Nauja natūrali antioksidacinė biomedžiaga iš Cinnamomum Osmophloeum Kanehira lapų slopina melanogenezę ir apsaugo nuo DNR pažeidimo

Susisiekite: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1, Jane-Yii Wu 1,* ir Chi-Yue Chang 2

Santrauka:Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) yra vietinė Taivano medžių rūšis. Cheminės kompozicijos,antioksidantasveikla, grybastirozinazėbuvo tiriamas COK lapų hidrozolio slopinimas, melanino sintezės slopinimas ir apsauga nuo DNR pažeidimo distiliuojant garais. Atlikome 1,1-difenil-2-pikrilhidrazilo radikalų šalinimo, metalo jonų chelatavimo, redukcijos galios ir Trolox ekvivalento antioksidacinio pajėgumo (TEAC) tyrimus ir nustatėme bendro fenolio kiekio ir antioksidacinio aktyvumo sąsajas. Išvados parodė, kad COK hidrozolio antioksidacinės savybės yra glaudžiai susijusios su jų fenolio kiekiu. Be to, pagrindinės hidrozolio sudedamosios dalys, ty cinamonomaldehidas ir benzaldehidas, turėjo nuo dozės priklausomą antitirozinazės poveikį tiek monofenolazės, tiek difenolazės aktyvumui. GC-MS analizė parodė, kad pagrindiniai hidrozolio biologiškai aktyvūs komponentai buvo trans-cinamaldehidas (87,7 proc.). benzaldehidas (7.{11}} proc.) ir cinamilo acetatas (5,3 proc.). Be to, mes nustatėme, kad hidrozolis, kuriame yra benzaldehido, yra stipresnis nei grynas cinamaldehidas ir pagerinatirozinazėslopinantis hidrozolio aktyvumas. Kinetinės analizės metu Lineweaver-Burk brėžiniai ir pakartotiniai brėžiniai parodė, kad COK hidrozolis yra mišraus tipo inhibitorius. Be to, mes nustatėme, kad labai mažos COK hidrozolio dozės slopina melanocitus stimuliuojančio hormono sukeltą su mikroftalmija susijusio transkripcijos faktoriaus sintezę, todėl B16-F10 melanomos ląstelėse sumažėjo melanino sintezė. Šie rezultatai parodė, kad hidrozolio gamyba iš COK lapų naudojant distiliavimą garais gali būti saugus ir veiksmingasoda -balinimaskosmetikos ir farmacijos priemonės suantioksidantas, antitirozinazės, anti-melanogenezės ir DNR apsauginės veiklos.

Raktiniai žodžiai: antioksidantasveikla; Cinamomoum ​​osmophloeum; hidrozolis;tirozinazėslopinantis aktyvumas;balinimas; Apsauginis DNR pažeidimo poveikis

Spustelėkite norėdamiCistanchestiebas ir produktas odai balinti

1. Įvadas

Žmogaus odos sutrikimai, tokie kaip lentigo, amžiaus dėmės, melasma ir piktybinės melanomos, buvo susiję su melanino susidarymu ir kaupimu [1]. Tirozinazių ir melanogenezės slopinimas gali palengvinti dermatologinius sutrikimus ir hiperpigmentacijos sindromą. Be to, pasaulinė odos balinimo priemonių ir kosmetikos gaminių rinka pastaruoju metu išsiplėtė, nes šviesesnės odos spalvą renkasi daugelis tamsesnės odos žmonių [2]. Todėl efektyvus ir saugustirozinazėir melanino sintezės inhibitoriai laikomi svarbiais pigmentacijos ligų ir kitų su melaninu susijusių žmonių sveikatos problemų prevencijai [3,4]. Be to, aplinkos toksinės medžiagos sukelia įvairią oksidacinį stresą žmonėms ir gali sukelti reaktyviąsias azoto rūšis arba reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS) [5]. Per didelis laisvųjų radikalų ir ROS kiekis yra susijęs su uždegiminiais signalizacijos keliais, kurie galiausiai sukelia ląstelių pažeidimą, senėjimą, nervų sutrikimus, diabetą, aterosklerozę, uždegimines, širdies ir kraujagyslių ligas, vėžį ir melanogenezę [6, 7]. Keletas tyrimų rodo, kadantioksidantaigali slopinti oksidacinio slėgio žalą, veikdamas kaip laisvųjų radikalų arba ROS sulaikytojai [7, 8]. Be to, tiek ROS susidarymo inhibitoriai, tiek ROS šalintojai gali sumažinti melaninpigmentų gamybą [9]. Tiksliau,tirozinazėyra pagrindinis fermentas, kuris katalizuoja greitį ribojantį žingsnį pirmuosiuose dviejuose melanino sintezės procesų etapuose [10], o tirozinazės reguliavimas yra esminis tikslas siekiant išvengti odos ligų ir gamintiodos balinimasagentai [11].Todėl būtina sukurti natūralius antioksidantus, kurie veiksmingai slopina tirozinazes, kad būtų išvengta arba gydoma nepageidaujama odos hiperpigmentacija ir apsaugota nuo DNR pažeidimo.

Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) yra Taivano vietinė cinamono rūšis, dažnai naudojama kaip kinų vaistažolė. Aktyvūs COK eterinių aliejų junginiai pasižymi puikiu farmakologiniu antibakteriniu poveikiu [12]. Nors ankstesni COK lapų alkoholio ekstraktų tyrimai parodė antitirozinazės aktyvumą, beveik visi šie tyrimai buvo skirti etanolio ekstraktams arba eteriniams aliejams iš COK. Be to, nebuvo pranešta apie jokius kiekybinius ir sisteminius tyrimusantioksidantassavybės,tirozinazėslopinančią veiklą ir melanino sintezės slopinimą COK lapų vandens ekstraktais (hidrozoliu). Todėl šis tyrimas buvo atliktas siekiant ištirti COK hidrozolio poveikį oksidaciniam stresui ir melanogenezei B16F10 melanomos ląstelėse ir apsaugoti nuo DNR pažeidimo. Šis tyrimas yra pirmoji išsami ataskaita apie cheminę sudėtį irantioksidantas,tirozinazės slopinimas, melanogenezę slopinantis ir DNR pažeidimas apsauginė hidrozolio iš COK lapų veikla.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Cheminės medžiagos ir antikūnai

Grybastirozinazė, butilintas hidroksitoluenas (BHT), -tokoferolis, 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkromano-2-karboksirūgštis (Trolox), trichloracto rūgštis (TCA), galis rūgštis, kalio geležies cianidas, geležies chloridas, geležies chloridas, ferozinas, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazilas (DPPH),2,20-azinobis-3-etilbenztiazolinas{{14} } sulfono rūgštis (ABTS), Folin-Ciocalteu reagentas, L-tirozinas ir L-3,4-dihidroksifenilalaninas (L-DOPA) buvo gauti iš Merck Co. (Darmštatas, Vokietija). Visos cheminės medžiagos ir tyrime naudojami tirpikliai buvo analitinės kokybės arba didelio efektyvumo skysčių chromatografijos. Antikūnai prieš su mikroftalmija susijusį transkripcijos faktorių (MITF) ir aktiną buvo gauti atitinkamai iš Cell Signaling Technology (Danvers, MA, JAV) ir Sigma Chemical Co. (St. Louis, JAV).

2.2. Hidrozolio paruošimas: ekstrahavimas iš COK lapų naudojant distiliavimą garais

Lapai iš 13-metų COK medžio Taivane (Nr. 186, Yongping Road, Zhongliao Township, Nantou County, Taivanas) buvo išdžiovinti ore. Naudojant nerūdijančio plieno šlifuoklį, lapai buvo sumalti į smulkius miltelius (mažiau nei 10 akių) ir laikomi kambario temperatūroje. Tada 3,5 kg džiovintų COK lapų miltelių buvo ekstrahuoti distiliuojant garais 4 valandas. Šis procesas buvo pakartotas keturis kartus. Naudojant vakuumą, ekstraktas buvo filtruojamas, o po to naudojant sukamąjį garintuvą buvo gautas sausas ekstraktas (1 pav.). Ekstraktas galiausiai buvo išgarintas, kad gautų galutinį svorį.

2.3. Hidrozolio dujų chromatografijos/masių spektrometrijos (GC/MS) analizė

Thermo-GC/MS instrumentas su THERMO WaxMS kryžminiu ryšiu susietu 5 procentų fenilo - 95 procentų metilpolisiloksano kapiliarine kolonėle (60 m × 0,25 mm vid, plėvelės storis {{1) 0}},25 µm) buvo naudojamas kaip nešančiosios dujos, esant pastoviam 1,0 ml/min srauto greičiui. Po injekcijos kolonėlė buvo palaikoma 200 ◦ C temperatūroje 5 min., o po to kaitinama 5 ◦ C/min iki 260 ◦ C. Grynas eterinis aliejus (1,0 ml) buvo švirkščiamas santykiu 1:100. Injektoriaus, perdavimo linijos ir jonų šaltinio temperatūra buvo atitinkamai 250 ◦C, 250 ◦C ir 200 ◦C. MS aptikimas atliktas elektronų smūgio režimu, esant 70 eVionizacijos energijai ir 60 µA jonizacijos srovei; instrumentas buvo naudojamas viso skenavimo gavimo režimu 50–350 amu diapazone. Junginiai buvo identifikuoti lyginant chromatografinių smailių sulaikymo laikus ir indeksus su autentiškų etaloninių standartų, įšvirkštų tomis pačiomis sąlygomis, sulaikymo laikus ir indeksus. MS fragmentacijos modeliai buvo lyginami su grynų junginių modeliais, o masės spektro duomenų bazė buvo ieškoma naudojant Nacionalinio standartų ir technologijos instituto (NIST) MSspectral duomenų bazę [13].

2.4.Bendras fenolio kiekis

Bendras fenolio kiekis (TPC) ekstraktuose buvo nustatytas naudojant anksčiau aprašytus Folin-Ciocalteu tyrimus [14]. Trumpai tariant, hidrozolio mėginiai (100 µL) buvo sumaišyti su 100 µL Folin-Ciocalteu reagento alikvotinėmis dalimis (10- karto praskiedimas) ir 10 µL natrio karbonato alikvotinėmis dalimis (10 proc., m/t). Palaikius 30 min. absorbcija buvo išmatuota ties 735 nm. TPC išreiškiamas gallo rūgšties ekvivalentais (GAE) mg 100 g šviežios medžiagos.

