Aktyvus baimės atminties fazės perėjimas nuo susitaikymo iki išnykimo naudojant ERK tarpininkaujamą susitaikymo prevenciją

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Thebaimės atminties išgavimassukelia du priešingus atminties procesus, ty rekonsolidaciją ir išnykimą. Trumpas atkūrimas skatina pakartotinį konsolidavimą išlaikyti arbapagerinti baimės atmintį,o ilgalaikis ieškojimas užgesina šią atmintį. Nors pakartotinio konsolidavimo ir išnykimo mechanizmai buvo ištirti, vis dar nežinoma, kaip atminties gavimo metu baimės atminties fazės perjungiamos nuo pakartotinio konsolidavimo į išnykimą. Čia parodome, kad nuo ekstraląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) priklausomas atminties perėjimo procesas po atkūrimo reguliuoja atminties fazių perjungimą nuo konsolidacijos iki išnykimo, užkertant kelią pakartotinio konsolidavimo indukcijai atliekant slopinimo vengimo (IA) užduotį pelių patinams. Pirma, pereinamoji atminties fazė, kuri panaikina rekonsolidacijos indukciją, bet yra nepakankama išnykimui įgyti, buvo nustatyta po rekonsolidacijos, bet prieš išnykimo fazes. Antra, atkūrimo, perėjimo ir išnykimo fazės po atminties gavimo parodė skirtingus molekulinius ir ląstelių parašus per cAMP reaguojantį elementą surišantį baltymą (CREB) ir ERK fosforilinimą migdolinėje, hipokampe ir medialinėje prefrontalinėje žievėje (mPFC). Atkūrimo fazė parodė padidėjusį CREB fosforilinimą, o išnykimo fazėje buvo keletas nervų populiacijų su įvairiais CREB ir (arba) ERK fosforilinimo deriniais šiuose smegenų regionuose. Įdomu tai, kad trys atminties fazės, įskaitant pereinamąją fazę, parodė trumpalaikį ERK aktyvavimą iškart po atkūrimo. Svarbiausia, kad ERK blokada migdoliniame kūne, hipokampe arba mPFC pereinamojoje atminties fazėje netrukdė konsolidacijos sukeltam IA atminties padidėjimui. Šie stebėjimai rodo, kad ERK signalizacijos kelias aktyviai reguliuoja atminties fazės perėjimą nuo konsolidacijos iki išnykimo ir šis procesas veikia kaip jungiklis, kuris atšaukia baimės konsolidavimą.atmintis.

Raktiniai žodžiai: ERK; išnykimas;baimės atmintis; pakartotinis konsolidavimas; perėjimas

1 Biomokslų katedra, Gyvybės mokslų fakultetas, Tokijo žemės ūkio universitetas, Tokijas 156-8502, Japonija ir

2 Žemės ūkio ir gyvosios gamtos mokslų absolventas, Tokijo universitetas, Tokijas 113-8657, Japonija

Reikšmingumo pareiškimas

Baimės atminties išgavimassukelia du priešingus atminties procesus; susijungimas ir išnykimas. Rekonsolidavimas išlaiko/gerina baimės atmintį, o išnykimas susilpnina baimės atmintį. Lieka nežinoma, kaip atkūrimo metu atminties fazės perjungiamos iš pakartotinio konsolidavimo į išnykimą. Čia mes nustatėme aktyvų atminties perėjimo procesą, veikiantį kaip jungiklį, kuris slopina pakartotinį konsolidavimą. Ši atminties pereinamoji fazė parodė trumpalaikį ekstraląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) fosforilinimo padidėjimą migdoliniame kūne, hipokampe ir medialinėje prefrontalinėje žievėje (mPFC). Įdomu tai, kad ERK slopinimas šiuose regionuose pereinamojoje fazėje stabdė su konsolidavimu sukeltą slopinimo vengimo (IA) atminties stiprinimą. Šie atradimai rodo, kad pereinamojo laikotarpio atminties procesas aktyviai reguliuoja baimės atminties atminties fazių perjungimą, užkertant kelią pakartotinio konsolidavimo indukcijai aktyvuojant ERK signalizacijos kelią.

Įvadas

Atminties atkūrimasnėra pasyvus procesas, o veikiau dinamiškas procesas, leidžiantis išlaikyti, stiprinti, susilpninti arba pakeisti/atnaujinti originalią atmintį (Misanin ir kt., 1968; Schneider ir Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus ir kt.). , 1979; Gordon, 1981; Nader ir kt., 2000; Nader ir Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima ir kt., 2014). Svarbu tai, kad išgauta sąlyginės baimės atmintis, trumpam pakartotinai veikiant sąlyginį stimulą (CS), tampa labili ir reikalauja nuo genų ekspresijos priklausomo konsolidavimo, kad ją išlaikytų ar sustiprintų (Nader ir kt., 2000; Dudai, 2002; Kida ir kt., 2002; Suzuki ir kt., 2004; Tronel ir kt., 2005; Fukushima ir kt., 2014). Ir atvirkščiai, nuolatinis arba pakartotinis CS poveikis sukelia atminties išnykimą, o tai silpnina baimės atmintį (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers ir Davis, 2002). Taigi,baimės atminties išgavimassukelia du priešingus atminties procesus, ty pakartotinį konsolidavimą ir išnykimą, nors abu procesai sukelia pakartotinį poveikį identiškam CS, tačiau skiriasi priklausomai nuo pakartotinio CS poveikio trukmės.

