gana dažna priežastislėtinė inkstų liga(CKD). Tačiau ADTKD statusasUMODTaivane lieka nežinoma. Šiame tyrime nustatėme tris heterozigotiniusUMODmissense variantai, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) ir c.817G > T (p.Val273Phe), iš viso 221 pasirinktoje CKD šeimoje (1,36%). Apie du iš šių „missense“ variantų, p.Cys41Arg ir p.Gly60Asp, anksčiau nebuvo pranešta. In vitro tyrimai parodė, kad abu uromodulino variantai turi ląstelių membranos judėjimo ir išskyrimo į auginimo terpę defektus. Struktūros modelis numatė pakitusį disulfidinio ryšio susidarymą abiejuose variantuose, tačiau tik p.Gly60Asp sukels baltymų destabilizaciją. Mūsų išvados išplečia mutacijų spektrą ir rodo, kad ADTKD-UMODprisidėjo prie nedidelės, bet reikšmingos CKD priežasties Taivano populiacijoje.

Raktažodžiai: uromodulinas;lėtinė inkstų liga(CKD); autosominis dominuojantis tubulointersticinisinkstų liga(ADTKD); inkstų nepakankamumas (KF).

SPAUSKITE ČIA, KAD GAUTI CISTANCHE ŽOLELINIŲ PAPILDŲ NAUDOJANT INKSTŲ ligą

1. Įvadas

ADTKD yra reta dominuojanti paveldima liga, kurią sukelia heterozigotinės UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] ir SEC61A1 [5] mutacijos. UMOD yra pirmoji nustatyta ir dažniausia ADTKD priežastis, todėl buvo atliktas išsamus tyrimas [1,6]. Nors retai, ADTKD yra trečias pagal dažnumą monogeninisinkstų ligapo ADPKD ir IV tipo kolageno nefropatijos, tačiau ADTKD-UMOD paplitimas lieka neaiškus, o naujausi tyrimai rodo, kad jis sudaro iki 2% pacientų, sergančių KF arba 0,3% visų asmenų, sergančių CKD [7, 8]. UMOD koduoja uromoduliną ir yra gausiausias baltymas žmogaus šlapime [9]. Uromodulinas yra inkstams būdingas baltymas, kurį gamina Henlės kilpos storosios kylančiosios galūnės epitelio ląstelės ir distalinio vingiuoto kanalėlio ankstyvoji dalis [10]. Jis susidaro kaip didelės molekulinės masės polimeras per savo zoną. pellucida domenas [11]. Be to, uromodulinas yra labai glikozilintas baltymas, turintis septynias N-glikozilinimo vietas ir C-galo gale suskaidomas serino proteazės hepsinu, prieš išskiriant į kanalėlių spindį [9,12,13]. Uromodulino funkcija apima apsaugą nuo kalcio oksalato kristalizacijos [14], apsaugą nuo šlapimo takų infekcijų nuo uropatogeninių bakterijų [15–18] ir Ca2+-K+ jonų kanalo reguliavimą [19]. UMOD mutacijų poveikis yra uždelstas brendimas, susilaikymas endoplazminiame tinkle (ER), sumažėjusi ekspresija plazmos membranoje ir sumažėjęs šlapimo išsiskyrimas, dėl kurio atsiranda ER stresas ir išsiskleidęs baltymų atsakas [20–22].

Klinikiniai ADTKD-UMOD fenotipai yra nespecifiniai ir apima CKD, podagrą, hiperurikemiją, normalią ar lengvą proteinuriją, šeimos istorijos buvimą ar nebuvimą ir dažniausiai sergančius KF nuo 30 iki 50 metų amžiaus asmenis [23]. Inkstų histologija rodo kanalėlių išsiplėtimą arba atrofiją, kanalėlių bazinės membranos panaikinimą arba sustorėjimą, intersticinę fibrozę ir mutavusio uromodulino kaupimąsi kaip polimorfines nestruktūrines medžiagas, atskleistas dažant PAS [24, 25].

