Šlapimo eksosomos nustato su vankomicinu susijusio ūminio inkstų pažeidimo uždegimo kelius

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Linda Awdishu 1,*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 ir tiesioginių tyrėjų vardu †

1 Skagso farmacijos ir farmacijos mokslų mokykla, Kalifornijos universitetas, San Diegas, CA 92093, JAV;a6le@ucsd.edu (AL); jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 Medicinos mokykla, Kalifornijos universitetas, San Diegas, CA 92093, JAV; sobal@ucsd.edu (SB);emacedo@ucsd.edu (EM); svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (RM)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Olbanio medicinos koledžas, Olbanis, NY 12208, JAV; jorge.cerda82@gmail.com

6 Inkstų ligų ir hipertenzijos skyrius, Skagso farmacijos ir farmacijos mokykla, Aurora, CO 80045, JAV; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 Medicinos mokykla, Kolorado universitetas, Aurora, CO 80045, JAV

8 Mount Sinai medicinos mokykla, Niujorkas, NY 10029, JAV; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Ląstelinės ir molekulinės medicinos skyrius, Mičigano universiteto medicinos sistemos universitetas, Ann Arbor, MI 48109, JAV; satishpr@med.umich.edu

* Korespondencija: lawdishu@ucsd.edu; Tel.: plius 858-534-3919

† Tiesioginių tyrėjų narystė pateikiama padėkose.

Santrauka:

Fonas:Vankomicinas dažniausiai naudojamas kaip pirmos eilės gydymas gramteigiamiems mikroorganizmams, tokiems kaip meticilinui atsparus Staphylococcus aureus. Vankomicino sukeltas ūminisinkstassužalojimas(V-AKI) buvo pranešta iki 43 procentų pacientų, ypač tiems, kurių tikslinė mažiausia koncentracija buvo didesnė. Tikslus žmogaus sužalojimo mechanizmas lieka sunkiai suprantamas, nes naujausi įrodymai yra nukreipti į proksimalinę kanalėlių ląstelių apoptozę. Šiame tyrime mes ištyrėme V-AKI sergančių pacientų šlapimo egzosomų baltymų kiekį, kad toliau išsiaiškintume sužalojimo mechanizmų ir galimų atsakų biomarkerius. Metodai: Į analizę buvo įtraukti šlapimo mėginiai iš pacientų, sergančių V-AKI, kurie buvo įtraukti į DIRECT tyrimą ir atitiko sveikus kontrolinius pacientus iš UAB-UCSD O'Brien CenterBiorepository. Egzosomos buvo ekstrahuotos naudojant tirpiklio išskyrimo principą ir polietilenglikolio sukeltą nusodinimą. Baltymų tapatumas ir kiekybinis įvertinimas buvo nustatyti skysčių chromatografijos masės spektrometrija (LC/MS) be etiketės. Vidutinė didžiausia kreatinino koncentracija serume buvo 3,7 ± 1,4 mg/dl, o laikas ikiinkstassužalojimasbuvo 4.0 ± 3.0 dienos. Išrašymo metu 90 procentų pacientų iš dalies pasveiko; 33 proc. visiškai pasveiko iki 28 dienos. Penkių V-AKI ir 7 kontrolinių mėginių proteominė analizė atskleidė 2009 baltymus visuose mėginiuose ir 251 baltymą, reikšmingai susijusį su V-AKI (Pi balas > 1). Pagrindiniai skiriamieji baltymai buvo komplementasC3, komplementas C4, galektiną -3-jungiantis baltymas, fibrinogenas, alfa-2 makroglobulinas, sunkusis imunoglobulino konstanta mu ir serotransferinas.

Išvada:Šlapimo eksosomos atskleidžia padidėjusį uždegiminių baltymų reguliavimą po nefrotoksinio pažeidimo V-AKI. Norint patvirtinti šias išvadas, norint išsiaiškinti patofiziologinius mechanizmus ir patvirtinti galimus sužalojimo biologinius žymenis, reikia atlikti tolesnius tyrimus.

Raktiniai žodžiai:vankomicino; AKI; nefrotoksiškumas; egzosomos; uždegimas; papildyti; imuniniai keliai

Cistanche žolėgali gydyti inkstų pažeidimus

Čengdu Wecistanche turicistancheproduktai, skirti gydyti inkstų pažeidimus

1. Įvadas

Vankomicinas yra glikopeptidinis antibiotikas, vartojamas meticilinui atsparioms Staphylococcus aureus infekcijoms gydyti kritinės būklės pacientams. Nefrotoksiškumas yra rimtas nepageidaujamas reiškinys, paveikiantis 10–20 procentų gydytų pacientų, ir yra susijęs su pailgėjusia buvimo ligoninėje trukme, 30-grįžimo į ligoninę dažnumu ir mirtingumu dėl visų priežasčių 30-dieną [1]. Su vankomicinu susijęs ūminisinkstassužalojimas(V-AKI) priklauso nuo dozės ir prasideda po 4–17 dienų. Nors V-AKI jau seniai buvo pripažintas pagrindiniu vankomicino šalutiniu poveikiu, nefrotoksiškumo mechanizmai liko menkai suprantami. Vankomicino sukeltų ląstelių ir molekulinių atsakų supratimas yra labai svarbus norint suprasti mechanizmus ir kurti strategijas, kaip sumažinti V AKI riziką ir susijusias išlaidas, kartu maksimaliai padidinant jo veiksmingumą gydant infekcijas. Atrodo, kad toksinį inkstų atsaką sukelia tiesioginis vankomicino poveikis proksimalinių kanalėlių epiteliui [2]. Iki šiol tiriant V-AKI pelių modeliuose buvo taikomi standartiniai toksikogenominiai metodai, tačiau tyrimų su žmonėmis trūksta [3–5]. Gyvūnų modeliai rodo, kad vankomicino vartojimas sukelia oksidacinį stresą, kuris gali prisidėti prie inkstų pažeidimo [6, 7]. Vienas iš galimų sužalojimo mechanizmų yra vaisto įstrigimas proksimalinėse kanalėlių ląstelėse, nes organinių katijonų pernešėjai (OCT) jį perneša per bazolaterinę membraną ir į proksimalinę kanalėlių ląstelę, tačiau aktyvių išsiliejimo transportavimo mechanizmų nenustatyta [6]. –8].

