Urolitino A senėjimą stabdantis poveikis galvijų kiaušialąstėms in vitro 2

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

2.8.Statistinė analizė

Duomenys iš embrionų gamybos ir kokybės seansų buvo analizuojami naudojant Proc Glimmix iš SAS (Statistical Analysis Systems, SAS Inst., Inc., Cary, NC, JAV), naudojant dvejetainį paskirstymą ir logit kaip sąsajos funkcijas. Apibendrintas linijinis mišrus modelis apėmė gydymą (UA dozės, senėjimo efektas ir moters amžius bei jų sąveika) kaip fiksuotą efektą ir pakartojimus kaip atsitiktinį poveikį. Be to, buvo apskaičiuoti kiekvieno gydymo vidurkiai, o grupių palyginimas atliktas naudojant PDIFF testą. JC-1 duomenys, mRNR nuorašo lygiai ir mt-DNR kopijų skaičius buvo analizuojami naudojant SAS Proc Mixed su modeliu, apimančiu gydymą (UA efektas, senėjimo poveikis ir (arba) moters amžius ir jų sąveika). kaip fiksuotas efektas. Sesija buvo laikoma atsitiktiniu efektu. Chromosomų konfigūracijų duomenys buvo lyginami tarp grupių naudojant tikslų Fišerio testą, 2 x 2 nenumatytų atvejų lentelėje. Rezultatų analizė buvo laikoma statistiškai reikšminga, kai p<>

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

3. Rezultatai

3.1. Ankstesnis tyrimas – dozės ir atsako tyrimas

Kiaušialąstės brendimo būklė, stebėta UA, papildyto brandinimo terpe, dozės ir atsako tyrimo metu, parodyta 1 paveiksle. Šis papildymas reikšmingai paveikė oocitų branduolio brendimo stadijas. 50 UA grupė (38,9±0,5 proc.) parodė didesnį oocitų skaičių AI/TI fazės būsenoje, palyginti su kontroline (10,8±{{). 15}}.5 proc ,P=0.03)ir 10 UA(0.0±0.{{ 45}} proc. ,p=0.0006) grupėse. Šioje fazėje didesnis rodiklis 25 UA (17,2±0,5 proc. ,p=0.05) grupėje, palyginti su taip pat buvo nustatyta 10 UA grupė. Be to, buvo nustatyta tendencija tarp 50 UA grupės ir 1 UA (14,3±2,0 proc. ,p=0.08). Didžiausia dozė taip pat parodė žalingą poveikį, sumažindama II metafazės klasifikuojamų oocitų skaičių. (MII) stadija (50 UA, 44,4 ±2,0 proc. ), lyginant su kontroline (86,5±7,0 proc. ,p=0.003),1 UA(82,1±2,5 proc. ,p{{ 53}},01), 10 UA(89,3±6,5 proc. ,p=0.002) ir 25UA(82,8±9,0 proc. ,p=0.01) grupių. Tarp likusių skirtumų nepastebėta oocitų brendimo stadijos. GV ir CCl brendimo fazės nebuvo parodytos 1 paveiksle, nes šiose kategorijose nebuvo įvertinta oocitų.

Dozės ir atsako testas neparodė reikšmingo UA koncentracijos poveikio skilimo ir išsiritusių embrionų greičiui. Tačiau 7 dieną pagamintų embrionų greičiui įtakos turėjo skirtingos UA koncentracijos. 50 UA grupėje (7,2±2,7 proc.) 7 dieną buvo mažesnis embrionų skaičius, palyginti su 1 UA (28,5±4,8 proc. ,p=0.004), 10 UA (20,4±4,0 proc. , p=0.03) ir 25 UA(18,5±4,7 proc. ,p=0.05) grupės. Nors reikšmingų skirtumų tarp kontrolinės ir 50 UA grupių nenustatyta, nustatyta tendencija (p=0.06). Be to, 7 dieną embrionų dažnis (p =0,07) būna didesnis po 1 UA dozės papildymo, palyginti su kontroline grupe. Be to, 1 UA grupė padvigubino puikios / geros kokybės embrionų skaičių (68,9 proc. 1 laipsnio embrionų,n=20), palyginti su kontroline (34,6 proc. ,n=10) ir 10 UA (26,8). procentai ,n=10). Didesnėmis dozėmis gautas mažas 1 laipsnio embrionų skaičius: 25UA grupė (15,4 proc. ,n=4) ir 50UA (35,4 proc. ,n=3). Remiantis aukščiau minėtais rezultatais, 1 uM UA buvo pasirinktas tolesniems tyrimams.