Remiantis tarptautiniais USRDS ataskaitos palyginimais, Taivane yra didžiausias ŠKL ir KF dažnis ir paplitimas [26]. Tačiau nė vienas tyrimas nebuvo sutelktas į ADTKD-UMOD būklę CKD populiacijoje Taivane. Šiame tyrime mes ištyrėme ADTKD-UMOD mutacijų paplitimą pasirinktoje CKD grupėje viename tretiniame Taivano centre.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. CKD asmenys ir DNR paruošimas

Šiame tyrime buvo įdarbinta 221 CKD šeima (228 asmenys) iš Gaosiongo medicinos universiteto ligoninės CKD priežiūros programos. Į įtraukimo kriterijus buvo įtraukti podagros epizodai arba hiperurikemija, kai eGFR buvo mažesnis nei 90 ml/min/1,73 m2 iki 40 metų amžiaus. Kraujo mėginiai, kilmės informacija ir galimybė susipažinti su laboratorinių darbų rezultatais buvo gauti iš asmenų, davus informuotą sutikimą. Tyrimas buvo atliktas vadovaujantis Helsinkio deklaracija ir patvirtintas KMUH institucinės peržiūros tarybos (KMUHIRB-G(II)-20160024). DNR iš periferinio kraujo mėginių ekstrahuota standartiniu metodu.

2.2. Exome sekos ir bioinformatikos analizė

Exome bibliotekos kūrimui buvo naudojamas Nextera Flex for Enrichment and Exome skydelis (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, USA). Dydžio pasirinkimas, sekos fiksavimas, sodrinimas ir eliuavimas buvo atlikti pagal gamintojo instrukcijas. Tada DNR bibliotekų dydžio pasiskirstymas buvo išmatuotas naudojant TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, JAV), po to seka buvo nustatyta Illumina NovaSeq 6000 su 150 bp suporuoto galo skaitymo. Gauti fastq duomenys buvo suderinti su etalonine žmogaus genomo seka (GRCh37 / hg19) ir mes atlikome nukleotidų variantų iškvietimą naudodami DRAGEN Bio-IT platformą (Illumina). VCF failas buvo analizuojamas CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, JAV). Pagal Amerikos medicinos genetikos ir genomikos koledžo (ACMG) klasifikaciją, naudojant VarSome programinę įrangą, nustatyti variantai buvo pažymėti kaip patogeniški / tikėtinai patogeniški, neaiškios reikšmės variantas (VUS) arba gerybinis. , HGMD ir dbSNP duomenų bazės. Aptikti patogeniški, tikėtinai patogeniški ir VUS variantai buvo patvirtinti Sangerio seka. Atliekant Sanger sekvenavimą, PGR produktai buvo išgryninti krevečių šarmine fosfataze / egzonukleaze I (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, JAV), o po to iš abiejų galų buvo atlikta seka, naudojant termociklerio seką, naudojant BigDye® terminatorių 3.1 sekvenavimą. rinkinys (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV), atlikus analizę naudojant ABI 3730XL DNR analizatorių (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Segregacijos analizė buvo atlikta, jei DNR buvo prieinama iš šeimos narių. UMOD 2, 3, 4 ir 5 egzonai buvo patikrinti Sangerio sekvenavimu 221 CKD šeimos, išskyrus DY5 šeimą, kuriai buvo nustatyta egzomų seka. UMOD naudojama NCBI nuorodų seka NM_003361.4. Nukleotidams numeruoti ir mutacijoms ar variantams pavadinti buvo naudojama standartinė nomenklatūra, kurią rekomenduoja Žmogaus genomo variacijų draugija (http//www.hgvs.org/; pasiekiama 2022 m. liepos 18 d.).