Egzosomos yra iš membranos gautos mikrocitinės pūslelės, kurios atlieka pagrindinį vaidmenį tarpląsteliniame ryšyje ir baltymų / nukleorūgščių tiekime ir suteikia galimybę atrasti naujus biomarkerius, padedančius klinikinėje diagnozėje.inkstassužalojimas[9]. Buvo pasiūlyta, kad egzosomos pasižymi didesniu specifiškumu ir jautrumu biomarkerių atradimui, priskiriamam mėginių stabilumui, palyginti su transkriptominiais ir proteominiais metodais, naudojant įprastus serumo ir šlapimo mėginius [9]. Šiame tyrime išbandėme hipotezę, kad šlapimo eksosomų baltymų pokytis, reaguojant į V-AKI, padeda išsiaiškinti sužalojimo mechanizmus ir nustatyti naujus biomarkerius pacientams, kuriems patvirtintas vaistų sukeltas inkstų pažeidimas. Tam pasitelkėme tiriamuosius iš Narkotikų sukeltų inkstų pažeidimo konsorciumo (DIRECT) tyrimo, kuris yra tarptautinė, kelių centrų grupė kliniškai įvertintų vaistų sukeltų ūminių atvejų.inkstassužalojimasir populiacija pagrįsta kontrolė, skirta ištirti farmakogenomikos prognozes naudojant genomo masto asociaciją. Išsami informacija apie DIRECT tyrimą aprašyta skyriuje Metodai ir neseniai paskelbtame mūsų laboratorijos leidinyje [10].

2. Rezultatai

Į analizę buvo įtraukti šlapimo mėginiai iš 22 tiriamųjų, 10 V-AKI atvejų ir 12 kontrolinių grupių. V-AKI atvejų ir kontrolinių pacientų demografiniai rodikliai buvo panašūs ir apibendrinti 1 lentelėje. Kaip ir tikėtasi, hipertenzijos, diabeto ir širdies nepakankamumo paplitimas buvo didesnis V-AKI atvejais, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (1 lentelė).

Visiems V-AKI atvejams išsivystė 2 ar aukštesnė AKI stadija, kaip apibrėžta pagal inkstų ligą gerinančių visuotinių rezultatų (KDIGO) kriterijus (1 pav.) [11]. V-AKI pasireiškė praėjus 40 ± 30 dienoms po vankomicino pradžios. Kreatinino koncentracijos serume (Scr) pokyčių trukmė po hospitalizacijos ir išrašymo iš ligoninės ir vėliau parodyta 1 paveiksle.

1 pav. Serumo kreatinino pokyčiai per V-AKI kursą. Šiame paveikslėlyje pavaizduoti kreatinino koncentracijos serume pokyčiai 10 atvejų per su vankomicinu susijusią ūminę ligą.inkstassužalojimasnuo patekimo į ligoninę iki 90 dienos po traumos. Laiko taškai atitinka vaistų sukelto inkstų pažeidimo konsorciumo (DIRECT) tyrimo laiko taškus. Santrumpos: SCr=kreatinino kiekis serume, ligoninė=hospitalizacija, Predrug=iki vaisto poveikio, DIRI=vaistų sukelto inkstų pažeidimo apibrėžimas atitinka, DrugDC {{8} } vaisto vartojimo nutraukimas arba dozės sumažinimas, Nadir Scr=mažiausias serumas po V-AKI, Hospital Disch{11}} išrašymas iš ligoninės

Pradiniai rizikos veiksniai V-AKI atvejais buvo sepsis (30 proc.), širdies liga (30 proc.), cukrinis diabetas (30 proc.), anemija (20 proc.), radiokontrasto poveikis (10 proc.), kepenų liga (10 proc.) ir. hipoalbuminemija (10 proc.) (2 pav.).

Daugiausia V-AKI atvejų buvo išgirsti trys vankomicino dozės. Vankomicino paros dozės svyravo nuo 1000 iki 4000 mg. Vidutinis (tarpkvartilis intervalas (IQR)) dienų skaičius, praleistas kiekviename dozavimo epizode, parodytas 3 paveiksle. Vidutinė (standartinis nuokrypis (SD)) vankomicino mažiausia koncentracija plazmoje, susijusi su 1–3 dozavimo epizodais, buvo padidinta 20,6 ± 8,1. Atitinkamai 29,6 ± 16,3, 38,0 ± 13 mg/l. Tačiau koncentracijų skirtumas tarp kiekvieno epizodo nebuvo statistiškai reikšmingas (1 epizodas prieš 2 p=0.5, 2 epizodas vs 3 p=0.41)

Kitų rezultatų duomenys apibendrinti 2 lentelėje. Atsižvelgiant į sužalojimo sunkumą, 20 procentų pacientų prireikė pakaitinės inkstų terapijos. Mirtingumas ligoninėje buvo 10 procentų. Išrašant iš ligoninės 90 procentų pacientų nuo V-AKI nepagijo. Šešiems pacientams Scr buvo išmatuotas 28 dieną po traumos ir keturiems 90 dieną. Iki 28 dienos du iš šešių (33 proc.) pacientų sirgo AKD, bet nė vienas iš keturių likusių pacientų neturėjo AKD iki 90 dienos.Inkstasbiopsijos buvo atliktos 20 procentų V-AKI atvejų (2 lentelė).

