Išskirtinis hipoksijos sukeliamo faktoriaus pasiskirstymas-1 kultivuotose inkstų kanalėlių ląstelėse su hipoperfuzija, imituojama dengiant dengiamąja medžiaga

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Abstraktus

Lėtinė hipoksija inkstų kanalėliuose vaidina pagrindinį vaidmenį progresuojant lėtinei ligai.inkstasliga(CKD). Todėl svarbu ištirti kanalėlių hipoksiją ir hipoksijos sukeliamo faktoriaus (HIF) -1 aktyvumą reaguojant į hipoksiją. Peritubulinio kapiliaro retėjimas sukelia hipoperfuziją sergant ŠKL; tačiau hipoperfuzijos poveikis HIF buvo retai tiriamas. Mes sukėlėme hipoperfuziją, kurią sukėlė dengiamojo stiklo uždėjimas žmoguiinkstas-2 ląstelių ir stebėjo deguonies gradientą po dengiamuoju stikleliu. HIF-1 imunocitochemija parodė spurgos formos darinį ant pimonidazolo teigiamos srities krašto, kurį pavadinome „HIF žiedu“. Apskaičiuota, kad HIF žiedo deguonies įtempis yra nuo maždaug 4 mmHg iki 20 mmHg. Šis rezultatas buvo nesuderinamas su ankstesnių tyrimų rezultatais, rodančiais HIF-1 kaupimąsi anoksiniame diapazone esant homogeninei deguonies įtampai. Toliau stebėjome pH gradiento buvimą po dengiamuoju stikleliu, taip pat HIF žiedo poslinkį dėl auginimo terpės pH pokyčių, o tai rodo, kad HIF žiedas susidarė slopinant su HIF-1 susijusią. iki žemo pH. Šis tyrimas parodė, kad HIF{10}} aktyvinimas imituoja fiziologinę būseną auginamose ląstelėse su hipoperfuzija.

RAKTINIAI ŽODŽIAIhipoperfuzija, hipoksija, hipoksijos sukeliamas faktorius, deguonies gradientas, pH

Cistanche žolėapsaugo nuo inkstų ligos, spustelėkite čia, kad gautumėte mėginį

1|ĮVADAS

Sergamumas lėtinėmisinkstasliga(CKD) didėja visame pasaulyje, senstant visuomenėms (Tonelli ir Riella, 2014). LIL progresavimas yra negrįžtamas, kai inkstų pažeidimas pasiekia tam tikrą laipsnį ir galiausiai baigiasi galutinės stadijos inkstų liga (NSL), nepaisant pagrindinės ligos. Šis rezultatas rodo, kad egzistuoja „galutinis bendras kelias“. Remiantis ankstesnėmis patologinėmis analizėmis, inkstų funkcijos sumažėjimas labiau koreliuoja su tubulointersticiniu pažeidimu nei su glomerulų pažeidimu. Buvo keletas pranešimų, įrodančių, kad inkstų fibrozė sukelia lėtinę hipoksiją tubulointerstitium, o ši tubulointersticinė hipoksija apsunkina CKD ir sukelia ESRD. Šie įrodymai rodo, kad tubulointersticinė hipoksija atlieka galutinį bendrą CKD kelią (Mimura ir Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Theinkstasyra labai jautrus hipoksijai dėl didelio deguonies poreikio ir deguonies šunto tarp intrarenalinių arterijų ir venų (Nangaku, 2006; Welch ir kt., 2001; Zhang ir kt., 2014). Todėl manome, kad labai svarbu ištirti hipoksiją ir atsaką į hipoksiją inkstų kanalėlių interstite.

Pirminis biologinis atsakas į hipoksiją gyvuose organizmuose atsiranda per hipoksijos sukeliamo faktoriaus (HIF) kelią (Hypoxia, 2011; Semenza ir Wang, 1992; Zhou ir kt., 2003). HIF susideda iš - ir -subvienetų. Nors -subvienetas yra konstituciškai aktyvus, -subvienetas degraduoja esant deguoniui. Normoksinėmis sąlygomis HIF- hidroksilina prolilhidroksilazės domenas (Ph.D.), todėl jį atpažįsta von Hippel-Lindau naviko slopintuvas (VHL). Šis atpažinimas sukelia ubikvitinaciją ir hidroksilinto HIF-skilimą proteasomoje. Hipoksinėmis sąlygomis HIF kaupiasi citozolyje, nes nehidroksilintas HIF išvengia degradacijos. Sukauptas HIF- perkeliamas iš citozolio į branduolį, kur dimerizuojasi su HIF- ir veikia kaip transkripcijos faktorius, skatinantis pasroviui esančių genų ekspresiją. Yra žinoma, kad iš trijų nustatytų HIF subvienetų izoformų – HIF-1, HIF-2 ir HIF-3 – inkstų kanalėlių epitelio ląstelės ekspresuoja HIF-1 (Tanaka ir kt. ., 2016). Ankstesni tyrimai parodė laikiną arba regioninį HIF kaupimąsiinkstassu CKD (Goldfarb ir kt., 2006; Yu ir kt., 2012), o šis HIF aktyvuojamas sumažėjus deguonies įtampai CKD aplinkoje. Netinkamą prisitaikymą prie hipoksijos sergant CKD gali sukelti veiksniai, slopinantys HIF kelius (Asai ir kt., 2016; Tanaka ir kt., 2013; Thangarajah ir kt., 2009). Buvo pranešta apie apsauginį HIF aktyvacijos poveikį keliuose gyvūnų modeliuose, įskaitant streptozotocino sukeltas diabetines žiurkes ir 5/6 nefrektomijos žiurkes (Deng ir kt., 2010; Nordquist ir kt., 2015). Ph.D. inhibitoriai neseniai patraukė dėmesį kaip nauji terapiniai metodai inkstų anemijai gydyti pacientams, sergantiems CKD (Akizawa ir kt., 2019; Chen ir kt., 2017, 2019; Coyne ir kt., 2017; Miyata ir kt., 2011; Pergola ir kt. ., 2016; Provenzano ir kt., 2016). Tačiau išsami informacija apie inkstų hipoksijos progresavimą ir tai, kaip HIF kaupiasiinkstassu CKD, lieka neaiškios. Nuo deguonies priklausomas HIF hidroksilinimas vyksta citozolyje, todėl svarbu išmatuoti tarpląstelinę ir tarpląstelinę deguonies įtampą. Deguonies įtampai matuoti naudojami keli metodai, įskaitant mikroelektrodų naudojimą arba nuo kraujo deguonies lygio priklausomą magnetinio rezonanso tomografiją (BOLD-MRI). Kiekybiniam viduląstelinio deguonies būsenos matavimui naudojome fosforescencinę viso gyvenimo trukmės vaizdo mikroskopiją (PLIM) (Hirakawa ir kt., 2017; Yoshihara ir kt., 2015). BTPDM1 yra fosforescuojantys dažai, kurių pagrindą sudaro iridžio (III) kompleksas BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoatas-piridinas, aac=acetilacetonas) su katijonine dimetilamino grupe, kuri yra pasyviai. pasiskirstęs tarpląstelinėse lizosomose. Jis buvo susintetintas kaip naujausias fosfozondas, skirtas išmatuoti deguonies slėgį ląstelėje (Yoshihara ir kt., 2015). PLIM su BTPDM1 leido gauti didelės skiriamosios gebos vaizdus apie dalinį deguonies slėgį inkstų kanalėlių ląstelėse normalių pelių inkstų paviršiuje, pateikiant duomenis, rodančius deguonies gradiento buvimą net ir normaliuose inkstuose (Hirakawa ir kt., 2018). ).

