Genų ekspresijos kitimas tarp dviejų sorgo dvispalvių linijų, kurios skiriasi įgimto imuniteto atsaku

Santrauka:

Su mikrobais susieto molekulinio modelio (MAMP) sukeltas imunitetas (MTI) yra pagrindinis augalo įgimto imuninio atsako į mikrobų atpažinimą komponentas. Tačiau didžioji dalis mūsų dabartinių žinių apie MTI gaunama iš pavyzdinių augalų (ty Arabidopsis thaliana), kurių darbo naudojant pasėlių augalus atlikta palyginti mažiau. Šiame darbe tyrėme MAMP sukeltą oksidacinį sprogimą (ROS) ir transkripcijos atsaką dviejuose Sorghum bicolor genotipuose – BTx623 ir SC155-14E. SC155-14E yra linija, kuri pasižymi dideliu atsparumu antracnozei, o linija BTx623 yra jautri antracnozei. Mūsų rezultatai atskleidė aiškų genų ekspresijos ir ROS skirtumą, reaguojant į flagellino (flg22) arba chitino iššaukimą tarp dviejų linijų. Nors transkripcijos atsakas į kiekvieną MAMP ir kiekvienoje eilutėje buvo unikalus, buvo didelis persidengimo laipsnis, ir mes galėjome apibrėžti pagrindinį genų rinkinį, susietą su sorgo MAMP transkripcijos atsaku. GO terminas ir KEGG kelio praturtinimo analizė atskleidė daugiau su imunitetu ir atsparumu patogenams susijusių DEG MAMP apdorotuose SC155-14E mėginiuose nei BTx623 naudojant tą patį gydymą. Rezultatai yra pagrindas būsimiems tyrimams tirti įgimtus sorgo imuniteto kelius, įskaitant pastangas didinti atsparumą ligoms.

Spustelėkite norėdami nusipirktipatobulintas imuniteto produktas

    For more information:1950477648nn@gmail.com

Raktiniai žodžiai:

Dvispalvis sorgas; ROS; įgimtas imunitetas; MAMP; RNR-seq; genų ekspresija

1. Įvadas

Augalai natūraliai yra veikiami įvairių stresų, įskaitant daugybę bakterinių, grybelinių ir virusinių patogenų [1]. Augalai apsisaugo nuo patogenų naudodami iš anksto suformuotas struktūras ir chemines medžiagas bei infekcijų sukeltus imuninės sistemos atsakus. Augalų imuninė sistema naudoja dviejų pakopų suvokimo sistemą su dviem tarpusavyje sujungtais receptorių sluoksniais.

Pirmąją pakopą suaktyvina paviršiuje lokalizuoti modelio atpažinimo receptoriai (PRR), kurie suvokia molekules už ląstelės ribų, atpažindami įsiveržusį patogeną aptikdami konservuotus struktūrinius motyvus, vadinamus su mikrobais susijusiais molekuliniais modeliais (MAMP), kurie sukelia vidutinio sunkumo, bet platus, gynybinis atsakas [2]. Flagelinas, chitinas, lipopolisacharidai, peptidoglikanai (PGN) ir pailgėjimo faktorius Tu yra gerai ištirtų MAMP pavyzdžiai [3–5]. Šis gynybinis atsakas vadinamas MAMPtrigged imunitetu (MTI) [6]. Antroji gynybos pakopa, žinoma kaip efektoriaus sukeltas imunitetas (ETI), atsiranda reaguojant į specifinius patogeno išvestus efektorinius baltymus, kuriuos augalas atpažįsta veikdamas atsparius baltymus, todėl susidaro stiprus, bet labai specifinis imuninis atsakas. ETI dažnai galima atpažinti iš vietinės ląstelių mirties, vadinamos padidėjusio jautrumo atsaku (HR) [7]. Tiek MTI, tiek ETI sistemos jaučia patogenus ir reaguoja suaktyvindamos antimikrobinę apsaugą užkrėstoje ląstelėje ir kaimyninėse ląstelėse [3, 8]. Augalai taip pat turi imuninius receptorius, kurie atpažįsta labai skirtingus patogenų efektorius, įskaitant NBS-LRR baltymų klasę [9].

Be to, sisteminis įgytas atsparumas (SAR) yra „viso augalo“ atsparumo reakcija, atsirandanti po ankstesnio lokalizuoto patogeno poveikio. SAR yra susijęs su įvairių genų (su patogeneze susijusių genų) indukcija, o norint suaktyvinti SAR, reikia kaupti endogeninę salicilo rūgštį (SA) [10].

Tyrimai, daugiausia atlikti naudojant Arabidopsis, parodė, kad MTI gali sukelti įvairias reakcijas, įskaitant pokyčius reaktyviųjų deguonies rūšių gamyboje (ROS), reaktyviųjų azoto rūšių gamybą, pvz., azoto oksidą (NO), kaliozės nusėdimą, kalcio kiekį ląstelėje, jonų srautą per plazmą. membrana, kelių su augalų apsauga susijusių genų ekspresijos indukcija arba slopinimas, augalų ląstelės sienelės pakitimai, antimikrobinių junginių indukcija ir su patogeneze susijusių (PR) baltymų sintezė [3,11].

Nors kai kurie iš šių MTI atsakymų gali būti laikomi bendraisiais augalų atsakais, jų dydis gali būti būdingas augalų rūšims ir net veislei [12–17]. Buvo sukurti metodai, skirti kiekybiškai įvertinti augalų MTI atsaką. Šie metodai apima ROS arba NO gamybos, mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės fosforilinimo, specifinės MAMP sukeltos genų ekspresijos, daigų augimo slopinimo, lignino ir ląstelių sienelių surištų fenolių bei MAMP sukelto atsparumo bakterijų ir grybelių patogenams matavimą [18–20].

Sorghum bicolor (L.) Moench yra pagrindinis pasaulinis javų pasėlis, pritaikytas įvairioms buveinėms ir veisiamas įvairiems tikslams [21]. Tikimasi, kad sorgo, kaip vienos iš pagrindinių maisto ir biomasės gamybos kultūrų, auginimas visame pasaulyje labai padidės [22].

Didėjant sorgų auginimo praktikai ir geografinėms vietovėms, neišvengiamai didėja ligų spaudimas. Sorgai tarp kitų javų išsiskiria neįprastai plačiu ligų spektru, o tai yra vienas iš svarbiausių jo auginimo apribojimų. Pasaulyje plačiai paplitusios grybelinės ligos yra žalingiausios sorgų ligos, dėl kurių labai sumažėja derlius tiek grūdų kiekio, tiek kokybės atžvilgiu [23]. Antraknozė yra viena iš sunkiausių grybelinių ligų, turinčių įtakos sorgo grūdų derliui ir biomasės gamybai. Jautrių veislių derliaus nuostoliai dėl šio patogeno gali siekti 50–70 procentų [24,25]. Augalai sukūrė įvairias gynybos strategijas, skirtas kovoti su patogenų invazija. Sorgo atveju šios strategijos apima PR baltymų aktyvavimą [26], vandenilio peroksido kaupimąsi [27] ir flavonoidų fitoaleksinų biosintezę [28]. Skirtingi metodai buvo naudojami tiriant sorgo atsparumą, identifikuoti gynybinius junginius ir nustatyti fizines kliūtis nuo antracnozės (žr. nuorodą [29,30]). Genų ekspresijos tyrimai buvo plačiai naudojami siekiant nustatyti atsparumo genus kandidatus augaluose, remiantis skirtinga ekspresija tarp atsparių ir jautrių veislių arba neinokuliuotų ir patogenais inokuliuotų augalų (pvz., nuorodos [31–37]). Wang ir kt. [37] atliko transkripto analizę, siekdami ištirti sorgo veislės BTx623 atsaką į C. subline-ola. Jie pranešė, kad genai, dalyvaujantys fenilpropanoido metabolizme ir antrinių metabolitų biosintezėje, buvo identifikuoti kaip skirtingai išreikšti reaguojant į infekciją patogenu, palyginti su nesokuliuotais kontroliniais augalais.