2.5. DPPH laisvųjų radikalų pašalinimo tyrimai

Kaip aprašyta anksčiau, naudojant DPPH tyrimą, hidrozolio radikalų pašalinimo aktyvumas buvo nustatytas [15] su pakeitimais. Trumpai tariant, įvairūs hidrozolio mėginių skiedimai (75 µL trimis egzemplioriais) buvo pridedami prie 150 µL DPPH alikvotinių dalių (0,02 g/100 ml), o absorbcija buvo išmatuota ties 517 nm po 30 min. BHT buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė (0,5 mg/ml etanolio). Radikalų šalinimo veikla buvo išreikšta kaip slopinimo koeficientai (procentais), naudojant šią lygtį:

Slopinimo koeficientas (procentai )=[1 − (A/B)] × 100 procentų

čia A yra hidrozolio mėginio absorbcija, o B yra tuščiojo mėginio absorbcija.

2.6. Frakcinės slopinančios koncentracijos

Frakcinių slopinamųjų koncentracijų (FIC) tyrimai buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau [16], su pakeitimais. Trumpai tariant, FeSO4 (20 µL; 2 mM) buvo sumaišytas su skirtingais hidrozolių mėginių skiedimais (200 µL). Pridėjus ferozino (40 µL; 5 mM), reakcijoms buvo leista tęstis 10 min., tada išmatuota absorbcija esant 562 nm. Be to, kaip teigiama kontrolė buvo naudojama 0,5 mg/ml etileno diamino tetraacto rūgšties (EDTA). Ferrozino-Fe2 ir komplekso susidarymo slopinimo procentas buvo apskaičiuotas pagal šią formulę:

Metalo kompleksonas (procentais)=[1 − (A/B)] × 100 procentų

čia A yra hidrozolio mėginio absorbcija, o B yra tuščiojo mėginio absorbcija.

2.7. Galios mažinimo tyrimai

COK hidrozolio redukcinė galia buvo nustatyta stebint Fe3 ir Fe2 plus redukciją, kaip aprašyta anksčiau [17], su pakeitimais. Trumpai tariant, iki 50 µL hidrozolio skiedimų buvo 50-µL fosfatinio buferio (pH 6,6, 200 mM) ir 50-µL kalio fericianido alikvotinės dalys (1 proc., m/v) pridėta. Po 20 minučių inkubacijos 50 ◦C temperatūroje buvo pridėta 50 µl TCA (10 proc., m/t); ir mišinys centrifuguojamas 9, 000 aps./min. greičiu 3 min. Galiausiai 50 µL supernatanto buvo sumaišyta su 50 µL distiliuoto vandens ir 50 µL geležies chlorido vandenyje (0,1 proc., m/t), o absorbcija buvo išmatuota esant 700 nm, palyginti su tuščiuoju mėginiu po 10 minučių reakcijos. Naudotos teigiamos kontrolės priemonės buvo butilintas hidroksitoluenas (BHT) ir tokoferolis.

2.8. Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) tyrimas

AntioksidantasCOK hidrozolio aktyvumas buvo įvertintas pagal anksčiau aprašytą metodą [15,18], su pakeitimais. Trumpai tariant, koncentruotas ABTS radikalų katijonų (ABTS• plus ) tirpalas buvo praskiedžiamas fosfatiniu buferiniu tirpalu (pH 7,4) iki galutinės absorbcijos 0,80 ± 0,05 esant 734 nm. Sumaišius (0,02 ml) mėginį su 1 ml ABTS plius tirpalo, po 5 minučių sumažėjo absorbcija ties 734 nm. Trolox buvo naudojamas kaip standartas, o hidrozolio aktyvumas buvo išreikštas kaip TEAC, braižant Troloxcalibration kreives. Hidrozolio mėginių molinės ekvivalentinės TEAC reikšmės buvo apskaičiuotos pagal Trolox tirpalo absorbcijos sumažėjimą. BHT ir -tokoferolis buvo naudojami kaip teigiami kontroliniai mėginiai.

2.9. Hidrozolio poveikis grybų tirozinazės slopinimui

Grybastirozinazėaktyvumas buvo matuojamas naudojant spektrofotometrinę analizę, kaip aprašyta anksčiau, su pakeitimais [19]. Trumpai tariant, 20 µL L-tirozino arba 20 µL L-DOPA PBS (pH 6,8; 80 µL) ir 80 µL PBS su tiriamuoju hidrozoliu arba be jo buvo įpilta į 96-šulinėlių mikroplokštes, o po to 20 µL grybų tirozinazės (100 U/). ml) buvo pridėta. Sumaišius ir inkubavus 37 ◦C temperatūroje 20 min., dopachromo gamyba (arba suvartojimas) reakcijos mišinyje buvo nustatyta esant 475 nm absorbcijai. Kojic rūgštis, kuri slopina tirozinazę, buvo naudojama kaip teigiama kontrolė. Tirozinazės slopinimo procentas buvo apskaičiuotas taip:

Slopinimas (procentais) ≡ {[(A − B) − (C − D)]/(A − B)} × 100 procentų

kur A rodo absorbciją su fermentu, kai nėra hidrozolio mėginio, B rodo absorbciją be fermento arba hidrozolio mėginio, C reiškia absorbciją su fermentu, o hidrozolį ir nurodo absorbciją be fermento, bet su hidrozoliu. Taip pat paskaičiavome 50 proctirozinazėmėginių slopinančios koncentracijos (IC50), nes tirozinazės aktyvumą slopina 50 proc.