Gyvuose organuose yra deguonies gradientai, įskaitantinkstus, net ir normaliomis sąlygomis (Hirakawa ir kt., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov ir kt., 2015), todėl tokių gradientų galima tikėtis ir sergant CKD. Hipoperfuziją sukelia mikrokraujagyslių retėjimas sergant ŠKL, kai progresuojantis glomerulų pažeidimas sumažina peritubulinę kapiliarinę kraujotaką, o tai apsunkina intersticinę fibrozę. Dėl intersticinės fibrozės sutrinka deguonies difuzija ir tiekimas į kanalėlių ląsteles, dėl to retėja mikrokraujagyslės, o tai dar labiau apsunkina tubulointersticinę hipoksiją (Mimura ir Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Tačiau biologinis hipoperfuzijos poveikis lieka neaiškus, nes daugumoje tyrimų buvo tiriamas hipoksijos ir HIF-1 poveikis kultivuotoms ląstelėms homogeninės perfuzijos ir deguonies įtampos sąlygomis (Rexius-Hall ir kt., 2017). Ankstesni tyrimai parodė, kad vienasluoksnės kultivuotos ląstelės, padengtos dengiamuoju stikleliu, yra geras hipoperfuzijos modelis, kurį sukelia difuzijos barjeras auginimo terpėje. Modeliuojama hipoperfuzija yra susijusi su deguonies gradientu, nes dengiamoji plokštelė neleidžia deguoniui difuzijai iš terpės viršaus į ląsteles (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi ir Sato, 2010; Yoshihara ir kt., 2015). Viename kultivuotų ląstelių sluoksnyje, padengtame dengiamuoju stikleliu, ląstelėje deguonies įtampa krinta atstumu nuo dengiamojo stiklelio krašto dėl ribotos deguonies difuzijos į kultivuojamas ląsteles. Dėl to nuo dengiamojo stiklelio krašto iki centro susidaro deguonies gradientas, o ląstelėje deguonies įtampa gali nukristi iki anoksinio diapazono dengiamojo stiklelio centre (Takahashi ir Sato, 2010; Yoshihara ir kt., 2015). . Šiame tyrime daugiausia dėmesio skyrėme HIF aktyvacijai ir ištyrėme, ar yra nuo deguonies nepriklausomų HIF ekspresijos pokyčių, kai vyksta hipoperfuzija su deguonies gradientu. Kadangi inkstų kanalėliuose in vivo egzistuoja hipoperfuzija su deguonies gradientu, nuo deguonies nepriklausomo poveikio HIF ekspresijai stebėjimas dengiamojo stiklelio modelyje gali suteikti informacijos apie mechanizmą, kuriuo grindžiamas nepakankamas HIF kaupimasis sergant CKD.

cistanche ekstraktasinkstams

2|MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1|Ląstelių kultūros

Kultivuojamos ląstelės buvo inkubuojamos drėgname inkubatoriuje su 5 procentais CO2. Hipoksinis inkubavimas buvo atliktas asmeniniame CO2 / kelių dujų inkubatoriuje APM-30D (Astec). Anoksija buvo sukelta anoksijos maišeliu, AnaeroPack ir anaerobinio auginimo rinkiniais #A-13 („Mitsubishi Gas Chemical“).

HK-2 ląstelės (Homo sapiens, žmogausinkstas, patinas, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), įamžinta proksimalinė kanalėlių epitelio ląstelių linija iš normalaus suaugusio žmogaus inksto, buvo kultivuojama Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje ir maistinių medžiagų mišinyje F{{2} } Kumpis (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich), kuriame yra 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) ir penicilino-streptomicino tirpalo (15070063, Thermo Fisher Scientific) 10 cm auginimo lėkštelėje. Kad būtų galima perkelti, HK-2 ląstelės buvo atskirtos su tripsinu (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ir centrifuguojamos 300 g 5 min.

HeLa gimdos kaklelio vėžio ląstelės ir žmogaus embrionasinkstasląstelės 293 (HEK293) buvo kultivuojamos DMEM su mažu (1000 mg/l) gliukozės kiekiu (D6046, Sigma Aldrich), turinčiu 5 procentus FBS, 10 cm auginimo lėkštelėje. Šios ląstelės buvo pasuotos kaip HK-2 ląstelės.

Inkstų proksimalinių kanalėlių epitelio ląstelės (RPTEC) (CC- 2553, Cambrex) buvo palaikomos naudojant RenaLifeTM Comp rinkinius (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Perėjimui RPTEC buvo atskirti naudojant tripsiną, neutralizuoti tripsino neutralizuojančiu tirpalu (CC-5002, Lonza Ltd.) ir centrifuguoti esant 200 g 5 min.

2.2|Hipoperfuzijos modelio sukūrimas dengiamuoju stikleliu

Apvalios formos 15 mm skersmens dengiamosios plokštelės (C015001, Matsunami) prieš naudojimą buvo nuvalytos ultragarsu ir laikomos 99,5 procento etanolyje. Buvo naudojami du metodai, pagrįsti ląstelių stebėjimu už dengiamojo stiklelio.

Vienasluoksnės kultivuotos ląstelės buvo įterptos tarp dangtelio ir indo dugno (S1a, b pav.) arba alternatyvus metodas (S1c paveikslas), kaip aprašyta toliau. Tradicinis arba alternatyvus metodas buvo pasirinktas siekiant sukurti mūsų tiesioginio vaizdo dangtelio modelį, nesvarbu, ar tai būtų deguonies, ar PH vaizdavimas. Imunocitochemijai (ICC) buvo pasirinktas alternatyvus metodas, nes naudojant tradicinį metodą, dauguma ląstelių dažnai atsiskyrė nuo lėkštelės dugno pašalinant dangtelį ląstelėms fiksuoti (S2a pav.).

2.2.1|Tradicinis metodas

1 dieną ląstelės buvo dedamos ant 27 mm stiklinio lėkštelės (3910-035, Iwaki) dugno 100 procentų * santakoje (maždaug 5,0 × 105 vienam indui). Jie buvo auginami DMEM/F12, kuriame yra 10 procentų FBS be antibiotikų tirpalo per naktį. 2 dieną ant kultivuotų ląstelių nurodytam laikotarpiui buvo uždėtas dangtelis (S1b pav.).

2.2.2|Alternatyvus metodas

Ląstelės buvo pasėtos ant dengiamojo stiklelio į 35 mm kultūros lėkštelę 100 procentų santakoje (maždaug 5,0 × 105 / lėkštelė) dieną.

1. Jie buvo auginami DMEM/F12, kuriame yra 10 procentų FBS be antibiotikų tirpalo per naktį. 2 dieną dangtelis buvo apverstas, kad jo ląstelių paviršius būtų pritvirtintas prie naujo 27 mm stiklinio indo dugno tam tikrą laikotarpį (S1c pav.).

Taip pat sukūrėme dengiamojo stiklo modelį naudodami apvalios formos 10 mm skersmens dengiamųjų stiklelių (CS01005, Matsunami) (S2b pav.).

2.3|Gyvo deguonies vaizdavimas naudojant BTPDM1

Kultivuojamos ląstelės buvo paruoštos 1 dieną, kaip aprašyta aukščiau. 2 dieną ląstelės buvo du kartus praplaunamos Hanks'o subalansuotu druskos tirpalu (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) ir inkubuojamos su 500 nM BTPDM1, iridžio katijoniniu lipofiliniu dažikliu, naudojamu kaip intracelulinis fosforescuojantis zondas (Yoshihara ir kt., . 2015), DMEM/F12 be fenolio raudonojo (21041-025, Thermo Fisher Scientific) 30 min. Po to, kai ląstelės buvo du kartus plaunamos HBSS, jos buvo įterptos tarp dangtelio ir indo dugno, kaip aprašyta aukščiau. Fosforescencijos iš BTPDM1 intensyvumas kultivuotose ląstelėse, padengtose dengiamuoju stikleliu, buvo stebimas naudojant sužadinimo ir emisijos filtrą, o BTPDM1 fosforescencija (Hirakawa ir kt., 2015) buvo aptikta naudojant fluorescencinį mikroskopą BZ-X710 (Keyence Corporation). Vaizdai, gauti iš apversto fluorescencinio mikroskopo, buvo pakoreguoti pagal ryškumą ir kontrastą naudojant BZ-X analizės programinę įrangą.

2.4|Imunocitochemija

Ant dengiamojo stiklelio esančios ląstelės buvo kultivuojamos su 200 µM pimonidazolo HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) DMEM/F12 be fenolio raudonojo 1 val., po to dengiantis stiklelis buvo apverstas ir pritvirtintas prie dengiamojo stiklinio indo, kaip aprašyta anksčiau. Tada ląstelės buvo kultivuojamos DMEM/F12 be fenolio raudonojo tam tikrą laikotarpį. Kai nebuvo naudojamas priešdažymas pimonidazolu, išankstinis apdorojimas pimonidazolu buvo praleistas.

Pasibaigus auginimo laikotarpiui, kiekvienas dangtelis buvo surinktas ir ląstelės nedelsiant fiksuojamos metanoliu / acetonu (1: 1) ant ledo, kur jos liko 30 min. Du kartus nuplovus Dulbecco fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) (D5652, Sigma Aldrich), ląstelės membrana buvo pralaidinama 30 min., inkubuojama su 5 procentų galvijų serumo albuminu (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) 30 min. su baltymų bloku be serumo (X0909, DAKO) 10 min. Ląstelės buvo nudažytos pirmuoju antikūnu, o vėliau - antruoju, fluorescenciniu antikūnu. Pirmųjų antikūnų sąrašas pateiktas S1 lentelėje. FITC kiaulių polikloninis anti-triušio imunoglobulinas (F0205, 1:20 praskiedimas, DAKO) buvo naudojamas kaip pirmasis antikūnas, jei šeimininkas buvo triušis. Fluorescencinis antikūnas Alexa Fluor 594 streptavidinas (S11227, praskiedimas 1:500, Thermo Fisher Scientific) buvo naudojamas kaip pirmasis antikūnas, jei šeimininkas buvo pelė, po to buvo panaudotas biotinilintas antipelės IgG (H plius L) (BA{{23} }, 1:1000 praskiedimas, Vector Laboratories), kaip antrasis antikūnas. Branduolinis dažymas buvo atliktas naudojant bisBenzimide H 33342 trihidrochloridą (B2261, Sigma Aldrich) kiekvienam mėginiui.

