Lyginamasis senėjimą stabdančių savybių ir mechanizmo tyrimas: Resveratrolis ir kalorijų apribojimas Ⅱ

Resveratrolio ir CR poveikis SIRT1, p53 ir Foxo3a mRNR ekspresijai senstančių žiurkių audiniuose

Oksidacinio streso sąlygosdažnai sukelia SIRT1 ekspresiją ir aktyvumą. SIRT1 moduliuoja pagrindinių išgyvenimo veiksnių, įskaitant p53 ir Foxo3a, funkcijas [9]. Norint nustatyti resveratrolio ir CR poveikį SIRT1, p53 ir Foxo3a mRNR lygiams D-Gal sukeltose senstančiose žiurkėse, buvo atlikti kiekybiniai RT-PGR tyrimai. Palyginti su atitinkama neigiama kontroline grupe, SIRT1 ir Foxo3a mRNR ekspresijos lygiai buvo reikšmingai sumažėję, tačiau p53 lygis reikšmingai padidėjo D-Gal grupėje (P < 0.01; 9A pav. 9B). Be to, vienu metu gydant resveratroliu arba CR su D-gal žiurkėms, padidėjo SIRT1 ir Foxo3a mRNR ekspresijos lygis, bet sumažėjo p53 lygis, palyginti su kontroline modelio grupe (P < 0.05). Tačiau, palyginti su gydymu CR, SIRT1 mRNR ekspresijos lygis reikšmingai padidėjo didelės resveratrolio ir D-gal dozės grupės kepenyse, o p53 mRNR ekspresijos lygis reikšmingai sumažėjo kepenyse ir smegenyse, vartojant didelę resveratrolio ir D-gal dozę. gal grupė (P < 0,05).

Spustelėkite čia norėdami gauti Cistanche senėjimą stabdančių papildų

Resveratrolio ir CR poveikis pagrindinio SIRT{0}}susijusio baltymo ekspresijai senstančių žiurkių smegenų audiniuose

FOXO3a ir p53, kuriuos reguliuoja SIRT1, yra pasroviui esančios SIRT1 molekulės. Tuo pačiu metu SIRT1 aktyvumą reguliuoja jo priešakyje esančios molekulės, pavyzdžiui, DBC1 (taip pat žinomas kaip KIAA1967), AROS (taip pat žinomas kaip RPS19BP1) ir naviko slopintuvas HuR (taip pat žinomas kaip ELAVL1) [9, 10] . Norint nustatyti resveratrolio ir CR poveikį p53, FOXO3a, HuR, AROS ir DBC1 baltymų kiekiui D-Gal sukeltose senėjimo žiurkėse, buvo atlikti Western blot tyrimai. Palyginti su atitinkama neigiama kontroline grupe, FOXO3a, AROS ir HuR baltymų ekspresijos lygiai buvo reikšmingai sumažėję, tačiau p53 ir DBC1 lygiai reikšmingai padidėjo D-gal grupėje (P < 0.01 1 pav. 0). Be to, vienu metu gydant resveratroliu arba CR su D-gal žiurkėms, padidėjo FOXO3a, AROS ir HuR baltymų ekspresija, tačiau sumažėjo p53 ir DBC1 lygiai, palyginti su modelio kontroline grupe (P < 0,05). Tačiau, palyginti su gydymu CR, HuR baltymo ekspresijos lygis buvo žymiai padidėjęs, tačiau DBC1 lygis reikšmingai sumažėjo didelės resveratrolio ir D-gal dozės grupės smegenyse (P <0,05). P53, FOXO3a ir AROS baltymų ekspresijos lygių skirtumų tarp resveratrolio ir D-gal grupės ir CR plius D-gal grupės nebuvo (P > 0,05).

FOXO3a ir p53 ekspresijos smegenų ir kepenų audiniuose

FOXO3a ir p53 ekspresijos būklė buvo nustatyta smegenų ir kepenų audiniuose imunohistochemijos būdu. Imunohistocheminė FOXO3a ir p53 analizė atskleidė, kad FOXO3a ekspresija smegenų ir kepenų audiniuose reikšmingai sumažėjo, o p53 ekspresija reikšmingai padidėjo D-Gal grupėje, palyginti su neigiama kontroline grupe (P < 0).{13} }5, 11 pav.). Be to, žiurkėms vienu metu gydant resveratroliu arba CR su D-gal, padidėjo FOXO3a ekspresija, bet sumažėjo p53 ekspresija, palyginti su kontroline modelio grupe (P < 0.05). Tačiau p53 ir FOXO3a išraiškos skirtumų tarp resveratrolio ir D-gal grupės bei CR ir D-gal grupės nesiskyrė (P > 0,05).