2.10. Grybų tirozinazės slopinimo kinetinė analizė

Reakcijos mišiniuose buvo 20 µL L-tirozino arba L-DOPA (0,25 mg/mL) kaip substratų, 100 µL grybų tirozinazės (20 vienetų/ml) 0,2 M natrio fosfato buferyje ( pH 6,8) ir 80 µl kiekvieno hidrozolio mėginio, kurio bendras tūris yra 200 µL. Tyrimas buvo atliktas esant 25 ◦C temperatūrai, o kiekvieno hidrozolio mėginio slopinamoji kinetika sutirozinazėbuvo analizuojamas naudojant Lineweaver-Burk sklypus. Abipusė lygtis buvo naudojama norint greitai susibalansuoti dėl mišraus tipo nekonkurencinio slopinimo, kaip nurodyta (1) [20] lygtyje. Hidrozolio mėginių Ki vertės buvo apskaičiuotos pagal nuolydžio perrašymus ((2) lygtis). Hidrozolio Ki reikšmės buvo apskaičiuotos pagal 1/v ašies pertraukos diagramą ((3) lygtis),

kur Vmax yra didžiausias greitistirozinazėaktyvumas, Ks yra substrato (S) disociacijos konstanta nuo fermento-substrato komplekso (ES), Ki yra inhibitoriaus [I] disociacijos konstanta nuo fermento-inhibitoriaus komplekso ir Ki yra inhibitoriaus disociacijos konstanta nuo fermento-substrato. - inhibitorių kompleksas (ESI).

2.11. Ląstelių kultūros ir ląstelių gyvybingumo tyrimai

B16-F10 melanomos ląstelės (BCRC60031) buvo gautos iš Bioresource Collection and ResearchCenter (BCRC), Taivanas. B16-F10 ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (Gibco, Kalifornija, JAV), turinčioje 10 procentų FBS, esant 37 ◦C temperatūrai ir 5 procentams CO2. Tripsinizacijos būdu ląstelės buvo surinktos. Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas naudojant 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromido (MTT) tyrimą, kaip aprašyta Lee [15 ].

2.12. Ląstelių melanino turinys

Melanino kiekis buvo matuojamas naudojant Lee aprašytą metodą. [15]. Trumpai tariant, B16-F10 ląstelės buvo kultivuojamos 6-šulinėlių plokštelėse, kurių tankis buvo 0,8 × 105 ląstelės, po to inkubuojamos 24 valandas. 24 val. gydomas įvairios koncentracijos 100-nM -melanocitus stimuliuojančiu hormonu (-MSH), kojo rūgštimi (teigiama kontrolė) ir hidrozoliu. Du kartus plaunamos PBS, ląstelės buvo lizuojamos buferyje, kuriame yra 100 mM natrio fosfato (pH 6,8), 1 % Triton X-100 ir 0,1 mM fenilmetansulfonilfluorido, ir laikomos –80 ◦C temperatūroje 30 min. Surinkus ląsteles, ląstelių nuosėdos buvo ištirpintos 1 N NaOH, turinčiame 10 procentų DMSO, 65 ◦ C temperatūroje 1 valandą. Po to absorbcija buvo išmatuota esant 405 nm.

2.13. Western Blot

Ląstelės buvo lizuojamos, kaip aprašyta 2.11 skyriuje, ir buvo atliktas Western blot MITF baltymas, naudojant anti-MITF antikūną.

2.14. DNR apsaugos tyrimai

Oksidacinis DNR pažeidimas buvo nustatytas pagal žiedinės superspiralinės pCI neoplazmidės DNR pavertimą į nikuotas žiedines arba toliau suskaidytas formas, naudojant anksčiau aprašytą metodą [21, 22] su nedideliais pakeitimais. 20 µL reakcijos mišiniuose buvo 2,5 µL superspiralinio pCI neo (150 ng/µL), 10 µL Fenton reakcijos tirpalo, kuriame yra 30 mM vandenilio peroksido, 100- µM geležies chlorido ir 100 µM askorbo rūgšties 20 mM Tris-HCl buferyje (pH 7,6) ir 5 µL hidrozolio (0,3325–5,32 mg/mL) arba kvercetino (teigiama kontrolė; 250 µg/mL). Reakcijos mišiniai buvo inkubuojami 37 °C temperatūroje 30 min., o plazmidinės DNR formos buvo atskirtos 0,7 procento agarozės gelyje ir nudažytos naudojant SafeView™ (Applied Biological Materials (ABM) Inc., Ričmondas, Kanada).