Bendra ir kritinė biocheminė pakartotinio konsolidavimo ir išnykimo ypatybė yra į cAMP reaguojančio elementą surišančio baltymo (CREB) tarpininkaujamos genų ekspresijos reikalavimas (Mamiya ir kt., 2009). Įdomu tai, kad mes parodėme kontrastingus molekulinius, anatominius ir elgesio parašus tarp kontekstinės baimės atminties atkūrimo ir išnykimo fazių (Suzuki ir kt., 2004; Mamiya ir kt., 2009). Baltymų sintezės blokavimas atkūrimo fazės metu sutrikdo pradinę baimės atmintį, o blokuojant baltymų sintezę išnykimo fazėje to nepavyksta padaryti, nors kontekstinė baimės atmintis buvo iš naujo suaktyvinta. Reikalavimas smegenų regionams, rodantiems CREB tarpininkaujamos genų ekspresijos aktyvavimą, skiriasi tarp konsolidacijos ir išnykimo; Atkūrimas priklauso nuo migdolinio kūno ir hipokampo, o išnykimas priklauso nuo migdolinės dalies ir medialinės prefrontalinės žievės (mPFC). Tačiau amygdaloid CREB aktyvacijos laikas skiriasi konsolidavimo ir išnykimo atminties fazėse. Šie stebėjimai rodo, kad konsolidavimo ir išnykimo fazės nėra nepriklausomos, o veikiau sąveikauja viena su kita. Įdomu tai, kad naujausi tyrimai nustatė laiko langą (pereinamąją fazę), kuris nerodo ekstraląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) aktyvacijos migdoliniame kūne po pakartotinio konsolidavimo, bet prieš išnykimo fazes po klausos baimės atminties atkūrimo (Merlo ir kt., 2018). ). Apibendrinant, šie atradimai rodo galimus mechanizmus, kuriais atminties fazės perjungiamos iš atkūrimo į išnykimą.baimės atminties išgavimas. Kitaip tariant, gali būti, kad atminties perėjimo procesas aktyviai reguliuoja šį jungiklį.

Atliekant slopinimo vengimo (IA) užduotį, pelės patiria elektrinį pėdos smūgį po to, kai jos patenka į tamsų skyrių iš šviesaus skyriaus ir susiformuojaatmintiskad išvengtumėte tamsaus skyriaus. Anksčiau, naudodamiesi šia užduotimi, parodėme, kad pakartotinio poveikio sesijos metu pelė patenka į tamsų skyrių iš šviesaus skyriaus atkūrimo ir išnykimo fazės gali būti diskriminuojamos (Fukushima ir kt., 2014). Todėl ši užduotis leidžia apibūdinti perspektyvinius molekulinius atkūrimo ir išnykimo fazių požymius, priešingai nei klasikinė kontekstinė baimės sąlygojimo paradigma, kurioje sąlyginės baimės atminties suaktyvinimas pakartotinai veikiant CS inicijuoja ir konsolidaciją, ir išnykimą; trumpas (3 min.) pakartotinis buvimas sąlyginiame kontekste skatina konsolidaciją, o ilgas (30 min.) arba pakartotinis buvimas šiame kontekste sukelia išnykimą (Eisenberg ir kt., 2003; Pedreira ir Maldonado, 2003; Suzuki ir kt., 2004; Lee ir kt., 2008; Mamiya ir kt., 2009). Be to, mes nustatėme, kad gauta IA atmintis yra pagerinta atliekant atminties konsolidavimą (Fukushima ir kt., 2014).

Suprasti perėjimo nuo konsolidacijos prie išnykimo mechanizmąbaimės atminties išgavimas, siekėme nustatyti ir apibūdinti IA atminties atkūrimo, perėjimo ir išnykimo fazių molekulinius, ląstelinius ir elgesio parašus. Mes išanalizavome CREB ir ERK aktyvavimą migdoliniame kūne, hipokampe ir mPFC rekonsolidavimo, perėjimo ir išnykimo fazėse ir ištyrėme ERK aktyvacijos vaidmenį šiuose atminties procesuose.

Medžiagos ir metodai

Pelės Visi eksperimentai buvo atlikti pagal Laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą (Japonijos neuromokslų draugija ir Tokijo žemės ūkio universitetas). Visi šiame tyrime atlikti eksperimentai su gyvūnais buvo patvirtinti Tokijo žemės ūkio universiteto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto (leidimo Nr. 280037). Visos chirurginės procedūros buvo atliekamos taikant Nembutal anesteziją ir buvo dedamos visos pastangos, kad kančios būtų kuo mažesnės. C57BL / 6N pelių patinai buvo gauti iš Charles River. Pelės buvo laikomos narvuose po penkis ar šešis, palaikomos 12/12 valandų šviesos / tamsos ciklu ir ad libitum buvo leista gauti maisto ir vandens. Tyrimo metu pelės buvo mažiausiai aštuonių savaičių amžiaus. Bandymas buvo atliktas šviesos ciklo fazės metu. Visi eksperimentai buvo atlikti aklai nuo pelių gydymo būklės.

IA testas Laipsniškas IA aparatas (OHARA Pharmaceutical) susideda iš dėžutės su atskirais šviesiais ir tamsiais skyreliais (abu 15,5 12,5 11,5 cm). Šviesos skyrius buvo apšviestas fluorescencine šviesa (2500 liuksai; Fukushima ir kt., 2008, 2014; Zhang ir kt., 2011; Ishikawa ir kt., 2016). Prieš pradedant IA mokymą, pelės buvo tvarkomos atskirai po 2 minutes kiekvieną dieną vieną savaitę. Treniruočių metu kiekvienai pelei buvo leista priprasti prie šviesos skyriaus 30 s, o giljotinos durys buvo pakeltos, kad būtų galima patekti į tamsųjį skyrių. Vėlavimas patekti į tamsųjį skyrių buvo laikomas įsigijimo matu. Kai tik pelė įėjo į tamsų skyrių, giljotinos durys buvo uždarytos. Po 5 s buvo atliktas kojų smūgis (0, 2 mA) iš viso 2 s (treniruotė). Praėjus 24 valandoms po treniruotės, pelė buvo įdėta atgal į šviesų skyrių, kol pateko į tamsųjį skyrių (vidutiniškai 459 6 15,49 s). Iš karto po to, kai pelė pateko į tamsųjį skyrių, giljotinos durys buvo uždarytos ir pelė tamsoje išbuvo tam tikrą laiką (0, 1 arba 10 min.) be pėdos smūgio (reaktyvacija). Atmintis buvo įvertinta po 48 valandų [ilgalaikės atminties po pakartotinio aktyvavimo (PR-LTM) testas] kaip kryžminio pelės delsa patekti į tamsųjį skyrių, kai ji buvo pakeista į šviesų skyrių, kaip ir pakartotinai aktyvuojant.