3.2.1 eksperimentas – senų ir fiziologiškai subrendusių kiaušialąsčių kiaušialąsčių kokybė ir vystymosi potencialas

3.2.1.Branduolinis brendimas

Ištyrėme UA papildymo poveikį senų ir fiziologiškai subrendusių oocitų, surinktų iš priešbrendimo ir suaugusių patelių, chromosomų brendimo būklei. Nepriklausomai nuo UA poveikio, kiaušialąstės senėjimas ir patelės amžius padarė didelį žalingą poveikį brendimui. Didesnis MII fazės dažnis buvo nustatytas kontroliniuose oocituose, palyginti su senais (22 val. =93,2±5,4 proc. vs. 30h=77,6±4,1 proc., p {{11) }}.{21}}2). Be to, buvo nustatytas senų lytinių ląstelių ir priešbrendimo patelių, turinčių daugiau oocitų AI/TI fazėje (22 val. =3,4±0,5 proc., palyginti su 30 val.), brendimo progresavimas. =17.9±0.6 proc. ,p=0.01 ir iki brendimo=21.1±1.1 proc., palyginti su suaugusiuoju=6.8±0.7 proc. p =0.03). Be to, po 30 val. IVM nustatytas didesnis degeneruotų oocitų skaičius, palyginti su po 22 val. (7,1 ± 1,39 proc., palyginti su 4,1 ± 0,89 proc. , p =0.02). . Moterų amžius ir UA papildymas netrukdė (p 0,05) degeneruotų oocitų skaičiui.

Tiek in vitro senėjimas, tiek UA papildymas brandinimo terpėje reikšmingai paveikė oocitų chromosomų konfigūraciją prieš brendimo ir suaugusių patelių (p.<0.05, figure="" 2).="" on="" the="" al/ti="" phase="" of="" the="" maturation="" status,="" higher="" rates="" of="" oocytes="" were="" found="" in="" this="" stage="" in="" the="" control="" aged="" 30="" h="" prepubertal="" group="" (46.7±0.5%)="" when="" compared="" to="" control="" prepubertal="" (0.0±0.0%,p="0.05)" and="" ua="" aged="" 30h="" prepubertal="" (0.0="" ±0.0%,p="0.02),and" both="" adult="" control="" (5.6±0.5%,p="0.01" and="" ua="" adult,0.0±0.0%,="" p="0.0002)and" control="" aged="" 30h="" adult="" (9.1±10%,p="0.02)groups." a="" trend="" was="" also="" identified="" between="" ua="" adults="" and="" ua="" aged="" 30="" h="" adult="" (p="">

Kalbant apie MII fazę, atitinkančią visišką branduolio brendimą, taip pat buvo nustatyti reikšmingi skirtumai tarp grupių (2 pav.). Mažesnis oocitų kiekis MII stadijoje nustatytas kontrolinėje grupėje, kuriai buvo 30 val. iki brendimo (53,3±20 proc.), palyginti su kontroline priešbrendimo stadija (10{{2{). {26 ±10,5 proc. ,p=0.0002) ir kontrolinės 30 metų amžiaus (86.0±5,5 proc. p =0.056) grupės. Be to, suaugusiųjų UA grupėje buvo didesnis subrendusių oocitų (MII) rodiklis, palyginti su UA, 30 val. amžiaus suaugusiu (76,2±11,3 proc., p=0.01), kontroliniu 30 valandų suaugusiu (86). 0±5,5 proc. ,p=0.08)ir kontrolinis suaugęs (83.3±4.5 proc. ,p=0.057).

Skirtumų tarp likusių oocitų brendimo etapų nepastebėta.flavonoidai,Apibendrinant galima teigti, kad UA papildymas pagerino senėjimo procesui pakenktų oocitų brendimo progresą in vitro, ypač patelėms iki brendimo. Taigi buvo nustatytas svarbus UA senėjimą stabdantis poveikis.

3.2.2.Mitochondrijų membranos potencialas

Siekiant išanalizuoti mitochondrijų disfunkcijos dalyvavimą moterų senyvuose oocituose ir UA bei motinos amžiaus poveikį, buvo įvertintas mitochondrijų membranos potencialas (MMP) skirtingų grupių oocituose.

Cistanche gali kovoti su senėjimu

Nepriklausomai nuo moters amžiaus ir UA poveikio, oocitų senėjimas turėjo reikšmingą žalingą poveikį MMP, įvertintą kaip išmatuotos raudonos ir žalios fluorescencijos santykį (22 val. santykis =0,54±1,8 proc. vs. 30hratio{{6}). },47±1,5 proc., p=0.002).