Tačiau šie eksperimentai buvo atlikti su jautrios veislės BTx623 sodinukais. Būtų naudingi papildomi transkriptominiai tyrimai, skirti palyginti genų ekspresijos atsaką į patogeną jautriose ir atspariose sorgo veislėse. Todėl svarbu suprasti genetinę architektūrą, kontroliuojančią sorgo bazinį atsparumą ligoms, ir jos ryšį su kiekybiniu atsparumu ligoms.

Kaip pradinį žingsnį šia kryptimi, neseniai ištyrėme įvairių sorgų gemalo plazmų rinkinį, kad būtų galima įvertinti jų atsaką į flg22 ir chitino iššaukimą, taip pat atsparumą grybelinėms ligoms [38]. Šiuo atveju MTI buvo kiekybiškai įvertintas išmatuojant ROS gamybą po MAMP iššaukimo. Tarp šio ankstesnio tyrimo rezultatų buvo nustatyti sorgo genotipai, kurie parodė stiprų arba silpną atsaką į MAMP iššaukimą.

Naujos kartos didelio našumo sekos nustatymas ir transkriptų tyrimas gali padėti išsiaiškinti augalų grybelinės infekcijos atsaką ir padidinti supratimą apie šeimininko atsakus. Transkripto analizė buvo plačiai naudojama tiriant augalų atsaką į grybelinę infekciją daugelyje augalų rūšių, įskaitant javus (pvz., nuorodos [31–37]).

Tačiau paskelbti duomenys apie lyginamąją javų kultūrų transkripto analizę daugiausia buvo sutelkti į atsaką į įvairius patogenus. Keliose publikacijose apie sorgą daugiausia dėmesio buvo skiriama augalų, apdorotų įvairiais patogenais, įskaitant antracnozę, transkripto palyginimams [35, 37]. Kai kuriose ankstesnėse publikacijose teigiama, kad nėra reikšmingos koreliacijos tarp atsako į MAMP ir grybelinės ligos. Pavyzdžiui, Zhang ir kt. [17] pranešė apie stiprų ryšį tarp atsako į du MAMP flg22 ir chitino kukurūzų kartografavimo populiacijoje, bet neatitiko atsako į grybelinę ligą. Kimball ir kt. [38] taip pat pranešė apie mažą koreliaciją tarp flg22-sukelto ROS atsako balų ir tikslinių lapų dėmėms atsparumo balų dviejose sorgo RIL populiacijose, įskaitant BTx623/SC155-14E populiaciją. Todėl, atsižvelgiant į duomenų trūkumą, manėme, kad svarbu transkripcijos būdu profiliuoti sorgo atsaką į gydymą MAMP.

Šioje dabartinėje ataskaitoje mes pratęsiame savo ankstesnę analizę, įvertindami pasaulinį transkripcijos atsaką į MAMP iššaukimą. Mes panaudojome Illumina pagrįstą RNR sekos analizę, kad ištirtume transkripcijos pokyčius, reaguojant į gydymą flg22 arba chitinu sorgo genotipuose BTx623 ir SC155-14E, kuriuos anksčiau apibūdinome atitinkamai kaip silpnus ir stiprius MTI reaguojančius. BTx623 yra Sorghum bicolor genomo atskaitos linija [22], o SC155-14E yra linija, rodanti padidėjusį atsparumą antracnozei [39]. Patil ir kt. [39] pranešė, kad SC155-14E parodė aukštą stabilaus atsparumo antraknozės ligai lygį (beveik be ligų) visose tirtose aplinkose, o BTx623 yra jautrus šiai grybelinei ligai. Mūsų RNR-seq analizė nustatė 5252 ir 8085 skirtingai išreikštus genus (DEG) BTx623, apdorotuose atitinkamai flg22 ir chitinu, ir 3849 ir ​​5786 DEG atitinkamai flg22 ir chitinu apdorotame SC155-14E, palyginti su neapdorota kontrolė. šių dviejų genotipų.

Be to, palyginus DEG, parinktus naudojant du skirtingus bioinformatinius vamzdynus, rezultatai buvo labai panašūs. Skirtingai išreikštų genų ekspresijos profiliai, genų ontologijos (GO) praturtinimo analizė ir KEGG kelio praturtinimo analizė parodė aiškų genotipu pagrįstą su MTI susijusią genų ekspresiją. GO termino ir KEGG kelio praturtinimo rezultatai atskleidė daugiau su imunitetu ir atsparumu patogenams susijusių DEG (PR genų, genų atsako į chitiną, genų atsaką į salicilo rūgštį, genų atsaką į stresą ir kt.), pateiktų MAMP gydytame SC{{4} }E mėginiai, palyginti su MAMP apdorotu BTx623. Rezultatai suteikia pagrindą įvairiems sorgo MTI atsako komponentams nustatyti.

2. Rezultatai ir aptarimas

2.1. Oksidacinio sprogimo kitimas skirtinguose sorgo lapuose

Mūsų ankstesnė įvairių sorgo genotipų MTI atsako analizė atskleidė reikšmingus MAMP sukelto oksidacinio sprogimo skirtumus tarp genotipų BTx623 ir SC155-14E [38]. Be to, SC155-14E yra linija, pasižyminti dideliu atsparumu antracnozei, o linija BTx623 yra jautri antracnozei [39]. Būtent dėl ​​šių priežasčių šie du genotipai buvo pasirinkti palyginimui naudojant RNR-seq.

Atlikdami ankstesnius ROS matavimus, net toje pačioje gamykloje nustatėme reikšmingų skirtumų, todėl atidžiau ištyrėme šio skirtumo šaltinį. Tiksliau, mes išbandėme ROS gamybą naudodami tris lapų rinkinius, einančius nuo penkiolikos dienų BTx623 ir SC155-14E augalų apačios iki viršaus. Lapai buvo pažymėti kaip #1, #2 ir #3, iš apačios į viršų, kaip parodyta 1A paveiksle. ROS tyrimo rezultatai (1B pav.) atskleidė, kad: (1) ROS gamybos lygis buvo mažesnis senesniuose lapuose (lapas Nr. 1), o didžiausias ROS gamybos lygis, reaguojant į flg22 arba chitiną, buvo iš jauniausių lapų. lapas Nr.3). (2) Tiek MAMP apdoroti, tiek neapdoroti BTx{15}} ir jauniausi lapai (2 lapas) davė palyginti mažą ROS gamybą.