Pirmojo eksperimento metu ištyrėme baltymų sintezės slopinimo poveikį po pakartotinio aktyvavimo (pakartotinis buvimas tamsioje kameroje 0, 1 arba 10 min.; 1 pav.). Baltymų sintezės inhibitorius anisomicinas (ANI; Wako) buvo ištirpintas fiziologiniame tirpale (pH nustatytas iki 7.{12}}–7,4 naudojant NaOH). Pelės buvo treniruojamos, kaip aprašyta aukščiau, o po 24 valandų jos gavo nešiklio (VEH) arba ANI (150 mg/kg, ip) iš karto po pakartotinio poveikio tamsioje patalpoje 0, 1 arba 10 minučių be smūgio kojomis. (reaktyvavimas). Vartojant šią dozę, ANI slopina 0,90 procentų baltymų sintezę smegenyse per pirmąsias 2 valandas (Flood ir kt., 1973). Praėjus 48 valandoms po pakartotinio aktyvinimo sesijos, atskiros pelės vėl buvo patalpintos į šviesos skyrių ir buvo įvertintas kryžminimo delsa.

Antrajam eksperimentui [fosforilintas CREB (pCREB) ir fosforilintas ERK (pERK) imunohistochemija; Fig. 2–5], ištyrėme smegenų sritis, kurios buvo suaktyvintos po pakartotinio poveikio šviesai (kol pelės pateks į tamsų skyrių, pakartotinai veikiant tamsiajame skyriuje 0 min.) arba tamsųjį skyrių (pakartotinai buvimas tamsiame skyriuje 1 arba 1 0 min.). Pelės buvo suskirstytos į keturias Fukušimos ir kt. · Baimės atminties fazių perėjimas po atkūrimo J. Neurosci., 2021 m. vasario 10 d., • 41(6):1288–1300 • 1289grupės. Praėjus 24 valandoms po treniruotės, atskiros pelės buvo pakartotinai veikiamos šviesiame skyriuje ir po to, kai jos įėjo iš tamsaus skyriaus, liko tamsiajame skyriuje [reaktyvavimas: 0 min. tamsiajame skyriuje, atkūrimo (Recon) grupė; 1 min., pereinamoji (Tran) grupė; 10 min., išnykimo (Ext) grupė]. Kita pelių grupė nebuvo grąžinta į šviesų / tamsų skyrių [nereaktyvuota (NR) grupė]. Tada pelės buvo anestezuotos Nembutal (750 mg / kg, ip) praėjus 5, 15 arba 30 minučių po pakartotinio aktyvavimo.

Trečiojo eksperimento metu (U{{20}}126 mikroinfuzija; 6, 7 pav.) ištyrėme ERK slopinimo migdoliniame kūne, hipokampe arba mPFC poveikį atminties atkūrimui/stiprinimui, perėjimui, ir išnykimas. MEK inhibitorius U0126 (Sigma-Aldrich) buvo ištirpintas dirbtiniame smegenų skystyje, kuriame yra trys lašai Tween 80 (Sigma) 2,5 ml 7,5 procento dimetilsulfoksido (Wako), ir sureguliuotas iki pH. 7,4 su NaOH. Pelės buvo apmokytos, kaip aprašyta aukščiau, o po 24 valandų jos buvo grąžintos į šviesos skyrių (reaktyvavimas). Pelės buvo mikroinfuzuojamos su U0126 (1 mg) arba VEH į įvairias smegenų sritis iš karto po (6A, C, E-H, 7A-C pav.) arba 30 minučių po (6B pav., D) pakartotinio aktyvavimo. Praėjus 48 valandoms po pakartotinio aktyvavimo, atskiros pelės vėl buvo patalpintos į šviesos skyrių ir buvo įvertintas kryžminis vėlavimas (PR LTM). Mikroinfuzijos į hipokampą ir mPFC (0,5 ml) buvo atliekamos 0,25 ml/min greičiu. Mikroinfuzijos į migdolą (0,2 ml) buvo atliekamos 0,1 ml/min greičiu. Injekcinė kaniulė buvo palikta vietoje 2 minutes po mikroinfuzijos, o tada pelės buvo grąžintos į savo namų narvus. MEK inhibitorius SL327 (Santa Cruz Biotechnology) buvo ištirpintas dimetilsulfokside ir praskiestas fiziologiniu tirpalu. Pelės buvo apmokytos, kaip aprašyta aukščiau, o po 24 valandų atskiros pelės buvo grąžintos į šviesos skyrių (reaktyvavimas). Pelėms buvo sistemiškai švirkščiama SL327 (10 arba 20 mg/kg) arba VEH iš karto po pakartotinio aktyvavimo (7D pav. – F). Praėjus 48 valandoms po pakartotinio aktyvavimo, atskiros pelės dar kartą buvo patalpintos į šviesos skyrių ir buvo įvertintas kryžminis vėlavimas (PR-LTM).

Imunohistochemija buvo atlikta taip, kaip aprašyta anksčiau (Mamiya ir kt., 2009; Suzuki ir kt., 2011; Zhang ir kt., 2011; Fukushima ir kt., 2014; Ishikawa ir kt., 2016; Hasegawa ir kt., 2019). Po anestezijos visos pelės buvo perfuzuotos 4 procentų paraformaldehidu. Smegenys buvo pašalintos, fiksuotos per naktį, perkeltos į 30 procentų sacharozės ir laikomos 4 laipsnių temperatūroje. Koroninės sekcijos (30 mm) buvo supjaustytos kriostate.