2.3. Ląstelių kultūra ir trumpalaikė transfekcija

HEK293 ląstelės (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, JAV) buvo kultivuojamos Kaighn modifikuotoje Ham's F-12 terpėje (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlingtonas , MA, JAV), papildytas 10% termiškai inaktyvuotu galvijų vaisiaus serumu (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV), 100 vienetų/ml penicilino, 100 µg/ml streptomicino (10378016, Scientificrmo Fisher). ), ir 10 vienetų/ml -interferono (IF002, Merck/Millipore Sigma). Ląstelės buvo palaikomos 37 ◦ C drėgnoje 5% CO2 atmosferoje.

Laikina HEK293 ląstelių transfekcija buvo atlikta naudojant Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Trumpai tariant, 2,5 µl Lipofectamine 2000 buvo įpilta tiesiai į 100 µL Optimum terpę (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) ir inkubuojama 5 minutes kambario temperatūroje. Iš viso į Lipofectamine 2000-Optimum mišinį buvo pridėta 1 µg DNR ir inkubuojama dar 20 min. Inkubacijos pabaigoje DNR mišinys buvo lašinamas į ląstelių kultūros plokšteles su terpe be serumo. Ląstelių sveikatos būklei po trumpalaikės transfekcijos nustatyti naudojome automatinį ląstelių skaitiklį LUNA-II™ (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Korėja), kad nustatytume tripano mėlynuoju dažymo ląstelių gyvybingumą kitu laiko momentu, o dauguma transfekuotos ląstelės išliko gyvos, kai buvo per didelė uromodulino ekspresija (duomenys nerodomi).

2.4. Vietinė mutagenezė

HA žymėtas laukinio tipo uromodulino vektorius buvo gautas iš dr. Rampoldi [27]. P.Cys41Arg ir p.Gly60Asp mutacijų konstrukcijos buvo sukurtos naudojant QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (200523, Agilent) pagal gamintojo instrukcijas. Mutacijos buvo patvirtintos Sangerio seka

2.5. ELISA ir frakcionavimas

Tuščias vektorius, laukinio tipo uromodulinas, p.Cys41Arg uromodulinas ir p.Gly60Asp uromodulino ekspresijos konstruktai buvo laikinai transfekuoti į HEK293 ląsteles. Po trumpalaikės transfekcijos auginimo terpė buvo surinkta 8, 24 ir 32 val., Tada prieš matavimą laikoma –80 ◦ C temperatūroje. Imunoblotavimui auginimo terpė buvo kondensuota Centri con (YM3, piktograma, Merck / Millipore Sigma) prieš SDS-PAGE elektroforezę. ELISA buvo naudojamas uromodulino matavimams auginimo terpėje pagal gamintojo instrukcijas (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Trumpai tariant, auginimo terpė ir standartai buvo praskiedžiami tyrimo skiedikliu, esančiu rinkinyje, ir pridedami į šulinėlius dviem egzemplioriais. Po 2, 5 h inkubacijos kambario temperatūroje šulinėliai buvo plaunami PBS ir buvo pridėtas biotinilintas uromodulino antikūnas. Po 1 valandos inkubacijos kambario temperatūroje šulinėliai buvo išplauti ir pridėtas streptavidino-krienų peroksidazės antrinis antikūnas. Po 45 minučių inkubacijos kambario temperatūroje šulinėliai buvo išplauti, o spalva buvo sukurta pridedant TMB substrato tirpalo ir inkubuojant tamsoje kambario temperatūroje 30 minučių. Reakcija buvo sustabdyta pridedant komplekte pateiktą stabdymo tirpalą, po to nedelsiant nuskaitant OD450 ir OD550. Auginimo terpės uromodulino koncentracija buvo nustatyta standartinės kreivės interpoliacijos būdu.