DISKUSIJA

Pagrindinis cheminis procesas, kuriuo grindžiamas senėjimas, pirmą kartą buvo patobulintaslaisvųjų radikalų senėjimo teorija[11] iroksidacinis stresasManoma, kad tai yra pagrindinis normalaus senėjimo proceso veiksnys.Laisvųjų radikalų iniciatorius AAPHbuvo įpratęssukelti oksidacinį stresąir sukurti oksidacinį modelįstreso sukeltas ląstelių senėjimasžmogaus IMR-90 ląstelėse [12, 13]. Šio metodo pranašumai yra tai, kad AAPH termiškai suyra ikigeneruoti radikalusbe biotransformacijų ar fermentų, ir greitisradikali kartagalima lengvai valdyti reguliuojant iniciatoriaus koncentraciją [12]. Nustatyta, kad AAPHslopina žmogaus dauginimąsiIMR- 90 ląstelės koncentracijos ir laiko priklausomu būdu. Rezultatai parodė, kad 2 d. inkubacija su AAPH (1 mM) žymiai padidino SA-Gal teigiamo santykio procentą, apoptotinių ląstelių populiaciją, sumažino SIRT1 mRNR ekspresiją ir padidino bei suplokštėjusią morfologiją. Tai parodė, kad AAPH sukeltas oksidacinis stresas privedė IMR-90 ląsteles į senėjimą. Remiantis šiuo ląstelių senėjimo modeliu, gydymas 10 μM resveratroliu efektyviau slopino AAPH sukeltą senėjimą ir apoptozę nei gydymas CR.

D-gal gyvūnų modelis yra tarptautiniu mastu pripažintas senstančių gyvūnų modelis ir buvo plačiai naudojamas šioje srityjevaistai nuo senėjimo. D-gal yra fiziologinė maistinė medžiaga, kurią gyvūnams paprastai metabolizuoja D-galaktokinazė ir galaktozės -1-fosfatas. Tačiau perteklinis D-gal kiekis, kurio nemetabolizuoja aukščiau minėti fermentai, bet kaupiasi ląstelėse, sukelia oksidacinį stresą ir ląstelių pažeidimus [14]. Taigi, ilgalaikis D-gal vartojimas sukelia pokyčius, panašius į natūralų gyvūnų senėjimą, pvz., sutrumpėja gyvenimo trukmė, kognityvinės funkcijos sutrikimas, neurodegeneracija, oksidacinis stresas, sumažėjęs imuninis atsakas ir pažengęs glikacijos galutinio produkto (AGE) susidarymas [15]. Šis tyrimas parodė sėkmingą mimetinio senėjimo modelio sukūrimą, kurį liudija puikus mokymosi ir atminties sutrikimas, MDA gamyba, lipofuscino kaupimasis, T-AOC ir SOD sumažėjimas bei sumažėjęs telomerazės aktyvumo reguliavimas smegenyse. Tuo tarpu gydymas resveratroliu arba CR apsaugojo D-gal sukeltas žiurkes nuo oksidacinio streso, padidindamas antioksidantų fermentų aktyvumą, sumažindamas lipidų peroksidacijos produktų kiekį ir išlaikydamas oksidacinių ir antioksidacinių sistemų pusiausvyrą. Atliekant elgesio ir telomerazės aktyvumo testus, gydymas resveratroliu arba CR gali pakeisti D-gal sukeltą pažinimo sutrikimą ir telomerazės aktyvumą. Be to, senstančios modelio žiurkės, gydomos didelėmis resveratrolio dozėmis, turėjo santykinai didesnį poveikį elgesiui nei gydytų CR.

