13-savaitės subchroninio toksiškumo 2-(l-mentoksi)etanolio F344 žiurkėms tyrimas

Įvadas

2-(1-mentoksi)etanolis (CAS Nr. 38618-23-4) yra skaidrus ir bespalvis skystis, turintis būdingą kvapą ir plačiai naudojamas kaip kvapioji medžiaga. Jungtinis FAO/PSO maisto priedų ekspertų komitetas (JECFA) įvertino 2-(l-metoksidas)etanolis kaip kvapioji medžiaga, priskiriama prie medžiagų, struktūriškai susijusių su mentoliu1. Remiantis kvapiųjų medžiagų struktūrine klase, 2-(l-metoksidas)etanolis buvo priskirtas I klasei. Jungtinėse Amerikos Valstijose ir Europoje suvartojami 2-(l-metoksidas)žmonių etanolio buvo atitinkamai 12 ug/asmeniui per dieną ir 0,01 ug/asmeniui per dieną, abu yra mažesni už I klasės 1800 ug/asmeniui per dieną ribą. Remiantis šiais įvertinimais, manoma, kad 2-(1-mentoksi) Įprastai naudojant kaip kvapiąją medžiagą etanolis gali nekelti saugumo problemų.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg kūno svorio [KW])1. Nepaisant to, kad kaip kvapioji medžiaga naudojamas 2-(1-mentoksi)etanolis, duomenų apie pakartotinių šio junginio dozių toksiškumą yra nedaug. Mūsų laboratorija ištyrė kelių maisto priedų, įskaitant tipines kiekvienos kategorijos kvapiąsias medžiagas, toksiškumą graužikų modeliuose2–7. Siekdami išsiaiškinti toksikologinį profilį ir nustatyti nepastebimo neigiamo poveikio lygį (NOAEL), atlikome 13-savaitės subchroninio 2-(1-mentoksi)etanolio toksiškumo tyrimą, kuris buvo duodama per burną F344 žiurkėms per zondą.

Medžiagos ir metodai

Bandomoji cheminė medžiaga

2-(1-mentoksi)etanolis (partijos Nr. 5I0002, grynumas 99,9 %), pagamintas Takasago Int. Corp. (Tokijas, Japonija) suteikė Japonijos Sveikatos, darbo ir gerovės ministerijos Maisto saugos departamento Standartų ir vertinimo skyrius, remiamas Japonijos skonio ir kvapiųjų medžiagų asociacijos (Tokijas, Japonija). Nors bandomoji medžiaga buvo pateikta kaip optinių izomerų mišinys (CAS Nr. 38618-23-4), gamintojas ją patvirtino kaip l-enantiomerą (CAS Nr. 75443-64-0). Dėl 2-(1-mentoksi)etanolio netirpumo ir lakumo vandenyje buvo pasirinktas zondavimas per burną su kukurūzų aliejumi (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonija), kaip nešiklis. 2-(1-mentoksi)etanolio tirpalai buvo ruošiami kasdien, prieš pat vartojimą. Po 2 valandų laikymo kambario temperatūroje likęs 2-(1-mentoksi) etanolio santykis 4, 40 ir 400 mg/ml tirpale buvo patvirtintas kaip 96,8 %, 99,8 % ir 96,5 %. , atitinkamai, naudojant dujų chromatografiją (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokijas, Japonija).

Eksperimentiniai gyvūnai

Iš viso iš Charles River Laboratories Japan (Jokohama, Japonija) buvo nupirkta 40 žiurkių patinų ir 40 patelių, neturinčių specifinių patogenų (F344 / DuCrlCrlj, 5 savaitės) ir panaudotos po aklimatizacijos vieną savaitę. Tyrimo metu gyvūnai buvo laikomi polikarbonatiniuose narvuose su minkštais drožlių pakratais, patalpoje su barjerine sistema, skirta šviesos/tamsos ciklui (12 val.), ventiliacijai (oro apykaitos greitis 18 kartų/val.), temperatūrai ( 24 ± 1 laipsnis) ir santykinę oro drėgmę (55 ± 5%). Narvai ir drožlių pakratai buvo keičiami du kartus per savaitę. Kiekvienas gyvūnas turėjo nemokamą prieigą prie vandens iš čiaupo ir bazinės dietos (CRF-1; Rytų mielės, Tokijas, Japonija). Eksperimento pradžioje gyvūnai buvo atsitiktinai suskirstyti į keturias grupes po 10 žiurkių patinų ir patelių, remiantis kūno svoriu, išmatuotu prieš pat pradedant gydymą tiriamąja chemine medžiaga.

