Nauja Cistanche Tubulosa aktyviųjų komponentų atrankos strategija, pagrįsta spektro ir poveikio santykio analize ir tinklo farmakologija Ⅱ

3. Rezultatai ir aptarimas

3.1. HPLC pirštų atspaudai

3.1.1. Metodo patvirtinimas

HPLC metodo patvirtinimas parodė, kad santykinis standartinis nuokrypis (RSD) metodo tikslumui, atkuriamumui ir stabilumui buvo mažesnis nei 2,85 proc. santykinio smailės ploto (n = 11) ir 0,77 proc. santykiniam sulaikymo laikui (n = 11). To paties mėginio tirpalo tikslumas buvo tarp 0.05–{{10}},77 proc. santykiniam laikui ir 0.28– 2,7 0 proc. bendrųjų smailių santykiniam plotui. Eksperimento atkuriamumas buvo 0.03–0,20 procentų santykiniam laikui ir 0,23–2,59 procentų santykiniam bendrų smailių plotui. Mėginio stabilumas buvo 0,09–0,24 procento santykiniam sulaikymo laikui ir 0,75–2,85 procento santykiniam bendrų smailių plotui. Šie rezultatai parodė, kad nustatytas piršto atspaudas buvo patenkintas. Genipozido rūgšties tiesiniai santykiai,echinakozidas, akteozido, tubulozidas A, irizoakteozidasparodytos S4 lentelėje. R kvadrato reikšmė buvo 1.0000, o tai rodo gerą tiesiškumą. Mėginių išgavimo rezultatai parodė, kad vidutiniai genipozido rūgšties, echinakozido,akteozido, tubulozidas A, irizoakteozidasbuvo 100,37 proc., 103,59 proc., 98,46 proc., 100,81 proc. ir 101,19 proc., o mėginių išgavimo RSD buvo mažesnis nei 2,68 proc.

Spustelėkite čia, jei norite gauti daugiau informacijos apie „Cistanche Active Components“.

3.1.2. Didžiausias plotas (PA) ir santykinis sulaikymo laikas (RRT)

Etaloniniai pirštų atspaudai ir HM, WE ir HR pirštų atspaudai iš 11 C. tubulosa partijų pateikti 2 paveiksle. Vienuolika smailių, kurios gerai skyrėsi ir skyrė, buvo nustatytos kaip bendros smailės tarp HM, WE ir HR. Penki standartiniai junginiai buvo identifikuoti kaip genipozido rūgštis (A2),echinakozidas(A8),akteozido (A9), tubulozidasA (A10) irizoakteozidas(A11). Standartinis junginys,echinakozidas, kuris buvo visose chromatogramose (vidutinė sulaikymo trukmė 12.86 min.) su tinkamu smailės plotu ir geru stabilumu, buvo pasirinkta kaip etaloninė smailė ir naudojama kitų dešimties santykiniams sulaikymo laikams (RRT) apskaičiuoti. bendrosios viršūnės. Šių skirtingų formų RRT yra 0.16–1.51 diapazone. Šių bendrų smailių PA ir dispersijos koeficientas (CV procentai ) pateikti S5–S7 lentelėse. Remiantis duomenimis, įvairių formų PA CV procentų reikšmės yra atitinkamai 25,78 proc. –142,02 proc., 23,36 proc. –150,38 proc., HM, WE ir HR – 28,91 proc. –112,78 proc. Šie rezultatai atskleidžia reikšmingus kiekvieno iš jų koncentracijos skirtumusCistanche tubulosajunginys tarp įvairių formų. HM, WE ir HR pirštų atspaudai parodyti 3 paveiksle.