Fluorescenciniai signalai buvo stebimi naudojant apverstą fluorescencinį mikroskopą BZ-X710 (Keyence Corporation) su šiais filtrais: Texas Red, kurio sužadinimo bangos ilgis (Ex) 560/40 nm, emisijos bangos ilgis (Em) 630/75 nm, GFP ( Pvz.: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) ir DAPI (pvz., 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Vaizdai buvo pakoreguoti pagal ryškumą ir kontrastą naudojant BZ-X analizės programinę įrangą.

2,5|HK-2 ląstelių, apdorotų kobalto chloridu, HIF ICC

Alternatyvus metodas buvo modifikuotas, kad būtų sukurtas HK-2 ląstelių, apdorotų kobalto chloridu, dengiamojo stiklo modelis. HK-2 ląstelės buvo pasėtos pusiau susiliejančiu tankiu (2,5 × 105 / lėkštelė) ant dengiamojo stiklelio 1 dieną ir 16 valandų apdorotos 300 µM kobalto chlorido heksahidratu (C 8661, Sigma Aldrich). 2 diena. 3 dieną dangtelis buvo apverstas, kad ląstelių paviršiai būtų pritvirtinti prie naujos 27 mm stiklinės lėkštelės dugno 3 valandoms, ir buvo atliktas HIF ICC.

2.6|Western blotingas

Norint ištirti HIF{{0}} kaupimąsi esant skirtingam deguonies įtempimui ir skirtingam pH lygiui, 1.0 × 106 HK-2 ląstelės 10 cm auginimo lėkštelėje buvo inkubuojami 5 valandas normoksijoje, 2 procentų deguonies, 1 procento deguonies arba anoksijos sąlygomis, arba DMEM/F12 esant pH 7,4, pH 6,0 arba pH 5,0 5 valandas.

Šios ląstelės buvo lizuojamos RIPA buferyje, kuriame yra 50 mM Tris-buferio (pH 8.{5}}), 150 mM NaCl, 0,5 m/t proc. natrio deoksicholatas, 0,1 m/t proc. SDS ir 1,0 m/t proc. NP40.

Western blotting, SDS mėginio buferis, kuriame yra {{0}},35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 % SDS, 36 % glicerolio, 0,012 % bromfenolio mėlynojo ir 0,1 M ditiotreitolio. (DTT) buvo pridėta prie baltymų. Baltymai, turintys SDS mėginio buferio, buvo eliuuojami verdant 95 laipsnių temperatūroje 5 min.

Baltymai buvo atskirti elektroforezės būdu ant 10 procentų SDS poliakrilamido gelių. Tada baltymai buvo perkelti ant AmershamTM HybondTM PVDF membranos (10600023, GE Healthcare) perkėlimo buferyje (48 mM Tris bazės buferis, 39 mM glicinas, 0,04 proc. SDS ir 20 tūrio proc. metanolio), naudojant Trans-Blot®. TurboTM perdavimo sistema (Bio-Rad). Membranos buvo inkubuojamos kambario temperatūroje su pirminiais antikūnais, anti-HIF1 antikūnais (NB100-134, skiedimas 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) ir antikūnu prieš aktiną (A2066). , skiedimas 1:2000, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), o vėliau antriniame antikūne – polikloninis ožkos anti-triušio imunoglobulinas/HRP (P0448, skiedimas 1:10000, DAKO, RRID: AB{26) }}). Aptikimui buvo naudojamas PierceTM ECL Plus Western Blotting substratas (32132, ThermoFisher Scientific). Chemiliuminescencija buvo stebima naudojant Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Atkuriamumas buvo patvirtintas atlikus bent tris nepriklausomus eksperimentus. Juostų intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant Nacionalinio sveikatos instituto ImageJ programinę įrangą (Schneider ir kt., 2012).

2.7|Liuciferazės reporterio tyrimas

Buvo atliktas luciferazės reporterio tyrimas, siekiant išmatuoti HIF1 kaupimąsi homogeninės hipoksinės kultūros inkubacijoje. Anksčiau sukūrėme pažymėtą luciferazės geną, kurį varo į hipoksiją reaguojantis elementas (HRE), ir sukūrėme į hipoksiją reaguojantį reporterio vektorių (Transgeno konstrukcija). Tai buvo sukurta iš tandeminių HRE kopijų iš žiurkės kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus geno, subklonuoto į am CMV promotoriaus-luciferazės transkripcijos vieneto 5' sritį (prieš Luc) (Chiang ir kt., 2011; Tanaka ir kt. al., 2004).

HK{{0}} ląstelės, kurių koncentracija 1,0 × 105 duobutėje, buvo paruoštos 12-šulinėlių auginimo plokštelėse (150628, Thermo Fisher Scientific). Ląstelės buvo transfekuotos kartu su 500 ng pGL{8}}Basic HRE-luciferazės vektorių ir 30 ng pRL-SV40 Renilla luciferazės kontrolinių vektorių (Promega), naudojant 2 µl FuGENE® HD transfekcijos reagento (E2311, Promega). gerai. HK-2 ląstelės, transfekuotos kartu su 500 ng ofpGL3-pagrindinių ugniagesių luciferazės vektorių ir 30 ng ofpRL-SV40 Renilla luciferazės kontrolinių vektorių (Promega), buvo naudojamos kaip neigiama kontrolė.

Transfekuotos ląstelės buvo inkubuojamos esant normoksijai, 2 procentų hipoksijai, 1 procento hipoksijai arba anoksijos maišelyje 5 valandas. Tada ląstelės buvo paimtos naudojant 100 µl pasyvaus baltymų lizės buferio dvigubos luciferazės tyrimui. Matavimams buvo naudojamas luminometras LB9507 (EG ir Berthold). Siekiant pakoreguoti transfekcijos efektyvumą, santykinė ugniagesių luciferazės šviesos vieneto vertė buvo padalinta iš Renilla luciferazės vertės.

cistanche red

2,8|Apoptozės analizė

Kultivuojamos ląstelės buvo uždengtos dengiamuoju stikleliu 0 min., 15 min., 30 min., 1 val., 3 val., 6 val. ir 24 val., o po to surinktos naudojant tripsiną. Ląstelės, apdorotos 3 procentų vandenilio peroksidu (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 30 min., buvo paruoštos kaip apoptotinė kontrolė. Kiekybinė apoptozės analizė buvo atlikta naudojant Muse Annexin V ir Dead Cell Kits (MCH100105, Millipore) Muse™ ląstelių analizatoriuje (Millipore), pagal gamintojo instrukcijas.

2,9|Kiekybinė realaus laiko PGR (qRT-PGR)

Bendra RNR ekstrakcija ir cDNR sintezė buvo atliekamos pagal gamintojo instrukcijas atitinkamai RNAiso Plus (9109, Takara) ir PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara). Realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) CFX Connect Real-Time PGR aptikimo sistemoje (Bio-Rad). Nuorašo lygiai buvo normalizuoti iki aktino mRNR ekspresijos lygio. qRT-PCR buvo atlikta trimis egzemplioriais, naudojant genų specifinius pradmenis. HIF-1 buvo sustiprintas naudojant priekinius, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ ir atvirkštinius 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′ pradmenis. -aktinas buvo amplifikuotas naudojant priekinius, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′ ir atvirkštinius 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′ pradmenis.

2.10|Transfekcija su siRNR

Norint ištirti RNRi sukeltą HIF-1 numušimą HK-2 ląstelėse, šešių šulinėlių plokštelėse buvo paruoštos 50 × 104 HK-2 ląstelės vienoje duobutėje. Su Lipofectamine RNAiMAX buvo naudojamos dviejų rūšių RNRi – HIF-1 siRNR (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] ir siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) Transfekcijos reagentas (Thermo Fisher Scientific). Kaip neigiama kontrolė buvo naudojama Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); Sumaišyta po 1,5 µl kiekvienos siRNR ir 5 µl RNAiMAX. siRNR transfekuotos ląstelės buvo inkubuojamos normaliomis arba hipoksinėmis (1 proc. O2) sąlygomis 48 valandas ir RNR buvo ekstrahuota. HIF-1 numušimo efektyvumas buvo ištirtas naudojant qRT-PCR.