Studiju dizainas

Preliminariame {{0}}dienos tyrime, kuriame buvo įvertintas 2-(1-mentoksi)etanolis, vartojamas 0, 200, 400 ir 800 mg/kg KM/ dieną absoliutus ir santykinis kepenų svoris žymiai padidėjo visose gydomose abiejų lyčių grupėse (duomenys nerodomi). Remdamiesi šiais rezultatais, pasirinkome 2-(1-mentoksi) etanolio dozes 0, 15, 60 ir 250 mg/kg KM per parą, skirtą žiurkių patinams ir patelėms šiuo {{ 13}}savaitės toksiškumo tyrimas.

Bendrosios būklės ir mirtingumas buvo vertinami kasdien. Kūno svoris, tiekiamos ir likusios dietos kiekis buvo matuojamas kartą per savaitę eksperimentiniu laikotarpiu. Baigus gydymą, visos žiurkės buvo nevalgiusios per naktį, o kraujo mėginiai hematologijai ir serumo biochemijai buvo paimti iš pilvo aortos taikant gilią inhaliacinę anesteziją, naudojant izofluraną. Tyrimo planas buvo parengtas pagal Japonijos maisto priedų paskyrimo ir maisto priedų naudojimo standartų peržiūros gaires (1996 m.) ir patvirtintas Japonijos Nacionalinio sveikatos mokslų instituto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto.

Hematologija ir serumo biochemija

Naudojant ProCyte Dx automatinius hematologijos analizatorius (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, JAV) buvo analizuojami šie hematologiniai parametrai: baltųjų kraujo kūnelių skaičius (WBC), raudonųjų kraujo kūnelių skaičius (RBC), hemoglobino koncentracija (HGB), hematokritas (HCT), vidutinis korpuskulinis tūris (MCV), vidutinis korpuskulinis hemoglobinas (MCH), vidutinė korpuskulinio hemoglobino koncentracija (MCHC), trombocitų skaičius (PLT) ir diferencinės leukocitų ląstelės, įskaitant neutrofilus (Neut), limfocitus (limfas), monocitus (mono), eozinofilus (eozino) ir bazofilų (Baso). Serumo biocheminę analizę atliko „Oriental Yeast“ pagal šiuos parametrus: bendras baltymas (TP), albuminas (Alb), albumino/globulino santykis (A/G), bendras bilirubinas (Bil), gliukozė, bendras cholesterolis (T-Chol), trigliceridas (TG), karbamido azotas (BUN), kreatininas (Cre), kalcis (Ca), neorganinis fosforas (IP), natris (Na), kalis (K), chloras (Cl), aspartato aminotransferazė (AST), alanino aminotransferazė (ALT), šarminės fosfatazės (ALP) ir -glutamilo transpeptidazės (-GTP).

Organų svoris ir histopatologinis įvertinimas

Visiems gyvūnams buvo atlikta pilna skrodimas, pasvertos smegenys, užkrūčio liauka, plaučiai, širdis, blužnis, kepenys, antinksčiai, inkstai, sėklidės ir kiaušidės. Šie organai, taip pat audiniai iš nugaros smegenų, trišakio nervo, hipofizės, nosies ertmės, seilių liaukų, liežuvio, stemplės, trachėjos, aortos, skydliaukės, prieskydinės liaukos, kasos, skrandžio, plonosios ir storosios žarnos, požandikaulio ir mezenterinės žarnos limfmazgiai, makštis, gimda, šlapimo pūslė, prostatos liauka, sėklinės pūslelės, epididimas, šlaunikaulis ir krūtinkaulis su kaulų čiulpais, slanksteliai, griaučių raumenys, sėdmeninis nervas, oda ir pieno liaukos buvo fiksuoti 10 % neutraliu buferiniu formalinu; tada buvo paruoštos parafinu įterptos sekcijos ir nudažytos hematoksilinu ir eozinu histopatologiniam tyrimui. Sėklidės ir akys su Harderio liaukomis buvo pritvirtintos atitinkamai Bouin fiksatoriuje ir Davidsono tirpale. Kauliniai audiniai, įskaitant nosies ertmę, slankstelius, krūtinkaulį ir šlaunikaulį, buvo nukalkinti naudojant 10% skruzdžių rūgšties ir 10% buferinio formalino mišinį iki 2 savaičių. Histopatologinis įvertinimas buvo atliktas visiems audiniams, paimtiems iš kontrolinės grupės gyvūnų, ir grupei buvo skirta didžiausia dozė, nebent buvo pastebėti su gydymu susiję pažeidimai.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA MUUNITETUI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2u-globulino imunohistochemija