12 mėginių, kurie buvo tinkami analizei įdėjus filtrą, skirtą peptidams suderinti su jų giminingais spektrais, iš viso turėjo 2009 baltymus. Šie baltymai buvo toliau analizuojami. Pirma, buvo atlikta pagrindinių koordinačių analizė (PCoA), siekiant palyginti bendrą kiekvieno mėginio proteomą. Ši analizė atskleidė reikšmingą atskyrimą (PERMANOVA p-reikšmė=0.037) tarp AKI ir kontrolinių mėginių (4 pav.), apibendrinus sisteminio lygio fenotipą ir egzosomų baltymų lygyje, taip padidinant mūsų pasitikėjimą šiais duomenų rinkiniais. . Ryšio tarp kiekvieno baltymo ir V-AKI būsenos stiprumas buvo įvertintas naudojant pi vertės metriką, kuri sujungia p vertės reikšmingumą su kartojimo pokyčiu [12].

4 pav. Proteomų sudėtis išskiria V-AKI pacientų ir kontrolinių asmenų šlapimo egzosomas. (A) Pavyzdžių proteomų pagrindinių koordinačių analizė. Bray-Curtis atstumo metrika buvo naudojama skirtumams tarp mėginio proteomo apskaičiuoti ir parodyta pagrindinių koordinačių diagrama. Buvo pastebėtas atskyrimas išilgai 1 ir 3 ašių tarp AKI mėginių (raudona) ir kontrolinių mėginių (mėlyna). (B) Boxplot, apibendrinantis Bray-Curtis atstumą tarp kontrolinių ir AKI mėginių. Statistinis AKI ir kontrolinių mėginių atskyrimas, parodytas (A), buvo patikrintas naudojant permutacinės dispersijos testą (PERMANOVA). Rodomos langelių diagramos, apibendrinančios rezultatus, kai lyginami kontrolinių arba AKI mėginių atstumai su kontroliniais mėginiais.

Tada dvejetainis V-AKI ir kontrolinių mėginių palyginimas davė 42 baltymus, reikšmingai susijusius su AKI fenotipu, ir 26 baltymus, susijusius su kontroliniu fenotipu (Pi balas > 1) (papildoma S1 lentelė). Vulkano brėžinys, iliustruojantis su kiekvienu baltymu susijusią reikšmę ir raukšlių pokyčius, parodytas 5A paveiksle. Pagrindiniai V-AKI atvejų skiriamieji baltymai buvo fibrinogenas, komplementas C3, komplementas C4, galektiną{10}}rišantis baltymas, alfa-2 makroglobulinas, sunkioji imunoglobulino konstanta mu ir serotransferinas (5B pav.). Genų rinkinio praturtinimo analizė buvo atlikta tarp reikšmingų baltymų, siekiant nustatyti V-AKI pacientų pakeistų baltymų kategorijas, o rezultatai apibendrinti papildomoje S1 lentelėje. Įrodyta, kad keli baltymai, kurie buvo susiję su AKI fenotipu, turi funkcijų, susijusių su uždegimu ir (arba) tarpininkaujančiu uždegiminiu fenotipu. Norint patikrinti, ar šie baltymų pokyčiai gali būti susiję su pagrindinių citokinų signalizacijos pokyčiais, buvo atlikta citokinų išvada, kuri parodė stiprų ryšį tarp su AKI susijusių baltymų ir citokinų IL10, IL6 ir TNF. Šiuose citokinuose buvo atitinkamai 2,8, 2,3 ir 2.{24}}karto daugiau jungčių su AKI susijusiais baltymais nei su kontrole susijusiais baltymais, kaip apibendrinta 5C paveiksle. Su AKI susijusių baltymų ir numanomų citokinų baltymų ir baltymų sąveikos tinklai parodė daugiausia priešuždegiminius ryšius tarp su AKI susijusių baltymų, kaip apibendrinta 5D paveiksle.

5 pav. Baltymų lygio asociacijos su V-AKI. (A) Vulkano diagrama, rodanti kiekvieno baltymo lenkimo pokytį ir t-testo reikšmę V-AKI būsenai. 10 geriausių baltymų, susijusių su AKI ir kontrolės būsena, rodomi atitinkamai mėlyna ir raudona spalva. Kiti susiję baltymai, kurių Pi balas > 1, rodomi geltonai. (B) Kiekvienam baltymui buvo apskaičiuotas Pi balas, kuris atspindi ir kartojimo pokytį, ir t-testo reikšmę, ir pavaizduoti baltymai, turintys stipriausias asociacijas. (C) Topcitokinai, susiję su AKI arba kontroliniais baltymais. Buvo taikytas tinkle pagrįstas citokinų išvados metodas ir parodyti citokinai, rodantys stipriausius AKI arba su kontrole susijusių baltymų praturtėjimo balus. Raudonos juostos žymi citokinus, susijusius su AKI susijusiais baltymais, mėlynos juostos žymi citokinus, susijusius su su kontrole susijusiais baltymais. (D) AKI susijusių baltymų ir AKI praturtintų citokinų baltymų ir baltymų sąveikos tinklas. Baltymų mazgų išorinis kraštas yra spalvotas, priklausomai nuo asociacijų su priešuždegiminiais arba priešuždegiminiais citokinais. Kiekvieno mazgo dydis parodo kiekvieno baltymo statistinio susiejimo su AKI būsena stiprumą.