Priešingai, MAMP apdoroti 2-ieji jauniausi SC155-14E lapai leido žymiai (esant 0.01 lygiui) gaminti didesnį ROS kiekį nei neapdoroti pavyzdžiai, taip pat apdoroti arba imituoti BTx{ {5}} jauniausi lapai. (3) Oksidacinis sprogimas, sukeltas naudojant flg22 arba chitiną, buvo aptiktas abiejų genotipų jauniausių lapų (3 lapas) lapų diskuose, nors, kaip buvo pastebėta anksčiau, ROS gamybos lygis buvo didesnis MAMP apdorotame SC. 155-14E palyginti su BTx623. Flg22-suaktyvintos ir chitino sukeltos ROS gamybos trukmė SC155-14E antrame jauniausiame lape atskleidė, kad chitino suaktyvinta ROS gamyba įvyko anksčiau nei flg22- sukėlė ROS gamybą (1C pav. ). Panašius rezultatus pranešė Zhang ir kt. [17] kur chitino suaktyvinta ROS gamyba atsirado anksčiau nei flg{21}}suaktyvinta ROS gamyba flg22 ir chitinu apdorotuose kukurūzų daiguose. Buvo pranešta [40], kad ROS gamyba, reaguojant į flg22, parodė didžiausią ROS gamybą maždaug 12 minučių, o mažiausia buvo 30 minučių Arabidopsis. Mūsų ROS tyrimo rezultatai su sorgais parodė didžiausią ROS gamybą maždaug po 13 min., o mažiausią - po 30 min. po gydymo flg22, o tai labai panašu į Arabidopsis rezultatus. Kadangi mūsų tikslas buvo rasti optimalias sąlygas palyginti dviejų genotipų MTI atsaką, RNR išskyrimui ir vėlesnei transkriptominei analizei pasirinkome 2-uosius jauniausius 15-dienų augalų lapus. Pavienių sorgo augalų lapų skirtumai primena, kad rezultatai gali skirtis priklausomai nuo eksperimento šaltinio, laiko ir kitų konkretaus eksperimento ypatybių, todėl eksperimentiniai parametrai turi būti atidžiai kontroliuojami.

Oksidacinis sprogimas, greitas, trumpalaikis reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamyba, yra vienas iš anksčiausiai stebimų augalų gynybinės reakcijos aspektų [41]. Atsižvelgiant į tai, kad ROS sprogimas yra tiesioginis atsakas, tikimasi šiek tiek vėlesnio su MTI susijusių genų transkripcijos atsako. Mes paėmėme mėginius praėjus 60 minučių po apdorojimo MAMP RNR-Seq analizei.

2.2. BTx623 ir SC155-14E skirtingai išreikšti genai (DEG) reaguojant į MAMP gydymą

Norint įvertinti kiekvieno mėginio anotuotų Sorghum bicolor baltymus koduojančių genų ekspresijos lygį, buvo apskaičiuotas švarių RNR-seq nuskaitymų skaičius, susietas su kiekvienu genu, o po to normalizuotas į FPKM (fragmentai per kb egzono modelį milijonui susietų fragmentų). Buvo tiriami kiekvieno geno ekspresijos pokyčiai MAMP apdorotuose BTx623 ir SC155-14E lapų diskuose, lyginant su imitaciniu (vandens) apdorojimu. Bendras išreikštų genų skaičius buvo panašus visais abiejų genotipų gydymo būdais: 27 171, 27 283, 27 161, 27 182, 27 512 ir 27 175 genai, išreikšti BTx623, flg22-apdoroto BTx623, chicktin-623, chicktin-623, Atitinkamai {22}}E, flg22-apdorotas SC155-14E ir chitinu apdorotas SC155-14E. Naudojome BTx623 etaloninį genomą skaitymui abiejose eilutėse, nes konkrečios nuorodos į SC155-14E nėra. Išreikšti genų numeriai, gauti iš BTx623 ir SC{{30}}E su visomis anksčiau pateiktomis sąlygomis, parodė, kad abi linijos turi panašų išreikštų genų skaičių. Bendri SC155- 14E modelio (3 pakartojimai), SC155-14E, apdoroto flg22 (3 pakartojimai), SC155-14E, apdoroto chitinu (3 pakartojimai), nuskaitymo kartografavimo dažniai , BTx623 imitacija (3 pakartojimai), BTx623 apdorota flg22 (3 pakartojimai), BTx623 apdorota chitinu (3 pakartojimai) buvo: 93,6 proc., 93,9 proc., 93,9 proc., 93,8 proc., 93,9 proc., 93,9 proc., 93,3 proc., 93,3 proc. , 93,1 proc , 96,9 proc , 97.0 proc , 97.0 proc , 97,2 proc , 96,8 proc , 97.0 proc , 96,9 proc , 97.0 atitinkamai 97,0 proc. Šie rezultatai rodo, kad skirtingas gydymo MAMP poveikis BTx623 ir SC155-14E transkriptams nebuvo nulemtas dviejų genotipų genominės sekos skirtumų.

Genų ekspresijos PCA diagrama suteikia įžvalgų apie ryšį tarp mėginių. Norėdami ištirti mūsų mėginių panašumą, atlikome PCA analizę. Pavyzdžių braižymas PC1 ir PC2 (2 pav.) parodė, kad keturios eksperimentinės sąlygos (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_chitinas ir SC{ {10}}E_chitinas) buvo labai atskirti. Priešingai, trys kiekvienos sorgo linijos ir kiekvieno MAMP apdorojimo biologiniai pakartojimai, taip pat imitacinis gydymas, buvo glaudžiai sujungti atitinkamai, o tai rodo gerą biologinių pakartojimų atkuriamumą (2 pav.).

Vulkano brėžiniai 3 paveiksle rodo genų ekspresiją dviejose sorgo linijose, apdorotose flg22 arba chitinu. Vulkano diagrama yra sklaidos diagramos tipas, rodantis statistinį reikšmingumą (p reikšmę), palyginti su pokyčio dydžiu (kartų pokytis). Tai leidžia greitai vizualiai identifikuoti genus su dideliais pokyčiais, kurie taip pat yra statistiškai reikšmingi. Tai gali būti biologiškai reikšmingiausi genai. 3 paveiksle genai, kurių −log10 (p reikšmė) yra lygus arba didesnis nei 3, laikomi DEG. Raudonos spalvos taškai žymi DEG, o juodos spalvos taškai – ne DEG. Kiekviename diagramoje genai, kurių log2 (kartų _pokytis) didesnis nei 0, yra aukštyn reguliuojami genai, kitaip – ​​žemyn reguliuojami genai. Labiausiai reguliuojami genai yra dešinėje, labiausiai žemyn reguliuojami genai yra kairėje, o statistiškai reikšmingiausi genai yra link viršaus.

Iš kiekvieno gydymo buvo atrinkti skirtingai išreikšti genai (DEG), atsižvelgiant į jų ekspresijos reikšmę (p reikšmė 0.001). Reikėtų pažymėti, kad pasirinkdami DEG šioje ataskaitoje naudojome p reikšmę 0.001 kaip slenkstį, bet ne FDR (q reikšmes). FDR (q vertės) taip pat buvo reikšmingos šiame lygyje (S2–S5 lentelės). Esant p-reikšmei 0,001, FDR buvo 0,0039, 0,0051, 0,0025 ir 0,0035 BTx623 su flg22, SC155-14E su flg22, BTx623 su apdorojimu chitinu 26}}E su gydymu chitinu, atitinkamai. BTx623 ir SC155-14E genų p ir q reikšmės visomis sąlygomis pateiktos S2–S5 lentelėse. Analizuodami šių genų ekspresijos modelius MAMP apdorotuose BTx623 ir SC155-14E lapuose, pastebėjome daug genų (14–30 proc. visų išreikštų genų), kurie po flg22 arba chitino labai skyrėsi. gydymas abiejose sorgo linijose. Bendras chitinu apdoroto BTx623 DEG skaičius (8085) buvo labai panašus į nurodytą ankstesniame transkripto tyrime su BTx623, užkrėstu antracnozės patogenu C. subline-ola (8078) [37]. DEG skaičius buvo didesnis flg22 (19 proc.) arba chitinu (30 proc.) apdorotuose BTx623 lapuose, palyginti su SC155-14E (atitinkamai 14 proc. ir 21 proc.).