Norint dažyti pCREB ir pERK, laisvai plūduriuojančios sekcijos buvo apdorotos 1 proc. H2O2 ir per naktį inkubuojamos su triušio polikloniniu anti-fosfo-CREB (serinas 133; S133) antikūnu (1:1000; #{{10). }}, Millipore) ir (arba) triušio monokloninis anti-fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) antikūnas (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) blokuojančiame tirpale (fosfatiniu buferiniu tirpalu ir 1 proc. ožkos serumo albumino, 1 mg/ml galvijų serumo albumino ir 0,05 proc. Triton X-100). Pjūviai buvo plaunami fosfatu buferiniu fiziologiniu tirpalu ir inkubuojami su krienų peroksidaze konjuguotu asilo anti-triušio IgG (1:500; Jackson ImmunoResearch) pCREB arba krienų peroksidaze konjuguotu ožkos anti-triušio IgG pERK 1 valandą kambario temperatūroje. pCREB signalai buvo sustiprinti biotino tiramidu ir vizualizuoti naudojant Alexa Fluor konjuguotą streptavidiną (Invitrogen). pERK signalai buvo sustiprinti naudojant TSA-FCM (Invitrogen). Sekcijos buvo sumontuotos ant skaidres ir padengtos dangteliu, naudojant montavimo terpę (Millipore).

Kiekybinis įvertinimas buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau (Frankland ir kt., 2006; Fukushima ir kt., 2014; Mamiya ir kt., 2009; Zhang ir kt., 2011; Suzuki ir kt., 2008). Struktūros buvo apibrėžtos anatomiškai pagal Franklin ir Paxinos atlasą (1997). Visus imunoreaktyvius neuronus suskaičiavo eksperimentuotojas, aklas nuo gydymo būklės

Rezultatai

Atminties fazių apibūdinimas po paieškos IA užduotyje

IA užduotis leidžia mums atskirti atkūrimo ir išnykimo fazes tuo metu, kai pelė patenka į tamsų skyrių iš šviesaus skyriaus (Fukushima ir kt., 2014). Norėdami suprasti mechanizmą, kuriuo grindžiamas atminties fazių perjungimas nuo pakartotinio konsolidavimo iki išnykimo, apibūdinome IA atminties fazes po atminties paieškos, išnagrinėdami baltymų sintezės slopinimo poveikį, reikalingą IA atminčiai atkurti ir išnykti (Fukushima ir kt., 2014). Pelės pirmiausia buvo patalpintos į šviesos skyrių. Praėjus 5 s po to, kai jie įėjo į tamsų skyrių, buvo atliktas trumpas elektrinis smūgis (treniruotė). Pelės buvo pakartotinai veikiamos šviesos skyriuje praėjus 24 valandoms po treniruotės (reaktyvavimo sesija; 1A pav.) ir buvo įvertintas jų kryžminis vėlavimas patekti į tamsų skyrių (1B pav.). Pelės buvo grąžintos į savo namų narvus iš karto po to, kai jos pateko į tamsųjį skyrių iš šviesos skyriaus (0-min. pakartotinis poveikis tamsoje; sutvirtinimo fazė) arba išbuvo tamsiajame skyriuje 1, 3 arba 10 min., nesulaukus smūgio kojos (išnykimo fazė; 1C–E pav.). Iš karto po reaktyvacijos sesijos pelėms buvo sušvirkšta sisteminė VEH arba baltymų sintezės inhibitoriaus ANI injekcija. Po 48 valandų kryžminio perdavimo delsa buvo įvertinta PR-LTM.

Remiantis ankstesniu mūsų tyrimu (Fukushima ir kt., 2014), pakartotinis buvimas šviesos skyriuje (0 min. grupė) paskatino IA atminties konsolidavimą ir patobulinimą. Dvipusė ANOVA atskleidė reikšmingą laiko (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), vaisto (F(1) poveikį ,24)=23.197, p , 0,0001) ir vaistų sąveikos laikas (F(1,24)=25.022, p , 0,0001; 1B pav.). Post hoc Bonferroni testas ir suporuotas t testas atskleidė, kad VEH ir ANI grupėse, atitinkamai, žymiai padidėjo arba sumažėjo kryžminio vėlavimo laikas PR-LTM, palyginti su pakartotinio aktyvinimo seansu (ps , 0,05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; 1B pav.). Šie stebėjimai rodo, kad IA atminties gavimas šviesos skyriuje pagerino atmintį, o baltymų sintezės slopinimas sutrikdė gautą atmintį, patvirtindamas ankstesnį pastebėjimą, kad IA atminties gavimas pagerina atmintį per konsolidavimą priklausomai nuo baltymų sintezės.

Priešingai, pakartotinis buvimas tamsioje erdvėje sukėlė ilgalaikį išnykimą [dvipusė ANOVA, laikas (1C pav., F(1,28)=9.575, p=0). {50}}04; 1D pav., F(1,36)=11.699, p=0.0016), vaistas (1C pav., F(1,28)=4.674, p=0.039; 1D pav., F(1,36)=12.285, p {{29 }}.0012), vaistų sąveikos laikas (1C pav., F(1,28)=7.916, p=0.009; 1D pav., F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], kaip buvo pastebėta anksčiau (Fukushima ir kt., 2014). VEH grupėse, kurios išbuvo tamsiame skyriuje 3 ar 10 min., PR-LTM kryžminio delsos laikas žymiai sumažėjo, palyginti su pakartotinio aktyvinimo seansu, tuo tarpu ANI grupėse buvo panašus kryžminis vėlavimas PR-LTM, palyginti su pakartotinio aktyvinimo seansu ir VEH grupės (post hoc Bonferroni testas, ps , 0,05; suporuotas t testas, 1C pav., VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, p. 0,05; 1D pav., VEH, t(9)=10.211, p , 0,0001, ANI, t(9)=1.02, p. 0,05 ). Šie stebėjimai rodo, kad pakartotinis buvimas tamsiame skyriuje 3 ar 10 minučių užgesino IA atmintį ir kad baltymų sintezės slopinimas užblokavo ilgalaikį išnykimą. Taigi, IA atminties gavimas tamsiajame skyriuje užgesina IA atmintį priklausomai nuo genų ekspresijos.