Cistanche tubulosagali gydyti inkstų pažeidimus

3. Diskusija

Mes pranešame apie naują metodą, kaip panaudoti šlapimo egzosomas, siekiant informuoti apie patofiziologinius mechanizmus, susijusius su narkotikų sukeltais.inkstassužalojimasnaudojant vankomiciną kaip prototipinį toksinį poveikį inkstams. Viena iš šio tyrimo privalumų yra gerai apibūdintų pacientų lygmens duomenų iš DIRECT tyrimo [10] įtraukimas, sukurtas siekiant išsiaiškinti mechanizmus, įskaitant vaistų sukeltų genomiką.inkstassužalojimas. Tiriamieji, kuriems buvo 2 ar aukštesnė AKI stadija, pradžioje buvo veikiami įprastinių rizikos veiksnių. Visiems tiriamiesiems buvo reikšmingai padidėjusi vankomicino koncentracija plazmoje, nepaisant to, kad jie vartojo paros dozes, mažesnes nei visuotinai pripažinta nefrotoksiškumo riba – 4 g per dieną [13]. Daugelis tiriamųjų visiškai neatsigavo nuo V-AKI po išrašymo iš ligoninės ir mėnesį po traumos sirgo ūmine inkstų liga. Kaip ir tikėtasi, nedaugeliui pacientų buvo atlikta inkstų biopsija.

Šlapimo egzosomų / tarpląstelinių pūslelių (EV) proteomika parodė, kad tiksliniai skiriamieji baltymai V-AKI atvejais buvo C3 komplementas, C4 komplementas, galektiną-3-rišantis baltymas, fibrinogenas, alfa-2 makroglobulinas, imunoglobulino sunkioji konstanta mu ir serotransferinas. Šie egzosomų radiniai informuoja apie V-AKI sužalojimo mechanizmus subląsteliniame / viršmolekuliniame lygmenyje ir gali būti biomarkeriai vaistų sukeltos ligos proceso tęstinumu.

Kraujyje ir šlapime esančios egzosomos atlieka svarbų vaidmenį tarpląsteliniame ryšyje, krešėjimui ir atliekų tvarkymui [14]. Po su toksinais susijusių ūminiųinkstassužalojimas, egzosomos, išsiskiriančios iš kanalėlių epitelio ląstelių, gali perduoti sužalojimo signalus, kad paskatintų makrofagų infiltraciją ir skatintų tubulointersticinį uždegimą [15]. Mes motyvavome, kad egzosomų baltymų kiekis skirsis tarp V-AKI atvejų ir sveikų kontrolinių grupių. Du šimtai penkiasdešimt vienas baltymas buvo sutrikęs V-AKI, ir atrodė, kad jie daugiausia dalyvauja uždegiminiuose ir krešėjimo keliuose. Tarp šių 251 baltymo mūsų analizė parodė, kad C3 komplementas, C4 komplementas, galektiną -3- jungiantis baltymas, fibrinogenas, alfa-2 makroglobulinas, imunoglobulino sunkioji konstanta mu ir serotransferrinas buvo reikšmingai susiję su V-AKI atvejais.

Remdamiesi mūsų rezultatais, kad C3 ir C4 buvo vieni iš labiausiai skiriančių V-AKI egzosomų baltymų, siūlome, kad komplemento sistemos aktyvacija būtų susijusi su vankomicino sukelta inkstų kanalėlių pažeidimu. Tai taip pat gerai sutampa su publikuota literatūra, kad komplemento sistemos aktyvinimas turi įtakos imuninio komplekso glomerulonefritui ir įvairioms inkstų ligoms [16]. Komplemento aktyvacijos sukeltas inkstų pažeidimas sergant AKI dėl išemijos ar nefrotoksinų poveikio buvo susijęs su sisteminiais uždegiminiais reiškiniais, kurie sukelia ir prisideda prie tolimųjų organų sužalojimų bei pacientų mirtingumo [17]. Išemijos-reperfuzijos (IR) pažeidimo modeliuose hipoksija, ATP išeikvojimas ir mitochondrijų pažeidimai sukelia laisvųjų deguonies radikalų susidarymą reperfuzijos metu [18]. Citokinai, chemokinai ir komplemento aktyvinimas sustiprina uždegimą, sukeldami ūminį kanalėlių pažeidimą. Be to, pelės, kurioms trūksta C3a ir C5a receptorių, yra apsaugotos nuo IR pažeidimo [19, 20]. Įrodyta, kad IR pažeidimas padidina vietinę komplemento komponentų gamybąinkstasendotelio ir kanalėlių ląstelės [16,21]. Keletas tyrimų su gyvūnų modeliais ir žmonėmis nustatė padidėjusį komplemento baltymų produktų, tokių kaip C3 ir C4, nusėdimą išilgai vamzdinės pamatinės membranos po traumos ar sužalojimo.inkstas. Nenustatyta, kad šie padidėję nuosėdų kiekiai būtų reikšmingai peritubinėje ar glomerulų srityje, tačiau jie labai susikaupę kanalėlių membranoje, kaip matyti iš žmonių ir gyvūnų modelių inkstų biopsijų [17]. Egzosomos ir EV gali transportuoti kraujotakos komplemento komponentus, kai komplemento aktyvacija yra nereguliuojama [22, 23]. Keletas ląstelių eksperimentų ir klinikinių stebėjimų patvirtino, kad išleisti EV neša ir moduliuoja komplemento baltymus, o kartu jų gamyba esant uždegiminei būklei taip pat gali turėti įtakos kraujotakos pūslelių skaičiui [23]. Ši dviejų procesų tarpusavio priklausomybė leidžia daryti išvadą, kad EV gali būti biomarkerių šaltiniai, taikiniai ir terapiniai tiekimo agentai, skirti komplemento ir imunomoduliuojantiems junginiams, kurie yra labai svarbūs AKI uždegiminių mechanizmų srityje. Mūsų išvada, kad V-AKI mėginiai, palyginti su sveikomis kontrolėmis, rodo imuninio atsako į tiesioginį vankomicino toksiškumą inkstų kanalėlių ląstelėse. Be visų pirmiau minėtų baltymų kiekio, egzosomos / EV, gautos iš šlapimo, taip pat yra potencialūs neinvaziniai biomarkeriai kaip alternatyva inkstų biopsijai, siekiant aptikti ir informuoti apie komplemento sistemos vaidmenį vaistų sukeltame.inkstassužalojimas.

