Lyginamasis senėjimą stabdančių savybių ir mechanizmo tyrimas: Resveratrolis ir kalorijų apribojimas

SANTRAUKA

Resveratrolis ir kalorijų apribojimas (CR) yra galingos gydymo galimybėsanti-senėjimo. Čia jų lyginamasis poveikissu ilgaamžiškumu susijęs genasslopinimo informacijos reguliatorius (SIRT1) buvo įvertintas in vitro ir in vivo. IMR-90 ląstelės, apdorotos 2,2'-azobis (2-amidinopropano) dihidrochloridu (AAPH), buvo panaudotos ląstelių senėjimo modeliui nustatyti, o žiurkės, apdorotos D-galaktoze (D-gal). kaip ansenstančio gyvūno modelis. Resveratrolis ir CR buvo panašūsanti-senėjimo veikla, liudijaslopina senėjimą ir apoptozę bei atkuria pažinimo sutrikimus ir oksidacinius pažeidimus. Be to, jie galėjoreguliuoti telomerazę(TE) veikla,padidinti SIRT1 išraiškas3a šakės galvutės langelis (Foxo3a), aktyvus SIRT1 (AROS) ir Hu antigeno R (HuR) reguliatorius, tačiau sumažina p53 ir pašalinamas krūties vėžio 1 (DBC1) lygis. Tačiau 10 μM resveratrolis in vitro ir didelės dozės grupė in vivo parodėsantykinai stipresnė senėjimą stabdančio ir SIRT1 lygio stimuliavimo veikla nei CR. Apibendrinant, resveratrolis ir CR parodė panašiusanti-senėjimo veiklaapie SIRT1 signalizaciją,resveratrolio, kaip CR mimetiko, potencialą.

Spustelėkite čia, kad sužinotumėte Cistanche vaistažolių preparatą nuo senėjimo

ĮVADAS

Sveikatos priežiūros gerinimas pastaraisiais dešimtmečiais padėjo pailginti žmonių gyvenimo trukmę, todėl pagyvenusių žmonių skaičius labai auga. Deja, tai vis dar reiškia, kad padaugėja prastos sveikatos ar negalios laikotarpių. Šiuo metu įvairios su senėjimu susijusios ligos iškyla kaip didžiausia grėsmė sveikatai daugumoje išsivysčiusių šalių. Nors genetinio fono modifikuoti kol kas neįmanoma, šiuo metu atsiranda įvairios kovos su senėjimu strategijos kaip sveikas gyvenimo būdas ir terapinės intervencijos, kuriomis siekiama sumažinti prastos sveikatos rizikos veiksnių paplitimą [1].

CR, sumažėjęs kalorijų suvartojimas be netinkamos mitybos, yra viena tvirčiausių intervencijų, pailginančių modelių organizmų nuo mielių iki primatų gyvenimo trukmę [2]. Tai galėtų apsaugoti nuo biologinių funkcijų pablogėjimo, sumažinti sergamumą ir atitolinti daugelio su amžiumi susijusių ligų atsiradimą. Mechanizmas, kuriuo CR pailgina gyvenimo trukmę, apima augimo sulėtėjimą, kūno riebalų mažinimą, neuroendokrininių ar imunologinių pokyčių vėlavimą, DNR atstatymo pajėgumų padidėjimą, pakitusią genų ekspresiją, sustiprėjusią apoptozę, kūno temperatūros sumažėjimą ir medžiagų apykaitos greičio slopinimą bei oksidacinių sutrikimų pagerėjimą. stresas [3]. Senėjimą stabdantis CR poveikis buvo stipriai susijęs su padidėjusiu sirtuinų šeimos narių lygiu ir aktyvavimu, taip pat su kitais molekuliniais signalų perdavimo būdais, įskaitant peroksisomų proliferatoriaus aktyvuojamą receptorių G koaktyvatorių- 1 (PGC{{). 6}}), adenozino monofosfatu aktyvuota proteinkinazė (AMPK), insulino/insulino augimo faktorius-1 ir rapamicino taikinys [1, 4]. Tačiau dauguma žmonių nesilaikytų tokios griežtos mitybos programos, ypač ilgalaikėje perspektyvoje. Todėl naujausiais tyrimais vis labiau siekiama nustatyti natūralių ir (arba) farmakologinių CR imituojančių molekulių / gydymo būdų tinkamumą ir veiksmingumą nemažinant maisto vartojimo [5].

Resveratrolis yra augalinis polifenolis, dažniausiai randamas įvairiuose augaluose, įskaitant vynuogių, uogų ir žemės riešutų odą. Įdomu tai, kad resveratrolio įtraukimas į maisto papildus ar maistą gali būti galingas terapinis būdas kovoti su senėjimu, o keli pranešimai rodo, kad gydymas resveratroliu daro teigiamą poveikį, panašus į CR [6], o tai reiškia, kad resveratrolis gali būti CR mimetikas. [4]. Neseniai buvo įrodyta, kad resveratrolis pailgina gyvenimo trukmę, nes žymiai padidina SIRT1 aktyvumą, todėl padidėja SIRT1 afinitetas tiek NAD plus, tiek acetilintam substratui [7, 8], kuris taip pat yra atsakingas už CR sukeltą ilgaamžiškumą. Nors resveratrolis ir CR buvo plačiai tiriami dėl galimos naudos sveikatai, mažai žinoma apie jų lyginamąjį poveikį. Šiame tyrime palyginome resveratrolio ir CR senėjimą stabdantį poveikį in vivo ir in vitro, nustatydami SIRT1 kelią.

REZULTATAI

Resveratrolis ir CR sumažino su senėjimu susijusį -galaktozidazės (SA -gal) dažymą AAPH apdorotose IMR-90 ląstelėse

Pasinaudodami AAPH sukeltu IMR-90 ląstelių senėjimo modeliu, išbandėme galimą poveikį SA- -gal dažymui. Kaip parodyta 1 paveiksle, AAPH apdorotose ląstelėse buvo platesnis ir stipresnis teigiamas dažymas nei kontrolinėse ląstelėse, o teigiamo dažymo kontrolinėse ląstelėse buvo palyginti nedaug. Nustatyta, kad gydymas resveratroliu (5 μM, 10 μM ir 20 μM) arba CR suteikia ryškią apsaugą nuo AAPH sukelto senėjimo. Be to, lyginant resveratrolio ir CR poveikį, ląstelės, apdorotos 10 μM resveratroliu, santykinai rečiau pasižymėjo SA- -Gal teigiamu dažymu nei gydant CR. Taigi šie rezultatai rodo, kad 10 μM resveratrolis efektyviau slopino AAPH sukeltą senėjimą nei CR.

IMR- 90 ląstelių nuskaitymo elektronų mikroskopinė analizė

Skenuojančio elektroninio mikroskopinio tyrimo metu gauta keletas naujų detalių apie AAPH apdorotų ląstelių struktūrą (2 pav.). Įprasta IMR-90 pasirodė kaip visiškai išsklaidytos ląstelės, turinčios tipišką fusiformą. Daugumoje ląstelių buvo du smailėjantys procesai ir buvo keletas dėmių. AAPH apdorotos ląstelės pasižymėjo padidinta ir suplokšta morfologija su daugybe dėmių. Esant skirtumams, IMR-90 mėginių, apdorotų resveratroliu arba CR, stebėjimas skenuojančiu elektroniniu mikroskopu po AAPH vartojimo aiškiai parodė, kad nors ir buvo galima aptikti kai kurių dėmių, normali fusiform forma išliko ir visiškai išplito.

Resveratrolis ir CR sumažino apoptozę AAPH apdorotose IMR-90 ląstelėse

Fosfatidilserinas ant ląstelių paviršiaus, laikomas apoptozės požymiu ankstyvoje fazėje, buvo nustatytas PI/Aneksino V dažymo tyrimu (3 pav.). Apoptozines ląsteles sudaro ir ankstyvos apoptozinės ląstelės, nudažytos aneksin-V-FITC, ir vėlyvos apoptozinės arba nekrozinės ląstelės, nudažytos aneksino-V-FITC ir PI. Apoptozinių ląstelių populiacija reikšmingai didėjo AAPH grupėje (34,54 proc.), palyginti su neigiama grupe (7,32 proc.). Tuo tarpu buvo nustatyta, kad gydymas resveratroliu (5 μM, 10 μM ir 20 μM) arba CR sumažina AAPH sukeltų IMR{13}} ląstelių apoptozę. Be to, gydymas 10 μM resveratroliu (11,58 proc.) efektyviau sumažino AAPH sukeltą apoptozę nei gydymas CR (16,78 proc.).

Bendros išvaizdos ir kūno svorio pasikeitimas

Viso eksperimento proceso metu senstančios modelio žiurkės kiekvieną dieną gavo 200 mg/kg D-gal dozę ir buvo stebima bendra išvaizda. Palyginti su įprastomis kontrolinėmis žiurkėmis, D-gal modelio grupės žiurkės palaipsniui tapo apatiškos, nuobodžios ir lėtos. modelių grupės plaukai palaipsniui prarado elastingumą ir tapo trapūs; oda tapo plona, ​​neelastinga ir po truputį suglebo. Tačiau žiurkėms vienu metu gydant resveratroliu arba CR su D-gal, pirmiau minėti pokyčiai pasikeitė, palyginti su D-gal grupe. Eksperimentinių grupių kūno svoris gydymo laikotarpiu nesiskyrė, išskyrus CR grupę, kurios svoris eksperimento metu beveik nepadidėjo (4 pav.).

Resveratrolis ir CR pagerino SD žiurkių erdvinį mokymąsi ir atmintį

Atlikdami Morriso vandens labirinto testą, įvertinome žiurkių erdvinį mokymąsi ir atminties gebėjimus. Kaip parodyta 5 paveiksle, visoms penkioms grupėms pavyko sėkmingai išmokti užduotį, o tai rodo palaipsniui mažėjantis pabėgimo laikas ir padidėjęs plaukimo greitis per 4 vietos navigacijos dienas. Analizuojant dvipusio ANOVA metodu, buvo parodyti reikšmingi skirtumai tiek vidutiniame pabėgimo delsoje, tiek plaukimo greičio tarp treniruočių dienų (F(3,138)=41.660, P < 0). 01; F(3,138)=10.013, P < 0.01) ir tarp procedūrų (F(4,46) )=36.762, P < {{40}}.01; F(4,46)=20.102, P < 0,01, atitinkamai), bet nėra sąveikos tarp veiksnių dieną ir gydymo (atitinkamai F(12,138)=0,846, P > 0,05; F(12,138)=1,084, P > 0,05). Pabėgimo delsa D-gal grupėje buvo žymiai ilgesnė nei kontrolinėje grupėje (P < 0,01) (Post-hoc analizė, 5A pav.). Tuo tarpu žiurkėms resveratrolio ir D-gal grupėje arba CR ir D-gal grupėje pirmiau minėti pabėgimo delsos pokyčiai pasikeitė, palyginti su D-gal grupe (P < 0,01) (5A pav.), ir žymiai sutrumpino pabėgimo laiką. delsos lygis buvo panašus su kontroline grupe. Panašūs rezultatai buvo gauti ir žiurkių plaukimo greičiui (5B pav.), o resveratrolio ir D-gal grupėse bei CR ir D-gal grupėse plaukimo greitis žymiai padidėjo, palyginti su D-gal grupe (P < 0,01). ). Tačiau žiurkės, vartojusios didelę resveratrolio ir D-gal dozę, turėjo santykinai ilgesnį pabėgimo laiką ir mažesnį plaukimo greitį, palyginti su CR ir D-gal grupe.

1 pav. Resveratrolis ir kalorijų apribojimas sumažina SA- -gal dažymąsi AAPH apdorotose IMR-90 ląstelėse. AAPH sukeltos IMR- 90 ląstelės buvo apdorotos kalorijų apribojimu (CR) arba resveratroliu (RES) nurodytoje koncentracijoje 2 dienas. Padidinimas buvo 20 kartų.

2 pav. IMR-90 ląstelių nuskaitymo elektronų mikroskopinė analizė. AAPH sukeltos IMR-90 ląstelės buvo apdorotos kalorijų apribojimu (CR) arba resveratroliu (RES) nurodytoje koncentracijoje 2 dienas. Padidinimas buvo 6000 ×.

3 pav. Resveratrolis (RES) ir kalorijų apribojimas (CR) sumažino apoptozę AAPH apdorotose IMR-90 ląstelėse. Ląstelės buvo nudažytos anneksinu V-FITC/PI ir analizuojamos srauto citometrija. FL1 kanalas buvo naudojamas aneksino-V-FITC dažymui aptikti, o FL2 kanalas buvo skirtas PI dažymui

Erdvinio zondo fazėje (5C ir 5D pav.) buvo galima pastebėti, kad D-gal grupėje, palyginti su kontroline grupe, žymiai sumažėjo perėjimo per platformą skaičius (P < 0.{{6} }1). Įdomu tai, kad vidutinis kartų, kai žiurkės kirto platformą, skaičius žymiai pagerėjo po resveratrolio ar CR, palyginti su D-gal grupe (P < 0, 01). Tačiau žiurkės, vartojusios dideles resveratrolio ir D-gal grupės dozes, per platformą kirto dažniau nei CR ir D-gal grupės žiurkės.

Šie rezultatai parodė, kad senstančios modelio žiurkėms buvo sutrikęs erdvinis mokymasis ir atmintis, o gydymas resveratroliu arba CR gali atkurti su amžiumi susijusį pažinimo sutrikimą, kurį sukelia D-gal vartojimas. Be to, senstančios žiurkės, gydytos didele resveratrolio doze, elgėsi santykinai veiksmingiau nei gydytos CR.

Resveratrolio ir CR poveikis SOD, T-AOC, MDA ir lipofuscino lygiams senstančiose žiurkėse

SOD, T-AOC, MDA ir lipofuscino lygiai žiurkėms buvo įvertinti siekiant patvirtinti, ar resveratrolio ir CR senėjimą stabdantis poveikis buvo susijęs su D-gal vartojimo sukelto oksidacinio streso mažinimu. 1 lentelėje parodytas SOD, T-AOC ir MDA lygis normalių ir senstančių žiurkių serume, kepenyse ir smegenyse. D-gal poveikis žymiai sumažino SOD ir T-AOC lygius, bet padidino MDA lygį serume, kepenyse ir smegenyse, palyginti su kontroline grupe (P < 0,05). Vienu metu gydant resveratroliu arba CR su D-gal žiurkėms sumažėjo MDA aktyvumas, tačiau padidėjo SOD ir T-AOC lygiai, palyginti su D-gal grupe. Tačiau, palyginti su gydymu CR, rezultatai parodė, kad didelės resveratrolio dozės skyrimas buvo santykinai pranašesnis.

4 pav. Resveratrolio ir kalorijų apribojimo poveikis D-gal gydytų žiurkių kūno svoriui eksperimento metu. Visos vertės buvo išreikštos kaip vidurkis ± SD. NG, neigiama kontrolinė grupė; MG, modelio kontrolinė grupė; RESL, maža resveratrolio dozė; RESH, didelė resveratrolio dozė; CR, kalorijų apribojimo grupė.

5 pav. Resveratrolio ir kalorijų apribojimo poveikis D-gal gydytų žiurkių elgesiui su Morriso vandens labirintu. (A) Platformos delsos palyginimas per 4 mokymo dienas. Kiekvienai pelei buvo atlikti 4 bandymai per dieną. (B) Plaukimo greičio palyginimas per 4 treniruočių dienas. (C) Perėjimo platformų, kuriose platforma buvo pašalinta zondo bandymui, skaičiaus palyginimas. (D) Tipinis plaukimo takelis zondo bandyme. Visos vertės buvo išreikštos kaip vidurkis ± SD. * P < 0.05, **P < {{10}},01, palyginti su neigiama kontroline grupe; # P < 0,05, ##P < 0,01, palyginti su modelio kontroline grupe. NG, neigiama kontrolinė grupė; MG, modelio kontrolinė grupė; RESL, maža resveratrolio dozė; RESH, didelė resveratrolio dozė; CR, kalorijų apribojimo grupė.

1 lentelė: Antioksidantų būklė kiekvienos grupės žiurkių audiniuose ir kraujyje

Pastaba: reikšmės buvo vidurkis ± SD. * P < {0}}.05, **P < 0.01 palyginti su kontroline grupe (visos grupės); # P < 0,05, ##P < 0,01, palyginti su modelių grupe (CR grupė ir RES grupė); ∆P < 0,05, ∆∆P < 0,01 lyginant su CR grupe (RES grupe). NG, neigiama kontrolinė grupė; MG, modelio kontrolinė grupė; RESL, maža resveratrolio dozė; RESH, didelė resveratrolio dozė; CR, kalorijų apribojimo grupė.

yra santykinai pranašesnis. Lipofuscino kaupimasis yra vienas nuosekliausių smegenų senėjimo požymių. Kaip parodyta 6 paveiksle, D-gal gydytų žiurkių lipofuscino kiekis žymiai padidėjo, palyginti su kontroline grupe (P < 0.01). Tačiau gydymas resveratroliu ir CR sumažino lipofuscino kaupimąsi senstančių žiurkių smegenų žievėje, palyginti su žiurkėmis, gydytomis D-gal (P < 0,01). Be to, nebuvo skirtumų tarp resveratrolio ir D-gal grupės bei CR ir D-gal grupės (P > 0,05).

Resveratrolis ir CR padidino telomerazės aktyvumą senstančiose žiurkėse

Įvertinome resveratrolio ir CR poveikį telomerazės aktyvumui kepenyse ir smegenų audiniuose (7 pav.). Mūsų rezultatai parodė, kad gydymas neturėjo reikšmingos įtakos telomerazės aktyvumui kepenų audiniuose (P > 0.05). Tačiau telomerazės aktyvumas sumažėjo D-gal vartojusių grupėje, palyginti su kontroline (P < 0,05). Tuo tarpu resveratrolis arba CR gali padidinti telomerazės aktyvumą vartojant D-gal ir resveratrolį arba CR gydymo grupę. Be to, nebuvo skirtumų tarp resveratrolio grupės ir CR grupės (P > 0, 05).

6 paveikslas: Resveratrolio ir kalorijų apribojimo poveikis lipofuscino lygiui senstančiose žiurkėse. Visos vertės buvo išreikštos kaip vidurkis ± SD. * P < 0.05 palyginti su neigiama kontroline grupe; # P < 0,05, palyginti su modelio kontroline grupe. NG, neigiama kontrolinė grupė; MG, modelio kontrolinė grupė; RESL, maža resveratrolio dozė; RESH, didelė resveratrolio dozė; CR, kalorijų apribojimo grupė.

Resveratrolis ir CR padidino AAPH sukeltą SIRT1 mRNR ekspresiją Norint ištirti SIRT1 vaidmenį gydant resveratrolį ir CR, SIRT1 mRNR ekspresijos lygiai IMR-90 ląstelėse ir audiniuose buvo ištirti kiekybiniu realiu laiku RT. PGR. Rezultatai parodė, kad AAPH žymiai sumažino SIRT1 mRNR ekspresiją IMR-90 ląstelėse. Resveratrolis ir CR galėtų veiksmingai atkurti SIRT1 mRNR ekspresijos lygį AAPH apdorotose ląstelėse, o 10 μM resveratrolis buvo optimali koncentracija stimuliuoti SIRT1 mRNR ekspresiją IMR-90 ląstelėse (P < 0,01; pav. 8)