Nors didesnis DEG skaičius MAMP apdorotame BTx623, palyginti su SC155-14E, buvo priešingas šių dviejų genotipų ROS atsakui, tai galbūt nenuostabu, nes ROS atsakas ir genų ekspresijos atsakas į gydymą MAMP atsiranda skirtingu laiku, yra iš esmės nepriklausomi ir yra tarpininkaujami skirtingų mechanizmų [42,43]. GO terminas ir KEGG kelio praturtinimas atskleidė daugiau su imunitetu ir atsparumu patogenams susijusių DEG, pateiktų MAMP apdorotuose SC155-14E mėginiuose. Be to, faktas, kad DEG skaičius buvo didesnis chitinu apdorotuose mėginiuose, palyginti su tų, kurie buvo apdoroti flg22, gerai atitiko ROS atsako tyrimus (1B pav.), kuriuose matėme stipresnį ROS atsaką gydant chitinu.

Norėdami ištirti, kokiu mastu genai ir biologiniai procesai yra dalijami tarp flg22 ir chitino gydymo BTx623 ir SC155-14E, mes palyginome jų DEG išsamiau. Venno diagramos 4A paveiksle rodo DEG sutapimą bendruose aukštyn ir žemyn reguliuojamų genų rinkiniuose, kurių p reikšmė yra 0,001. Iš visų 10 535 DEG pagrindinis 2272 genų rinkinys reagavo į gydymą flg22 ir chitinu abiejose sorgo linijose. Panašiai, iš viso 5410 aukštyn reguliuojamų genų, pagrindinis 1778 genų rinkinys buvo reguliuojamas abiejuose genotipuose, o iš 5125 sumažintų genų pagrindinis rinkinys 474 buvo reguliuojamas abiejuose genotipuose. genotipai.

Čia pateikti RNR sekų duomenys buvo analizuojami naudojant bioinformatikos vamzdyną su įrankiais Bowtie{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 ir Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) su numatytaisiais parametrais (konvejeris Nr. 1). Norėdami dar labiau patvirtinti tyrimo rezultatus, analizei atlikti naudojome kitą dujotiekį (2 vamzdyną) su HiSat2, HTSeq ir edgeR. HiSat2 yra kitas TopHat2 vystymas. Mes palyginome kiekvienos būklės DEG (ty du genotipus, apdorotus flg22 arba chitinu, visus, aukštyn arba žemyn reguliuojamus DEG), pasirinktus naudojant abu vamzdynus. Rezultatai (5 pav.) parodė, kad naudojant abu dujotiekius pasirinkti DEG skaičiai buvo labai artimi.

Bendras DEG, pasirinktas naudojant 1 konvejerį ir 2 konvejerį, buvo BTx623_flg22: 5241 ir 5413; SC155-14E_flg22: 3849 prieš 3476; BTx623_chitinas: 8085 prieš 8320; SC155-14E_chitinas: 5786 prieš 5383. Su 1 konvejeriu ir 2 konvejeriu pasirinkti aukštesnio reguliavimo DEG buvo BTx623_flg22: 3074 ir 3076; SC155-14E_flg22: 2591 prieš 2483; BTx623_chitinas: 4156 prieš 4583; SC155-14E_chitinas: 3486, palyginti su 3346. Žemiau reguliuojami DEG, pasirinkti naudojant konvejerį Nr. 1, palyginti su dujotiekiu Nr. 2, buvo BTx623_flg22: 2152 ir 2237; SC155-14E_flg22: 1257 prieš 993; BTx623_chitinas: 3919 prieš 3757; SC155-14E_chitinas: 2296, palyginti su 2037. Be to, 5 paveiksle pateikti rezultatai taip pat atskleidė, kad didelė procentinė DEG, atrinkta naudojant du dujotiekius, sutapo visomis sąlygomis. Sutampančių DEG numerių / DEG numerių, pasirinktų naudojant konvejerį Nr. 1, procentas buvo 79,6 proc. ir 73,7 proc. 80,8 proc. ir 74,4 proc. visų BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitino ir SC155-14E{{73} DEG }chitinas, atitinkamai; 83 proc., 80,6 proc., 85,3 proc. ir 81,1 proc. padidintų reguliuojamų BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitino ir SC{{ 88}}E{89}}chitinas, atitinkamai; 75,1 proc., 59,5 proc., 75,8 proc. ir 67,4 proc. sumažintų BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitino ir SC{{ 105}}E{106}}atitinkamai chitinas. Taigi šie lyginamieji rezultatai įrodė, kad pateikti RNR sekų duomenys yra teisingi, nepaisant to, kuris iš dviejų metodų naudojamas analizei.

BTx623 ir SC155-14E DEG, apdorotų flg22 arba chitinu, trijų biologinių pakartojimų sugrupuotų ekspresijos profilių šilumos žemėlapis parodytas 6 paveiksle. Genų ekspresijos reikšmės buvo normalizuotos kaip z balai. Didėjant vertei, spalva pasikeičia iš violetinės į raudoną, o tai rodo, kad genų ekspresija yra nuo mažos iki didelės. Šis šilumos žemėlapis aiškiai parodo skirtingą genų reguliavimą BTx623 ir SC155-14E, reaguojant į gydymą flg22 arba chitinu. Be to, rezultatai taip pat rodo, kad kiekvienos būklės trijų biologinių pakartojimų šilumos žemėlapiai buvo labai artimi, o tai rodo gerą biologinių pakartojimų atkuriamumą.

Be to, palyginimas poromis (7A pav.) tarp aukštyn ir žemyn reguliuojamų Flg22 ir chitino gydymo DEG parodė, kad BTx623 ir SC155-14E labai sutampa. Iš 3074 flg22-sukeltų BTx623 genų 83,8 proc. taip pat buvo indukuoti BTx623, reaguojant į gydymą chitinu, o iš 2591 flg22-sukeltų genų SC155-14E, {{ 16}},6 proc. atsakė ir į chitinu gydytą SC155-14E. Galbūt tai nenuostabu, nes ankstesni darbai su Arabidopsis thaliana parodė reikšmingą genų, reaguojančių į įvairius skirtingus MAMP, sutapimus, kurie apibrėžia bendruosius MTI kelius [44–46].

Be to, Zhang ir kt. [17] taip pat pranešė apie reikšmingą ryšį tarp flg22 ir chitino atsako kukurūzuose. Buvo pastebėtas mažesnis sutapimas tarp BTx623 ir SC155-14E lapų diskų, apdorotų tuo pačiu MAMP (7A pav.). 64,3 proc. flg22-sukeltų genų BTx623 buvo indukuoti flg22-gydytame SC155-14E ir 68,3 proc. E. Panašiai, iš 2152 genų, kurie buvo sumažėję gydant flg22 BTx623, didelį procentą (75,9 proc.) taip pat sumažino chitinas BTx623. Iš 1257 genų, kurių SC155-14E sergant flg22 reguliavimas buvo sumažintas, 70,8 proc. taip pat buvo sumažintas chitino reguliavimas SC155-14E. Tačiau tik 29 procentai flg22 reguliuojamų genų, esančių BTx623, taip pat buvo reguliuojami flg22-gydytame SC155-14E ir 45 procentai chitino reguliuojamų genų BTx623 buvo nepakankamai reguliuojami. chitinu apdorotame SC155-14E (7A pav.). Taigi, nors dviejuose lyginamuose genotipuose MTI keliai į flg22 ir chitiną buvo reikšmingi konvergencija, duomenys taip pat rodo įdomų sudėtingumą, kaip šie du genotipai reaguoja į skirtingus MAMP.