Nors daugelis ankstesnių tyrimų (konkrečias nuorodas rasite keliuose kituose sakiniuose) buvo sutelkti į galektino -3 (Gal-3) vaidmenįinkstassužalojimas, yra mažai duomenų apie galektiną-3 surišantį baltymą (Gal-3-bp). Gal-3 yra ekspresuojamas inkstų surenkamuose kanalėliuose ir skatina nefrogenezę, moduliuoja ląstelių-ląstelių ir ląstelės-matricos sąveiką bei reguliuoja uždegimą [24–26]. Hendersonas ir kt. apžvelgė Gal-3 vaidmenį uždegime ir nustatė, kad Gal-3 yra pagrindinis lėtinio uždegimo komponentas ir jei audinių pažeidimai pasikartoja. Tai palengvina audinių pažeidimo „atsirišimą“, stabdo pažeidimo plitimą [27]. Be to, Nishiyama ir kt. žiurkėms, sergančioms išeminiu AKI, buvo įrodyta, kad Gal-3 mRNR buvo sureguliuota, o po reperfuzijos, imunohistochemija atskleidė padidėjusį Gal{11}} nefrono segmentuose [25]. Tsuchiyama ir kt. nustatė, kad skiriant Gal-3 žiurkėms, sergančioms nefrotoksiniu serumo nefritu, sumažėjo baltymų išsiskyrimas su šlapimu, pusmėnulio susidarymas ir makrofagų infiltracija į glomerulus [28]. Tai rodo, kad po išeminio ar imuninės sistemos sukelto pažeidimo Gal{16}} vaidina svarbų vaidmenį regeneruojant. Būdamas Gal-3 giminingo partnerio, pagrindinis Gal-3-bp vaidmuo ir jo padidinto nefrotoksinio pažeidimo, kurį sukelia vankomicinas ir kiti agentai, reguliavimas, bus būtinas būsimuose tyrimuose.

Mūsų tyrimas taip pat nustatė, kad visi trys fibrinogeno subvienetai yra nereguliuojami, gerai suderinant su anksčiau paskelbtais duomenimis. Fibrinogenas yra tirpi dimerinė plazmos molekulė ir kiekvienas dimeras susideda iš trijų polipeptidų: alfa, beta ir gama [29]. Jis vaidina pagrindinį vaidmenį hemostazėje ir krešėjimui, tačiau taip pat buvo įrodyta, kad jis svarbus reguliuojant uždegimines sąlygas [30–32]. Ajay ir kt. parodė, kad fibrinogeno prieinamumas yra svarbus inkstų funkcijai, uždegimui ir išgyvenimui [33]. Be to, fibrinogenas gali turėti antiadhezinį poveikį inkstų epitelio ląstelėms, o tai gali būti naudinga, nes padeda išvengti kanalėlių obstrukcijos [34]. Fibrinogeno kiekis žymiai padidėja ir reguliuojamas sergant AKI ir anksčiau buvo įvertintas kaip galimas ankstyvo AKI aptikimo biomarkeris [29]. Hoffman ir kt. tyrė fibrinogeno pokyčius po išemijos / reperfuzijos ir cisplatinos vartojimo žiurkėms, o mRNR buvo padidinta 30 minučių po dvišalio IR pažeidimo ir pasiekė piką po 48–72 val., tuo tarpu vartojant cisplatiną, fibrinogeno mRNR ekspresija buvo aptiktas 24 val. [29]. Fibrinogenas šlapime buvo aptiktas jau praėjus 3 valandoms po išeminės reperfuzijos pažeidimo ir 24 valandas po cisplatinos vartojimo, o tai reiškia, kadinkstassužalojimas1 molekulė (KIM-1) [29].

Cistanche nauda: gali gydytiinkstų pažeidimas

Istoriškai buvo visuotinai pripažinti du skirtingi patofiziologiniai V-AKI mechanizmai: ūminė kanalėlių nekrozė dėl tiesioginio toksinio poveikio ir ūminis intersticinis nefritas. Inkstų proksimalinis kanalėlių epitelis praranda citoskeleto vientisumą, nekrozę ir apoptozę ūminės kanalėlių nekrozės atveju [35]. Nekrotinės ląstelės išskiria molekules, kurios reguliuoja įgimtą imuninę sistemą, sukeldamos uždegimą ir pagreitindamos kanalėlių pažeidimą [35]. Šiame tyrime parodėme uždegiminius žymenis pacientų, sergančių V-AKI, šlapimo EV. Be to, mes nustatėme priešuždegiminį ryšį tarp citokinų IL10, IL6 ir TNF bei mūsų geriausių AKI skiriančių baltymų. Apibendrinant, šie duomenys rodo, kad V-AKI patofiziologija yra toksinis kanalėliuose, kai padidėja uždegimo reguliavimas per 24–72 valandas po sužalojimo.