11 pav. Imunohistocheminė p53 (A, B) ir FOXO3a (C, D) ekspresijos analizė senstančių žiurkių kepenų (A, C) ir smegenų (B, D) audiniuose. Padidinimas buvo 20 kartų. NG, neigiama kontrolinė grupė; MG, modelio kontrolinė grupė; RESL, maža resveratrolio dozė; RESH, didelė resveratrolio dozė; CR, kalorijų apribojimo grupė

Tyrimai parodė, kad CR, maistingos dietos suvartojimo sumažinimas 10–40 proc.sulėtinti senėjimą ir padidinti gyvenimo trukmę, todėl šiame tyrime CR grupės žiurkėms buvo taikomas vienas dažniausiai naudojamas CR lygis (40 procentų sumažintas maisto suvartojimas). Nepaisant to, kai kurie tyrimai atskleidė, kad CR neturi teigiamo poveikio natūraliai senų primatų ilgaamžiškumui [16]. Panašiai, nors buvo įrodyta, kad gydymas resveratroliu sukelia į CR panašų poveikįenergijos apykaitąir medžiagų apykaitos profilį nutukusiems žmonėms [17], jis nepagerino nutukusių moterų, kurios normaliai toleruoja gliukozę, metabolinės funkcijos [18]. Šių tyrimų skirtumų priežastis nėra aiški, tačiau gali būti, kad CR ir resveratrolis atkuria homeostazę žmonėms, kurių metabolizmas sutrikęs, ir mažiau sveikų asmenų, o tai atitinka žinomas SIRT1 funkcijas atliekant tyrimus su gyvūnais [19]. Todėl D-gal sukeltų senėjimo žiurkių modeliai buvo taikomi lyginant resveratrolio ar CR, o ne natūraliai senstančių žiurkių modelio senėjimą stabdantį poveikį.

SIRT1, nuo (NAD plius) priklausoma deacetilazė, susilaukė daug dėmesio dėl daugybės vaidmenų, susijusių su gyvenimo trukmės pailgėjimu, atsparumu stresui ir apoptozės mažinimui [20, 21]. Besikaupę tyrimai aiškiai reiškė, kad SIRT1 buvo pagrindinis resveratrolio ir CR tikslas [22]. Yra daugybė pasroviui esančių SIRT1 molekulių, įskaitant p53, Foxo1, Foxo3, Foxo4 ir E2F1, kurias reguliuoja SIRT1. Tuo pačiu metu SIRT1 aktyvumą reguliuoja jo priešakyje esančios molekulės, pavyzdžiui, p53, HIC1, E2F1, DBC1, HuR ir AROS. Ūmus maistinių medžiagų pašalinimas suaktyvina transkripcijos programą SIRT1 promotoriuje, kuriai vadovauja transkripcijos faktoriai Foxo3a ir p53. Kadangi p53 slopina SIRT1 geno ekspresiją, jo pašalinimas Foxo3a suaktyvina SIRT1 transkripciją [23]. DBC1 ir AROS neseniai buvo aprašyti kaip tiesioginiai neigiami ir teigiami SIRT1 aktyvumo reguliatoriai, HuR rodo SIRT1 ekspresijos lygio mažinimo poveikį senstančiose ląstelėse [9, 10].

CRstabdo senėjimą ir prailgina vidutinę ir maksimalią gyvenimo trukmęįvairiose rūšyse, įskaitant žiurkes, peles, žuvis, muses, kirminus ir mieles. Tačiau tokios griežtos laisvai gyvenančių žmonių mitybos programos iškėlė etinių ir metodinių problemų [24]. Šiuo metu sveikatos trukmės ilginimas gali būti svarbiau nei tiesiog pratęsti gyvenimo trukmę. Naujausi tyrimai rodo, kad resveratrolis yra vienas stipriausių SIR2 aktyvumo kurstytojų tarp visų augalų polifenolių [25] ir įtakoja ilgaamžiškumą panašiais mechanizmais, kaip matyti ribojant kalorijas. Šie rezultatai parodė, kad CR ir resveratrolis turėjo panašią veiklą, atkuriant SIRT1 mRNR ekspresijos lygius, padidinant FOXO3a, AROS ir HuR baltymų ekspresiją ir sumažinant p53 ir DBC1 lygius. Tuo tarpu daugybė įtikinamų įrodymų rodo teigiamą resveratrolio poveikį neurologinėms, kepenų ir širdies bei kraujagyslių sistemoms.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Ląstelių kultūra, stresas ir gydymas