2.3. Genų funkcinio praturtinimo analizė, lyginant BTx623 ir SC155-14E MTI atsaką

Norėdami nustatyti funkcines genų, reguliuojamų reaguojant į flg22 arba chitiną, kategorijas ir skirtingą dviejų tirtų sorgo linijų atsaką, naudojome PlantRegMap [47,48] platformą, kad atliktume genų rinkinio praturtinimo analizę, pagrįstą aptiktais DEG biologiniuose tyrimuose. proceso kategorija. 8A ir B paveiksluose pavaizduoti pagrindiniai biologiniais procesais praturtintų genų GO terminai su aukštyn reguliuojamais DEG ir žemyn reguliuojamais DEG iš BTx623 ir SC155-14E. Visas DEG sąrašas pateiktas S6–S13 lentelėse. Daugelis šių genų yra susiję su procesais, įskaitant atsaką į stresą, augalų apsaugos reakcijas, atsaką į stimulą, atsaką į biotinį dirgiklį, atsaką į bakteriją, atsaką į kitą organizmą, ląstelių ryšį, fosforo apykaitos procesą ir baltymų fosforilinimą.

Rezultatai 8A ir B paveiksluose rodo aiškius genų, paprastai susijusių su įgimtu imunitetu, ekspresijos skirtumus tarp dviejų sorgo genotipų. Tais praturtintais GO terminais kiekvienoje būsenoje buvo rasta keletas unikalių DEG su persidengimu. Pavyzdžiui, GO termino gynybinis atsakas (GO 0006952): 91 ir 84 aukštyn reguliuojami DEG buvo atitinkamai praturtinti BTx623 arba SC155-14E, apdorotais flg22. Tuose DEG 24 DEG buvo unikalūs BTx623, o 15 DEG buvo rasti tik SC155-14E, o kiti buvo pateikti abiejuose sorgo genotipuose. Panašiai 102 ir 93 aukštyn reguliuojami DEG buvo praturtinti atitinkamai BTx623 arba SC155-14E, apdorotais chitinu. Tuose DEG 20 DEG buvo unikalūs BTx623, o 14 DEG buvo unikalūs SC155-14E, o kiti buvo pateikti abiejuose sorgo genotipuose.

Pagal GO terminą „atsakas į chitiną (GO: 0010200)“ mes pastebėjome 18 padidintų DEG iš 779 šios kategorijos genų, praturtintų chitinu apdorotais SC155-14E mėginiais (8 pav. ), tuo tarpu chitinu apdorotuose BTx623 mėginiuose joks genas nebuvo praturtintas. Be to, 16 aukštai reguliuojamų DEG buvo praturtinti flg22-apdorotuose SC155-14E mėginiuose, o 12 aukštai reguliuojamų DEG buvo praturtinti flg22-apdorotuose BTx623 mėginiuose (8 pav.). Palyginus GO termino „atsako į chitiną“ DEG sąrašus flg22 ir chitinu apdorotame BTX623 ir SC155-14E (S9 lentelė), paaiškėjo, kad DEG, praturtinti flg22 arba chitinu apdorotu SC155- 14 E buvo vienodi, išskyrus tai, kad chitinas sukėlė dar du DEG nei flg22. Priešingai, visi 12 DEG, praturtinti flg22-apdorotu BTX623, skyrėsi nuo DEG, kuriuos sukėlė MAMP SC155-14E. Tie MAMP sukeltos DEG gali prisidėti prie atsparumo antracnozės atsakui SC155-14E, nes chitinas yra tipiška MAMP molekulė iš grybelio ląstelių sienelių, sukelianti augalų imuninį atsaką. Stringlis ir kt. [49] taip pat pranešė, kad daug reguliuojamų DEG buvo praturtinti GO terminu „atsako į chitiną“ iš chitino, flg22 ir augalams naudingų rizobakterijų Pseudomonas simiae WCS417 apdorotų Arabidopsis augalų. Matic ir kt. [33] pranešė, kad 21 DEG buvo praturtintas GO terminu "atsakymas į chitiną" iš ryžių lapų RNR-seq analizės atspariai veislei, bet ne iš jautrios veislės po užkrėtimo grybeliniu patogenu Fusarium fujikuroi.

PR (su patogeneze susiję) genai dalyvauja augalų imuniniame atsake [50] ir turi priešgrybelinį aktyvumą prieš daugelį fitopatogeninių grybų [51]. PR-10 baltymai yra maži, pirmiausia rūgštūs, tarpląsteliniai baltymai, turintys priešgrybelinių savybių, kurios buvo susijusios su augalų rūšių, įskaitant sorgus, gynybiniais atsakais [52]. PR-10 genų šeimos nariai buvo sukelti patogenų atakų įvairiose augalų rūšyse [53]. Sorgo atveju Lo ir kt. [26] pranešė, kad PR-10 ekspresija buvo indukuota kaip aktyvios sorgo šeimininko apsaugos nuo lapų grybelio patogenų C. heterostrophus ir C. sublineolum dalis. Katie ir kt. [54] pranešė, kad lauko bandymų metu kelios sorgų veislės parodė reikšmingą normalizuoto santykinio PR-10 kiekio indukciją po C. lunata ir F. capsicum grybų sporų inokuliacijos. Šiltnamio sąlygomis užkrėstų augalų gėlės rodė PR-10 mRNR indukciją, o dviejų atsparių veislių, tirtų tirtų, atsakas buvo didesnis, palyginti su dviem jautriomis veislėmis.

Mūsų rezultatai atskleidė, kad tarp nustatytų DEG buvo rasti keturi PR-10 genai (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). SC155-14E visi keturi PR-10 DEG buvo sureguliuoti gydant flg22 arba chitinu, priešingai, BTx623, SORBI_3001G401000 DEG nerasta, o SORBI{{15} }G401300 (sureguliuotas) buvo pateiktas tik BTx623 gydant chitinu, bet ne gydant flg22. Tai parodė, kad PR genų ekspresija gali būti panaudota reaguojant į didesnį ROS produkto kiekį po gydymo MAMP ir atsparumą antracnozei SC155-14E.

Salicilo rūgštis (SA) yra augalų imuninis signalas, būtinas tiek vietiniam gynybiniam atsakui, tiek sisteminiam įgytam atsparumui. Jis vaidina svarbų vaidmenį atsparumui ir augalų apsaugai nuo patogenų atakų [55]. Sorguose Tugizimana ir kt. [56] pranešė apie kiekybinius jazmono rūgšties, salicilo rūgšties konjugatų ir abscizo rūgšties kiekio pokyčius C. subline-ola užkrėstuose sorgais. C. subline-ola yra antracnozės sukėlėjas. Sorgo genotipai, turintys padidintą aminorūgščių (triptofano ir tirozino), jazmono rūgšties ir salicilo konjugatų bei zeatino kiekį, buvo atsparesni antracnozei. Šiame tyrime GO terminas „reakcija į salicilo rūgštį“ (GO: 0009751), įskaitant 19 aukštai reguliuojamų DEG, buvo specialiai praturtintas tik SC155-14E, apdorotame chitinu (S9 lentelė). Taigi, salicilo signalizacijos kelias gali atlikti svarbų vaidmenį reaguojant į didesnį ROS gamybos lygį po gydymo MAMP ir atsparumą antracnozei sergant SC155-14E.

Be to, 169 sureguliuoti DEG buvo praturtinti GO termino atsaku į stresą tik SC155-14E, apdoroto chitinu (S9 lentelė). Kiti GO terminai, aptinkami tik MAMP apdorotame SC155-14E, bet ne BTx623 su tokiu pačiu būdu, yra antriniai metaboliniai procesai (GO: 0019748), fosfatidilcholino biosintezės procesas (GO: 0006656) ir lipidų biosintezės procesas ( GO:0008610).

Be to, 169 sureguliuoti DEG buvo praturtinti GO termino atsaku į stresą tik SC155-14E, apdoroto chitinu (S9 lentelė). Kiti GO terminai, aptinkami tik MAMP apdorotame SC155-14E, bet ne BTx623 su tokiu pačiu būdu, yra antriniai metaboliniai procesai (GO: 0019748), fosfatidilcholino biosintezės procesas (GO: 0006656) ir lipidų biosintezės procesas ( GO:0008610).