Yra keletas mūsų tyrimo apribojimų. Nedidelis 22 pacientų, daugiausiai baltaodžių, imties dydis riboja mūsų išvadų apibendrinimą kitoms lytims, rasėms ir etninėms grupėms. Antrasis mūsų tyrimo apribojimas buvo tas, kad kiekvieno paciento šlapimo egzosomų mėginyje buvo įvairus bendro baltymų kiekis, todėl sunku išmatuoti specifinius baltymus, ypač mažesnio absoliutaus kiekio. Nors tai nebūtinai yra šio tyrimo ribojimas per se, nes kiekvieno žmogaus gebėjimas pakuoti baltymus į šlapimo egzosomas natūraliai skiriasi, mažesnis baltymų kiekis kai kuriuose individuose riboja mūsų galimybes atlikti tolesnę analizę ir daryti reikšmingas išvadas, kurias galima apibendrinti. didesnės populiacijos. Trečiasis apribojimas yra vieno laiko taško pavyzdys, kuris riboja mūsų supratimą apie ląstelių pokyčius, vykstančius skirtingose ​​AKI kontinuumo fazėse, pvz., tiesioginio sužalojimo fazėje, taisymo fazėje ir kt. Nuoseklus mėginių ėmimas padės geriau suprasti egzosomų turinio laiko eigą. pokyčiai, oksidacinis stresas, sukeltas vaistų kaupimosi, ir imuninių kelių atstatymo reguliavimas. Į dabartinį tyrimą buvo įtraukti pacientai, apibrėžti Scr slenksčiais. Kreatinino kiekis serume yra netobulas inkstų funkcinis biomarkeris, nes Scr padidėjimas dažnai atsilieka nuo pažeidimo [36]. Tai riboja Scr jautrumą ir specifiškumą, kad būtų galima anksti aptiktiinkstassužalojimas[36], ir buvo atlikti tyrimai, nustatantysinkstassužalojimasbiomarkeriai, tokie kaipinkstas sužalojimas1 molekulė (KIM1) ir su neutrofilų želatinaze susijęs lipokalinas (NGAL), kad būtų galima anksti nustatyti nefrotoksiškumą [37, 38]. Kaip buvo pranešta anksčiau, biologiniai žymenys gali aptikti tiek atvirą, tiek subklinikinį vaistų sukelto poveikio lygį.inkstassužalojimas[39,40].

4. Medžiagos ir metodai

4.1. Paciento atranka

Į analizę buvo įtraukti 10 pacientų, sergančių V-AKI, kurie buvo įtraukti į DIRECT tyrimą [10], ir 12 sveikų kontrolinių šlapimo mėginių iš UAB-UCSD O'Brien centro biorepository. Kontrolės tiriamieji pagal lytį, rasę ir amžiaus dešimtmetį buvo suderinti su tiriamaisiais ir neturėjo vankomicino ekspozicijos ar žinomosinkstassužalojimas. DIRECT tyrimas yra tarptautinis tyrimas, nagrinėjantis vaistų sukeltų farmakogenetinių veiksnių prognozesinkstassužalojimasnaudojant genomo masto asociacijų tyrimą ir populiacija pagrįstą kontrolę [10]. DIRECT tyrimą patvirtino institucinė tyrimų taryba (IRB Nr. 121651), o prieš registraciją iš visų dalyvių buvo gautas raštiškas sutikimas, kuriame buvo numatyta naudoti saugomus mėginius būsimoms analizėms. AKI buvo apibrėžtas DIRECT kaip staigus inkstų funkcijos sumažėjimas, parodytas pagal bet kurį iš šių kriterijų: (1) absoliutus kreatinino (Scr) padidėjimas serume (didesnis arba lygus 0,3 mg/dL arba didesnis arba lygus 26,4 µmol/ L) (per 48-h laiko lange) nuo pamatinės Scr vertės, (2) procentinis Scr padidėjimas didesnis nei 50 procentų (1,5 karto nuo atskaitos) per septynias dienas, (3) šlapimo sumažėjimas išvestis (dokumentuota oligurija<0.5 ml/kg/h="" for="">6 val.) nepaisant tinkamo skysčių gaivinimo, kai taikoma, (4) absoliutus Scr sumažėjimas Didesnis arba lygus 0,3 mg/dL arba didesnis arba lygus 26,4 µmol/L (per 48- h laiko langas) nuo etaloninio Scr ir (5) santykinis Scr sumažėjimas, didesnis nei arba lygus 50 procentų (1,5 karto nuo atskaitos) per septynias dienas. Į tyrimą buvo įtraukti pacientai, kuriems po vankomicino ekspozicijos buvo 2 ar aukštesnės stadijos AKI. Klinikiniai duomenys, įskaitant demografinius duomenis, ligos istoriją, fizinio tyrimo rezultatus, gyvybinius požymius, kraujo ir šlapimo chemines medžiagas, biopsijos rezultatus ir vaistų dozavimo duomenis, buvo renkami šiais laiko momentais: (1) hospitalizacija, (2) vankomicino vartojimo pradžia, ( 3) sužalojimo pikas, (4) vaisto vartojimo nutraukimas arba dozės sumažinimas, (5) traumos pašalinimas, (6) išrašymas iš ligoninės, (7) 28 dienos ir (8) 90 dienų po sužalojimo. Vankomicino dozavimo epizodas buvo apibrėžtas kaip dozės arba dažnio pasikeitimas. Ūminė inkstų liga (AKD) apibrėžiama kaip 1 ar didesnės AKI stadijos išlikimas daugiau nei 7 dienas po poveikio [41]. Pacientai, sergantys AKD, buvo suskirstyti į kategorijas išrašant iš ligoninės, jei AKI 1 ar aukštesnė stadija išliko ir laikas nuo ekspozicijos iki išrašymo iš ligoninės buvo ilgesnis nei septynios dienos. Iš visų dalyvių buvo paimti šlapimo ir viso kraujo mėginiai. Visi V-AKI atvejai buvo įvertinti dviejų nepriklausomų nefrologų (EM, JC, RL), kad nustatytų priežastinį ryšį. Išsamus metodų aprašymas buvo paskelbtas anksčiau [10].