Svarbu tai, kad VEH grupė parodė panašų kryžminį delsą PR-LTM, palyginti su pakartotinio aktyvinimo seansu ir ANI grupe, kai jie išbuvo tamsiame skyriuje 1 minutę [dviejų krypčių ANOVA, laikas (F(1,36) {{ 5}}.03, p . 0.05), vaistas (F(1,36)=0.019, p. 0.05), vaistų sąveikos laikas (F(1,36)=0.011, p . 0,05); post hoc Bonferroni testas, ps . 0,05; suporuotas t testas, VEH, t(9)=0.091, p. 0,05, ANI, t(9)=0.328, p. 0,05; 1E pav.]. Šie stebėjimai rodo, kad VEH grupė neparodė nei IA atminties padidėjimo, nei išnykimo, o ANI grupė neparodė IA atminties sutrikimo. Todėl pakartotinis buvimas tamsiame skyriuje 1 min. užblokavo ir iš naujo suaktyvintos IA atminties patobulinimą ir ANI sukeltus sutrikimus, bet neužgesino IA atminties, o tai rodo, kad šis 1-min. pakartotinis eksponavimas atšaukia pakartotinio konsolidavimo indukciją. , bet jo nepakanka IA atminčiai užgesinti.

Apibendrinant galima pasakyti, kad šie rezultatai parodė, kad pakartotinis šviesos skyriaus poveikis sukelia atkūrimo fazę, o ilgesnis pakartotinis poveikis tamsioje srityje (3 arba 10 min.) sukelia išnykimo fazę. Dar svarbiau, kad buvimas 1 minutę tamsiame skyriuje sukelia pereinamąjį etapą nuo konsolidacijos iki išnykimo, o tai slopina baimės atminties atkūrimą, nesukeliant išnykimo.

Migdolinio kūno, hipokampo ir mPFC atkūrimo, perėjimo ir išnykimo fazių molekuliniai parašai po IA atminties gavimo

Kontekstinės baimės atminties konsolidavimas ir išnykimas rodo CREB fosforilinimo padidėjimą ties S133, kuris yra genų ekspresijos aktyvacijos žymuo, reikalingas atkūrimui ir ilgalaikiam išnykimui, tačiau rodo skirtingą CREB fosforilinimo dinamiką (Mamiya ir kt., 2009). ). Įdomu tai, kad naujausi tyrimai parodė, kad ERK, CREB reguliatoriaus prieš srovę, fosforilinimas nepadidėjo (Impey ir kt., 1998; Wu ir kt., 2001) bazolateriniame migdolinio kūno regione pereinant nuo pakartotinio konsolidavimo. iki užuominos baimės atminties išnykimo, nors šis fosforilinimas padidėja bazolateriniame regione, kai užsifiksuota baimės atmintis vėl konsoliduojama ir užgęsta (Merlo ir kt., 2014, 2018). Kitas tyrimas parodė, kad hipokampo ERK aktyvuojamas tik tada, kai kontekstinė baimės atmintis užgęsta, bet nėra konsoliduojama (Tronson ir kt., 2009). Šie radiniai rodo, kad konsolidacijos, perėjimo ir išnykimo fazės turi skirtingus molekulinius ir ląstelių parašus. Todėl mes išmatavome ir palyginome pCREB ir pERK lygius konsolidavimo, perėjimo ir išnykimo fazėse, naudodami imunohistochemiją. Naudodami keturias eksperimentines grupes atlikome panašius eksperimentinius grafikus, kaip ir 1B, D, E paveiksluose. Pelės buvo pakartotinai veikiamos šviesiame skyriuje praėjus 24 valandoms po treniruotės, o po to liko tamsiame skyriuje [reaktyvavimas: 0 min. tamsiajame skyriuje, pakartotinio konsolidavimo (Recon) grupė; 1 min., pereinamoji (Tran) grupė; 10 min., išnykimo (Ext) grupė]. Kita pelių grupė nebuvo grąžinta į šviesų / tamsų skyrių (neaktyvuota, NR grupė). Suskaičiavome pCREB teigiamus (pCREB1) neuronus, pERK teigiamus (pERK1) neuronus ir dvigubai teigiamus (pCREB1 / pERK1) neuronus migdoliniame kūne, hipokampe ir mPFC praėjus 30 minučių po reaktyvacijos seanso.

Migdolinis kūnas (šoninis regionas) CREB buvo aktyvuotas išnykimo ir konsolidavimo fazėse, o ERK buvo aktyvuotas tik išnykimo fazėje (2 pav. A – C). Vienpusis ANOVA atskleidė reikšmingą grupės poveikį (2B pav., F(3,29)=14.85, p , 0.0001). Panašiai kaip ir ankstesnėse išvadose (Mamiya ir kt., 2009), post hoc Newman-Keuls testas atskleidė, kad Recon ir Ext grupėse buvo daug daugiau pCREB1 neuronų nei kitose grupėse (p, 0,05). Šie stebėjimai parodė, kad panašiai kaip stebėjimai elgsenos lygiuose (1 pav.), 1 min. poveikis tamsoje (pereinamoji fazė) panaikina CREB fosforilinimo „įsijungimą“, kuris padidėtų pakartotinio konsolidavimo fazėje. Priešingai, Ext grupėje buvo pastebėta žymiai daugiau pERK1 neuronų nei kitose grupėse, nors pERK1 neuronų buvo daug mažiau nei pCREB1 neuronų Ext grupėje (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; 2C pav.).