2.11|Tiesioginis PH gradiento poveikio vaizdas

Mes vizualizavome gyvų ląstelių tarpląstelinį pH gradientą po dengiamuoju stikleliu. Ląstelės buvo apdorotos pHrodo Green AM intraceluliniu pH indikatoriumi (p35373, ThermoFisher Scientific) pagal gamintojo instrukcijas, prieš įdiegiant dengiamojo stiklelio modelį. Apverstas fluorescencinis mikroskopas BZ-X710 (Keyence Corporation) su GFP filtru buvo naudojamas stebėti fluorescencijos intensyvumo gradiento laiko pokytį po dengiamuoju stikleliu.

2.12|Kiekybinė HIF žiedo analizė

2.12.1|HIF žiedo vieta

Mes išmatavome HIF žiedų ir pimonidazolo teigiamų sričių atstumą nuo dengiamojo stiklelio kraštų naudodami ImageJ, kaip nurodyta toliau. Nustatyti HIF žiedo ir pimonidazolo teigiamo apskritimo išorinių ir vidinių apskritimų plotai, apskaičiuotas kiekvieno apskritimo spindulys. Kiekviena vertė buvo atimta iš 7,5 mm, kuris yra 15 mm dengiamojo stiklelio spindulys, siekiant apskaičiuoti atstumą nuo dengiamojo stiklelio krašto. Buvo atlikti trys nepriklausomi HIF ICC eksperimentai kiekvienoje būsenoje.

2.12.2|HIF žiedo apibrėžimas

Naudojome fluorescencinius vaizdus, ​​gautus iš dengiamojo stiklelio modelio, inkubuoto esant normoksijai ir neutraliam pH. HIF žiedo vietą ir jo išorę bei vidų apibrėžėme kaip 2,5–3.0 skalė (0.22–0.45 mm), 0.5 –1.{11}} skalė (1,12–1,35 mm) ir 5.{17}}–5,5 (2,24–2,47 mm) nuo dengiamojo stiklelio krašto, naudojant „ImageJ“. Viename mėginyje išmatavome penkias HIF{24}} signalų vietas ir apskaičiavome vidurkį. Buvo atlikti trys nepriklausomi HIF ICC eksperimentai.

cistanche ekstrakto milteliai

2.13|Deguonies slėgio matavimas PLIM vaizdu

2.13.1|Kalibravimo linijos deguonies slėgiui matuoti statyba

Remiantis ankstesnėje ataskaitoje aprašytu metodu (Yoshihara ir kt., 2015), buvo sudaryta HK-2 ląstelių kalibravimo kreivė. HK-2 ląstelės, pakrautos 500 nM BTPDM1 30 min., buvo kultivuojamos keičiamo deguonies koncentracijos kelių dujų inkubatoriuje su apverstu fluorescenciniu mikroskopu, kuris buvo prijungtas prie gyvavimo trukmės matavimo sistemos. Kalibravimo linija, pagrįsta Stern-Volmer analizėmis, buvo sukurta naudojant HK-2 ląstelių fosforescencijos trukmę (PL) esant kelioms skirtingoms deguonies įtempimams, naudojant

1 lygtis

kur τp reiškia PL esantį pO2, τ0 reiškia PL deguonies pašalinimo metu, kq reiškia gesinimo greičio konstantą, o pO2 reiškia dalinį deguonies slėgį. Naudojant šią kalibravimo liniją, deguonies slėgį galima apskaičiuoti pagal PL.

2.13.2|PLIM dengiamojo stiklelio modelio vaizdas

Buvo paruoštos HK-2 ląstelės, įdėtos 500 nM BTPDM1 30 min. Dengiamasis stiklelio modelis buvo sukonstruotas ir kultivuojamas keičiamo O2 koncentracijos kelių dujų inkubatoriuje su apverstu fluorescenciniu mikroskopu, prijungtu prie eksploatavimo trukmės matavimo sistemos.

Fosforescencinės gyvavimo trukmės vaizdo mikroskopijos (PLIM) vaizdai buvo įrašyti naudojant apverstą fluorescencinį mikroskopą su konfokaline skenavimo sistema (Hirakawa ir kt., 2018). PLIM vaizdai buvo gauti po 30 minučių inkubacijos 21% O2 arba 4% O2. Siekiant nustatyti vidutinį PL, atsižvelgiant į dengiamojo stiklelio PL skirtumus, buvo paimti keturi PLIM vaizdai kiekvienam mėginiui iš viršutinio, apatinio, kairiojo ir dešiniojo regionų, esančių šalia dengiamojo stiklelio krašto.

2.13.3|HIF žiedo identifikavimas PLIM vaizde

Pimonidazolas buvo teigiamas žemiau 10 mmHg deguonies slėgio. Pagal kalibravimo liniją 10 mmHg deguonies slėgio PL ekvivalentas buvo 4034,6 ns, todėl buvo galima nustatyti išorinę pimonidazolo apskritimo liniją PLIM vaizde. Vėliau išorinių ir vidinių HIF žiedų vietas PLIM vaizde buvo galima rasti naudojant kiekybinę atstumo analizę. Išmatavome vidutinių PL diapazoną, atitinkantį HIF žiedą, esant 21 proc. O2 ir 4 proc. O2.

2.13.4|HIF žiedo deguonies slėgio matavimas

Mes apskaičiavome HIF žiedo deguonies slėgio diapazoną iš PL, naudodami kalibravimo liniją. PLIM vaizdai buvo analizuojami naudojant SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|Statistinė analizė

Bandomųjų ir kontrolinių grupių palyginimui buvo naudojamas Dunnett testas, o reikšmės < 0,05="" buvo="" laikomos="" statistiškai="" reikšmingomis="" skirtumais.="" trims="" ar="" daugiau="" grupių="" palyginimui="" buvo="" naudojami="" stjudento="" t="" testai="" ir="" pritaikyta="" bonferroni="" pakoreguota="" p="" vertė.="" visos="" statistinės="" analizės="" buvo="" atliktos="" naudojant="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" daroma="" prielaida,="" kad="" vertės="" buvo="" gautos="" iš="" normaliai="" pasiskirstančios="" populiacijos="" ir="" parodytos="" kaip="" vidurkis="" ±="" standartinis="" nuokrypis="">

kas yra cistanche

3|REZULTATAI

3.1|Deguonies gradiento susidarymas hipoperfuzijos modelyje

Mes patvirtinome deguonies gradiento buvimą hipoperfuzijos modelyje, kurį sukelia dangtelio uždėjimas, tiesiogiai įvertindami deguonies įtampą, naudodami fosforescenciją. Fosforescencijos intensyvumo matavimas gali numatyti apytikslę deguonies slėgio tendenciją (Hirakawa ir kt., 2015; Yoshihara ir kt., 2015). Stebėjome HK-2 ląstelių, apdorotų BTPDM1, dengiamojo stiklelio modelio fosforescencijos intensyvumą. Fosforescencijos intensyvumo vaizdai parodė hipoksiją daugumoje dengiamojo stiklelio viduje, bet hipoksijos šalia krašto nebuvo. Šis stebėjimas rodo, kad HK-2 ląstelėse, padengtose dangteliu, aplink dengiamojo stiklelio kraštą yra deguonies gradientas. dengiamąjį stiklelį (1a pav.). Kadangi fosforescencijos intensyvumas priklauso nuo zondo koncentracijos ir sužadinimo laiko, fosforescencijos trukmės (PL) matavimas yra naudingas kiekybinei deguonies slėgio analizei (Yoshihara ir kt., 2015). Taigi, norėdami kiekybiškai išmatuoti kultivuotų ląstelių deguonies įtampą aplink dengiamojo stiklelio kraštą, gavome HK-2 ląstelių PLIM vaizdus, ​​padengtus dengiamuoju stikleliu 30 minučių (1b pav.). PL pailgėjo didėjant atstumui nuo dengiamojo stiklelio krašto. Patvirtinome, kad deguonies įtempimas, apskaičiuotas naudojant kalibravimo liniją (S3 pav.), sumažėjo, kai atstumas nuo dengiamojo stiklelio krašto didėja, o tai rodo, kad aplink dangtelio kraštą yra deguonies gradientas (1c pav.). Fosforescencijos intensyvumo laikinojo profilio tyrimas parodė, kad deguonies gradientas pradėjo formuotis praėjus 10 minučių po dengiamojo stiklelio uždėjimo

(1d pav.).