4.2. Egzosomų paruošimas ir proteominių duomenų rinkimas

Šlapimo ir kraujo mėginiai buvo paimti iš DIRECT tyrimo dalyvių, o mėginiai buvo užšaldyti –80 ◦C temperatūroje prieš paruošiant egzosomą. Šioje analizėje naudojami šlapimo mėginiai buvo atrinkti iš laiko, artimiausio inkstų pažeidimui, nuo 24 iki 72 val.inkstassužalojimas. Egzosomos buvo ekstrahuotos iš šaldytų AKI šlapimo mėginių, naudojant vidinį protokolą, sukurtą remiantis tirpiklio išskyrimo principu, naudojant polietilenglikolio (PEG) sukeltą nuosėdą, kaip aprašyta Rao ir kt. neseniai publikuotas egzosominių baltymų puslapis [42] buvo atliktas prieš gelio tripsinizaciją, naudojant NuPAGE bisTris10 procentų akrilamido 12 šulinėlių gelius, kad būtų išskirta 40 µL baltymų iš kontrolinių ir AKI šlapimo mėginių egzosomų.

Gelio ekstraktai buvo sujungti su buferiu, kad būtų išvengta proteolizės, kurio sudėtyje yra 75 mM NaCl (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV), 3 procentų natrio dodecilo sulfato (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, JAV), 1 mM NaF (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV), 1 mM beta glicerofosfatas (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV), 1 mM beta glicerofosfatas (Sigma, Sigma, Sent Luisas, MO, JAV), 1 mM natrio ortovanadatas (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV), 10 mM natrio pirofosfatas (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV), 1 mM fenilmetilsulfonilfluoridas (PMSF, Sigma) ir 1 × Complete Mini EDTA laisvos proteazės inhibitorių tabletės, visos 50 mM HEPES (Sigma, St. Louis, MO, JAV), pH 8,5. Baltymams denatūruoti buvo pridėtas vienodas tūris 8 M karbamido 50 mM HEPES, pH 8,5, ir zondas ultragarsu buvo atliktas naudojant du 10- s intervalus 25 procentų amplitude. Baltymai buvo redukuoti, alkilinti ir užgesinti naudojant ditiotreitolį ir jodoacetamidą, kaip aprašyta anksčiau [43]. Baltymai buvo nusodinti į mėginius ant ledo pridedant trichloracto rūgšties (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV), o baltymus granuliuojant centrifuguojant 4 ◦C temperatūroje. Baltymų granulės du kartus plaunamos lediniu acetonu. Baltymų granulės buvo džiovinamos 56 ◦ C temperatūroje 30 min., po to resuspenduojamos 1 M karbamido tirpale 50 mM HEPES ir per naktį virškinamos kambario temperatūroje su 6 µg LysC (Vako, Ričmondas, Virdžinijos Sandrauga, JAV), po to {{27} }h virškinimas sekvenavimo laipsnio tripsinu (Promega, Fitchburg, WI, JAV) 37 ◦C temperatūroje. Mėginiai buvo nusūdyti per C18 Sep-Paks, o baltymai buvo kiekybiškai įvertinti [44]. Iš viso 1,0 ug baltymų viename mėginyje buvo ištirta skysčių chromatografijos-tandemo masės spektrometrija (LC-MS [2]), naudojant 85 minučių skysčių chromatografijos gradientą Easy-nLC 1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, JAV). prijungtas prie Orbitrap Fusion masės spektrometro (Thermo Fischer Scientific).

Chromatografija buvo atlikta naudojant namuose ištrauktą ir supakuotą 30 cm kolonėlę, kuri buvo trigubai užpildyta 0,5 cm, 0,5 cm ir 30 cm 5 µm C4, 3 µm C18 ir 1,8 µm C18 atitinkamai ir kaitinami iki 60 ◦C. Iš pradžių peptidai buvo įpilami 500 barų slėgiu, po to buvo atliktas chromatografinis gradientas nuo 6 iki 25 procentų acetonitrilo per 70 min., po to – 5-min gradientas iki 100 procentų acetonitrilo, kuris buvo palaikomas 10 min. Elektrospurškimo jonizacija buvo atlikta naudojant 2000 V įtampą per nerūdijančio plieno T formos jungtį, jungiančią analizinę kolonėlę ir Easy-nLC sistemą. Po kiekvieno mėginio buvo du kartus plaunami, pradedant gradientu nuo 3 iki 100 procentų acetonitrilo per 15 min., o dar 10 minučių 100 procentų acetonitrilu. 375–1500 masės iki įkrovimo (m/z) diapazonas buvo nuskaitytas peptidams, kurių įkrovos būsenos yra 2–6. Smailių kiekybiniam įvertinimui buvo naudojami centriniai duomenys. Įsigijimas buvo atliktas nuo duomenų priklausančiu teigiamų jonų režimu. Neapdorotų spektrų buvo ieškoma Proteome Discoverer 2.1 versijoje, palyginti su UniProt (www.uniprot.org (prieiga 2017 m. lapkričio 5 d.)) etaloninėje Homo sapiens duomenų bazėje, naudojant Sequest algoritmą [18] kartu su atvirkštiniu duomenų bazės metodu, naudojamu peptidų ir klaidingų atradimų kontrolei. normos (FDR) iki 1 procento [17]. In silico tripsino virškinimas, kaip nurodyta paieškos parametruose, kartu su minimaliu šešių aminorūgščių peptido ilgiu. Paieškos parametrai taip pat apėmė dinaminį metioninų oksidacijos modifikavimą ir statinį cisteinų karbamidometilinimo modifikavimą. Pirmtakų masės tolerancija buvo nustatyta iki 50 ppm, o fragmentų masės tolerancija – 0,6 Da.