Iš dalies kiekybiškai įvertintiantioksidantasekstraktų aktyvumas, pCI neo superspiralinių ir įtrūkusių formų kiekiai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant AlphaImager Mini (paprastą baltymą) instrumentą, o agarozės gelių juostų intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant Gelpro programinę įrangą. Kaip neigiama ir teigiama kontrolė, pCI neoplazmidė buvo atitinkamai inkubuojama atskirai ir su Fenton reagentų mišiniu. Duomenys išreiškiami superspiralinės DNR kiekiais, palyginti su tuo (100 proc.) neigiamuose kontroliniuose mėginiuose. Apsauginis ekstraktų aktyvumas buvo apskaičiuotas pagal superspiralinės ir įtrūkusios plazmidės DNR kiekius, naudojant šias lygtis [23]:

Superspiralinės plazmidės apsauga (procentais) =superspiralinės formos intensyvumaspCI neo DNR juostos intensyvumas × 100

Įtrūkusios plazmidės (procentais) apsauga =įtrūkusios formos intensyvumas CI neo DNR juostos intensyvumas × 100

2.15. Statistinė analizė

Visi duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Skirtumai tarp gydymo būdų buvo nustatyti naudojant Stjudento t-testą arba ANOVA, o po to Scheffe testą. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais, kai p <>

3. Rezultatai ir aptarimas

3.1. Lakiųjų junginių identifikavimas hidrozolyje

Hidrozolių kiekis buvo analizuojamas naudojant GC/MS. Komponentai buvo identifikuoti pagal standartų sulaikymo laiką, o kiekiai buvo nustatyti pagal eliuentų smailių plotus (2 pav.). Kaip parodyta 2A–D paveiksluose, trans-cinnamaldehidas, benzaldehidas ir cinamilo acetatas buvo pagrindiniai COK hidrozolio junginiai ir jų buvo atitinkamai 87,7 proc., 7.0 proc. ir 5,3 proc. Anksčiau eugenolio C. verum eteriniuose aliejuose buvo rasta 7,29 proc. [24], tačiau dabartiniame COK hidrozolyje jo nebuvo aptikta (2 pav.). Ekstrahavimo procesų ir tyrimo metodų skirtumai gali turėti įtakos C. cassia eterinių aliejų cinamaldehido kiekio skirtumams [25].

3.2. COK lapų hidrozolio antioksidacinės savybės

3.2.1. DPPH radikalų šalinimo veikla

3A paveiksle hidrozolių DPPH radikalų pašalinimo aktyvumas nuo 1.06×10−2 iki 5,32×10−1 mg/mL buvo tarp 5.04 atitinkamai ± 0,96 procento ir 41,76 procento ± 2,50 procento. Šie duomenys rodo nuo dozės priklausomą COK hidrozolio radikalų pašalinimą. Palyginimui, teigiamos kontrolės BHT ir -tokoferolis pašalino atitinkamai 94,32 proc. ± 0,08 proc. ir 93,82 proc. ± 0,13 proc. DPPH reaktyvių radikalų, esant 0,5 mg/ml. ).Daugelis tyrimų rodo, kad fenoliai ir flavonoidai neleidžia susidaryti DPPH radikalams, dovanodami vandenilio atomus. Taigi Cinnamomum rūšių DPPH radikalų šalinimo veikla taip pat gali atspindėti vandenilio donoro veiksmus [26, 27].

3.2.2. Metalo jonų chelatas

Mes įvertinome hidrozolių Fe2 ir surišimo pajėgumą esant 1, 06 × 10–3 ir 5, 32 × 10–1 mg / ml, kaip parodyta 3A paveiksle. Metalo chelatinimas hidrozolio komponentais nežymiai padidėjo didėjant koncentracijai, bet esant 6 mg/ml, turėjo tik 37,3 proc. EDTA kompleksonų sudarymo (3A pav.).

3.2.3. Galios mažinimas

Kaip parodyta 3A paveiksle, hidrozolio komponentų redukcinė galia priklausė nuo koncentracijos ir buvo didesnė nei BHT ir -tokoferolio (0,22 ± 0.01 ir {{9) }}.33 ± 0.15) esant 0,5 mg/ml. Ankstesnių tyrimų metu neapdorotų ekstraktų iš C. osmophloeum šakelių BuOH frakcijose redukcinė galia buvo didžiausia tarp visų frakcijų ir didėjo tiesiškai didėjant koncentracijai [28].antioksidantasEkstraktuose esančių junginių potencialai skiriasi, bendras ekstraktų antioksidacinis aktyvumas labai priklauso nuo ekstrakcijos tirpiklio. Tačiau vandens ekstraktų iš C. osmophloeum šakelių redukcinė galia (OD vertė {{0}},7) buvo panaši (OD vertė=0,66 ± 0,01) kaip ir dabartinių C. osmophloeum hidrozoliai (3A pav.), kurie buvo pagaminti naudojant distiliavimą garais. Sumažinimo galia paprastai siejama su redukuojančių medžiagų buvimu ir antioksidaciniu aktyvumu, atspindinčiu laisvųjų radikalų grandininių reakcijų nutraukimą redukuojant vandenilio atomus. C. osmophloeum redukcinę galią tikriausiai nulemia fenolio junginiuose esančios hidroksilo grupės (2 pav.), kurios gali veikti kaip elektronų donorai.

3.2.4. TEAC tyrimai

Dabartinio hidrozolio TEAC vertės buvo padidintos, kai koncentracija didesnė nei 5,32 × 10–3 mg/mL ir buvo didesnės nei etaloninių junginių – tokoferolio ir BHT, kaip parodyta 3A paveiksle. Pagrindinis aktyvumo kriterijus atliekant TEAC tyrimus. Atitinkamai, dabartinių hidrozolio sudedamųjų dalių fenilo grupės yra šiek tiek mažiau kliudomos nei Trolox.

3.2.5. TPC ir antioksidacinės veiklos sąsajos

Kaip parodyta 3B paveiksle, buvo labai reikšminga koreliacija tarp TPC ir DPPH laisvųjų radikalų pašalinimo aktyvumo esant GAE nuo 1,75 ± 0,438 iki 100,41 ± 1,581 mg/g . TPC koreliacijos koeficientai su DPPH laisvųjų radikalų pašalinimo aktyvumu, FIC aktyvumu, mažinančia galia ir TEAC buvo atitinkamai 0,980, 0,925, 0,967 ir 0,902 (3B pav.). Visi šie duomenys rodo, kadantioksidantasCOK hidrozolių aktyvumas yra glaudžiai susijęs su fenolio kiekiu.

3.3. COK hidrozolio koncentracijos poveikis tirozinazės aktyvumui

Mes nustatėme COK hidrozolio koncentracijos poveikį L-tirozino ir L-DOPA oksidacijai grybaistirozinazėir palygino su kojinės rūgšties, kuri yra gerai žinomas tirozinazės inhibitorius, aktyvumu (3C, D pav.). Dabartinis hidrozolis stipriai ir nuo dozės priklausomai slopino grybų tirozinazės L-tirozino ir L-DOPA oksidazės aktyvumą (3C pav.), tačiau turėjo didesnį tirozinazę slopinantį aktyvumą esant L-tirozino substratui (monofenolazės aktyvumas) nei L-DOPA (difenolazės aktyvumas). Kojo rūgšties IC5{{10}} vertės prieš monofenolazės ir difenolazės aktyvumą buvo 4.0 × 10–5 ir 7,8 × 10–3 mg/mL (3C pav.), atitinkamai žymiai daugiau nei esamo hidrozolio (atitinkamai 7,96 × 10–4 mg/ml ir 0,35 mg/ml; 3D pav.). Taigi, norint pasiekti 90 procentų tirozinazę slopinančio aktyvumo (monofenolazės aktyvumo), hidrozolio ir kojo rūgšties reikėjo atitinkamai 0,52 mg/ml ir 4,0 × 10–3 mg/mL, kai substratas buvo naudojamas L-tirozinas (3C pav., D). ). Nors tirozinazę slopinančiam poveikiui reikia didesnės COK hidrozoltano kojinės rūgšties koncentracijos, šiuose eksperimentuose buvo akivaizdus stiprus tirozinazę slopinantis aktyvumas.

Įvairūstirozinazėpreparatai, aktyvumo tyrimo metodai ir inhibitorių grynumas bei komponentai galėjo turėti įtakos fermentų slopinimo kinetikos skirtumams [29]. Tačiau augalų ekstraktų biologinį aktyvumą lemia jų bioaktyvūs komponentai, kuriems įtakos gali turėti augalų rūšis, derliaus nuėmimo laikas, sezonas, geografinė kilmė, agronominė praktika ir ekstrahavimo metodai. Daugelyje naujausių tyrimų buvo nustatyti ir apibūdinti inhibitoriai iš natūralių šaltinių, o ryšys tarp slopinančio aktyvumo ir natūralių ingredientų yra gerai nustatytas (1 lentelė). Visų pirma, daugelis aldehidų ir kitų junginių buvo išskirti ir apibūdinti kaip tirozinazės inhibitoriai. Tai apima cinamaldehidą, 2-hidroksi-4-metoksibenzaldehidą, anisaldehidą, kmynaldehidą, kumino rūgštį, flavonolius, flavonus ir izoflavanus [4,19,30–37]. Dabartinis hidrozolis sudarė 87,7 proc. cinamaldehido ir 7,0 proc. benzaldehido, o tai rodo, kad cinamono maldehidas, po to benzaldehidas, yra pagrindinė medžiaga, atsakinga už hidrozolio tirozinazę slopinantį aktyvumą. Pagal 1 lentelę nustatėme, kad hidrozolyje, kuriame yra daugiau benzaldehido, yra nei gryno cinamaldehido, ir pagerinatirozinazėslopinantis hidrozolio aktyvumas. Taip pat patvirtinta, kad benzaldehidas slopina ir difenolazės aktyvumą, ir fungirozinazės monofenolazės aktyvumą [38]. Benzaldehido tipo inhibitorių tirozinazę slopinantis mechanizmas tikriausiai atsiranda dėl jų gebėjimo sudaryti Šifo bazę su pirmine aminogrupe fermente [33,39]. Elektronus dovanojančios grupės pridėjimas benzaldehido para padėtyje padidina tirozinazę slopinantį aktyvumą, tikriausiai stabilizuoja Schiff bazę.

3.4. COK hidrozolio grybų tirozinazės slopinimo kinetiniai režimai

Buvo tiriamas hidrozolio kinetinis elgesys su monofenolaze ir tirozinazės difenolazės aktyvumu, naudojant atitinkamai L-tiroziną ir L-DOPA kaip substratą. Thetirozinazėhidrozolio inhibitorikinetika buvo analizuojama naudojant Lineweaver-Burk dvigubus abipusius grafikus, kaip parodyta 4 paveiksle. 4A, B paveiksluose keturios linijos žymi neslopintą fermentą (1 eilutė) ir slopinimą pagal tris hidrozolio koncentracijas (2 eilutė – 4 eilutė). šios linijos susikerta į kairę nuo 1/v ašies virš 1/S ašies. Nestabdomomis eksperimentinėmis sąlygomis didžiausias tirozinazės katalizuojamos L-tirozino ir L-DOPA oksidacijos reakcijos greitis (Vmax) buvo {{10}},055 ∆OD475/min ir 0,096 ∆OD475/min. hidrozolis (atitinkamai 4A, B paveikslo 1 eilutė). Grybų kinetiniai parametrai Km (Michaelio konstanta).tirozinazėgautas iš Lineweaver-Burk, kuriame substratai yra atitinkamai L-tirozinas ir L-DOPA, rodo, kad Km buvo 0,534 mg/mL ir 0,511 mg/mL be hidrozolio (linija). 1 pav. 4A, B).

Keturios linijos, gautos iš neslopinto fermento ir trijų skirtingų hidrozolio koncentracijų, susikerta 1/v ašies kairėje virš 1/S ašies. Padidėjusi hidrozolio koncentracija sumažino Vmax ir padidino Km. Konkrečiai, kai kaip substratas buvo naudojamas L-tirozinas, dėl didėjančios hidrozolio koncentracijos susidaro kelios linijos su įvairiais nuolydžiais ir pertraukomis, tačiau jos susikirto viena su kita antrajame kvadrante (4A paveikslo 1–4 eilutė). Panašūs rezultatai buvo gauti, kai kaip substratas buvo naudojamas L-DOPA (4B paveikslo 1–4 eilutės), patvirtinant teiginį, kad hidrozolyje yra mišraus tipo tirozinazės inhibitoriai. Atsižvelgiant į mišraus tipo slopinimą, hidrozolio komponentai greičiausiai suriša laisvą fermentą ir fermento substrato kompleksą. Mišraus tipo slopinimas gali atsirasti įvairiais būdais: hidrozolio slopinimas gali atsirasti dėl to, kad jie sąveikauja su vėlesniu tarpiniu reakcijos modeliu, bet ne su pradiniu fermento-substrato kompleksu [40]. Taigi nustatėme disociacijos konstantas (Ki ir Ki, atitinkamai) inhibitorių prisijungimui prie laisvo fermento (E) ir fermento ir substrato komplekso, naudojant dvigubas abipuses diagramas ir nuolydžio bei vertikalios sankirtos diagramas, palyginti su hidrozolio koncentracija, esant L-tirozinui (4C pav., D) arba L- DOPA kaip substratai (4E pav., F). Kaip parodyta 4A, B paveiksle, Ki reikšmė, kai substratas buvo naudojamas L-tirozinas, buvo maždaug 1,28 karto mažesnė nei esant L-DOPA, o tai rodo veiksmingesnį slopinančio fermento prisijungimą su L-tirozinu nei su L-DOPA. Be to, Ki reikšmė buvo 1,71 karto didesnė už L-DOPA oksidacijos Ki reikšmę, o tai rodo, kad hidrozolio komponentų afinitetas laisvajam fermentui yra stipresnis nei fermento ir substrato kompleksui. Šie duomenys rodo, kad hidrozolis turi įtakos L-DOPA fermentą, bet neprisijungia prie aktyvios vietos. Be to, Ki reikšmė buvo beveik tokia pati kaip L-tirozino oksidacijos Ki reikšmė, o tai rodo, kad mišrūs inhibitoriai yra nekonkurencingi inhibitoriai, kurie jungiasi prie laisvo fermento ir fermento-substrato komplekso su ta pačia pusiausvyros konstanta, naudojant L- tirozinas kaip substratas (4A pav.). Tačiau atitinkamai laisvo fermento ir fermento ir substrato komplekso pusiausvyros surišimo konstantos skiriasi naudojant L-DOPA kaip substratą (4B pav.), o tai rodo, kad mišraus tipo (konkurencinis ir nekonkurencinis mišrus) inhibitorius gali prisijungti ne tik laisvas fermentas, bet taip pat su fermento-substrato kompleksu, naudojant L-DOPA kaip substratą. Ankstesni tyrimai taip pat atskleidė, kad C. cassia eterinis aliejus ir cinamaldehidas yra mišraus tipo inhibitoriai [19]. Priešingai, trans-cinnamaldehidas, išskirtas iš C. cassia žievės, rodo konkurencinį grybų L-DOPA oksidacijos slopinimą.tirozinazė[32], o cinamaldehidas išskirtas iš P šaknies. cernua buvo nekonkurencinis slopinimas [35].