Nuosekliai daugiau dvigubai teigiamų neuronų (pCREB1/pERK1) buvo pastebėta Ext grupėje (F(3,29)=6.698, p=0.00 14; 2D pav.), tuo tarpu Recon ir Ext grupėse buvo pastebėta žymiai daugiau pCREB1/ pERK– (pCREB vieno teigiamo) neuronų (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; 2E pav.). Taigi, pakartotinio konsolidavimo fazė parodė tik vieną pCREB1 / pERK neuronų populiaciją. Priešingai, išnykimo fazė parodė dvi pCREB1 / pERK ir pCREB1 / pERK1 neuronų populiacijas, o tai rodo, kad ERK aktyvuojamas tik pCREB1 neuronų pogrupyje. Svarbu tai, kad panašūs rezultatai buvo pastebėti migdolinio kūno bazolaterinėje srityje (2G pav., F(3,29)=13.042, p , 0,0001; 2H pav., F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; 2I pav., F(3,29)=12.633, p , 0,0001; 2J pav., F(3,29)=12 .505, p , 0,0001).

Dvifazis ERK aktyvinimas išnykimo fazėje ERK yra CREB aktyvatorius, todėl ERK aktyvinimas reikalingas baimės atminčiai konsoliduoti ir vėl konsoliduoti (Schafe ir kt., 200{{31). }}; Duvarci ir kt., 2005). Tačiau nenuosekliai nebuvo pastebėta ERK aktyvacijos migdoliniame kūne, hipokampe ar mPFC rekonsolidacijos fazėje, kai pERK buvo matuojamas praėjus 3 0 min. po pakartotinio aktyvavimo seanso (2-4 pav.). Todėl mes ištyrėme ERK ir CREB fosforilinimo laiko eigą. Atlikome panašų eksperimentą, kaip parodyta 2-4 paveiksluose, išskyrus tai, kad pCREB ir pERK lygiai buvo išmatuoti praėjus 5, 15 ir 30 min. po pakartotinio aktyvavimo seanso (pakartotinis buvimas tamsiame skyriuje {{ 66}}, 1 arba 10 min.; 5A pav.). Remiantis duomenimis, pateiktais 2-4 pav., reikšmingas pCREB1 neuronų padidėjimas buvo pastebėtas po 30 min., bet ne po 5 min., po pakartotinio aktyvavimo seanso Recon (migdoloje, mPFC ir hipokampe) ir Ext (migdolinėje ir mPFC). ) grupės, bet ne Tran grupė (5E pav., vienpusė ANOVA, migdolinis kūnas, 5 min., F(3,23)=0.346, p. 0,05, 30 min., F(3,23)=15.272, p , 0,0001; mPFC, 5 min., F(3,23)=1,169, p. 0,05, 30 min., F(3,23)=32. 346, p , 0,0001; hipokampas, 5 min., F(3,23)=0.154, p. 0,05, 30 min., F(3,23)=16.197, p , 0,0001; nesuporuotas t testas, migdolinis kūnas, pakartotinis konsolidavimas, 5 prieš 30 min., t(12)=7.807, p , 0,0001, išnykimas, 5 prieš 30 min., t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, pakartotinis konsolidavimas, 5 prieš 30 min., t(12)=5.727, p , 0.0001, išnykimas, 5 prieš 30 min., t(12)=4.188 , p=0.0013; hipokampo CA1 sritis, pakartotinis konsolidavimas, 5 prieš 30 min., t(12)=2.339, p=0.0374).

Įdomu tai, kad reikšmingas pERK1 neuronų padidėjimas buvo pastebėtas Recon, Tran ir Ext grupių migdoliniame kūne, mPFC ir hipokampe praėjus 5 min. po reaktyvacijos seanso, palyginti su NR grupe (5F pav., migdolinis kūnas, F(3,23).=10.961, p=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011; hipokampas, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Šie stebėjimai parodė, kad ERK aktyvuojamas iškart po pakartotinio aktyvinimo sesijos visose atminties fazėse. Tačiau šis pERK1 neuronų skaičiaus padidėjimas grįžo į bazinį lygį (palyginamas su NR grupe) praėjus 15 minučių po reaktyvacijos seanso (5F pav., migdolinis kūnas, F(3,20)=2.676, p. . 0,05; mPFC, F(3,23)=0,683, p. 0,05; hipokampas, F(3,20)=0,74, p. 0,05). Be to, remiantis 2-4 paveiksluose pateiktomis išvadomis, žymiai daugiau pERK1 neuronų buvo pastebėta migdoliniame kūne, mPFC ir hipokampe praėjus 30 min. po reaktyvacijos seanso tik Ext grupėje (5F pav., migdolinis kūnas, F(). 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; hipokampas, F( 3,23)=6.206, p=0.003). Taigi, rekonsolidavimo ir pereinamojo laikotarpio fazės rodo trumpalaikį ERK aktyvavimą tik ankstyvuoju laiko momentu (5 min.), o išnykimo fazė rodo dvifazę ERK aktyvaciją ankstyvuoju (5 min.) ir vėlyvuoju (30 min.) laiko taškais po pakartotinio aktyvavimo. sesija. Šie stebėjimai parodė, kad ERK aktyvacijos reguliavimo mechanizmai skiriasi konsolidavimo / perėjimo ir išnykimo fazėse. Bendrai mūsų stebėjimai parodė, kad atkūrimo, perėjimo ir išnykimo fazės turi skirtingus molekulinius parašus.

ERK aktyvavimo vaidmenys IA atminties atkūrimo ir išnykimo fazėse

Rekonsolidavimo / perėjimo ir išnykimo fazės parodė atitinkamai vienfazį ir dvifazį ERK aktyvavimą. Toliau ištyrėme ir palyginome ankstyvo (5 min.) ir vėlyvojo (30 min.) ERK aktyvavimo vaidmenis mPFC rekonsolidacijos ir išnykimo fazėse, tirdami ERK slopinimo poveikį (6 pav.).