Be spektrinių atitikmenų ir baltymų, kurie ribojami<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Proteomikos duomenų analizė

Proteomikos duomenų analizės įrašai buvo įkelti „jupyter“ nešiojamojo kompiuterio formatu į „Github“ saugyklą (prieiga 2021 m. kovo 3 d.)). Principinė koordinačių analizė (PCoA) buvo atlikta naudojant Qiime2 (versija 2019-7) [45]. Laiko įvairovės pagrindinės metrikos komanda buvo naudojama atstumams tarp mėginių apskaičiuoti naudojant Bray-Curtis metriką ir vizualizaciją naudojant PCoA. Statistinė atstumų tarp kontrolinių ir V-AKI mėginių analizė buvo atlikta naudojant porinį PERMANOVA testą naudojant komandą „qiime diversity beta-group significance“. Šių rezultatų „boxplot“ vizualizacija buvo sukurta naudojant jūrinį paketą (prieiga 2021 m. kovo 3 d.)). Dvejetainis V-AKI atvejų ir kontrolinių subjektų palyginimas buvo atliktas naudojant scipy paketą ((prieiga 2021 m. kovo 3 d.)), naudojant nepriklausomą t-testą su nelygia dispersija. Ryšio tarp kiekvieno baltymo ir V-AKI būsenos stiprumas buvo įvertintas naudojant pi vertės metriką, kuri sujungia p vertės reikšmę su kartojimo pokyčiu [12]. Kaip aprašyta anksčiau [46], aukščiausios klasės, reikšmingos asociacijos buvo apibrėžtos kaip turinčios pi reikšmę > |1|. Kiekvienas baltymų susiejimas su V-AKI būsena buvo pavaizduotas ugnikalnio diagramoje, kad būtų dar labiau paryškinta aukščiausių-10 baltymų vieta. Genų rinkinio praturtinimo analizė buvo atlikta naudojant DAVID serverį [47], lyginant reikšmingus baltymus (pi vertė > |1|) su visų duomenų rinkinyje identifikuotų baltymų fonu. Susijusių funkcinių praturtinimų grupės pateikiamos papildomoje S1 lentelėje.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. Citokinai pirmiausia buvo filtruojami, kad būtų bent penki ryšiai su reikšmingai pakeistais baltymais. Tada jungčių dalis tarp kiekvieno citokino ir su V-AKI susijusių arba su kontrole susijusių baltymų buvo palyginta su bendru jungčių tarp V-AKI arba su kontrole susijusių baltymų skaičiumi. Siekiant atsižvelgti į jungčių, kurias kiekvienas citokinas turi su kitais baltymais, skaičiaus skirtumus, ši vertė buvo palyginta su jungčių, kurias kiekvienas citokinas turėjo su visais reikšmingai pakeistais baltymais, skaičiumi. Pasirinktų citokinų sodrinimo balai buvo nubraižyti pagal jų sąsajas su V-AKI arba su kontrole susijusiais baltymais. Galiausiai, naudojant Cytoscape 3.5.1 versiją, buvo vizualizuota patobulinta su V-AKI susijusių baltymų ir citokinų, turinčių praturtintus ryšius su V-AKI susijusiais baltymais, paieška, siekiant nustatyti jų sąveiką. Baltymų ir baltymų sąveikos tinklai buvo dekoruoti nustatant kiekvieno V-AKI susieto baltymo dydį pagal jų pi-score ryšį su V-AKI būsena ir nuspalvinti turint numanomą ryšį su praturtintais citokinais, turinčiais priešuždegiminį arba priešuždegiminį poveikį.

drakono žolelių cistanchegali gydytiinkstų pažeidimas

5. Išvados

Siekėme geriau suprasti V-AKI sužalojimo mechanizmą iš kliniškai įvertintų atvejų ir, kas įdomu, nustatėme, kad komplementas, galektiną -3 surišantis baltymas ir fibrinogenas buvo reikšmingai susiję su V-AKI. Ankstesnių ir mūsų tyrimų rezultatai rodo komplemento sistemos ir uždegimo takų vaidmenį V-AKI. Nors reikia atlikti didesnius tyrimus, kad būtų patvirtinti vankomicino sukeltos žalos molekuliniai procesai ir su tuo susiję atstatymo būdai, rezultatai rodo, kad šlapimo egzosomos gali suteikti svarbios informacijos apie patofiziologinius mechanizmus ir gali būti vaistų sukeltų biomarkeriai.inkstassužalojimas.

Autoriaus indėlis:

Konceptualizacija, LA ir SPR, metodika, SV, SPR, DJG, RM; programinė įranga, DJG, RHM, formali analizė, LA, AL, RHM; tyrimas, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN; rašymas – originalaus projekto rengimas, AL, JA, VJ, LA; rašymas – peržiūra ir redagavimas, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN; priežiūra, SV, SPR; projektų administravimas, LA; finansavimo įsigijimas, LA Visi autoriai perskaitė ir sutiko su paskelbta rankraščio versija.

Finansavimas:

Šį tyrimą finansavo Tarptautinis rimtų nepageidaujamų įvykių konsorciumas. MCT buvo paremta T32 mokymo dotacija DK007202.

Institucinės peržiūros tarybos pareiškimas: tyrimas buvo atliktas pagal Helsinkio deklaracijos gaires ir patvirtintas Kalifornijos universiteto San Diego žmogaus subjektų tyrimų apsaugos programos Institucinės peržiūros tarybos (arba Etikos komiteto) (IRB Nr. 121651).

Informuoto sutikimo pareiškimas: informuotas sutikimas buvo gautas iš visų tyrime dalyvaujančių subjektų

Padėkos:

Norėtume padėkoti už DIRECT tyrėjų indėlį: Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopheris Farmeris, Markas Tomas, Hudas N. Pangas , Hansjoergas Rothe.

Interesų konfliktai:

Autoriai pareiškia, kad nėra interesų konflikto.

Iš: „Šlapimo eksosomos nustato uždegiminius kelius su vankomicinu susijusiam ūminiam inkstų pažeidimui“, autorė Linda Awdishu

---Tarp. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2784