3.2|Unikalus HIF-1 pasiskirstymas hipoperfuzijos modelyje "HIF žiedas"

Mes ištyrėme HIF{0}} pasiskirstymą hipoperfuzijos modelyje su deguonies gradientu. HIF-1 ICC HK-2 ląstelėse parodė spurgos formos patobulinimą pimonidazolo teigiamos srities krašte, kurį pavadinome „HIF žiedu“ (2a pav.). HIF-1 signalo intensyvumas HIF žiede buvo žymiai didesnis nei jo vidinėje ar išorinėje srityje (2b pav.). Šis reiškinys buvo patvirtintas naudojant ICC su kitu HIF-1 antikūnu (S4a pav.) arba kitomis kanalėlių ląstelių linijomis (S4b,c pav.). Taip pat atlikome HIF{11}} ICC analizę kitų rūšių kultivuojamose ląstelėse, pvz., HeLa gimdos kaklelio vėžio ląstelėse. Nors dėl silpno šių ląstelių sukibimo su dengiamuoju stikleliu buvo sunku detaliai įvertinti HIF-1 pasiskirstymą, mes pastebėjome spurgos formos HIF-1 padidėjimą HeLa ląstelėse (S4d pav.).

HIF žiedas ir pimonidazolo teigiama sritis pradėjo formuotis praėjus kelioms valandoms po dengiamojo stiklelio uždėjimo, o HIF žiedas atrodė statiškas po 3 valandų (2c pav.). Dėl HIF-1 numušimo dingo signalas HIF-1, įskaitant HIF žiedą (2d pav., S4e pav.), o tai rodo, kad HIF žiedas priklausė nuo HIF-1.

Norėdami ištirti galimybę, kad HIF žiedo susidarymas priklauso nuo deguonies, ištyrėme HIF-1 pasiskirstymą dengiamojo stiklelio modelyje, inkubuojant su skirtinga deguonies įtampa. Padarę dengiamojo stiklelio modelį, iš karto įdėjome indą į hipoksines kameras su skirtinga deguonies įtampa. Hipoksinio inkubavimo metu pastebėjome, kad tiek HIF žiedas, tiek pimonidazolo teigiama sritis išsiplėtė į išorę (3a pav.). Mes išmatavome kiekvieno HIF žiedo ir pimonidazolo teigiamos srities atstumą nuo dengiamojo stiklelio krašto esant normoksijai, 4 procentai O2 ir 1 procentas O2 inkubacijos. Tiek HIF žiedas, tiek pimonidazolo teigiama sritis išsiplėtė į išorę, kai sumažėjo aplinkinė deguonies įtampa (3b pav.). Šie rezultatai parodė, kad HIF žiedas priklausė nuo HIF{10}} ir deguonies įtampos.

Siekdami patvirtinti, kad spurgos formos kaupimasis yra specifinis HIF reiškinys, dengiamojo stiklo modelyje atlikome ICC su namų tvarkymo genais. GAPDH ir aktino signalai buvo palaikomi visame dengiamojo stiklelio plote ir buvo palyginami tarp HIF žiedo regiono ir kitų regionų (S5a, b pav.).

3.3|HIF žiedo deguonies slėgio diapazono matavimas

Patvirtinome žiedo formos HIF-1 kaupimosi kultūrinėse ląstelėse, padengtose dengiamuoju stikleliu, padidėjimą – reiškinį, priklausantį nuo deguonies įtampos. Norėdami nustatyti deguonies įtempimo diapazoną, išanalizavome HIF žiedo deguonies slėgį, naudodami fosforescencijos naudojimo trukmę. Gavome dengiamojo stiklelio modelio PLIM vaizdus po 30 min. inkubacijos 21 proc. O2 arba 4 proc. O2 (4a pav.). HIF žiedas susidarė ant pimonidazolo apskritimo krašto HIF ICC (3b pav.). Mes nustatėme vietą PLIM vaizde, kuri buvo lygiavertė pimonidazolo teigiamai sričiai HIF ICC, ir vėliau nustatėme vietą, atitinkančią HIF žiedą (4b pav.), naudodamiesi kiekybine atstumo duomenų nuo HIF žiedo ir pimonidazolo teigiama sritis (3b pav.). Taip pat išmatavome HIF žiedo PL diapazoną ir tada panaudojome kalibravimo liniją (S3 pav.), kad apskaičiuotume HIF žiedo deguonies slėgį 21 proc. O2 (4,20 [3,46–4,97] ~ 35,9 [28,5–44,9] mmHg). , ir 4 procentai O2 (2,19 [0,21–4,32] ~20,4 [17,1–24,1] mmHg) (4c pav.).

3.4|HIF-1 kaupimasis esant homogeninei deguonies įtampai

Nors silpni HIF-1 signalai už HIF žiedo dengiamojo stiklelio modelio gali būti priskirti nepakankamai hipoksijai, o žiedo viduje esantys HIF-1 signalai turėjo būti stipresni dėl mažesnės deguonies įtampos. valdomas nuo deguonies nepriklausomo reiškinio. Norėdami ištirti reiškinius, sukeliančius maksimalaus HIF-1 kaupimosi nebuvimą anoksinėje srityje, atsirandančius tik hipoperfuzijos modelyje, ištyrėme, ar yra atvirkštinis ryšys tarp deguonies įtampos ir HIF-1 kaupimosi inkubuojant. su homogenine deguonies įtampa. Ląstelių lizatų Western blot analizė esant skirtingam vienalyčiam deguonies įtempimui parodė, kad inkubacijos be oksidacijos metu padidėja HIF-1 kaupimasis (5a pav.). HRE-luciferazės reporterio tyrimas taip pat parodė, kad HIF-1 kaupimasis padidėjo esant mažesnei deguonies įtampai, esant homogeninei deguonies įtampai (5b pav.). Šie rezultatai parodė, kad HIF-1 kaupimasis priklausė nuo deguonies įtampos, o didžiausias kaupimasis buvo stebimas anoksiniame diapazone. Hipoperfuzijos modelio ir modelio su homogenine deguonies įtampa HIF-1 charakteristikos turėtų skirtis. Spėliojome, kad unikalų HIF-1 kaupimosi reiškinį šiame hipoperfuzijos modelyje gali lemti kitas veiksnys, o ne deguonies įtampa.

3,5|HIF žiedo susidarymas nepriklauso nuo daktaro laipsnio

Ištyrėme, ar HIF{0}} degradacija, galimas HIF žiedo susidarymo mechanizmas, buvo reguliuojamas HIF žiede. Ši idėja atrodė neteisinga, nes hidroksilinant daktaro laipsnį, HIF skaidymo greitį ribojančiam procesui, kaip substratas reikalingas deguonis. Kobalto chloridas plačiai naudojamas kaip cheminis HIF stabilizatorius. Sukūrėme kobalto chloridu apdorotų HK-2 ląstelių dengiamojo stiklo modelį ir atlikome HIF ICC analizę. HIF-1 signalas nepadidėjo HIF žiedo viduje, o tai tapo neaišku dėl padidėjusio HIF-1 signalo už žiedo ribų (6c pav.). HK-2 ląstelių ICC su numušimu PHD2, kuri, kaip manoma, yra pagrindinė HIF prolilhidroksilazė ląstelių kultūros eksperimentuose (Strowitzki ir kt., 2019), davė panašius rezultatus (S6 pav.). Šie rezultatai parodė, kad HIF skilimo PHD-VHL ašis nebuvo susijusi su HIF žiedo susidarymu.

3.6|pH įtaka HIF-1 kaupimuisi

Ankstesnėje ataskaitoje buvo aprašytas širdies miocitų, kurių pH sumažėjo dengiamojo stiklelio viduje, dengiamojo stiklelio modelio naudojimas (Pitts & Toombs, 2004). Ištyrėme pH po dengiamuoju stikleliu ir jo įtaką HIF žiedo susidarymui. HK-2 ląsteles apdorojome viduląsteliniu pH indikatoriumi, kurio fluorescencijos intensyvumas leidžia įvertinti pH ląstelėse. Tiesioginis vaizdas parodė, kad pH sumažėjo daugumoje vidinio ploto, bet ne šalia dangtelio krašto, o tai rodo, kad dengiamojo stiklelio modelyje yra pH gradientas aplink kraštą (6a pav.). Kiekybinė koreliacijos tarp fluorescencijos intensyvumo ir atstumo nuo dengiamojo stiklelio krašto analizė parodė, kad didėjant atstumui pirmasis buvo padidėjęs, o tai patvirtino pH ir deguonies gradientų egzistavimą aplink dengiamojo stiklelio kraštą (6b pav.). Western blot analizės ląstelių lizatai esant homogeninei deguonies koncentracijai nustatė, kad inkubacija su pH 5,0 terpe slopina HIF-1 kaupimąsi hipoksinėmis sąlygomis (S7a–d pav.). Taip pat patvirtinome, kad HIF-1 kaupimasis esant hipoksijai skirtingomis pH sąlygomis sumažėjo žemiau pH 6,0 (S8a–c pav.).