Diskusija

Šiame tyrime ištyrėme atminties perėjimo nuo atkūrimo iki išnykimo fazių mechanizmus po IA atminties gavimo. Pirmiausia apibūdinome IA atminties fazių elgesio parašus po atkūrimo. Remiantis ankstesniu mūsų tyrimu (Fukushima ir kt., 2014), IA atminties atkūrimo sukeltas atkūrimas ir išnykimas pakartotinai veikiant šviesai (0 min. tamsoje) ir tamsoje ( atitinkamai 3 arba 10 min) skyriuose. Įdomu tai, kad IA atmintis nebuvo nei sustiprinta, nei užgesinta ir parodė atsparumą baltymų sintezės slopinimui, kai pelės buvo pakartotinai veikiamos tamsiame skyriuje tik 1 min. Todėl šie stebėjimai rodo, kad 1-min pakartotinis tamsaus skyriaus poveikis atšaukia pakartotinio konsolidavimo indukciją, bet jo nepakanka IA atminčiai užgesinti. Be to, mes nustatėme, kad ERK buvo aktyvuotas migdoliniame kūne, hipokampe ir mPFC ankstyvuoju laiko momentu (5 min.) po pakartotinio poveikio tamsoje 0, 1 arba 10 minučių. Nuosekliai ERK slopinimas šiuose smegenų regionuose blokavo IA atminties konsolidavimą / sustiprinimą ir išnykimą. Svarbiausia, kad ERK slopinimas migdoliniame kūne, hipokampe ir mPFC po 1-min. pakartotinio ekspozicijos tamsiajame skyriuje nestabdė konsolidacijos sukelto IA atminties stiprinimo, o tai rodo, kad ERK aktyvacija po trumpų (1 min.) pakartotinių ekspozicijų. į tamsųjį skyrių, kad būtų slopinamas IA atminties atkūrimas. Ir atvirkščiai, 1-min. pakartotinio ekspozicijos į tamsųjį skyrių nepakako IA atminčiai užgesinti, nors pratęstas pakartotinis ekspozicija tamsiajame skyriuje (3 arba 10 min.) šią atmintį užgesino. Todėl mūsų rezultatai rodo, kad 1-min pakartotinis buvimas tamsioje erdvėje sukelia atminties perėjimo procesą, kuris atšaukia konsolidavimą / patobulinimą, bet nepradeda išnykimo mokymosi. Kartu siūlome, kad atminties perėjimo procesas prisidėtų prie atminties fazių perjungimo nuo pakartotinio konsolidavimo iki išnykimo, naudojant ERK tarpininkaujamą atkūrimo prevenciją.

Panašiai kaip ir mūsų dabartiniai stebėjimai, neseniai atliktas tyrimas, naudojant klausos baimės kondicionavimą, parodė, kad pavieniai (1) arba užsitęsę (10) CS pristatymai atitinkamai sukelia atminties konsolidavimą ir išnykimą, nes padidėja pERK lygis bazolateriniame migdolinio kūno regione. Priešingai, tarpiniai (4–7) CS pristatymai nekeičia pERK lygių migdolinio kūno bazolateriniame regione. Svarbu tai, kad ERK slopinimas tarpiniuose CS pristatymuose neturėjo įtakos baimės atminčiai. Šis tyrimas parodė, kad po baimės atminties atkūrimo atminties fazė pereina nuo konsolidacijos iki išnykimo (Merlo ir kt., 2018). Šiame tyrime mes išplėtėme šią išvadą ir pasiūlėme, kad pereinamoji fazė aktyviai perjungia atminties fazes nuo pakartotinio konsolidavimo iki išnykimo, aktyvinant ERK signalo perdavimo kelią. Priešingai nei ankstesniuose išvadose (Merlo ir kt., 2018), mes nustatėme, kad pereinamoji fazė apima ERK fosforilinimą migdoliniame kūne, hipokampe ir mPFC. Šie neatitikimai gali būti dėl skirtingų laiko momentų, tiriančių ERK fosforilinimą; ankstesniame tyrime pERK lygis buvo matuojamas 12 minučių po CS pristatymo (Merlo ir kt., 2018), o mūsų tyrimas parodė, kad padidėjęs pERK lygis grįžo į bazinį lygį maždaug šiuo laiko momentu (15 minučių po pakartotinio poveikio). Be to, svarbu pažymėti, kad IA užduotis leidžia stebėti IA atminties pagerėjimą per konsolidavimą, todėl darome išvadą, kad ERK slopinimas pereinamojoje fazėje slopina IA atminties stiprinimą.

Ankstesni tyrimai parodė, kad ERK fosforilinimas padidėja migdolinio kūno bazolateriniame regione po 20–60 minučių po to, kai išmokstama baimės atminties išnykimas (Herry ir kt., 2006; Merlo ir kt., 2014, 2018), o hipokampas rodo. šis aktyvavimas per 1 valandą po kontekstinės baimės atminties išnykimo (Fischer ir kt., 2007; Tronson ir kt., 2009). Šiame tyrime gavome panašių stebėjimų, kad pERK padidėja praėjus 30 minučių po reaktyvacijos sesijos išnykimo fazėje. Šie radiniai rodo, kad ERK fosforilinimas yra įprastas vėlyvosios išnykimo fazės (20–60 min.) molekulinis požymis.

Be to, mes pastebėjome, kad ERK aktyvacija vyksta dvifaziškai ankstyvuoju ir vėlyvuoju laiko momentais (5 ir 30 min.) po reaktyvavimo seanso išnykimo fazėje, o šis aktyvavimas vyksta monofaziškai ankstyvuoju rekonsolidavimo etapo momentu (5 pav.). . Nuosekliai slopinant ERK smegenų regionuose šiais konsolidavimo ir išnykimo fazių momentais blokuojamas atitinkamai konsolidavimas / stiprinimas ir ilgalaikis išnykimas (6 pav. A, C-H). Šie stebėjimai rodo, kad vienfazis ir dvifazis ERK aktyvinimas yra reikalingas, kad IA atmintis būtų atitinkamai sustiprinta ir išnykusi. Svarbu pažymėti, kad ERK veikia kaip CREB fosforilinimo reguliatorius. Todėl trumpalaikis ERK aktyvavimas ankstyvoje atminties fazėje gali bent iš dalies prisidėti prie šio CREB fosforilinimo, kuris suaktyvina genų, reikalingų konsolidacijai ir ilgalaikiam išnykimui, ekspresiją.