Žiurkių patinų 2u-globulino kaupimasis inkstuose buvo tiriamas atliekant imunohistocheminę parafinu įterptų sekcijų analizę. Antigenų gavimui pjūviai, gauti iš 5 žiurkių kiekvienoje grupėje, buvo inkubuojami su proteinaze K (DAKO, Glostrup, Danija) 1 minutę kambario temperatūroje. Visos sekcijos buvo panardintos į 3% H2O2 / metanolio tirpalą 10 minučių kambario temperatūroje, kad būtų inaktyvuotas endogeninis peroksidazės aktyvumas. Užblokavus nespecifines reakcijas 10% normalaus triušio serumo, sekcijos buvo inkubuojamos su pirminiu 2uglobulino antikūnu (atskiestas 1:400; anti-žiurkės 2u-globulino antikūnas; R&D Systems, Mineapolis, MN, JAV) per naktį 4 laipsnių 8 temperatūroje. Antikūnų surišimo vizualizacija buvo atlikta naudojant VectaStain Elite ABC rinkinį (Vector Laboratories, Burlingame, CA, JAV) ir 3,3′-diaminobenzidiną. Visos sekcijos buvo nudažytos hematoksilinu.

Statistinė analizė

Kūno svorio duomenų verčių skirtumai eksperimentiniu laikotarpiu, taip pat hematologija, serumo biochemija ir organų svoriai buvo įvertinti homogeniškumui naudojant Bartlett testą. Vienakrypčiai dispersijos analizė ir Kruskal-Wallis testas buvo atitinkamai pritaikyti homogeniniams ir nevienalyčiams duomenims. Nustatant statistiškai reikšmingus skirtumus, kontrolinės ir gydomos grupės palyginimui buvo naudojamas Dunnett daugkartinio palyginimo testas. Histopatologinių dažnių ir laipsnių palyginimai buvo analizuojami naudojant Fišerio tikslios tikimybės testą ir Mann-Whitney U testą. P reikšmės<0.05 were considered statistically significant.

Rezultatai

Gyvenimo parametrai, hematologija ir serumo biochemija

Per visą eksperimentinį laikotarpį reikšmingų klinikinių požymių nepastebėta, o visi gyvūnai išgyveno iki numatytos skrodimo. Be to, žiurkių patinų ir patelių kūno svorio ir paros suvartojamo maisto skirtumo nepastebėta (1A ir B pav.).

Hematologijos ir serumo biochemijos duomenys pateikti atitinkamai 1 ir 2 lentelėse. Hematologiniai tyrimai atskleidė reikšmingai sumažėjusį HGB, HCT, MCV ir MCH bei padidėjusį PLT žiurkių patinams, kuriems buvo duodama 250 mg/kg KM per dieną 2-(1-mentoksi)etanolio (1 lentelė). Serumo biochemijoje nustatytas reikšmingas TP, T-Chol ir Ca padidėjimas bei Bil ir ALP sumažėjimas 250 mg/kg grupės vyrams (2 lentelė). Pastebėtas reikšmingas Cre padidėjimas ir A/G sumažėjimas 60 ir 250 mg/kg grupių vyrams. Moterims reikšmingas Ca padidėjimas ir ALP sumažėjimas buvo užfiksuotas 60 ir 250 mg/kg grupėse, o padidėjęs T-Chol ir sumažėjęs A/G, Bil, TG, AST ir ALT kiekis buvo nustatytas 250 mg /kg grupėje. Nors vyrams, vartojusiems 60 mg/kg, buvo pastebėtas reikšmingas TG padidėjimas ir Cl sumažėjimas, bet kokio ryšio su doze nebuvimas rodo, kad šie skirtumai nebuvo susiję su bandomosios medžiagos poveikiu.

Organų svoriai

Duomenys apie organų svorį yra apibendrinti 3 lentelėje. Absoliutus ir santykinis kepenų svoris reikšmingai padidėjo abiejų lyčių 250 mg/kg grupėje (3 lentelė). Pastebėtas reikšmingas santykinio kepenų svorio padidėjimas 60 mg/kg dozės grupės vyrams. Vyrų absoliutus ir santykinis inkstų svoris reikšmingai padidėjo 60 ir 250 mg/kg grupėse. 250 mg/kg vyrų grupėje buvo pastebėtas reikšmingas antinksčių absoliutaus ir santykinio svorio bei santykinio blužnies ir sėklidžių svorio padidėjimas.