Vienoje ataskaitoje buvo pabrėžta švelniai rūgščių sąlygų svarba, kai pH yra apie 6.0. Remiantis šiuo tyrimu, reoksigenacija po hipoksijos parūgštino terpę, o tai sukėlė VHL nukleolinę sekvestraciją. Savo ruožtu HIF degradacijai buvo užkirstas kelias C2C12 miotubuose, PC12 neuronuose ir 786-0 inkstų vėžio ląstelėse (Mekhail ir kt., 2004). Mūsų tyrime nepakito VHL pasiskirstymas kanalėlių ląstelėse tarp regionų, kuriuose kaupiasi HIF{7}}, ir tų, kuriuose jis buvo slopinamas, naudojant dengiamojo stiklelio modelį, kurio pH vertės nuo 5.0 iki 7,4 (S9a–c pav.). Vamzdinės ląstelės yra veikiamos įvairiomis pH sąlygomis (Burke ir kt., 1999; Pavuluri ir kt., 2019; Raghunand ir kt., 2003), todėl ištyrėme HIF žiedo kitimą skirtingo pH terpėje. reikšmės nuo 5,0 iki 8,5. HIF žiedas buvo aiškiai pastebėtas terpėje, kurios pH buvo 8,5 ir 7,4 (6c pav.). HIF žiedas taip pat egzistavo esant pH 6,5, bet buvo užmaskuotas (6c pav.). HIF-1 signalas buvo susilpnintas visame dengiamojo stiklelio plote, kai pH buvo 5,0. (6c pav.). Atlikome tolesnę kiekybinę padėties santykio tarp HIF žiedo ir pimonidazolo teigiamos srities krašto analizę (7a pav.) ir nustatėme, kad žiedo padėtis skiriasi priklausomai nuo pH. Vidinis apskritimas buvo linkęs plėstis į išorę, kai pH buvo 6,5, palyginti su pH 7,4, o išorinis apskritimas žymiai susitraukė į vidų, kai pH buvo 8,5, atsižvelgiant į pimonidazolo teigiamos srities kraštą (7b, c pav.). Mes taip pat patvirtinome, kad namų tvarkymo genų veikla buvo palaikoma dangtelio modelyje rūgštinėje inkubacijoje (S10 pav.). Todėl atrodo, kad pH vaidina svarbų vaidmenį HIF žiedo susidarymo mechanizme.

4|DISKUSIJA

Šiame tyrime nustatėme unikalų HIF-1 pasiskirstymą inkstų kanalėlių ląstelėse, naudodami hipoperfuzijos modelį, kurį sukelia dengiamojo stiklelio uždėjimas. Mes nustatėme, kad HIF žiedo susidarymą ir palaikymą reguliavo deguonies slėgis ir pH, kurie abu egzistavo gradientu dengiamojo stiklelio modelio dangtelio krašte. Remdamiesi šiais rezultatais, siūlome galimą HIF žiedo susidarymo mechanizmą, apimantį HIF-1 kaupimąsi mažėjant deguonies įtampai, o kaupimasis slopinamas dėl žemo pH tam tikru atstumu nuo dengiamojo stiklelio krašto (8 pav. ).

Hipoperfuziją sukelia mikrokraujagyslių retėjimas sergant CKD (Mimura ir Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). Ankstesniame darbe naudojome in vivo vaizdavimą, kad parodytume deguonies gradiento buvimą normalių pelių inkstų kanalėlių ląstelėse (Hirakawa ir kt., 2018). Taip pat tikimasi, kad CKD kanalėlių ląstelėse deguonies įtampa bus nevienalytė. Tačiau lieka neaišku, ar hipoperfuzija su deguonies gradientu veikia gynybos sistemą nuo hipoksijos, HIF. Šiame tyrime mes ištyrėme HIF pasiskirstymą kultivuojamose proksimalinėse kanalėlių ląstelėse pagal hipoperfuzijos modelį ir nustatėme, kad deguonies gradientas kultivuojamose inkstų kanalėlių ląstelėse buvo sėkmingai modeliuojamas naudojant apvalų stiklinį dangtelį. Eksperimentų, kuriuose naudojama homogeninė deguonies įtampa, įrodymai parodė, kad HIF-1, kurio hidroksilinimas ir vėlesnis skilimas daugiausia priklauso nuo deguonies, kaupiasi. Tai yra, HIF-1 kiekis didėja mažėjant deguonies įtampai. Tačiau mūsų dengiamojo stiklelio modelyje HIF-1 buvo nuslopintas anoksinėje srityje ir didžiausias kaupimasis tam tikru atstumu nuo dengiamojo stiklelio krašto. Šis spurgos formos HIF kaupimas dar niekada nebuvo parodytas. Mes parodėme, kad HIF žiedo formavimasis gali būti stebimas nepriklausomai nuo inkubacinės atmosferos deguonies įtampos, tačiau jo vieta priklausė nuo deguonies įtampos. Deguonies įtampos diapazonas HIF žiede buvo išmatuotas maždaug 4–20 mmHg, naudojant PLIM su BTPDM1. Daugumoje ankstesnių tyrimų, kuriuose pagrindinis dėmesys buvo skiriamas kultivuotoms ląstelėms atmosferoje su homogenine deguonies įtampa, nustatyta, kad HIF-1 baltymo kiekis padidėjo hipoksiniame arba anoksiniame diapazone (Ameri ir kt., 2002; Carrera et al. , 2014). Taigi mūsų modelyje HIF žiedo susidarymą turėjo paveikti kitas veiksnys, o ne deguonies įtampa; jis buvo nepriklausomas nuo daktaro laipsnio – greitį ribojančio HIF degradacijos proceso. Proveržis išaiškinant HIF žiedo susidarymo mechanizmą buvo mūsų atradimas apie pH gradiento ir deguonies gradiento vaidmenį dengiamųjų lūpų modelyje, kuris apribojo terpės įtekėjimą, panašią į in vivo hipoperfuziją. modelis. Šiame hipoperfuzijos modelyje intracelulinis pH sumažėjo, kai atstumas nuo dengiamojo stiklelio krašto padidėjo, o aplink dengiamojo stiklelio kraštą buvo stebimas pH gradientas. Mes parodėme, kad HIF-1 kaupimasis buvo slopinamas esant žemam pH, maždaug pH 5,0, palyginti su inkubacija maždaug neutraliame pH esant homogeninei deguonies įtampai. Išorinis HIF žiedo kraštas išsiplėtė į išorę, kai pH buvo 6,5, o vidinis HIF žiedo kraštas susitraukė į vidų, kai pH buvo 8,5, atsižvelgiant į pimonidazolo teigiamos srities kraštą. HIF žiedas buvo uždengtas rūgštinėmis sąlygomis, o HIF-1 signalas išnyko esant pH 5,0. Taigi, mes išsiaiškinome pH svarbą HIF žiedo susidarymui dengiamojo stiklo modelyje. Mes parodėme galimybę, kad HIF žiedas susidarė slopinant HIF-1 kaupimąsi dėl žemo pH žiedo viduje.

Keliuose ankstesniuose tyrimuose, naudojant dangtelio metodą, buvo naudojamos vėžio ląstelės. Remiantis viena ataskaita, naudojant žmogaus hepatomos ląstelių liniją Hep3B, kuri išreiškia nuo deguonies priklausomą žalio fluorescencinio baltymo (AcGFP1) raudonąjį poslinkį, gyvas ląstelių, padengtų stačiakampiu dengiamuoju stikleliu, vaizdavimas parodė raudonąjį poslinkį, padidėjus atstumui nuo dengiamojo stiklelio krašto (Takahashi & Sato, 2010). Sumažėjus deguonies įtampai, hepatomos ląstelių emisijos spektras pasikeitė nuo žalio fluorescencinio baltymo (GFP) fluorescencijos bangos ilgio į raudoną. Kitame tyrime SCC-7 ląstelių su apvaliu 15- mm dengiamuoju stikleliu deguonies įtempis buvo išmatuotas naudojant fosforescencijos naudojimo trukmės metodą. Deguonies įtempimas buvo 6,9 mmHg ir 166 mmHg, apskaičiuotas pagal PL, kuris buvo 3,89 µs ir 893 µs, atitinkamai 0–2 mm viduje ir 0–1 mm už dengiamojo stiklelio krašto (Yoshihara ir kt., 2015). Dengiamasis stiklelio metodas taip pat buvo naudojamas su širdies miocitais – sistema, kuri patraukė dėmesį kaip perspektyvus in vivo išemijos ir reperfuzijos modelis. Kelly ir kt. parodė, kad miocitai, padengti dangteliu, laikui bėgant patyrė ryškius morfologinius pokyčius, kartu su mitochondrijų membranos potencialo ir plazmos membranos dinamikos pokyčiais, dėl kurių galiausiai mirė miocitai. Jie taip pat parodė, kad miocitų, padengtų dengiamuoju stikleliu, viduląstelinis pH greitai nukrenta iki maždaug pH 4 dengiamojo stiklelio centre (Pitts & Toombs, 2004). Dengiamasis stiklelio modelis, slopinantis deguonies ar mitybos sklaidą į kultivuojamas ląsteles po dengiamuoju stikleliu, gali imituoti in vivo išeminių, normalių ir kraštinių zonų modelį dengiamojo stiklelio centre, išorėje ir krašte. Keliuose tyrimuose šis modelis buvo naudojamas kaip miocitų išemijos ir reperfuzijos modelis in vitro (Chun ir kt., 2015; Pitts ir kt., 2008; Solhjoo ir O'Rourke, 2015; Wang ir kt., 2012). Kiek mums yra žinoma, mūsų tyrimas yra pirmasis, kuriame vamzdinėms ląstelėms taikomas dengiamojo stiklo metodas. Mūsų sistemoje atstumas nuo dengiamojo stiklelio krašto iki srities, atitinkančios 10 mmHg deguonies įtempimą, kur pimonidazolas turėtų pasidaryti teigiamas, buvo 1,22 mm, o deguonies įtempimas sumažėjo iki nulio 2 mm atstumu nuo dengiamojo stiklelio krašto. . Šis rezultatas gali būti suderinamas su ankstesnėmis ataskaitomis, kuriose naudojamas maždaug 15 mm dangtelis, o tai rodo, kad deguonies gradientas yra bent 2 mm atstumu nuo krašto (Akiyama ir kt., 2018; Yoshihara ir kt., 2015). Ištyrėme ląstelių apoptozės greitį po dangteliais (S11 pav.) ir nustatėme, kad GAPDH ir aktinas buvo palaikomi net HIF žiedo viduje, o tai rodo, kad HIF žiedą sukėlė ne tik ląstelių apoptozė ar mirtis HIF žiede.

Keletas tyrimų išmatavo deguonies įtampą inkstuose naudojant skirtingus metodus. Kai kurie normalių inkstų deguonies įtampos matavimo pavyzdžiai buvo tokie: 50 mmHg ir 30 mmHg žievėje ir smegenyse naudojant mikroelektrodus; ir 49 mmHg ir 41 mmHg žievės kanalėlių ląstelių S1 ir S2 segmentuose, naudojant PLIM (Hirakawa ir kt., 2017, 2018; Zhang ir kt., 2014). Sergančių inkstų deguonies įtampa būtų mažesnė. Remiantis ankstesne ataskaita, naudojant deguonies mikroelektrodus, cukriniu diabetu sergančių žiurkių inkstų parenchimos deguonies įtampa buvo mažesnė: atitinkamai 36 mmHg ir 11 mmHg žievėje ir smegenyse (Heyman ir kt., 2013; Palm ir kt., 2003). Kadangi deguonies mikroelektrodai matuoja vidutinę parenchimos deguonies įtampą, sergant inkstais tikimasi didesnio diapazono. Išeminio inksto modelyje, kurio šoninė inkstų arterija ir vena buvo užspausta, intracelulinė deguonies įtampa sumažėjo iki nulio mmHg (Hirakawa ir kt., 2015). Atsižvelgiant į šias išvadas, deguonies įtampos diapazonas HIF žiede, maždaug 4–20 mmHg, atrodė tikėtinas in vivo.

Be to, mes nustatėme, kad pH paveikė HIF žiedo susidarymą ir deguonies įtampą. Kadangi inkstų kanalėlių epitelio ląstelės yra nuolat veikiamos šlapimo skysčių, kanalėlių ląstelių pH turėtų turėti įtakos šlapimo pH. Atsižvelgdami į platų pH diapazoną šlapime, nusprendėme ištirti ląsteles, inkubuotas pH intervale 5.{1}}–8,5. Buvo atlikti normalių inkstų pH ribos tyrimai. Vieno tyrimo metu nustatyta, kad žievės pH buvo 7,39 ± 0.{{10}}8, o smegenų 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, matuojamas naudojant mikroelektrodus (Burke ir kt., 1999). Kitas tyrimas, naudojant MRT pagrįstą pH vaizdą, parodė, kad pH vertės buvo atitinkamai 7,3 ± 0,13 ir 7.{51}} ± 0,29 (Raghunand ir kt., 2003). Buvo pranešta, kad inkstų pH sumažėjo nuo 6,5 iki 6,32, o sunkiais atvejais - iki 5,83 pelių, sergančių CKD su acidoze, modeliu (Pavuluri ir kt., 2019). Šie stebėjimai parodė pH kritimą ir CKD pokyčius. Tačiau pH įtaka HIF-1, kurią sukelia lėtinė hipoksija sergant CKD, nebuvo pakankamai gerai ištirta. Šiame tyrime buvo pastebėtas HIF žiedo poslinkis tarp pH 6,5 ir pH 7,4, ty pH diapazonas, kuris yra tikėtinas sergant CKD. Šis rezultatas patvirtino hipotezę, kad nedidelis pH sumažėjimas turi įtakos HIF-1 kaupimuisi sergant CKD. Atsižvelgiant į pH kritimo žemiau 6,0 įrodymus sunkiais LŠL atvejais, taip pat būtina įvertinti HIF-1 fiziologinę būklę esant žemesniam pH. Nors buvo pranešimų, kad rūgštinė aplinka, net esant normoksijai, stabilizuoja HIF-1, daugumoje šių ataskaitų buvo tiriamos silpno rūgštingumo sąlygos, viršijančios 6,0 pH (Filatova ir kt., 2016; Mekhail ir kt., 2004). . Šiame darbe mes parodėme HIF-1 kaupimosi kanalėlių ląstelėse, kai pH 5,0, ir HIF-1 signalų susilpnėjimą dengiamojo stiklelio modelyje, inkubuotame esant pH 5,0. Todėl inkstų pH sumažėjimas sergant CKD in vivo gali būti koreliuojamas su nepakankamu HIF aktyvavimu, taip pat su ureminiais toksinais hipoksiniame inkste, o tai apsunkina ŠKL progresavimą (Tanaka ir kt., 2013).

Mūsų tyrimas turi keletą apribojimų. Pirma, hipoperfuzijos srityje auginimo terpėje, be deguonies trūkumo ir sumažėjusio pH, turėtų trūkti maistinių medžiagų. Tačiau sunku apibūdinti pH, deguonies įtampos ir kitų hipoperfuzijos sukeltų veiksnių poveikį. Organizme organuose ir ląstelėse atsiranda išemija, patologinė kraujo hipoperfuzija, kurią sukelia mažas deguonies ir maistinių medžiagų trūkumas. Svarbu suprasti skirtumus tarp hipoksijos jutimo ir išemijos jutimo. Nepaisant to, kad sunku išsiaiškinti kiekvieno faktoriaus biologinį poveikį, mūsų hipoperfuzijos modelis yra fiziologiškai tikėtinas, imituojantis patologinę būklę in vivo . Antra, norint sukurti dengiamojo stiklelio modelį, reikia įgūdžių ir praktikos, nes dauguma ląstelių kartais atsiskyrė nuimant dangtelį, ypač naudojant tradicinį metodą (S2a pav.). Ši problema priklausė nuo naudojamos ląstelių linijos. Pavyzdžiui, mums buvo sunku pritaikyti dengiamojo stiklo modelį ant HEK 293 elementų, nes jų sukibimas su dengiamuoju stikleliu buvo gana silpnas. Trečia, buvo pageidautina kuo labiau sumažinti po dengiamuoju stikleliu auginamų ląstelių žalą. Kaip rodo apoptozės analizė, pažeistų ląstelių skaičius didėjo, nes ilgėjo laikotarpis, per kurį jos buvo dengiamos. Mes nustatėme, kad 3 valandos buvo tinkamos HIF žiedui įvertinti, kai atrodė, kad jis yra statinis, ir maždaug 10 procentų ląstelių tapo apoptozinėmis (S11 pav.). Ketvirtasis apribojimas buvo sunkumas kiekviename mėginyje vienodai pritvirtinti kultivuotas ląsteles prie dangtelio (S2b, c pav.). Skirtumas tarp tradicinio ir alternatyvaus dangtelio ir lūpų modelio kūrimo metodo taip pat galėjo turėti įtakos tyrimui. Mes išmatavome deguonies įtempimo diapazoną, atitinkantį HIF žiedą, naudodami fosforescencijos naudojimo trukmę, kai tradiciniu metodu sukūrėme dengiamojo stiklo modelį. Kadangi HIF žiedas imunocitochemijos metu buvo vizualizuotas naudojant alternatyvų metodą, tikroji deguonies įtampa gali skirtis. Šias klaidas sumažinome naudodamiesi įrodymais, kad pimonidazolas buvo teigiamas esant 10 mmHg ar mažesniam deguonies įtempimui. Penktasis apribojimas yra tas, kad tarpląstelinis pH nebūtinai yra toks pat kaip auginimo terpės pH. Kelios ankstesnės ataskaitos parodė, kad tarpląstelinis pH tam tikru mastu atitinka terpės pH kultivuojamose ląstelėse (Michl ir kt., 2019), pakeisdami terpės pH galėtume įvertinti tik intracelulinio pH tendenciją. In vivo ryšys tarp tarpląstelinių ir tarpląstelinių regionų, tokių kaip šlapimas ar kūno skystis, yra sudėtingesnis nei kultivuojamose ląstelėse. Taigi ateityje reikės atlikti tolesnius tyrimus apie tai, kaip pH pokytis reguliuoja HIF-1 baltymo kaupimąsi in vivo.

Cistanche nauda: tobulinkite inkstasfunkcija

Kitas apribojimas yra tas, kad pH turėtų turėti įtakos hipoksijos žymeniui pimonidazolui. Mes palyginome pimonidazolo teigiamos srities krašto atstumą nuo dengiamojo stiklelio centro esant skirtingoms pH sąlygoms mūsų dengiamojo stiklelio modelyje. Pimonidazolo teigiamo ploto kraštas buvo panašus tarp pH 6,5, 7,4 ir 8,5 (S12a, b pav.). Ankstesnis tyrimas taip pat parodė, kad pimonidazolo jungimasis palaikomas esant skirtingoms pH vertėms (Kleiter ir kt., 2006). Remdamiesi šiais įrodymais, padarėme išvadą, kad pimonidazolas yra tinkamas hipoksijos žymuo mūsų dengiamųjų stiklelių eksperimentams. Galutinis apribojimas yra tas, kad atsižvelgiant į deguonies įtempimo diapazoną nuo maždaug 4 mmHg iki 20 mmHg (0,52 proc. O2 iki 2,6 proc. O2) HIF žiede, Pt(II)- ir Pd(II)-porfirinai, kurie plačiai naudojami kaip biologiniai. deguonies zondai turi pranašumų matuojant labai mažas deguonies koncentracijas, nes jų fosforescencijos trukmė yra žymiai ilgesnė, palyginti su tais, kurie naudoja Ir (III) kompleksus (Yoshihara ir kt., 2017). Tačiau apskritai kiekybinis deguonies matavimas, pagrįstas fosforescencija, apskaičiuotas naudojant Stern-Volmer lygtį, turi geresnį našumą esant žemiems O2 intervalams (Papkovsky ir Zhdanov, 2016). Keletas ankstesnių tyrimų parodė, kad Ir (III) kompleksu pagrįstas deguonies įtempimo matavimas iki maždaug 10 mmHg (Akiyama ir kt., 2018; Yoshihara ir kt., 2015). Todėl manome, kad HIF žiedo deguonies įtempimo diapazonas turėtų būti tikslus rezultatas.

5|IŠVADOS

Apibendrinant, mes nustatėme, kad norint suprasti HIF-1 fiziologinę būseną sergant CKD, būtina suprasti deguonies ir pH vaidmenį, ir tai galima pasiekti tiriant kanalėlių ląsteles su hipoperfuzija. Dengiamasis stiklelio modelis, turintis terpės srauto apribojimus, buvo geras hipoperfuzijos in vivo modelis, ypač CKD kanalėliuose, nes peritubinių kapiliarų retėjimas yra pagrindinis ŠKL požymis (Mimura ir Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Šis hipoperfuzijos modelis taip pat gali imituoti deguonies ir pH gradientus in vivo, tokius kaip navikai ir išeminiai pažeidimai. Modelis suteikia daug žadantį požiūrį į šių biologinių mechanizmų išaiškinimą.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Visi autoriai neturi deklaruoti interesų konfliktų.

AUTORIŲ INSTRUKCIJA

Visi autoriai prisidėjo prie bendros koncepcijos formavimo. TH atliko bendrus eksperimentus. TH ir YH išanalizavo rezultatus ir sudarė skaičius. TH parašė originalų rankraštį. KM, TY ir ST atliko eksperimentą naudodami fosforescencijos visą gyvenimą metodą ir redagavo rankraščio dalį. YH, TT ir MN redagavo bendrą rankraštį. Visi autoriai perskaitė ir patvirtino galutinį rankraštį.

NUORODA

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir (iii) gyvų ląstelių ir akies dugno kompleksinis deguonies vaizdavimas naudojant ICCD kamerą. Fotocheminiai ir fotobiologijos mokslai, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustatas, hemodializuojamų pacientų anemijos konversija ir palaikomasis gydymas: atsitiktinių imčių, placebu kontroliuojamas 2b fazės tyrimas, po kurio sekė ilgalaikis tyrimas. Nephron, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE ir Harris, AL (2002). Žiurkės VL30 elemento reguliavimas žmogaus krūties vėžio ląstelėse esant hipoksijai ir anoksijai: HIF vaidmuo-1. British Journal of Cancer, 87(10), 1173–1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe- Akanuma, M. (2016). Arilo angliavandenilių receptoriaus aktyvinimas slopina nuo hipoksijos sukeltą faktorių priklausomą eritropoetino ekspresiją indoksilo sulfatu. Amerikos fiziologijos žurnalas. Ląstelių fiziologija, 310(2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D. ir Shapiro, JI (1999). Veiksniai, palaikantys pH gradientą inkstuose: kraujagyslių architektūros vaidmuo. Kidney International, 56(5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ ir Macip, S. (2014). HIF-1alfa transkripcijos faktoriaus vaidmuo padidėjusiam ląstelių dalijimuisi esant fiziologinei deguonies įtampai. PLoS One, 9 (5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., ... Yu, KHP (2019 m. ).

Roxadustat anemijai gydyti pacientams, sergantiems inkstų liga, kuriems netaikoma dializė. New England Journal of Medicine, 381 (11), 1001–1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., Jis, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). 2 fazės burnos hipoksijos sukeliamo faktoriaus prolilhidroksilazės inhibitoriaus FG-4592 tyrimai anemijai gydyti Kinijoje. Nefrologija, dializė, transplantacija, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T. ir Nangaku, M. (2011). Indoksilsulfatas, reprezentatyvus ureminis toksinas, slopina eritropoetino gamybą priklausomai nuo HIF. Laboratorinis tyrimas, 91(11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H. ir Moon, IS (2015). Gliukozės-insulino-kalio tirpalas apsaugo naujagimių žiurkių skilvelių miocitus in vitro dengiamojo stiklo išemijos / reperfuzijos modelyje. Korean Circulation Journal, 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D. ir Macdougall, IC (2017). Naujos lėtinės inkstų ligos anemijos galimybės. Kidney International Supplement, 7(3), 157–163. bučinys.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. ir kt. (2010). Inkstų apsauga sergant lėtine inkstų liga: hipoksijos sukeltas faktoriaus aktyvinimas ir angiotenzino II blokada. Amerikos fiziologijos žurnalas. Inkstų fiziologija, 299(6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Acidozė veikia per HSP90 nepriklausomai nuo doktorantūros / VHL, skatindama HIF funkciją ir kamieninių ląstelių palaikymą sergant glioma. Cancer Research, 76(19), 5845–5856. GALI-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S. ir Heyman, SN (2006). Ūminis ir lėtinis inkstų nepakankamumas žiurkėms: funkcinė kompensacija ir hipoksijos tolerancija. American Journal of Nephrology, 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S. ir Khamaisi, M. (2013). Kodėl cukrinis diabetas yra kontrastinių medžiagų sukeltos nefropatijos rizikos veiksnys? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S. ir Nangaku, M. (2018). Intravitalinis fosforescencinis inkstų žievės viso gyvenimo vaizdas tiksliai išmatuoja inkstų hipoksiją. Kidney International, 93(6), 1483–1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T. ir Nangaku, M. (2017). Inkstų hipoksija sergant ŠKL; Patofiziologija ir aptikimo metodai. Fiziologijos ribos, 8, 99.