2 pav. Standartinių mėginių HPLC pirštų atspaudai

3.1.3. HM, WE ir HR turinys

Penkios standartinės sudedamosios dalysC. tubulosabuvo išmatuoti. Pagrindinių komponentų turinys parodytas 1 lentelėje. HM, WE ir HR palyginimas parodytas 2 lentelėje ir 4 paveiksle. C. tubulosa PhG yra biologiškai aktyvūs, bet jautrūs šilumai. Vandenyje tirpstantys karščiui jautrūs komponentai gali būti efektyviai išgauti naudojant pagrįstą metodą. Paprastai Cistanche herba ekstrahuojama vandeniu ir išgarinama į koncentruotą tirpalą tokiai cheminei analizei [26, 27, 30]. Po ekstrahavimo ir koncentravimo buvo panaudota purškimo džiovinimo technologija, o procedūra buvo pakeista iš ankstesnio straipsnio. Iš skystų garų buvo greitai pašalinamas vanduo, o tada gaunami sausi augalų žaliavų ekstraktai. Šiame etape maltodekstrino pridėjimas laikomas įprastu nešikliu, siekiant pagerinti dispersiją ir pailginti laikymo laiką. Atliekant daugybę gamybos procesų, vaistažolių augalai buvo suspausti į formulių granules su priedais. Šis pagalbinių medžiagų pridėjimo veiksmas nebuvo įtrauktas į eksperimentą. Paprastai kalbant, mūsų gamybos procesas apima ekstrahavimą, koncentravimą ir džiovinimą purškiant, kaip aprašyta 2.2 skirsnyje, lygiagrečiai su formulės granulių gamybos procesu. Norint pagaminti šiuos pusgaminius, reikia atlikti pirmiau nurodytus tris veiksmus. WE formavimo procedūra apima koncentravimą ir džiovinimą purškiant, dėl kurių lengvai prarandami termiškai jautrūs komponentai, tačiau HR gaunami ekstrahuojant ir išdžiovinus HM. Įdomu, ar gali būti, kad aktyvūs komponentai lieka HR. Remiantis mūsų rezultatais, verbaskosido kiekis žymiai sumažėjo nuo HM iki WE ir HR (atitinkamai ir ). Verbaskozido terminis stabilumas tiriamas stebint smailės ploto pokyčius naudojant HPLC kaitinimo proceso metu. Kaitinant 4 val., verbaskozido lieka 41,6 proc. Tai rodo, kad verbaskozidas yra jautrus šilumai [31]. Izoakteozidas, tubulozidas A ir echinakozidas WE išliko stabilūs po sudėtingų apdorojimo procedūrų. Ilgalaikio džiovinimo metu PhG kaupimasis reikšmingai sumažėjo, o tai gali būti siejama su šių termiškai jautrių komponentų terminiu skilimu [32]. Kalbant apie kitus tikslinius komponentus, HR ir WE reikšmingai nesiskyrė, išskyrus verbascosidą. Mūsų supratimas apie šį skirtumą leis ateityje sukurti geresnius vaistažolių nuosėdų kokybės standartus ir paversti jas gaminiais.

1 lentelė 11 C. tubulosa partijų turinys

2 lentelė. Pagrindinių komponentų turinio palyginimas (n = 11).

,

4 pav. Penkių komponentų iš skirtingų formų turinio nustatymas (n = 11). , ns: nereikšminga.

3.1.4. Pirštų atspaudų panašumo analizė

Buvo įvertinti trijų C. tubulosa grupių panašumai. Žolinės medžiagos-vandens ekstrakto, vaistažolių medžiagos-žolės likučių ir vandens ekstrakto-žolės likučių panašumo vertės buvo 0.943–0.994, 0.847–{ {9}}.995 ir 0.938–1.000 (3 lentelė).

3 lentelė HM-WE, HM-HR ir WE-HR panašumai 11 C. tubulosa partijų.

3.2. Antioksidacinio aktyvumo testo rezultatai

Įvairių C. tubulosa formų antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant DPPH, , ir šalinimo pajėgumo tyrimus, o atitinkami rezultatai pateikti 5 paveiksle. S8 lentelėje DPPH ir šalinimo pajėgumo tyrimo rezultatų diapazonai buvo { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 ir 0,32–27,65 mg/mL trims skirtingoms formoms iš 11 C. tubulosa partijų. Trijuose antioksidacinio aktyvumo testuose HM ir WE pasižymėjo stipriu slopinimu, o HR parodė silpniausią slopinimą.