Mes taip pat ištyrėme genų, kurie yra kartu reguliuojami tarp dviejų genotipų po gydymo flg22 arba chitinu, sudėtį, taip pat pagrindinius DEG rinkinius visuose gydymo būduose ir du genotipus, atlikdami GO sodrinimo analizę (4B ir 7B paveikslai). Visas DEG sąrašas pateiktas S14 ir S15 lentelėse. 4B paveiksle pavaizduoti BTx623 ir SC{10}}E visų, aukštyn ir žemyn reguliuojamų DEG pagrindinių rinkinių praturtinti GO terminai su visais gydymo būdais. GO terminai, susiję su MAMP atsaku ir augalų apsauga (pvz., chitino prisijungimas, gynybinis atsakas, baltymų kinazės aktyvumas, baltymų fosforilinimas, baltymų serino / treonino kinazės aktyvumas), buvo žymiai praturtinti reguliuojamais DEG, o antrinio metabolito biosintezės proceso GO terminai, Geležies jonų surišimas, oksidoreduktazės aktyvumas buvo praturtintas tik sumažintais DEG. Šis rezultatas buvo panašus į rezultatus, gautus naudojant Arabidopsis, kur GO terminai, susiję su atsaku į stimuliatorius (flg22 peptidai iš P. simile WCS417 ir P. aeruginosa PAO1, chitinas ir P. simile WCS417 bakterinės ląstelės), buvo labiausiai praturtinti aukštyn reguliuojamuose pagrindinis DEG rinkinys [49].

7B paveiksle pavaizduoti žymiai praturtinti bendrai reguliuojamų (ty abiejų genotipų aukštyn arba žemyn reguliuojamų) DEG rinkinių GO sąlygos tarp BTx623 ir SC155-14E po gydymo flg22 arba chitinu. Rezultatai atskleidė, kad GO terminai, susiję su MAMP atsaku ir augalų apsauga (pvz., gynybos atsakas, baltymų kinazės aktyvumas, baltymų fosforilinimas, baltymų serino / treonino kinazės aktyvumas), buvo praturtinti tik flg22 arba chitino reguliuojamais DEG abiejuose genotipuose, o GO terminai. Antrinio metabolito biosintezės proceso, hemo jungimosi, geležies jonų surišimo, vieno deguonies atomo oksidoreduktazės aktyvumo ir fosfatidilcholino biosintezės proceso buvo praturtinti tik žemyn reguliuojamais DEG rinkiniais.

2.4. BTx623 ir SC155-14E MTI atsako KEGG kelio praturtinimo analizė

9 paveiksle parodyta MAMP apdorotuose BTx623 ir SC155-14E mėginiuose aptiktų MAMP apdorotų DEG KEGG kelio sodrinimo analizė naudojant DAVID internetinį įrankį [57]. Visas DEG sąrašas pateiktas S16–S20 lentelėse. Rezultatai nustato tuos specifinius geriausius KEGG kelius, praturtintus dėl MTI aktyvavimo dviejuose sorgo genotipuose. KEGG kelyje „augalų ir patogenų sąveika“ pastebėjome, kad chitinu apdorotuose SC155-14E mėginiuose buvo praturtinti 24 sureguliuoti DEG, o chitinu apdorotuose BTx623 mėginiuose nė vienas DEG nebuvo praturtintas. Stipresnis SC155-14E genotipo chitino atsakas koreliuoja su didesniu šio genotipo atsparumu grybelinei ligai antracnozei [39]. Be to, KEGG kelio praturtinimas atskleidė 28 genus, dalyvaujančius termininėje fenilpropanoido biosintezėje SC155-14E, apdorotame flg22. Fenilpropanoidų biosintezės kelias prasideda nuo fenilalanino, kuris gali būti paverstas aromatiniais junginiais, tokiais kaip flavonoidai, benzenoidai, kumarinas, hidroksicinamatai ir ligninas [58, 59]. Daugelis fenilpropanoidų ir flavonoidų buvo susiję su atsparumo ligai atsaku [28, 60]. Fitoaleksinų gamyba yra pagrindinė gynybos reakcija nuo antracnozės patogeno C. subline-ola [28] sorguose. 3- deoksiantocianidinai yra neįprasta flavonoidų grupė, sorgo sudėtyje esantys fitoaleksinai. Fitoaleksinai yra mažos antimikrobinio aktyvumo molekulės, pagamintos po patogeno infekcijos [61]. Wang ir kt. [37] taip pat nustatė, kad KEGG termino fenilpropanoido biosintezė buvo žymiai praturtinta C. subline-ola užkrėstų augalų DEG, atliekant sorgo transkriptomikos tyrimą. Reikėtų pažymėti, kad KEGG kelio sodrinimo rezultatai (9 pav.) taip pat parodė didesnį BTx623 atsaką po gydymo MAMP kai kuriuose keliuose, kurie gali turėti įtakos augalų ir patogenų sąveikai (pvz., fenilalanino ir triptofano biosintezės keliuose, antibiotikų biosintezėje).

Be to, KEGG kelio praturtinimo analizės rezultatai sumažino reguliuojamų DEG atskleidė, kad dešimt žemyn reguliuojamų DEG buvo pažymėti kaip „fotosintezės antenos baltymai“, o 84 DEG buvo anotuoti kaip „antrinių metabolitų biosintezės“ dalyviai, buvo praturtinti apdorotu flg22. BTx623. Tačiau tokie genų ekspresijos tyrimai gali nustatyti genus, skirtingai išreikštus atsakant į gydymą MAMP arba patogeno infekciją, tačiau tai nebūtinai parodo, kad šie genai yra labai svarbūs atsparumui konkrečiam patogenui. Taigi, kaip atskleidė RNR-Seq analizė, reikėtų atlikti tolesnius tyrimus, kad būtų galima suprasti priežastinius ryšius tarp grybelių atsparumo ir tų KEGG takų aktyvavimo abiejuose genotipuose.

Taip pat atlikome KEGG kelio praturtinimo analizę pagrindiniams DEG rinkiniams visomis sąlygomis (4C pav.), Taip pat bendrai reguliuojamus DEG tarp dviejų genotipų po gydymo flg22 arba chitinu (7C pav.). Rezultatai atskleidė, kad šeši svarbūs keliai, įskaitant augalų ir patogenų sąveikos kelią, buvo praturtinti tik aukštyn reguliuojamais pagrindiniais DEG rinkiniais, bet ne žemyn reguliuojamais pagrindiniais DEG rinkiniais. Panašiai septyni ir trys keliai, įskaitant augalų ir patogenų sąveikos kelią, buvo žymiai praturtinti chitino reguliuojamais DEG ir flg22 reguliuojamais DEG atitinkamai BTx623 ir SC155-14E. Priešingai, tik ribosomų biogenezė eukariotų kelyje buvo praturtinta chitino reguliuojamais DEG abiejuose genotipuose.

2.5. RNR-Seq duomenų patvirtinimas naudojant kiekybinę pasirinktų genų RT-PGR

Norėdami patvirtinti genų ekspresijos profiliavimo duomenis, gautus naudojant RNR-seq, atlikome qRT-PCR analizę, kad įvertintume devynių pasirinktų genų kandidatų ekspresiją. Tie devyni genai buvo atrinkti pagal ekspresiją, kurią stebėjo RNR-seq trijose kategorijose: (a) panašiai išreikšti BTx623 ir SC155-14E, gydant flg22 arba chitinu; (b) išreikšta tik MAMP apdorotuose SC155-14E, bet ypač maža ekspresija apdorotame BTx623 ir (c) išreikšta 2–21- kartus didesnė MAMP apdorotose SC155-14E, palyginti su BTx623 . qRT-PCR analizės rezultatai (1 lentelė) atskleidė visišką sutapimą su ekspresijos lygiais, nustatytais atliekant RNR-seq analizę kiekvienam iš devynių įvertintų genų. Šie rezultatai suteikia mums pasitikėjimo, kad RNA-seq atlikti matavimai atspindi sorgo linijų transkripcijos atsaką į gydymą MAMP

2.6. Išvados

Šiame tyrime pirmiausia nustatėme optimalias sąlygas palyginti dviejų genotipų MTI atsaką, išbandydami ROS gamybą naudojant tris lapų rinkinius ir pasirinkome antrus jauniausius penkiolikos dienų augalų lapus RNR ekstrakcijai ir vėlesnei transkriptominei analizei. Flg22-suaktyvintos ir chitino sukeltos ROS gamybos laiko eiga sorgo linijoje SC155-14E (1C pav.) atskleidė, kad chitino suaktyvinta ROS gamyba įvyko anksčiau nei suaktyvinta gydant flg22. Gavome grybelinės ligos antracnozei atsparaus Sorghum bicolor genotipo SC155-14E, pasižyminčio dideliu atsaku į gydymą MAMPs, ekspresijos profilius ROS gamybai ir jautraus genotipo BTx623, kurio ROS produkto reakcija į MAMP gydymą ankstyvosiose stadijose buvo žema. įgimto imuniteto atsakas.

Rezultatai rodo aiškų sorgo genotipų BTx623 ir SC155-14E genų ekspresijos kitimą, reaguojant į gydymą MAMP. Nors atsakymai į dvi MAMP kiekvienoje eilutėje labai sutampa (86,6–70,8 proc.), jie buvo skirtingi. Taip pat buvo pastebėtas tam tikras, nors ir mažesnis, sutapimas (68,3–29 proc.) tarp dviejų eilučių atsakymų į tą patį MAMP. Nemažai DEG, 2272 iš 10 535 DEG, buvo nustatyta visomis keturiomis sąlygomis ir preliminariai apibrėžia pagrindinį MAMP atsaką. Šis genų sąrašas turėtų būti naudingas toms laboratorijoms, kurios nori profiliuoti genų ekspresijos atsaką į gydymą MAMP. RNR-seq analizė nustatė didelius skirtingai išreikštų genų rinkinius BTx623 ir SC155-14E, apdorotuose flg22 arba chitinu, palyginti su neapdorotomis tų dviejų linijų kontrolėmis. Be to, palyginus DEG, parinktus naudojant du skirtingus bioinformatikos vamzdynus, buvo gauti labai panašūs rezultatai. Išsami šių DEG ekspresijos profilio analizė, GO sodrinimo analizė ir KEGG kelio analizė atskleidė aiškų dviejų genotipų genų ekspresijos atsako skirtumą. GO terminas ir KEGG kelio praturtinimas atrado daugiau su imunitetu ir atsparumu patogenams susijusių DEG (PR genų, genų atsako į chitiną, genų atsaką į salicilo rūgštį, atsaką į stresą, fenilpropanoido biosintezę ir kt.) MAMP apdorotame SC{{18} }E mėginiai, palyginti su BTx623, naudojant tą patį apdorojimą. Ši informacija suteikia svarbią pradinę informaciją apie tai, kaip šio pagrindinio augalo įgimta imuninė sistema reaguoja į MAMP sukėlimą. Atsižvelgiant į tai, kad apskritai trūksta informacijos apie įgimtą pasėlių augalų imuninį atsaką, palyginti su Arabidopsis modeliu, aprašyti genų sąrašai ir metodai yra šaltinis tolesniam sorgo atsako į patogenus tyrimui ir turėtų palengvinti pastangas galiausiai pagerinti atsparumą ligoms. šis svarbus maistinis ir biomasės augalas.

3. Medžiagos ir metodai

3.1. Augalinės medžiagos

Šiame tyrime buvo naudojamos dvi sorgo linijos, kurias pateikė dr. William Rooney (Teksaso A&M universitetas, koledžo stotis, JAV) ir dr. Stephenas Kresovich (Clemson University, Clemson, JAV). BTx623 yra standartinė sorgo linija su visa genomo seka [22], o SC155-14E yra linija, sukurta atsparumui antracnozei [39].

3.2. ROS tyrimai

Sorgo sėklos BTx623 ir SC155-14E buvo sterilizuotos paviršiuje (70 proc. etanolio 1 min., o po to 10 proc. baliklio 10 min., nuplaunamos autoklavuotu ddH2O) ir pasodintos į autoklavuotą Sunshine vazonų mišinį ir daigintos augimo kamerose ( 16 h/8 h šviesa/tamsa, 28/26 ◦C, 60–70 proc. drėgmė). Eksperimentams buvo naudojami penkiolikos dienų augalai.

Šiame tyrime buvo naudojami du MAMP, flg22 (genscript katalogas Nr. RP19986) ir chitinas iš krabo kiauto (Sigma-Aldrich, katalogo Nr. C3641). Flg22 yra peptidas, gautas iš augalų patogeninių bakterijų flagelino N-galo ir yra gerai žinomas, kad augaluose sukelia specifinį įgimtą imuninį atsaką [62]. Chitinas yra tipiška MAMP molekulė, gaunama iš grybelio ląstelių sienelių, sukelianti augalų imuninį atsaką [3]. ROS tyrimai buvo atlikti pagal Kimball ir kt. [38]. Norint įvertinti MAMP atsako kitimą atskiruose genotipuose, taip pat lapų padėtį, visi trys visiškai išsiplėtę kiekvieno genotipo augalų lapai buvo įvertinti atskirai. Kiekvieno genotipo penkiolikos dienų sorgo augalų lapai nuo apačios iki viršaus buvo pažymėti kaip 1, 2 ir 3 lapai. ROS gamybai matuoti mėginiams imti naudojome tik vidurinę lapo dalį. Iš karto po apdorojimo kiekvieno mėginio chemiliuminescencinis signalas buvo registruojamas 30 minučių naudojant Photek CCD kamerą (Photek Ltd., East Sussex UK). Aštuonios šulinėlės sudarytos iš imitacinio apdorojimo (be MAMP), o aštuoniose duobutėse – apdorojimas (su MAMP). Kiekvienu atveju kiekvienam gydymui buvo lyginami trys biologiniai pakartojimai su iš viso 8 mėginiais.

3.3. Mėginio apdorojimas MAMP

Eksperimentams buvo naudojami penkiolikos dienų augalai. MAMP gydymas buvo atliktas taip, kaip aprašyta Valdes-Lopez ir kt. [12] su nedideliais pakeitimais. Trumpai tariant, antras lapas (iš viršaus, ty antrasis jauniausias lapas) nuo penkių augalų kiekvienai sorgo linijai buvo atskirtas ir po to 2 minutes vakuume infiltruojamas autoklavuotu ddH2O. Iš kiekvieno genotipo vandeniu infiltruotų lapų buvo išpjauti maždaug penkiasdešimt 1 cm skersmens lapų diskai ir sujungti. Keturiasdešimt penki lapų diskai iš kiekvieno genotipo buvo perkelti į tris skirtingas Petri lėkšteles (po 15 lapų diskų kiekvienoje Petri lėkštelėje) ir po to per naktį plūduriuoti kambario temperatūroje ant autoklavuoto ddH2O su plokštelėmis, padengtomis aliuminio folija. Kitą dieną vanduo buvo pašalintas iš visų Petri lėkštelių ir pakeistas 10 ml ddH2O (mock), 10 ml 1 µM flg22 arba 10 ml 20 mg/mL chitino tirpalo. Po 60-min. apdorojimo modeliu ir MAMP apdoroti lapų griežinėliai buvo surenkami į skirtingus mėgintuvėlius ir nedelsiant užšaldomi skystame azote. Lapų griežinėlių mėginiai (101 kve Aukščiau aprašytos procedūros buvo atliekamos tamsiomis sąlygomis, kad būtų pašalintas bet koks galimas fotosintezės efektas.

3.4. RNR ekstrahavimas, sekos nustatymas ir bibliotekos kūrimas

RNR ekstrahavimas buvo atliktas naudojant „Zymoresearch“ rinkinį „Direct-zol RNA Miniprep Plus“ (katalogas Nr. R2071) pagal gamintojo instrukcijas.

Didelio našumo sekos nustatymas buvo atliktas Misūrio universiteto DNR pagrindiniame įrenginyje. Aštuoniolika bibliotekų buvo sukonstruota pagal gamintojo protokolą su reagentais, tiekiamais Illumina TruSeq mRNR gijų mėginių paruošimo rinkinyje. Mėginio koncentracija buvo nustatyta Qubit fluorometru (Invitrogen), naudojant Qubit HS RNR tyrimo rinkinį, o RNR vientisumas buvo patikrintas naudojant automatinę elektroforezės sistemą Fragment Analyzer. Trumpai tariant, poli-A turinti mRNR buvo išgryninta iš visos RNR (1 µg), RNR buvo suskaidyta, iš suskaidytos RNR buvo sukurta dvigrandė cDNR, o indeksas, turintis adapterius, surištas prie galų. Amplifikuotos cDNR konstrukcijos buvo išgrynintos pridedant Axyprep Mag PCR Clean-up granules. Galutinė kiekvienos išgrynintos bibliotekos konstrukcija buvo įvertinta naudojant automatinę elektroforezės sistemą Fragment Analyzer, kiekybiškai įvertinta Qubit fluorometru, naudojant Qubit HS dsDNA tyrimo rinkinį, ir praskiesta pagal Illumina standartinį sekos nustatymo protokolą, skirtą sekai nustatyti NextSeq 500. Sekos nustatymo ilgis buvo vienas. skaityti 75 bazėse.

3.5. RNA-Seq skaitymų kartografavimas ir apdorojimas

Sekos duomenys atspindėjo šešias skirtingas sąlygas: BTx623 su imitaciniu, flg22 arba chitino apdorojimu ir SC155-14E su imitaciniu, flg22 arba chitinu. Kiekviena būklė buvo pavaizduota trimis biologiniais pakartojimais, todėl iš viso buvo 18 mėginių. Pirma, 30 skaitymo galai buvo „apkarpyti“ Illumina adapteriams, dviprasmiškiems nukleotidams (N) ir (dėl NextSeq technologijos) dirbtiniam poli-G (pavaizduotam G{100}), naudojant cutadapt. 1.15 versija (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, pasiekiama 2019 m. rugpjūčio 21 d.), skirta skaitymui, kurio 30 galų sutampa su adapteriu, mažiausiai 3 bazėms su 90 procentų tapatumo. Jei po šio apkarpymo skaityme buvo mažiau nei dešimt bazių, jis buvo išmestas (kartu su suporuotu skaitymu, jei taikoma). RNR seq duomenų kokybės balai po apipjaustymo buvo ištirti naudojant FASTQC (0.11.9 versija) [63]. Visų skaitymų pozicijų vidutinis kokybės balas yra maždaug 34, o tai rodo, kad bazinio skambučio tikslumas yra didesnis nei 99,9 proc. Kiekvieno mėginio skaitymai buvo suderinti su etaloniniu genomu (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) su Tophat 2.1.1. Gauti derinimo failai buvo pateikti Cufflinks 2.2.1, kad būtų galima surinkti kiekvieno mėginio nuorašus. Šiame tyrime naudota anotacijos versija buvo Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Tos pačios būklės mėginiai buvo sujungti naudojant Cuffmerge. Tikslas buvo suteikti vienodą genų ir transkripto ekspresijos apskaičiavimo pagrindą kiekvienoje būsenoje.

3.6. Bioinformatinė RNR-Seq duomenų analizė

RNR sekų duomenys buvo analizuojami naudojant bioinformatikos įrankius Bowtie{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 ir Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) su numatytaisiais parametrais. Su šiais įrankiais naudojome tą patį vamzdyną, kaip aprašyta Trapnell ir kt. [64]. Norėdami dar labiau patvirtinti tyrimo rezultatus, analizei atlikti naudojome kitą konvejerį su HiSat2 (versija 2.1.{15}}), HTSeq (versija 0.12.4) ir edgeR (versija 3.26.8). HiSat2 yra kitas TopHat2 vystymas. Pirmiausia naudojome HiSat2, kad suderintume naudodami Sorghum etaloninį genomą. Tada mes panaudojome HTSeq, kad suskaičiuotume, kiek skaitymų buvo susietas su kiekvienu genu. Tam mums reikėjo bam failų, sugeneruotų atliekant ankstesnį veiksmą, ir genomo anotacijos (gif failo). Atkreipkite dėmesį, kad etaloninis genomas ir anotacijų failai yra tokie patys, kokius naudojome pradiniame dujotiekyje. Galiausiai, mes panaudojome R paketą edgeR, norėdami nustatyti skirtingai išreikštus genus kiekvienoje būsenoje

3.7. Skirtingai išreikštų genų identifikavimas
Sujungtas agregatas buvo tiekiamas Cuffdiff, kuris apskaičiuoja išraiškos lygius ir tikrina stebimų pokyčių tarp dviejų sąlygų statistinį reikšmingumą. Palyginome BTx623 ir SC155-14E SC155-14E sąlygas. Skirtingai išreikšti genai buvo išgauti naudojant 0.001 p vertės slenksčius. Vulkano brėžiniai buvo sudaryti naudojant R paketą (ggplot2 V3.3.0), kad būtų parodyta genų ekspresijos pokyčio reikšmė esant atitinkamai BTx623, apdoroto flg22 arba chitinu, ir SC155- 14E, apdoroto flg22 arba chitinu, reikšmė. Genų taškai, kurių −log10 (p reikšmė) yra lygūs arba didesni nei trys, buvo laikomi DEG. Kiekviename diagramoje genų taškai, kurių log2 (kartų _pokytis) didesnis nei nulis, buvo aukštyn reguliuojami genai, kitu atveju jie sumažino reguliavimą.

3.8. PCA sklypas

Norint ištirti kiekvienos sorgo linijos trijų biologinių pakartojimų ir kiekvieno MAMP apdorojimo genų ekspresijos verčių ryšį, naudojant R paketus (ggfortify V{{0}}.4.10, ggplot2 V3) buvo sukurti pagrindinių komponentų analizės (PCA) grafikai. .3.0). Kiekvienas taškas reiškia būseną po pirminės ypatybių erdvės (geno išraiškos) susiejimo su pirmaisiais dviem pagrindiniais komponentais. Taškai, priklausantys tai pačiai būklei, linkę susikaupti

3.9. DEG šilumos žemėlapis

1 Augalų mokslo ir technologijų bei biochemijos skyrius, CS Bondo gyvybės mokslų centras, Misūrio universitetas, Kolumbija, MO 65211, JAV; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 Elektros inžinerijos ir kompiuterių mokslo katedra, CS Bondo gyvybės mokslų centras, Misūrio universitetas, Kolumbija, MO 65211, JAV; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Augalų mokslo tyrimų skyrius, USDA-ARS, Rolis, NC 27695, JAV

* Correspondence: staceyg@missouri.edu