Panašiai kaip ir ankstesniuose išvadose, naudojant kontekstinį baimės kondicionavimą (Mamiya ir kt., 2009), CREB buvo suaktyvintas rekonsolidavimo (migdolos / hipokampo / mPFC) ir išnykimo (migdolos / mPFC) atminties fazėse, o ERK buvo aktyvuotas tik išnykimo fazėje. praėjus 30 minučių po aktyvinimo seanso. Nuosekliai buvo pastebėta tik viena pCREB1/pERK– neuronų populiacija rekonsolidacijos fazėje, o atskiros neuronų populiacijos – išnykimo fazėje: pCREB1/pERK– ir pCREB1/pERK1 neuronai migdoliniame kūne (2 pav.); pCREB– /pERK1 neuronai hipokampe (3 pav.); ir pCREB1/pERK–, pCREB– /pERK1 ir pCREB1/pERK1 neuronai mPFC (4 pav.). Šie stebėjimai, ypač kontrastingi pCREB–/ pERK1 ir pCREB1/pERK– neuronų stebėjimai, rodo, kad CREB ir ERK aktyvacija kiekvienoje smegenų srityje reguliuojama skirtingai, kai atmintis užgęsta, o vėlyvoji ERK aktyvacija yra specifinė ir aiški. baimės atminties išnykimo vaidmenys, palyginti su kitais atminties procesais, tokiais kaip konsolidacija ir pakartotinis konsolidavimas, kaip aptarta toliau. Įdomu tai, kad mes pastebėjome, kad pERK1 neuronų buvo gausiau mPFC, palyginti su hipokampu ir migdolais, nes mPFC parodė didesnį pERK1 neuronų (išnykimo fazė) ir pCREB1 neuronų (rekonsolidavimo fazė) santykį, palyginti su hipokampu ir migdolais, o tai rodo, kad ERK aktyvinimas mPFC vaidina konkretesnį atminties išnykimo vaidmenį.

Lieka neaišku, ar atkūrimo, perėjimo ir išnykimo atminties fazėse aktyvuojamos tos pačios ar skirtingos neuronų populiacijos. Ankstesniame tyrime buvo nustatytas „baimės neuronų“ ir „išnykimo neuronų“ aktyvavimas migdoliniame kūne, kai atitinkamai vėl suaktyvinama arba užgęsta baimės atmintis (Herry ir kt., 2008). Todėl gali būti, kad ERK ir CREB aktyvuojami skirtingose ​​neuronų populiacijose, turinčiose skirtingą laiko profilį (ty „rekonsolidavimo neuronai“ ir išnykimo neuronai). Kaip aptarta aukščiau, pCREB1 neuronai, įskaitant pCREB1 / pERK1 neuronus, gali reguliuoti IA atminties atkūrimą ir ilgalaikį išnykimą, aktyvindami genų ekspresiją kaip atitinkamai konsolidavimo ir išnykimo neuronus. Atvirkščiai, ERK aktyvacija pCREB–/pERK1 neuronuose gali prisidėti prie CREB sukeltos transkripcijos aktyvacijos, kurios prireiktų konsolidacijai, atšaukimo, nes šis ERK aktyvavimas ypač stebimas vėlyvoje išnykimo fazėje; ERK suaktyvėjo rekonsolidacijos neuronuose, kad panaikintų genų ekspresijos aktyvavimą išnykimo fazėje. Įdomu tai, kad ankstesnis tyrimas parodė, kad hipokampo ERK aktyvacija blokuoja c-fos indukciją, kai išnyksta kontekstinė baimės atmintis (Guedea ir kt., 2011), todėl padidėja galimybė, kad šis ERK aktyvinimas prieštarauja CREB signalizacijos keliui. Svarbu nustatyti neuronų populiacijas, kurios reguliuoja konsolidaciją, perėjimą ir išnykimą, ir ištirti šių neuronų molekulinius parašus ir funkcinę reikšmę. Be to, šiame tyrime nustatyta nervų populiacijų sąveika lieka nežinoma. Gali būti, kad „išnykimo (perėjimo) neuronai“ moduliuoja rekonsolidavimo neuronų funkciją, kad užkirstų kelią pakartotiniam konsolidavimui dėl jų sąveikos (Eisenberg ir kt., 2003; Merlo ir kt., 2014). Todėl taip pat svarbu ištirti šias sąveikas migdoliniame kūne, mPFC ir hipokampe ir tarp jų.

Anksčiau mes parodėme, kad hipokampas nerodo CREB fosforilinimo ir lanko ekspresijos pokyčių po kontekstinės baimės išnykimo, ir nuosekliai baltymų sintezės slopinimas hipokampe išnykimo fazėje nesugeba blokuoti ilgalaikio išnykimo (Mamiya ir kt. , 2009). Šie stebėjimai iškėlė galimybę, kad hipokampas nėra reikalingas ilgalaikiam išnykimui. Tačiau mes parodėme, kad ERK aktyvuojamas hipokampe po to, kai išmokstama IA atmintis, ir nuosekliai, blokuojant ERK aktyvavimą hipokampe, trukdo ilgalaikis išnykimas. Todėl mūsų dabartiniai stebėjimai rodo esminius hipokampo vaidmenis atminties išnykime. Kartu su ankstesniais atradimais siūlome, kad hipokampas reikalingas atminčiai išnykti, bet ne į konsolidaciją panašiam procesui, siekiant stabilizuoti „išnykimo atmintį“ aktyvinant genų ekspresiją.