Nustatyta, kad purškiant išdžiovinti WE turi reikšmingą aktyvumą net esant mažoms koncentracijoms. Ankstesnėje ataskaitoje buvo nurodyta, kad purškiant išdžiovintas Vernonia amygdalina WE, esant 0,17 mg/mL, buvo sumažintas 50 procentais [33]. Ilgas ekstrahavimo laikas ir aukšta temperatūra yra dviašmenis kardas. Viena vertus, padidinus ekstrahavimo laiką ir purškiamojo džiovinimo įleidimo temperatūrą, pagerėja derlius ir efektyvumas. Be to, ekstraktai pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu ir didesne biologinių komponentų koncentracija nei tie augalai [34]. Kita vertus, per karštas įleidžiamas oras suardo bioaktyvius junginius. Dėl tokios padidėjusios oro įleidimo temperatūros sumažėjo antioksidanto Bidens pilosa ekstrakto aktyvumas ir sumažėjo fenolio junginių kiekis [35]. Dabartiniai rezultatai atitinka pirmiau minėtą ataskaitą. Pavyzdžiui, S6 WE pasižymėjo silpnesniais radikalų slopinimo gebėjimais nei HM ir HR. Be to, S5 HR pasižymėjo stipresniu DPPH ir superoksido anijonų šalinimo gebėjimu nei HM ir WE. PhG struktūrą sudaro glikozidiniai ryšiai ir acetilo grupės, kurios lengvai hidrolizuojamos veikiant fermentams arba suyra aukštoje temperatūroje. Dėl šių reakcijų gali sumažėti kai kurių pagrindinių komponentų kiekis didelio masto gamybos metu. Tačiau tam tikrų komponentų hidrolizė arba izomerizacija gali paspartinti kitų komponentų sintezę. Tokios transformacijos dažnos apdorojant Cistanches žoleles [36–38]. Tai, kad PhG yra tirpūs vandenyje, reiškia, kad daugumą biologinių komponentų galima panaudoti ekstrahuojant vandeniu. Teiginys, kad dauguma aktyviųjų komponentų lieka WE, išliko dešimtmečius, todėl atrodo pagrįsta manyti, kad šlapias likusias medžiagas po ekstrahavimo galima išmesti. Tačiau neteisinga C. tubulosa HR laikyti atliekomis. Tyrėjai pažymi, kad PhG yra nestabilūs ir yra jautrūs fermentiniam ar hidroliziniam skaidymui [39]. Hidrolizės arba izomerizacijos reakcijos, kurios prisideda prie biologinių sudedamųjų dalių sumažėjimo fitomedicinoje perdirbimo metu, gali tuo pat metu suteikti naujų galimybių išnaudoti HR. Keičiant tradicinius ekstrahavimo metodus, galima sukurti ir efektyviau panaudoti vaistų likučius. Buvo atlikta fermentinė hidrolizė, siekiant paversti Panax ženšenio likučius į monocukrų. Padidėjo polisacharidų ir ginzenozidų, tokių kaip cukrus, gintaro rūgštis, ženšenio polisacharidai ir ginzenozidai, derlius [40]. Sophora flavescens likučiai iš naujo ekstrahuojami ultragarso bangomis etilo acetatu [41]. Atnaujintas žolelių likučių panaudojimo technologijas apibendrina Huang ir kt. [42].

Remiantis PLSR ir BCA rezultatais, penkios didžiausios skirtingų formų smailės buvo patikrintos naudojant DPPH, superoksido anijonų ir hidroksilo radikalų pašalinimo tyrimus, siekiant nustatyti svarbiausias smailes. Rezultatai iliustruoti Venno diagramoje (7 pav.). A2, A6, A8 ir A10 yra bendros smailės, kurias dalijasi HM, WE ir HR (7(a) ir 7(c) pav.) superoksido anijonų ir hidroksilo radikalų pašalinimo tyrimuose, tuo tarpu HM, WE ir HR. HR neturi DPPH tyrimo smailių. Tuo tarpu BCA modeliai rodo, kad A1, A2, A3 ir A6 yra bendros smailės, kurias dalijasi HM, WE ir HR (7 (d)–7 (f) pav.). Pažymėtina, kad Venno diagramos sutapimai rodo, kad BCA modelis atrodo tinkamesnis nei PLSR modelis, o pirmasis pasižymi daugiau pasikartojimų. BCA modelio koeficientai ir antioksidacinio gebėjimo IC50 reikšmės buvo analizuojamos naudojant RDA. Kaip parodyta 8 paveiksle, A1, A3 ir A6 iš HM ir HR yra teigiamai susiję su antioksidantų indeksais, išskyrus tai, kad A3 yra neigiamai susiję su hidroksilo radikalų šalinimo pajėgumu. A1 ir A6 iš WE turi stiprią koreliaciją su DPPH ir superoksido anijonu. A6 smailės, pastebėtos iš įvairių formų, turi stipriausią ryšį su DPPH, superoksido anijonu ir hidroksilo radikalais. A1 ir A3 taip pat rodo panašų ryšį.