3.5. Nuo koncentracijos priklausomas hidrozolio koncentracijų poveikis melanogenezei

Norėdami ištirti hidrozolio poveikį ląstelių gyvybingumui ir melanogenezei esant skirtingoms koncentracijoms ({0}},0035–10,64 mg/ml), mes sukėlėme melanogenezę B16-F10 melanomos ląstelėse naudodami -MSH ir palyginome poveikis naudojant kojinę rūgštį kaip teigiamą kontrolę (5 pav.). Šio ląstelių gyvybingumo tyrimo rezultatas parodė, kad hidrozolis neturėjo citotoksiškumo, kai koncentracija B16F10 melanomos ląstelėse buvo 0, 0035–1, 064 mg / ml (5a pav.). Kadangi melanogenezės inhibitoriai yra kuriami, saugumas ir veiksmingumas turėtų būti svarbiausias daugelio programų aspektas. Tačiau B16F10 melanomos ląstelių apdorojimas hidrozoliu žymiai sumažino ląstelių gyvybingumą, kai koncentracija buvo 5, 32–10, 64 mg / ml. Remiantis saugumo ir veiksmingumo tyrimų rezultataisodos balinimasproduktų B16F10 ląstelių kultūrose, 1,064 mg/ml yra slenkstinė koncentracija atliekant pirminį atranką ląstelėje. Todėl 0, 1064–1, 064 mg / ml koncentracijos buvo panaudotos tiriant antitirozinazės mechanizmus B16F10 melanomos ląstelėse naudojant hidrozolį.

Melanogenezės slopinimas apdorojant hidrozoliu įvairiomis koncentracijomis buvo nustatytas melanino kiekio ląstelėse procentais (5b pav.). Taip pat išanalizavome MITF ekspresijos lygius naudodami Western bloting (5c pav.). Šiuose eksperimentuose melanino kiekis ir MITF ekspresijos lygiai buvo priklausomai nuo dozės slopinami COK hidrozoliu, o tai rodo, kad COK hidrozolis sumažina melanino kiekį ląstelėse slopindamas MITF sintezę.

3.6. DNR apsaugos tyrimai

Yra gerai žinoma, kad reaktyviosios deguonies rūšys pažeidžia DNR ir sukelia ląstelių senėjimą bei vėžį. DNR nikavimo tyrimai siūlo patogią modelio sistemą be ląstelių, kad būtų galima jautriai nustatyti DNR žalingų radikalų gamybą [41]. Šių eksperimentų metu Fentono reakcijos gamino hidroksilo radikalus, kurie suskaido superspiralinę plazmidinę DNR ir paverčia ją DNR įtrūkusia forma, kuri sumažino elektroforetinį mobilumą. [42,43]. Taigi, norėdami įvertinti hidrozolio DNR apsauginį aktyvumą, mes inkubavome pCI neo DNR su Fenton reagentais [44]. Kaip parodyta 6 paveiksle, superspiralinės ir įtrūkusios plazmidės formos aiškiai išsiskiria pagal jų santykinį elektroforetinio mobilumo greitį agarozės gelyje; supercoiledDNR judėjo greičiausiai, o nikuota DNR – atitinkamai lėčiausiai. Po apdorojimo hidrozoliu DNR pažeidimai šiek tiek sumažėjo, kai hidrozolio koncentracija buvo 1,33–5,32 mg/ml, o superspiralinės formos apsauga buvo atitinkamai 28–58 procentai (6–8 juostos). Esant hidrozolio koncentracijai 0,3325–0,665 mg/ml, apsaugos, palyginti su neigiama kontrole (4 ir 5 juostos), nepastebėta. Priešingai, kvercetinas veiksmingai apsaugojo plazmidės DNR nuo hidroksilo radikalų. tarpininkaujamas suskaidymas, kaip parodyta anksčiau [45]. Tai pirmieji duomenys, rodantys apsauginį hidrozolio ekstraktų iš C. osmophloeum Kanehira palieka DNR pažeidimus dėl Fentono reakcijų. Šis poveikis greičiausiai atsiranda dėl polifenolių junginių.

4. Išvados

COK jau seniai naudojamas kaip vaistinis augalas Taivane. Tačiau, mūsų žiniomis, tai yra pirmoji ataskaita, parodanti, kad hidrozoliai, pagaminti distiliuojant garais iš COK lapų, turi antioksidacinį poveikį, kaip pastebėta atliekantantioksidantasaktyvumas ir DNR pažeidimai. Mes taip pat parodėme, kad šis hidrozolis slopina melanogenezę. Atliekant GC/MS analizę, buvo nustatyta, kad pagrindiniai COK hidrozolio junginiai yra cinamaldehidas ir benzaldehidas, ir šie agentai stipriai slopina tirozinazės monofenolazės ir difenolazės aktyvumą. Mūsų tirozinazės slopinimo kinetikos vertinimais, COK hidrozolis parodė mišraus tipo nuo dozės priklausomą L-tirozino ir L-DOPA oksidazės aktyvumo slopinimą.tirozinazė. Dabartiniai hidrozolio junginiai taip pat slopino MITF baltymų ekspresiją, todėl sumažėjo -MSH sukelta melanino sintezė.

Galiausiai, tirozinazės inhibitorių, ypač naudojamų kosmetikos ir maisto produktų, kurie gali būti naudojami reguliuojamais kiekiais, saugumas yra pagrindinis aspektas. COK jau yra valgomas ir plačiai naudojamas natūralus maisto ir kosmetikos priedas. Be to, cinamaldehidas paprastai pripažįstamas kaip saugus vartoti žmonėms. COK hidrozolis yra puiki natūrali biomedžiaga, efektyvi ir saugitirozinazėir melanino sintezę slopinantis aktyvumas bei galimybė apsaugoti nuo DNR pažeidimo. Todėl manome, kad COK hidrozolis gali būti naudojamas kaip saugi ir efektyvi pigmentacijos šalinimo priemonė daugeliu atvejų.