Histopatologija ir imunohistochemija

Duomenys apie histopatologinius ir imunohistocheminius radinius yra apibendrinti atitinkamai 4 ir 5 lentelėse. Histopatologiniai radiniai atskleidė, kad eozinofilinių granulių (2A–D pav.), bazofilinių kanalėlių ir hialino gipso kaupimosi dažnis, taip pat židininis intersticinis uždegimas inkstuose, palyginti su kontroline grupe, žymiai padidėjo. grupė (4 lentelė). Remiantis imunohistocheminėmis analizėmis, žiurkių patinai, gydyti tiriamąja medžiaga, padidino 2u-globulino imunoreaktyvumą proksimalinių kanalėlių epitelio ląstelėse, o tai rodo aiškią priklausomybę nuo dozės (2E–H pav.) (5 lentelė).

Skrodimo metu vienam žiurkės patinui iš 250 mg/kg dozės grupės buvo labai padidėjęs dešinysis inkstas dėl histologiškai būdingos nefroblastomos. Nors nefroblastoma daugumoje žiurkių padermių yra nedažna9, šis atvejis buvo laikomas atsitiktiniu, nes jokie kiti gyvūnai neturėjo panašių pažeidimų. Be to, atliekant burnos kancerogeniškumo tyrimus, spontaniškos nefroblastomos dažnis F344/DuCrlCrlj žiurkių patinams svyravo tarp 0–2,0 %10. Nors kai kurie pažeidimai buvo sporadiškai aptikti kituose organuose, reikšmingų nuo gydymo priklausomų šių pažeidimų dažnio pakitimų nepastebėta.

Diskusija

Iki šiol 24 kvapiąsias medžiagas, įskaitant 2-(1-mentoksi)etanolį, JECFA įvertino kaip medžiagas, struktūriškai susijusias su mentoliu, ir visos yra išvardytos kaip „saugumo nekeliančios problemos“ pagal dabartinį apskaičiuotą lygį. suvartojimo1, 11. 2-(1-Mentoksi)etanolis yra priskiriamas aliciklinių alkoholių arba eterių pogrupiui ir laikomas daugiausia konjuguotu su gliukurono rūgštimi, o po to išsiskiria su šlapimu1. Nors geriamųjų šių medžiagų LD50 vertės graužikams yra gana didelės, kartotinių dozių toksiškumo tyrimų duomenys tebėra riboti. 13-savaitę atliktas kartotinių dozių toksiškumo tyrimas atskleidė, kad mentilpirolidono karboksilatas (CAS Nr. 68127-22-0), struktūriškai su mentoliu panašus junginys, gali būti susijęs su padidėjusiu vyrų ir moterų kepenų ir inkstų svoriu. Wistar žiurkės. 2u-globulino kaupimasis proksimaliniuose žiurkių patinų kanalėliuose taip pat buvo pastebėtas vartojant 1 111 mg/kg KM per parą dozę, o NOAEL nustatyta kaip 109 mg/kg KM per dieną1.

Atliekant dabartinį 13-savaitės subchroninį 2-(1-mentoksi)etanolio toksiškumo tyrimą, toksikologinių bendros būklės, kūno svorio ir suvartojamo maisto pokyčių nepastebėta. Atlikę hematologinį įvertinimą, pastebėjome, kad vyrams sumažėjo HGB (96,6% iki kontrolinių vidurkių), HCT (96,3%), MCV (98,4%) ir MCH (98,2%) bei padidėjo PLT (111%). 250 mg/kg grupėje, kuri buvo laikoma toksikologiniu apdorojimo 2-(1-mentoksi)etanoliu poveikiu. Tiek absoliutus (115% abiejų lyčių), tiek santykinis (119% vyrų ir 111% moterų) kepenų svoris reikšmingai padidėjo abiejų lyčių 250 mg/kg grupėse. Nors kepenyse histopatologinių pokyčių nebuvo, padidėjo T-Chol (110% vyrų ir 121% moterų) ir TP (105% vyrų) ir TG sumažėjimas (60,1% moterų) 250 m. mg/kg grupės rodo toksinius pokyčius, susijusius su lipidų apykaita ir baltymų sinteze kepenyse. Taip pat buvo aptiktas sumažėjęs HGB ir MCH bei padidėjęs PLT, T-Chol ir TP vyrams bei sumažėjęs TG ir padidėjęs absoliutus ir santykinis kepenų svoris abiem lytims, o tai statistiškai reikšminga 28- dienos preliminariajame tyrime (duomenys nerodomi ), patvirtinantis, kad šie pakitę hematologiniai ir serumo biocheminiai parametrai, taip pat kepenų svoris buvo ne atsitiktinis, o su tiriamąja medžiaga susijęs poveikis. Priešingai, reikšmingas santykinio kepenų svorio padidėjimas, nustatytas 60 mg / kg vyrų grupėje šiame tyrime, nebuvo lydimas absoliutaus svorio padidėjimo ar susijusių biocheminių parametrų pokyčių, o tai rodo, kad šis padidėjimas buvo prisitaikantis pokytis.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Buvo manoma, kad labai padidėjęs absoliutus (120 %) ir santykinis (118 %) antinksčių svoris 250 mg/kg vyrų grupėje buvo susijęs su tiriamąja chemine medžiaga. Be to, padidėjęs absoliutus ir santykinis antinksčių svoris abiem lytims parodė aiškią priklausomybę nuo dozės 28-dienos preliminaraus tyrimo metu (duomenys nerodomi), o tai rodo ryšį su apdorojimu bandomąja chemine medžiaga. Nors antinksčių hipertrofija gali atsirasti dėl streso, tiek dabartiniuose, tiek preliminariuose tyrimuose nebuvo jokių stresą rodančių išvadų, tokių kaip sumažėjęs kūno svorio padidėjimas arba užkrūčio liaukos ir kitų limfoidinių organų atrofija. Kadangi antinksčių liaukos histopatologinių pokyčių gali nebūti net ir sutrikus gliukokortikoidų gamybai, kai slopinami su steroidogeneze susiję fermentai12, negalima atmesti galimybės, kad padidėjęs antinksčių svoris yra toksinis radinys. Priešingai, padidėjęs santykinis blužnies ir sėklidžių svoris 250 mg/kg vyrų grupėje, nepastebėtas preliminariame tyrime, buvo laikomas toksikologiškai nereikšmingu, nes nebuvo histopatologinių pažeidimų arba žymiai padidėjo absoliutus svoris. Panašiai serumo biochemija atskleidė abiejų lyčių A / G sumažėjimą ir Ca padidėjimą, o tai, manoma, neturi toksikologinės reikšmės, atsižvelgiant į tai, kad susijusiuose parametruose nebuvo aptikta jokių nukrypimų. Be to, sumažėjęs Bil ir ALP kiekis abiem lytims ir sumažėjęs AST ir ALT patelėms priešingai nei tikėtasi toksinis poveikis ir buvo laikomas nereikšmingu.

Lėtinė nefropatija, kuriai būdingi bazofiliniai kanalėliai, hialino gipsas ir židininis intersticinis uždegimas, buvo statistiškai reikšminga visų gydomų grupių vyrams. Be to, 60 ir 250 mg/kg vyrų grupėse nustatytas padidėjęs Cre serumo ir absoliutus bei santykinis inkstų svoris; moterų gydymo grupėse šių pokyčių nepastebėta. Tokiais atvejais eozinofilinių granulių kaupimosi proksimalinėse kanalėlių epitelio ląstelėse laipsnis padidėjo, matyt, priklausomai nuo dozės. Šios granulės buvo patvirtintos kaip 2u-globulinas imunohistochemijos būdu, o tai rodo 2u-globulino nefropatijos atsiradimą. 2u-globulinai, prijungti prie tam tikrų cheminių medžiagų, tokių kaip d-limonenas, kaupiasi lizosomose ir yra stebimi proksimaliniuose kanalėliuose kaip eozinofilinės arba hialininės granulės9. Šis kaupimasis gali pažeisti epitelio ląsteles, sukeldamas lėtinę progresuojančią nefropatiją ir dėl to naviko susidarymą9. Taigi, nors 2-(1-mentoksi)etanolio NOAEL, susijusio su 2u-globulino nefropatija žiurkių patinų inkstuose, nenustatyta, pranešama, kad šio tipo nefropatija būdinga žiurkių patinams ir todėl nėra aktuali žmonėms. rizikos vertinimas13. Padidėjusi inkstų nepakankamumo rizika, sąlygota mechanizmų, susijusių su 2u-globulino kaupimu, yra labai mažai tikėtina, nes šio baltymo žmonėms nėra14. Todėl buvo manoma, kad nustatant NOAEL buvo pagrįsta neįtraukti su lėtine nefropatija susijusių pokyčių vyrams, kurie buvo pastebėti.

Apibendrinant, dabartinis 13-savaitės subchroninio toksiškumo tyrimas parodė, kad gydymas 250 mg/kg kūno masės per dieną 2-(1-mentoksi) etanoliu sukėlė toksinius hematologijos, serumo biochemijos ir organų svorio pokyčius. F344 žiurkių patinams ir patelėms. Remiantis pastebėtais rezultatais, 2-(1-mentoksi)etanolio NOAELbuvo įvertinta kaip 60 mg/kg KM per dieną abiem lytims.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%