7 pav

PLSR ir BCA modelio Venn diagramos: (a) DPPH tyrimas. b) pašalinimo tyrimas. (c) pašalinimo testas buvo analizuojamas PLSR modeliu. d) DPPH tyrimas. e) pašalinimo tyrimas. (f) pašalinimo tyrimas buvo analizuojamas BCA modeliu. Sutampantis skyrius buvo bendros HM, WE ir HR smailės.

3.4. Tinklo farmakologija pagrįsta analizė

3.4.1. CT tinklo statyba

Iš GeneCards duomenų bazės ir OMIM duomenų bazės buvo gauti iš viso 4359 taikiniai, susiję su antioksidaciniu aktyvumu. Tuo pačiu metu aktyvūs komponentai buvo patikrinti iš TCMSP duomenų bazės ir SwissTargetPrediction duomenų bazės. Tada UniPort duomenų bazėje buvo surinkti ir standartizuoti 198 tikslai. Buvo 159 tiksliniai genai, kuriuos dalijasi aktyvūs komponentai ir su antioksidantais susijusios ligos (žr. S1 paveikslą). KT tinklas buvo sukurtas siekiant parodyti ryšį tarp junginių ir pagrindinių genų taikinių (9 pav.).

9 pav. KT tinklas. Tinklas parodė ryšį tarp aktyvių komponentų ir pagrindinių genų tikslų.

3.4.2. PPI tinklo kūrimas ir pagrindinių tikslų patikrinimas

PPI buvo vizualizuotas naudojant STRING duomenų bazę (10 pav.). Tinklas apėmė 159 mazgus ir 2528 kraštus. Visame sąveikos tinkle jungiamieji komponentai arba mazgai, turintys daugiau tikslinių taškų, gali būti pagrindinis komponentas arba tikslinis genas, atliekantis antioksidacinį vaidmenį C. tubulosa. Rezultatai buvo atsisiųsti ir įtraukti į Cytoscape vizualizavimui. Kuo didesnė nuolatinės srovės vertė, tuo tamsesnė spalva ir kuo didesnė bendra balo reikšmė, tuo storesnis kraštas. Mes nustatėme, kad RAC-alfa serino / treonino baltymų kinazė (AKT1), interlukinas -6 (IL6), naviko nekrozės faktorius (TNF) ir kraujagyslių endotelio augimo faktorius A (VEGFA) yra centre (11 pav.), tai rodo, kad jie buvo pagrindiniai taikiniai, kai aktyvūs komponentai darė antioksidacinį poveikį. Pranešama, kad echinakozidas sumažina mitochondrijų disfunkciją reguliuodamas mitogeno aktyvuotas proteinkinazes (MAPK) ir AKT bei jų fosforilintas formas [43]. Tyrėjai spėliojo, kad C. tubulosa glikozidų antidiabetinį poveikį gali lemti antioksidacinis PhG aktyvumas, mažinantis priešuždegiminius citokinus, tokius kaip IL-6 ir TNF- [44]. Be to, echinakozidas gali pakenkti kiaušidžių vėžio ląstelių augimui, sumažindamas VEGFA ekspresiją, kad slopintų angiogenezę [45], kuri yra glaudžiai susijusi su ROS sistema, nes ROS sukelia VEGF signalizacijos ekspresiją [46].

10 pav. PPI tinklas.