Po to, kai buvo surinkta auginimo terpė, ląstelės, pritvirtintos prie auginimo lėkštelės, buvo frakcionuojamos naudojant tarpląstelinį baltymų frakcionavimo rinkinį (78840, Thermo Fisher Scientific) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, mes surinkome vienodus kiekius trijų skirtingų tipų uromodulino ląstelių lizato ir pašalinome visą supernatantą, kol jis buvo kuo sausesnis. Į ląstelių nuosėdas įdėjome ledo šalto citoplazminio ekstrahavimo buferio, kuriame yra proteazės inhibitorių, inkubavome 4 ◦ C temperatūroje 10 minučių švelniai maišydami, tada centrifugavome 500 × g 5 minutes. Nedelsdami pašalinome supernatantą (citoplazminį ekstraktą) į švarų iš anksto atšaldytą mėgintuvėlį ant ledo ir į nuosėdas įdėjome ledo šalto membranos ekstrahavimo buferio, kuriame yra proteazės inhibitorių. Membranos dalis buvo maišoma 5 s didžiausioje padėtyje ir inkubuojama 4 ◦ C temperatūroje 10 minučių švelniai maišant. Supernatantą (membranos ekstraktą) perkėlėme į švarų iš anksto atšaldytą mėgintuvėlį ant ledo po centrifugavimo 3000 × g 5 minutes. Subląstelinė membrana ir citoplazminis baltymas buvo analizuojami Western blot metodu.

2.6. Imunoblotavimo analizė

Baltymų mėginiai buvo paimti iš ląstelių naudojant RIPA buferį (R0278, Merck / Millipore Sigma) arba frakcionavimo etapą. Vėliau baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant baltymų tyrimo dažus (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, JAV) ir prieigą prie vienodo kiekio baltymų, tada atskirta elektroforeze SDS-PAGE. Po to, kai baltymai buvo perkelti ant polivinilideno difluorido (PVDF) membranų (1620177, BIO-RAD), PVDF membrana buvo panardinta į 5% liesą pieną esant 1X TBST, blokuojama 1 val. kambario temperatūroje ir tris kartus plaunama 1X TBST. 5 min. Tada PVDF membraną inkubavome su pirminiu antikūnu 4 ◦ C temperatūroje per naktį, tris kartus plauname 1X TBST 5 minutes ir inkubavome su antriniu antikūnu 1 valandą kambario temperatūroje. Po antrinio antikūnų inkubavimo jis tris kartus plaunamas 1X TBST 5 minutes, tada pridėjome sustiprinto chemiliuminescencijos (ECL) substrato rinkinį (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) ir aptikome baltymo signalą naudodami rentgeno procesorių (MXP{{). 19}}, KODAK, Ročesteris, NY, JAV) rentgeno juostoje (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Pirminiai ir antriniai antikūnai buvo atskiesti 5 % nugriebto pieno 1X TBST, o išsami informacija yra tokia: 1:2000 uromodulinui (sc-20631, Santa Cruz, Dalasas, TX, JAV) ir 1:20 000 triušiui. HRP 2-asis antikūnas (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, JAV).

2.7. Baltymų struktūros numatymas

Dinamitas buvo pritaikytas laukinio tipo ir mutantinio uromodulino (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; pasiekiamas 2022 m. birželio 15 d.) 3D struktūrai prognozuoti, naudojant viso ilgio natūralaus žmogaus uromodulino (baltymo) struktūrą. Duomenų bankas: 7PFP) [28]. DiANNA buvo naudojama laukinio tipo ir mutantinio uromodulino disulfidinio ryšio prognozei (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/; gauta 2022 m. birželio 16 d.) [29–31].

2.8. Statistinė analizė

„ImageJ“ analizės programinė įranga išanalizavo ir kiekybiškai įvertino Western blot juostas. Statistinės analizės ir grafikai buvo atlikti ir parengti naudojant GraphPad Prism8 programinę įrangą (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, USA), ir buvo pateiktas vidurkis ± SEM. Dviejų grupių palyginimui buvo pritaikytas nesuporuotas t testas. Statistiniai rezultatai buvo pažymėti taip: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas mažiausiai tris kartus.

Pagalbinė paslauga:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp / Tel:+86 15292862950

Parduotuvė:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop