Ginsenozido F1 balinimo veiksmingumas slopinant melanino pernešimą kultivuotuose žmogaus melanocitų-sekeratinocituose ir trimatėje žmogaus odos ekvivalente

Ginsenozidai yra pagrindinės veikliosios ženšenio medžiagos. Odos fiziologijoje ginsenozidai veikia pigmento reguliavimą ir pasižymi senėjimą stabdančiomis savybėmis. Remiantis naujausiais pranešimais, ginsenozidas Rg1 padidina melanogenezę ir tirozinazės aktyvumą žmogaus melanocituose [1]. Priešingai, pranešama, kad ginsenozidas F1 (GF1) (1 pav.), metabolitas, susidarantis hidrolizės būdu Rg1, slopina matomą pigmentaciją. Han ir kt. atliktas klinikinis tyrimas parodė, kad GF1 balina odą dirbtinai įdegusiai žmogaus odai, kurią sukelia interleukino 13 gamyba iš žmogaus epidermio gd T ląstelių [2]. Kim ir kt. parodė, kad GF1 sumažina melanino sekreciją per dendrito atitraukimą, nedarant poveikio intraceluliniam melanino kiekiui ir tirozinazės ekspresijai melanocitus stimuliuojančio hormono (MSH) stimuliuojamose B16F10 pelių melanomos ląstelėse [3]. Tačiau iki šiol nebuvo gauta tiesioginių išvadų apie GF1 balinamąjį poveikį žmogaus epidermio aplinkoje, kurią sudaro melanocitai ir keratinocitai in vitro eksperimentinėje sistemoje.

Interpoliacija, tuo pačiu metu nustatėme, kad Cistanche deserticola yra ir tirozinazės, o tirozinazės-dopos greičio oksidacijos metodu buvo atliktas tirozinazės aktyvumo reguliavimo tyrimas feniletanoido glikozido ekstrakte Cistanche deserticola, rezultatai rodo, kad: bendras feniletanoidas. Cistanche deserticola glikozidai Ekstraktas gali žymiai sumažinti tirozinazės aktyvumą. Cistanche deserticola esantis feniletanoido glikozidas taip pat gali veiksmingai sugerti ultravioletinę spinduliuotę saulės šviesoje. Feniletanoidinio glikozido molekulinė struktūra turi daug konjuguotų sistemų. Po ultravioletinių spindulių nuskaitymo nustatyta, kad jis turi stiprią sugertį nuo 280 nm iki 380 nm, o didžiausias sugerties bangos ilgis yra 281 nm ir 333 nm. , rodantis, kad Cistanche deserticola feniletanoidinis glikozidas gerai sugeria ultravioletinius spindulius ir gali geriau užkirsti kelią ultravioletinės spinduliuotės odai ir ją sušvelninti.

Click jing herbs cistanche ekstrakto miltelių produktas

1 pav. GF1 poveikis melanino kiekiui ir tirozinazės ekspresijai žmogaus melanocituose. GF1 (10 mM, 50 mM, 100 mM) buvo apdorotas MNT-1 ląstelėmis 24 val., 48 val. ir 72 val. (A) Tada buvo analizuojamas melanino kiekis. (B) Tirozinazės ekspresijos lygis buvo analizuojamas. Be to, GF1 (10, 50, 100 uM) buvo apdorotas a-MSH (500 nM) stimuliuotomis MNT-1 ląstelėmis 48 ir 72 valandas. (C) Tada buvo analizuojamas melanino kiekis. (D) Tirozinazės ekspresijos lygis buvo analizuojamas. Pirminius normalius žmogaus epidermio melanocitus (NHEM) apdorojome GF1 (50 mM ir 100 mM), esant a-MSH stimuliacijai arba be jos 48 valandas. (E) Tada buvo analizuojamas melanino kiekis. (F) Tirozinazės ekspresijos lygis buvo analizuojamas. MNT-1 ląstelės buvo apdorotos GF1 (50 mM ir 100 mM) 48 valandas auginimo terpėje, kurioje yra 100 mM arba 500 mM L-tirozino. (G) Tada buvo analizuojamas melanino kiekis. GADPH, gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazė; GF1, ginsenozidas F1.

Čia mes ištyrėme anti-melanogeninį GF1 poveikį MNT-1/HaCaT kokultūrų ląstelėms ir trimačiam (3-D) žmogaus odos ekvivalentui. Be to, mes sutelkėme dėmesį į dendrito susidarymą melanocituose ir melanosomų perkėlimą į keratinocitus po gydymo GF1. Bendrai, mūsų išvados pirmą kartą parodo, kad GF1 parodė balinimo poveikį žmogaus epidermyje, egzistuojančiame kartu su melanocitais ir keratinocitais.

Šiam tyrimui MNT{0}} ląstelės buvo kultivuojamos minimalioje esminėje terpėje (MEM), kurioje yra 20 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS), 1 procento gentamicino ir 20 mM hidroksietilpiperazinetansulfonrūgšties (HEPES). HaCaT ląstelės buvo kultivuojamos dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM), turinčioje 10 procentų FBS, 1 procentą gentamicino ir 20 mM HEPES. Normalūs žmogaus epidermio melanocitai (NHEM) buvo įsigyti iš (Lonza, Bazelis, Šveicarija) ir buvo auginami melanocitų auginimo terpėje-4 (MGM{8}}). Ląstelės buvo inkubuojamos 37 C temperatūroje 5 procentų CO2 atmosferoje.

Norint išmatuoti melanino kiekį, ląstelės ({0}}) buvo kultivuojamos 6-šulinėlių plokštelėje 24 valandas. Ląstelės buvo apdorotos nurodytomis GF1 koncentracijomis. Po to ląstelės buvo du kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), o po to atskirtos tripsinu / EDTA. Ląstelės buvo lizuojamos inkubuojant 200 ml 1 N NaOH 80 C temperatūroje 2 valandas. Ląstelių lizatai buvo perkelti į 96-šulinėlių plokštelę, o absorbcija išmatuota esant 405 nm.

Norint atlikti Western blotting, ląstelės buvo du kartus plaunamos šaltu PBS ir lizuojamos lediniame modifikuotame radioimunoprecipitacijos tyrimo (RIPA) buferyje (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 proc. Nonidet P-40 , 0,5 proc. natrio deoksicholatas, 150 mM NaCl), turintis proteazės inhibitorių ir fosfatazės inhibitorių kokteilių rinkinį (Calbiochem, San Diego, CA, JAV). Baltymai buvo atskirti natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze (SDS-PAGE) ir perkelti į nitroceliuliozės membranas. Membranos buvo inkubuojamos su pirminiais antikūnais 4 C temperatūroje 24 valandas, tada plaunamos tris buferiniu fiziologiniu tirpalu, įskaitant 0,1 procento Tween-20, 1 valandą kambario temperatūroje buvo veikiamos su peroksidaze konjuguotais antriniais antikūnais, plaunamos ir vizualizuojamos. naudojant Odyssey vaizdo gavimo sistemą.

Norint išanalizuoti melanosomų perdavimą, MNT{0}}/HaCaT ląstelės buvo kultivuojamos 12-šulinėlių plokštelėje santykiu 1:10 24 valandas, o po to GF1. buvo gydoma nurodyta koncentracija. Ląstelės du kartus plaunamos šaltu PBS ir fiksuojamos 3,5 procento paraformaldehidu 10 min. Ląstelės buvo plaunamos ir apdorotos 0,1 proc. Triton X-100 10 min., o po to 0,5 proc. galvijų serumo albuminu (BSA) 1 val. Melanocitams ir keratinocitams aptikti buvo naudojami antikūnai prieš su tirozinaze susijusį baltymą 1 (1:200, raudonas) ir citokeratiną -18 (1:200, žalias).

MelanoDerm Skin Tissue Model (TM) yra gyvybingas atkurtas {{0}}D žmogaus odos ekvivalentas, kuriame yra normalių melanocitų ir keratinocitų (MatTek Corp., Ashland, MA). Naudojome MelanoDerm TM (MEL-300-A), gautą iš Azijos donorų. Jie buvo prižiūrimi naujoje priežiūros terpėje-113, kaip rekomendavo gamintojas. GF1 buvo užteptas ant MelanoDerm TM 0, 4, 6, 8, 11, 13 ir 15 dienomis. Prieš pradedant gydymą GF1, audiniai buvo nuplauti 1 ml PBS, kad būtų pašalintas bet koks likutis. Audiniai buvo fiksuoti 18 dieną histologinei analizei. Histologinis vertinimas atliktas šviesos mikroskopu (Bx-41; Olympus, Tokijas, Japonija), o mikrofotografijos darytos skaitmeniniu fotoaparatu (DP72; Olympus). Melanoderma buvo fiksuota 4 procentų buferiniame formaldehido tirpale dažymui. Mėginiai buvo įterpti į parafino vašką, supjaustyti iki 3 mm storio ir nudažyti naudojant hematoksiliną ir eoziną bei Fontana ir Mason dažymo tirpalą. Visi duomenys išreiškiami vidutinėmis SD (standartinio nuokrypio) reikšmėmis, o statistiniam palyginimui buvo naudojamas Stjudento t testas. P reikšmė < 0,05 buvo laikoma statistiškai reikšminga (atskiros p reikšmės pateiktos paveikslų legendose).

Norėdami nustatyti GF1 poveikį žmogaus melanocitams, labai pigmentuotas žmogaus melanomos ląsteles (MNT-1) gydėme GF1 24, 48 ir 72 valandas, po to buvo atlikta intracelulinio melanino kiekio ir tirozinazės baltymo ekspresijos analizė. . Kaip parodyta 1A pav., GF1 neturėjo slopinamojo poveikio melanino kiekiui, kai koncentracija yra 10e100 mM. Be to, GF1 nesumažino tirozinazės ekspresijos MNT-1 ląstelėse (1B pav., 2A pav.). A-MSH stimuliuojamų MNT-1 ląstelių apdorojimas GF1 48 ir 72 valandas nesumažino melanino kiekio (1C pav.) ar tirozinazės ekspresijos (1D pav., 2B pav.). Norėdami dar labiau patvirtinti GF1 poveikį žmogaus melanocitams, pirminį NHEM apdorojome GF1, esant a-MSH stimuliacijai arba be jos 48 valandas. Panašiai kaip duomenys, gauti naudojant MNT-1 ląsteles, GF1 neturėjo įtakos melanino kiekiui (1E pav.) arba tirozinazės ekspresijai (1F pav., 2C pav.) NHEM. Galiausiai įvertinome, ar L-tirozino lygis auginimo terpėje turi įtakos GF1 aktyvumui, nes L-tirozinas yra tirozinazės substratas melanino sintezei. Atitinkamai, MNT-1 ląstelės buvo apdorotos GF1 48 valandas auginimo terpėje, kurioje yra 100 mM arba 500 mM L-tirozino. Kaip parodyta 1G pav., GF1 neslopino melanino kiekio MNT-1 ląstelėse, nepaisant L-tirozino koncentracijos.

2 pav. GF1 poveikis dendrito susidarymui ir melanosomų pernešimui MNT-1/HaCaTcocultured ląstelėse ir 3-D žmogaus odos ekvivalentu. Kultivuotos MNT-1/HaCaTląstelės buvo apdorotos 100 mM GF1, esant a-MSH (500 nM) stimuliacijai arba be jos 48 valandas. ( A ) Po fiksavimo, naudodami optinę mikroskopiją, stebėjome dendrito susidarymą melanocituose (skalės juosta; 50 mm). (B) Imuniniam dažymui melanosomas nudažėme TRP-1 antikūnu (raudona spalva), o keratinocitus - citokeratinu-18 (žalia spalva). Baltos rodyklės rodo, kad melanosoma perkelta į HaCaT iš MNT-1 ląstelių (Masto juosta; 20 mm). Žmogaus odos ekvivalentas (MelanoDerm; n ¼ 3) buvo apdorotas 1% Kojic rūgšties kaip etaloninio balinimo junginio ir GF1 (10 ir 50 ug/ml) 18 dienų. (C) Po gydymo buvo nufotografuoti odos ekvivalentai. (D) Apskaičiuota 6 l vertė (šviesumo laipsnis, palyginti su nešikliu apdorotu kontroliniu tirpalu) kiekvienam tiriamajam mėginiui. (E) Audinių sekcijų dažymas hematoksilinu ir eozinu (H&E). (F) Fontana-Mason (F&M) audinių sekcijų dažymas. Skaidrės buvo fiksuotos formaldehido tirpale ir įterptos į parafino vašką dažymui (Skalės juosta; 50 mm). Juodos rodyklės rodo perkeltą melanosomą iš melanocitų baziniame sluoksnyje į keratinocitus viršutiniame sluoksnyje. Mėlynos rodyklės rodo melanocitus, sudarančius išplėstinius dendritus. (*p < 0,05, **p < 0,01, *p < 0,001). CON, valdymas; GF1, ginsenozidas F1; KA, Kojic rūgštis.

Nustačius, kad GF1 nedaro anti-melanogeninio poveikio monokultūriniams žmogaus melanocitams, toliau išanalizavome, ar GF1 veikia melanino sintezę melanocituose eksperimentinėje sistemoje, kurioje yra ir keratinocitų, ir melanocitų, su galimybe užmegzti ryšį tarp ląstelių. MNT-1 ir HaCaT (įamžinta žmogaus normalių keratinocitų ląstelių linija) ląstelės buvo kultivuojamos kartu su 100 mM GF1, švitinant UV-B arba be jo. Po 48 valandų (3A pav.) arba 72 valandų (3B pav.) įvertinome melanino kiekį iš izoliuotų MNT-1 ir kartu kultivuotų ląstelių. Mūsų duomenys parodė, kad GF1 neslopina melanino sintezės tiek izoliuotose MNT-1, tiek kartu auginamų ląstelių grupėse.

Be melanino sintezės, mes sutelkėme dėmesį į slopinamąjį GF1 veiksmingumą melanosomų perkėlimui iš melanocitų į keratinocitus. Konkrečiai, kartu kultivuotos MNT-1/HaCaT ląstelės buvo apdorotos 100 mM GF1, kai stimuliuojama a-MSH arba jos nėra (2A pav.), po to buvo atliktas dendrito susidarymo melanocituose tyrimas, kuris reikalingas melanosomų perkėlimui. . Įdomu tai, kad aMSH sukelti ištempti dendritai buvo atitraukti po gydymo GF1. Tada mes nudažėme TRP-1-teigiamas melanosomas (raudonas) MNT1 ląstelėms ir citokeratiną-18 (žalią) HaCaT ląstelėms bendroje kultūroje. Kaip parodyta 2B pav., TRP-1-teigiamos melanosomos MNT-1 ląstelėse buvo perkeltos į HaCaT ląsteles po a-MSH stimuliacijos, kurią žymiai slopino GF1. Šie rezultatai rodo, kad GF1 slopina melanosomų perdavimą, sukeldamas melanocitų dendrito atsitraukimą.

Norėdami išplėsti šį tyrimą į fiziologiškesnę sistemą, ištyrėme GF1 balinimo gebėjimą 3-D žmogaus odos ekvivalente, kuris yra epidermio sluoksnis, susidedantis iš melanocitų ir keratinocitų. 2C pav., GF1-apdorotas audinys atrodė šviesesnis nei kontrolinis audinys, o L reikšmė (šviesumo/tamsumo indeksas) buvo pakeista po gydymo GF1 (2D pav.). Be to, audinių pjūvių dažymas hematoksilinu ir eozinu neparodė audinių žlugimo ar toksiškumo (2E pav.). Fontana ir Mason dažymo eksperimentai parodė, kad GF1 slopina melanocitų dendrito susidarymą baziniame sluoksnyje ir kartu slopina melanosomų perdavimą iš bazinio sluoksnio melanocitų į diferencijuoto viršutinio sluoksnio keratinocitus (2F pav.). Šie atradimai bendrai patvirtina slopinamąjį GF1 veiksmingumą melanosomų pernešime, todėl žmogaus odos audinio modelyje skatinamas balinimas.

Šiame tyrime GF1 neslopino melanino sintezės ir tirozinazės ekspresijos; veikiau GF1 šiek tiek padidino intracelulinį melanino kiekį ir tirozinazės ekspresiją MNT-1 ląstelėse ir kartu auginamose ląstelėse (1A ir 1B pav. ir 3A pav.). Tačiau tuo pačiu metu mes nustatėme, kad GF1 slopino melanosomų perdavimą per sumažėjusį melanocitų dendritų susidarymą. Įtariame, kad padidėjusį intracelulinį melanino kiekį GF1 gali sukelti melanosomų kaupimasis dėl melanosomų perdavimo blokavimo ir tirozinazės ekspresijos indukcijos. Matoma odos pigmentacija nustatoma pagal melanosomų išsisklaidymą iš įvairių išplėstinių melanocitų dendritų sričių į aplinkinius keratinocitus [4]. Keletas junginių, tokių kaip kentaureidinas ir metilofiopogonanonas B, parodė balinimo veiksmingumą, todėl melanocitų dendritas atsitraukia, nedarant įtakos melanogeninio fermento ekspresijai ar melanino sintezei [5]. Todėl melanosomų pernešimo į keratinocitus blokada iš melanocitų laikoma efektyviu balinimo efektu, nors melanino biosintezė neslopinama. Todėl manėme, kad padidėjęs GF1 melanino kiekis turi mažai įtakos GF1 balinimo efektyvumui. Be to, sukauptas melanosomas suardytų autofagija odos homeostazei, nors melanosomų likimas neaiškus [6].

Pirmą kartą parodėme, kad GF1 slopina a-MSH sukeltą dendrito susidarymą, todėl žmogaus ląstelių kultūrose slopinamas melanosomų perkėlimas į keratinocitus. Be to, GF1 sutrikdė melanino perdavimą iš melanocitų baziniame sluoksnyje į keratinocitus viršutiniame sluoksnyje, sukeldamas balinamąjį poveikį žmogaus odos ekvivalentui. Naujausi bendros kultūros eksperimentai rodo, kad melanocitai perneša pigmentą į keratinocitus per dendritinius morfologijos pokyčius, tokius kaip b-tubulino mikrofilamentų dezorganizacija tarpląsteliniame citoskelete [7, 8]. Ciklinis adenozino monofosfatas, melanogenezės induktorius, tarpininkauja dendrito susidarymui, padidindamas Rac ir sumažindamas Rho aktyvumą [9, 10]. Todėl būsimuose mūsų grupės tyrimuose pagrindinis dėmesys bus skiriamas išsamiam GF1 tikslinių baltymų, tokių kaip molekulės, dalyvaujančios cikliniame adenozino monofosfato signalizacijos kelyje, įvertinimui.

Visi mūsų rezultatai yra preliminarūs įrodymai, kad GF1 gali vystytis kaip veiksmingas balinimo reagentas, skirtas pigmentiniams sutrikimams gydyti ir patamsėjusiai odos spalvai pašviesinti kaip kosmetikos ingredientas.

Interesų konfliktai

Visi prisidedantys autoriai pareiškia, kad nėra interesų konfliktų.

Padėkos

Šį tyrimą palaikė ir finansavo Amorepacific tyrimų ir plėtros centras.

Nuorodos

[1] Lin M, Zhang BX, Zhang C, Shen N, Zhang YY, Wang AX, Tu CX. Ginsenozidai Rb1 ir Rg1 stimuliuoja melanogenezę žmogaus epidermio melanocituose per PKA / CREB / MITF signalizaciją. Evid. Pagrįstas. Papildyti. Alternatyva Med 2014; 2014: 892073

[2] Han J, Lee E, Kim E, Yeom MH, Kwon O, Yoon TH, Lee TR, Kim K. Epiderminio gd T ląstelių gauto interleukino 13 vaidmuo balinančiame Ginsenoside F1 poveikį. Exp Dermatol 2014;23:860e2.

[3] Kim JH, Baek EJ, Lee EJ, Yeom MH, Park JS, Lee KW, Kang NJ. Ginsenozidas F1 susilpnina hiperpigmentaciją B16F10 melanomos ląstelėse, sukeldamas dendrito atsitraukimą ir aktyvuodamas Rho signalizaciją. Exp Dermatol 2015;24:150e2.

[4] Ando H, Niki Y, Ito M, Akiyama K, Matsui MS, Yarosh DB, Ichihashi MJ. Melanosomos perkeliamos iš melanocitų į keratinocitus pakavimo, išsiskyrimo, įsisavinimo ir dispersijos procesuose. Invest Dermatol 2012;132:1222e9.

[5] Ebanks JP, Wickett RR, Boissy RE. Odos pigmentaciją reguliuojantys mechanizmai: veido spalvos kilimas ir kritimas. Int J Mol Sci 2009; 10: 4066e87.

[6] Katsuyama Y, Taira N, Yoshioka M, Okano Y, Masaki H. Melanosomų transportavimo sutrikimas melanocituose, apdorotuose teofilinu, sukelia jų degradaciją dėl autofagijos. Biochem Biophys Res Commun 2017;485: 126e30.

[7] Ni J, Wang N, Gao L, Li L, Zheng S, Liu Y, Ozukum M, Nikiforova A, Zhao G, Song Z. Nuo NMDA receptorių priklausomo signalizacijos kelio poveikis ląstelių morfologijai ir melanosomų perkėlimui melanocitų. J Dermatol Sci 2016;84:296e304.

[8] Scott G. Rac ir rho: melanocitų dendrito susidarymo istorija. Pigment Cell Res 2002;15:322e30

[9] Scott G, Leopardi S. cAMP signalizacijos kelias turi priešingą poveikį Rac ir Rho B16F10 ląstelėse: poveikis dendrito susidarymui melanocitinėse ląstelėse. Pigment Cell Res 2003;16:139e48.

[10] Ma HJ, Ma HY, Yang Y, Li PC, Zi SX, Jia CY, Chen R. a-melanocitus stimuliuojantis hormonas (MSH) ir prostaglandinas E2 (PGE2) skatina melanosomų perdavimą, skatindami filopodijų pristatymą ir sferoidinių granulių išsiskyrimą: atominės jėgos mikroskopijos stebėjimo įrodymai. J Dermatol Sci 2014; 76: 222e30.

Chang-Seok Lee 1,3 , Gibaeg Nam 1 , Il-Hong Bae 1 , Junseong Park 1,2,*

1 Amorepacific CO R&D centras, Yongin-si, Korėjos Respublika

2 Inžinerinės chemijos katedra, Chungbuk nacionalinis universitetas, Cheongju-si, Chungbuk, Korėjos Respublika

3 Grožio ir kosmetikos mokslų katedra, Sveikatos mokslų kolegija, Eulji universitetas, Seongnam-si, Korėjos Respublika

For more information:1950477648nn@gmail.com