Žmogaus diploidinis fibroblastų padermė IMR{0}} buvo gauta iš ATCC. Ląstelės buvo auginamos minimalioje esminėje terpėje (MEM) (Gibco, JK), papildytos 10 procentų galvijų vaisiaus serumu (FBS) (Gibco), 37 laipsnių temperatūroje 5 procentų CO2. Pasiekus susiliejimą, ląstelės buvo pasėtos į 6-šulinėlių auginimo plokšteles. Po vienos dienos ląstelės 48 valandas buvo apdorotos 1 mM 2,2'-azobis (2-amidinopropano) dihidrochloridu (AAPH) (Sigma, JAV), praskiestu MEM ir 10 procentų FBS. 48 valandų inkubacija su laisvųjų radikalų iniciatoriumi AAPH sukuria oksidacinio streso sukelto ląstelių senėjimo modelį [12, 13]. Kontrolinės ląstelės buvo inkubuojamos tik auginimo terpėje. Po gydymo AAPH, IMR{17}} buvo plaunami šaltu fosfatiniu buferiniu fiziologiniu tirpalu (PBS), pH 7,4, ir inkubuojami su šviežia auginimo terpe arba auginimo terpe, kurioje yra resveratrolio (resveratrolio grupė) arba MEM, papildytu 3 procentų FBS (CR grupė). likus 48 valandoms iki derliaus nuėmimo.

SA -gal dažymo aktyvumas

Buvo patikrintas senėjimo biomarkerių atsiradimas (proliferacinio potencialo sumažėjimas ir SA-gal dažymo padidėjimas) [26] nuo kitos dienos po gydymo. Tada ląstelės buvo nudažytos pagal gamintojo nurodymus naudoti SA-gal dažymo rinkinį (CST, JAV). Po dažymo buvo ištirta mažiausiai 300 ląstelių keliuose laukuose ir suskaičiuotos SA-gal teigiamos ląstelės. Šie eksperimentai buvo pakartoti tris kartus, o rezultatai buvo pateikti kaip vidutinės vertės su standartiniais nuokrypiais (SD). Siekiant išvengti nespecifinio dažymo, galbūt dėl ​​​​ląstelių susiliejimo, SA-gal histocheminis dažymas buvo atliktas su subkonfluentinėmis ląstelėmis.

Skenavimo elektronų mikroskopinė analizė

Ląstelės buvo auginamos ant dengiamųjų stiklelių 6-šulinėlių kultūros plokštelėse, kaip aprašyta aukščiau. Apdorojus resveratrolį ir CR, nuo plokštelių buvo nuimti dengiamieji stikleliai, tada ląstelės fiksuojamos 2,5 procento fosfatiniu buferiniu glutaraldehidu ir fiksuojamos 1 procento buferiniu osmio tetroksidu. Fiksuoti bandiniai buvo panardinti į t-butilo alkoholį po dehidratacijos per rūšiuotą etanolio seriją. Mėginiai buvo išdžiovinti šaldant iš t-butilo alkoholio, po to padengti auksu, naudojant automatinį smulkųjį dangą (JFC{10}}, JEOC, Japonija), ir ištirti naudojant skenuojantį elektroninį mikroskopą (JEOL, JSM{11}). }LV, Japonija).

Apoptotinė analizė

Po resveratrolio arba CR inkubacijos visos ląstelės buvo surinktos tripsinu ir du kartus plaunamos PBS, po to pakartotinai suspenduotos 400 μL aneksino V surišimo buferyje. Tada ląstelės buvo nudažytos pagal gamintojo nurodymus dėl aneksino V-FITC ląstelių apoptozės aptikimo rinkinio (BestBio, Kinija). Fluorescencijai aptikti buvo naudojamas FACSCalibur srauto citometras (Becton-Dickinson, San Chosė, CA), o apoptozinių ląstelių procentas buvo apskaičiuotas naudojant vidinę FACSCalibur programinės įrangos sistemą. Kiekvienam pėdsakui buvo ištirtos maždaug 104 ląstelės.