3.4.3. Praturtinimo analizė ir CTP tinklo sukūrimas

Galimi antioksidaciniai junginiai veikė daugybę biologinių funkcijų, įskaitant BP, CC ir MF. 12 paveiksle (a) parodyta 10 geriausių būdų. Numatyti tikslai iš PPI tinklo daugiausia reagavo į daugelį biologinių procesų, tokių kaip organiniai cikliniai junginiai, ksenobiotiniai stimulai, neorganinės medžiagos, deguonies lygis ir teigiamas ląstelių komponentų judėjimo reguliavimas. Ląstelių komponentų analizė parodė, kad genai daugiausia buvo susiję su membranos plaustu, ekstraląsteline matrica, sekrecijos granulių liumenu, transkripcijos reguliatoriaus kompleksu ir ląstelės viršūnine dalimi. Šie taikiniai taip pat dalyvauja daugelyje molekulinių funkcijų, įskaitant DNR surišantį transkripcijos faktorių, baltymų homodimerizacijos aktyvumą, specifinį baltymų domeno surišimą ir citokinų receptorių surišimą.

12 pav. Sodrinimo analizė: a) GO sodrinimo analizė. b) KEGG sodrinimo analizė.

Siekiant ištirti šių pagrindinių centrų biologines funkcijas, buvo atlikta kelio sodrinimo analizė. Remiantis KEGG sodrinimo rezultatais, buvo sudaryta burbulų diagrama, rodanti 20 geriausių būdų. Kuo didesnė dėmė, tuo daugiau genų buvo įtraukta į kelią. Kaip parodyta 12(b) paveiksle, pagrindiniai C. tubulosa keliai buvo susiję su vėžiu, lipidais ir ateroskleroze, AGE-RAGE signalizacijos keliu sergant diabeto komplikacijomis, chemine kancerogeneze – receptorių aktyvavimu ir MAPK signalizacijos keliu. Ištirtas C. tubulosa poveikis apoptozei ir ląstelių redokso homeostazei. Duomenys rodo, kad C. tubulosa gali būti perspektyvus kandidatas gydyti nuo gaubtinės žarnos vėžio [47]. C. deserticola ekstraktas randamas vyresnio amžiaus žmonėms [48].

13 paveikslas iliustruoja koreliaciją tarp kelių ir su jais susijusių taikinių bei ryšį tarp persidengiančių tikslinių genų ir biologiškai aktyvių C. tubulosa komponentų. Buvo sukurtas pasaulinis CTP tinklo vaizdas, kurį sudarė 12 ingredientų, 159 taikiniai ir 20 kelių. Daugumą taikinių dalinosi kandidatai aktyviems junginiams. Šios kandidatinės veikliosios medžiagos, turinčios aukštą tarpusavio ryšio laipsnį, buvo atsakingos už didelį CTP tinklo, ypač kvercetino (laipsnis = 131), tarpusavio ryšį. Dauguma taikinių, tokių kaip AKT1, IL6, TNF ir VEGFA, buvo susieti su KEGG keliais, susijusiais su vėžio keliais.

13 pav. CTP tinklas.

4. Išvados

Šiame tyrime mes pirmiausia ištyrėme sudėtingas situacijas, atsižvelgdami į spektro ir efekto ryšius tarp HM, WE ir HRC. tubulosa. HPLC pirštų atspaudai irantioksidantų tyrimaibuvo naudojami skirtumams tarp H, WE ir HR nustatyti nustatytiC. tubulosa. Remiantis HPLC pirštų atspaudais, tarp 11 H, WE ir HR partijų buvo 11 smailių. Genipozido rūgštis,echinakozidas, verbascoside, tubulozidas A, irizoakteozidasbuvo nustatyti tarp šių viršūnių. Buvo nustatytas šių penkių komponentų turinys. Be to, antioksidacinis poveikisC. tubulosaHs, WE ir HR skyrėsi dėl cheminės sudėties pokyčių, kuriuos sukėlė sudėtingos gamybos sąlygos. Remiantis įvairiais statistiniais modeliais, spektro ir poveikio santykio tyrimas parodė, kad smailė A6 gali būti svarbiausias komponentas tarp trijų formų.C. tubulosa. Tyrimas buvo pagrįstas tinklo farmakologija, siekiant ištirti galimus mechanizmusC. tubulosaįjungtaantioksidacijaatliekant junginių atranką, numatant pagrindinius tikslus, tiesiant tinklus ir atliekant sodrinimo analizę. Mūsų rezultatai suteikia teorinį pagrindą žolelių likučiams ir jų potencialui perdirbtiC. tubulosagydantsu antioksidantais susijusios ligos.