Gyvūnų procedūros

Albinosų Wistar žiurkių patinai, sveriantys maždaug 200 ± 10 g, buvo gauti iš Huazhongo mokslo ir technologijos universiteto Tongji medicinos koledžo eksperimentinio gyvūnų centro (SCXK 2010-0009). Gyvūnai buvo aklimatizuoti 2 savaites prieš dozavimą Hubėjaus kinų medicinos universiteto Eksperimentinių gyvūnų centre, per tą laiką jie turėjo laisvą prieigą prie maisto ir vandens ad libitum. Po aklimatizacijos buvo atrinkta 50 žiurkių ir suskirstyta į penkias grupes po dešimt. Gyvūnai buvo prižiūrimi pagal nacionalines gaires ir protokolus, patvirtintus Institucinio gyvūnų etikos komiteto (IAEC).

I grupės (neigiamos kontrolinės grupės) žiurkės 6 savaites vartojo tik nešiklį (1 ml/kg kūno svorio 0,9 proc. fiziologinio tirpalo). II grupės (kontrolinės modelio grupės) žiurkės 6 savaites gavo D-gal (200 mg/kg kūno svorio, Sigma Chemical, St. Louis, MO). III grupės (mažos resveratrolio dozės grupės) žiurkės 6 savaites gavo D-gal ir resveratrolį (50 mg/kg kūno svorio), ištirpinto 5 procentų dimetilsulfokside (DMSO). IV grupės (didelės resveratrolio dozės grupės) žiurkės gavo D-gal ir resveratrolį (100 mg/kg kūno svorio). V grupės (CR grupė) žiurkės 6 savaites vartojo D-gal ir CR (šeriamos 40 procentų mažiau kalorijų turinčios žiurkės [27]). D-gal buvo skiriamas į pilvaplėvės ertmę, o resveratrolis buvo vartojamas per burną visą eksperimento laiką. Žiurkės buvo nužudytos paskutinę gydymo dieną, tada kraujas, serumai ir organai buvo nedelsiant paimti biologiniam tyrimui arba laikomi –80 laipsnių temperatūroje vėlesniam naudojimui.

Elgesio testai

Morriso vandens labirinto testas buvo skirtas įvertinti žiurkių erdvinio mokymosi ir atminties gebėjimus praėjus 6 savaitėms po sužalojimo [28]. Morriso vandens labirinto testą sudarė 4-dienos mokymasis ir atminties lavinimas bei zondo bandymas 5 dieną. Gyvūnai buvo mokomi apskritame baseine (155 cm skersmens) su vaizdiniais ženklais. Pabėgimo platforma (90 cm skersmens) buvo panardinta 10 cm žemiau baseino vandens paviršiaus, kuris buvo palaikomas 25 ± 2 laipsniais. Platformos vieta išliko šiaurės vakarų kvadranto centre per visą 4-dienos mokymo laikotarpį. Kiekvieną dieną žiurkės buvo treniruojamos vienam rytiniam blokui ir vienam popietiniam blokui. Žiurkė laisvai plaukė, kol per 120 sekundžių rado platformą. Jei nepavyko, jis buvo pastatytas ant platformos 10 s. Buvo užregistruotas pabėgimo delsa (panardintos evakuacijos platformos radimas) ir plaukimo greitis. Bandymas buvo atliktas nuėmus platformą ir leidžiant kiekvienai žiurkei laisvai plaukti baseine 120 s. Peronų kirtimų skaičius apmokytame kvadrante (kur peronas buvo pašalintas) buvo užfiksuotas kompiuterine vaizdo sistema. Matomos platformos vandens labirinto versija nebuvo atlikta po to, kai buvo pastebėtas reikšmingas plaukimo greičio skirtumas tarp žiurkių, gydytų D-gal ir transporto priemone.

Su oksidaciniu stresu susijusių biologinių rodiklių nustatymas

MDA, SOD ir T-AOC lygiai kraujyje ir audiniuose buvo nustatyti fotometriškai pagal gamintojo protokolą, naudojant komerciškai prieinamus fermentinių tyrimų rinkinius (Nanjing Jiancheng Bioinžinerijos institutas, Nanjing City, PR Kinija). Visi šiame skyriuje aprašyti eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais, siekiant gauti priemones ir SD.

Lipofuscino lygis nustatytas Sohal metodu [29]. Trumpai tariant, mes pasvėrėme 200 mg smegenų žievės, įpylėme 2 ml chloroformo-metanolio (2:1) ekstrakto, homogenizavome ir filtravome, tada likučius nuplovėme ekstraktu, sumaišome filtratus, supilame ekstraktą į 5 ml ir išmatavo fluorescencijos intensyvumą fluorescencijos spektrometru. Emisijos bangos ilgis buvo 435 nm, o sužadinimo bangos ilgis buvo 365 nm. Spektrofluorometras buvo standartizuotas, kad būtų gauta 50 deformacija esant aukščiau nurodytam bangos ilgiui, naudojant 1 ug/ml chinino bisulfato tirpalą 0,1 M H2SO4. Rezultatai buvo išreikšti santykiniais fluorescenciniais vienetais/ml chloroformo/g drėgno audinio masės.

TE aktyvumo nustatymas

Telomerazės ekstrahavimui maždaug 30 mg audinio buvo du kartus plaunamas lediniu PBS ir galiausiai homogenizuotas maždaug 150 ml PBS. TE aktyvumas buvo matuojamas naudojant TE ELISA rinkinius pagal gamintojo instrukcijas (Nanjing Sen Beijia Biological Technology Co., Ltd., Nankinas, Kinija). Tyrimų jautrumo ribos buvo 0,8 IU/L TE.

RT-PGR analizė

SIRT1, Foxo3 ir p53 mRNR ekspresijos lygiai kepenų ir smegenų audiniuose buvo analizuojami naudojant RT PGR analizę. Bendra RNR buvo ekstrahuota naudojant Trizol, o jų kiekis ir grynumas buvo įvertinti ultra mikrospektrofotometru (Thermo Fisher Scientific, JAV), remiantis absorbcijos matavimu esant 260 ir 280 nm. Po kiekybinio įvertinimo cDNR buvo susintetinta naudojant FastQuant RT rinkinį (Tiangen Biotech, Pekinas, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. SIRT1, Foxo3, p53 mRNR ekspresijos lygiai buvo išmatuoti RT-PCR, naudojant TIANGEN SuperReal PreMix Plus (Tiangen Biotech, Pekinas, Kinija) su specifiniais pradmenimis (2 lentelė). Kiekybinė realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant LightCycler 480 laipsnių PGR sistemą (Roche, Bazelis, Šveicarija), naudojant 20 μL kaip bendrą kiekvienos reakcijos tūrį. PGR amplifikacija buvo pradėta 15 minučių denatūruojant 95 laipsnių temperatūroje, po to sekė 40 ciklų 95 laipsnių 10 s, 59–63 laipsnių (atkaitinimo temperatūra) 20 s ir 72 laipsnių 30 s, o galutinė inkubacija 72 laipsnį 5 min. Gautas kiekvieno geno ciklo slenkstinis skaičius (Ct reikšmė) buvo normalizuotas į santykinių pokyčių kartos pagal 2-∆∆CT metodo lygtį [30].

2 lentelė: Pradmenų sąrašas

Western blot analizė

P53, FOXO3a, HuR, RPS19BP1 ir DBC1 baltymų ekspresijos lygiai smegenų audiniuose buvo analizuojami naudojant Western blot analizę. Bendras smegenų audinių baltymas buvo ekstrahuotas naudojant RIPA lizės buferį (Beyotime, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. Baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kinija). 5 mg baltymų buvo atskirti naudojant 12 procentų SDS-poliakrilamido gelius ir perkelti ant PVDF membranos (0.45 μm, Millipore, JAV). Blotai buvo užblokuoti 5 procentų neriebiu pienu TBS, po to inkubuojami per naktį 4 laipsnių temperatūroje su tinkamu pirminių antikūnų praskiedimu: anti-p53 (SC- 6243, Santa Cruz Biotechnology), anti-FOXO3a (#12829, ląstelė). Signalizacijos technologija), anti-HuR (#12582, ląstelių signalizacijos technologija), anti-AROS (Ab201091, abcam), anti-DBC1 (#5857, ląstelių signalizacijos technologija), anti- - veikimas (AC004, ABkloninė technologija) . Išplovus membranas, kad būtų pašalintas pirminių antikūnų perteklius, membranos buvo inkubuojamos 1 valandą kambario temperatūroje su atitinkamais antriniais antikūnais, praskiedus 1: 2000-1: 5000 (AC004 arba AS003, ABclonal Technology). Membranos buvo plaunamos 3 kartus ir vizualizuotos naudojant Pierce ECL Western Blotting substratą (Thermo Scientific). – veiksmas buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė.

Imunohistochemija

Audinių mėginiai buvo fiksuoti 10 procentų neutraliu buferiniu formalinu per 1 valandą po chirurginio pašalinimo ir įterpti į parafiną naudojant standartines procedūras. Tada fiksuoti parafinu įterpti mėginiai buvo supjaustyti į 5- μm storio dalis, kurios buvo deparafinuotos ksilene, rehidratuotos etanolyje ir apdorotos mikrobangų krosnelėje, kad būtų galima gauti antigeną. Tinkamai praskiesti pirminiai antikūnai, anti-p53 (SC-6243, Santa Cruz Biotechnology) ir anti-FOXO3a (#12829, Cell Signaling Technology), buvo inkubuojami 60 minučių kambario temperatūroje drėgmės kameroje. Tada stikleliai buvo nuplauti PBS ir vėliau inkubuojami su antriniu antikūnu prieš triušio antikūną ir HRP vizualizacija (koncentracija 1:300, #074-1506, KPL). Tada stikleliai buvo nuplauti ir sekcijos buvo sukurtos fermento substrato diaminobenzidino (DAB, Sigma) tirpale. Imunohistochemiškai nudažytų pjūvių vaizdai buvo užfiksuoti skaitmeniniu „Olympus“ mikroskopu (IX-73P1F, Olympus, Japonija).

Statistinė analizė

Rezultatai buvo išreikšti kaip vidurkis ± SD mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų metu ir buvo analizuojami naudojant SPSS 18.{1}} programinę įrangą. Grupės skirtumai tarp pabėgimo delsos ir plaukimo greičio atliekant Morriso vandens labirinto treniruočių užduotį buvo analizuojami naudojant dvipusę dispersijos analizę (ANOVA) su kartotinėmis priemonėmis, o veiksniai buvo gydymo ir treniruočių diena. Kiti duomenys buvo analizuojami naudojant vienpusį ANOVA, po kurio buvo atliktas post-hoc Tukey testas. P reikšmė mažesnė nei 0,05 buvo laikoma reikšminga.

IŠVADOS

Resveratrolis ir CR parodė panašią senėjimą stabdantį poveikį tiek in vitro, tiek in vivo, o tai patvirtina jų gebėjimas slopinti AAPH sukeltą senėjimą ir apoptozę bei atkurti su amžiumi susijusį pažinimo sutrikimą, kurį sukelia D-gal vartojimas. Jų kovos su senėjimu mechanizmai apėmė TE aktyvumo reguliavimą, oksidacinės žalos mažinimą ir SIRT1 kelio reguliavimą. Apskritai, 10 μM resveratrolis in vitro ir didelė resveratrolio dozė in vivo parodė santykinai stipresnį senėjimą stabdantį ir stimuliuojantį SIRT1 lygį. Šie rezultatai rodo, kad resveratrolis gali būti CR mimetikas.

Santrumpos

AAPH, 2,2′-azobis (2-amidinopropano) dihidrochloridas; AMPK, adenozino monofosfato aktyvuota proteinkinazė; ANOVA, dispersinė analizė; AROS, aktyvus SIRT1 reguliatorius; CR, kalorijų apribojimas; DBC1, ištrintas sergant krūties vėžiu 1; D-gal, D-galaktozė; FBS, vaisiaus galvijų serumas; Foxo3a, šakutės dėžutė 3a; HuR, Hu antigenas R; MEM, minimali esminė terpė; PBS, fosfatinis buferinis fiziologinis tirpalas; PGC-1, peroksisomų proliferatoriaus aktyvuotas receptoriaus G koaktyvatorius-1; RES, resveratrolis; SA -gal, su senėjimu susijusi -galaktozidazė; SD, standartiniai nuokrypiai; SIRT1, garso slopinimo informacijos reguliatorius; TE, telomerazė.

Autoriaus indėlis

Tyrimo koncepcija ir planas: Gang Chen; duomenų gavimas, analizė ir interpretavimas: Juan Li, Xia Chun Zhang, Yi-Mei Liu; finansavimo gavimas ir rankraščio kritinė peržiūra dėl intelektualinio turinio: Gang Chen, Ke-Li Chen; rankraščio rašymas: Juanas Li. Visi autoriai perskaitė ir patvirtino šio rankraščio publikaciją. PADĖKA IR FINANSAVIMAS

Šį darbą finansavo Kinijos doktorantūros mokslų fondas (2016M601237), Gamtos mokslų fondo projektas (81373704, 30873292).

INTERESŲ KONFLIKTAI

Jokio visų dalyvaujančių autorių interesų konflikto.

NUORODOS

1. Ramis MR, Esteban S, Miralles A, Tan DX, Reiter RJ. Kaloringumo apribojimas, resveratrolis ir melatoninas: SIRT1 vaidmuo ir pasekmės senėjimui ir susijusioms ligoms. Mech Aging Dev. 2015 m.; 146–148:28–41.

2. Colman RJ, Beasley TM, Kemnitz JW, Johnson SC, Weindruch R, Anderson RM. Kalorijų apribojimas sumažina su amžiumi ir dėl visų priežasčių susijusį rezus beždžionių mirtingumą. Nat Commun. 2014 m.; 5:3557.

3. Sohal RS, Weindruch R. Oksidacinis stresas, kalorijų apribojimas ir senėjimas. Mokslas. 1996 m.; 273:59–63.

4. Testa G, Biasi F, Poli G, Chiarpotto E. Kalorijų ribojimo ir dietos ribojimo mimetikai: sveiko senėjimo ir ilgaamžiškumo gerinimo strategija. Curr Pharm Des. 2014 m.; 20:2950–77.

5. Lane MA, Roth GS, Ingram DK. Kalorijų apribojimo mimetika: naujas biogerontologijos metodas. Metodai Mol Biol. 2007 m.; 371:143–9.

6. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG ir kt. Resveratrolis pagerina daug kalorijų turinčių dietų pelių sveikatą ir išgyvenamumą. Gamta. 2006 m.; 444:337–42.

7. Lagouge M, Argmann C, Gerhart-Hines Z, Meziane H, Lerin C, Daussin F, Messadeq N, Milne J, Lambert P, Elliott P, Geny B, Laakso M, Puigserver P ir kt. Resveratrolis pagerina mitochondrijų funkciją ir apsaugo nuo medžiagų apykaitos ligų aktyvuodamas SIRT1 ir PGC-1alfa. Ląstelė. 2006 m.; 127:1109–22.

8. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin RE, Chung P, Kisielewski A, Zhang LL, Scherer B, Sinclair DA. Mažos molekulės sirtuinų aktyvatoriai prailgina Saccharomyces cerevisiae gyvavimo trukmę. Gamta. 2003 m.; 425:191–6.

9. Kwon HS, Ott M. SIRT1 pakilimai ir nuosmukiai. Trends Biochem Sci. 2008 m.; 33:517–25.

10. Brooks CL, Gu W. Kaip SIRT1 veikia medžiagų apykaitą, senėjimą ir vėžį? Nat Rev vėžys. 2009 m.; 9:123–8.

11. Harman D. Laisvųjų radikalų senėjimo teorija. Mutat Re. 1992 m.; 275:257–66.

12. Mayo JC, Tan DX, Sainz RM, Lopez-Burillo S, Reiter RJ. Peroksilo radikalų sukeltas oksidacinis katalazės pažeidimas: funkcinė apsauga nuo melatonino ir kitų antioksidantų. Nemokama Radic Res. 2003 m.; 37:543–53.

13. Hubackova S, Krejcikova K, Bartek J, Hodny Z. IL1- ir TGF-Nox4 signalizacija, oksidacinis stresas ir atsakas į DNR pažeidimus yra bendri replikacinio, onkogeno sukelto ir vaistų sukelto parakrininio pašalinio senėjimo bruožai “. Senėjimas (Albanis, NY). 2012 m.; 4:932–51. https:// doi.org/10.18632/aging.100520.

14. Cui X, Zuo P, Zhang Q, Li X, Hu Y, Long J, Packer L, Liu J. Lėtinis sisteminis D-galaktozės poveikis pelėms sukelia atminties praradimą, neurodegeneraciją ir oksidacinius pažeidimus: apsauginis R{{ poveikis 2}}lipoinė rūgštis. J Neurosci Res. 2006 m.; 84:647–54.

Paprašyk daugiau:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plius 86 15292862950