Moters amžiaus, senėjimo efekto ir UA papildymo derinys brendimo metu reikšmingai (p{0}}.{{10}}07) turėjo įtakos MMP (3 pav.). Kaip pastebėta 3 paveiksle, didesni MMP rodikliai buvo gauti UA priešbrendimo (santykis =0,55±0,04) ir UA suaugusiųjų (santykis =0,63±0,04) grupėse, kuriose oocitai buvo brandinami 22 val. , lyginant su kontroline 30 val. amžiaus suaugusiuoju (santykis =0,45±0,04,p=0.04 ir p=0.0007, atitinkamai) ir UA, 30 val. suaugusiuoju (santykis{ {23}}.45±0.03,p=0.03 ir p=0.0003, atitinkamai) grupės.hesperidino vartojimasBe to, reikšmingas JC{{0}} agregatų/monomerų santykio padidėjimas, o tai rodo reikšmingą MMP padidėjimą, buvo pastebėtas UA suaugusiųjų grupėje, palyginti su kontroline suaugusiųjų (santykis =0.47). ±0.04,p =0.0031),kontrolė iki brendimo (santykis=0.52±0,04, p=0). 03), kontrolinė 30 val. suaugęs (santykis=0.48±0,03,p=0.003) ir UA, 30 val. suaugęs (santykis=0.47±0,03,p{{25). }}.001) grupės. Taip pat buvo nustatyta tendencija tarp UA iki brendimo ir UA iki 30 valandų iki brendimo (p=0.07).

Apibendrinant galima pasakyti, kad UA pagerino MMP fiziologinio brendimo metu, tačiau negalėjo įveikti neigiamo senėjimo poveikio tiek ikibrendimo, tiek suaugusiems oocitams.

3.2.3.Embrioninis vystymasis

Embriono vystymosi potencialas buvo įvertintas pagal skilimo, D7 ir išsiritusių embrionų greitį, gautą taikant skirtingus gydymo būdus (senėjimą ir UA papildymą), taikytas priešbrendimo ir suaugusių patelių SGK brendimo metu. Nepriklausomai nuo moters amžiaus ir UA poveikio, oocitų senėjimas turėjo reikšmingą žalingą poveikį skilimui (22 val.{2}},5±1,7 proc., palyginti su 30h=68,6±2,0 proc. p=0,0001) ir D7 embrionų rodikliai (22 val.=18.6±1,9 proc.

palyginti {8}}.1±1,5 proc., palyginti su UA=20,0±2,0 proc. ,p=0.0009).

Patelės amžiaus, senėjimo efekto ir UA papildymo derinys brendimo metu reikšmingai (p {{0}}.{{30}}1) turėjo įtakos embriono vystymuisi, būtent skilimui ir D7 embrionų dažnis (2 lentelė). Didesnis skilimo greitis buvo pasiektas, kai suaugę oocitai buvo brandinami 22 valandas su UA papildymu arba be jo (kontrolinė suaugusiųjų =1.4±3,2 proc. ir UA suaugusiųjų =80). 9±3,4 proc.), o priešbrendimo oocitai subrendo 22 val. su UA papildymu (UA iki brendimo=80.6±3,2 proc.), palyginti su UA 30suaugusiais (66,5±4,2 proc. ,p Mažiau nei arba lygus 0,01), kontrolinė 30 val. iki brendimo (66,9±3,9 proc.,p Mažiau arba lygi 0,02) ir UA, 30h iki brendimo (67,2±4,0 proc.,p Mažesnė arba lygi 0,01) grupės (2 lentelė). Tendencija (p=0.09) taip pat buvo nustatyta tarp kontrolinės suaugusiųjų ir kontrolinės 30 valandų amžiaus suaugusiųjų grupių.

Another parameter that was significantly (p=0.01) influenced by the combination of the female age, the supplementation with UA, and COCs aging was the rate of embryos produced at day 7(Table 2). Exceptions were made for the UA prepubertal and UA 30 h prepubertal groups, the UA adult group presented the highest rates of the embryo at day7 (26.8±4.3%,p≤0.05). Moreover, lower D7 embryo rates were produced from aged oocytes from both adult and prepubertal females without the supplementation of UA (control aged 30hprepubertal=7.7±2.6% and control aged 30h adult=7.7±2.6%)compared to those that were supplemented with UA, respectively (UA aged 30 h prepubertal=18.9±4.0%,p=0.03 and UA aged 30 h adult=15.9±4.0%,p=0.09). The supplementation of UA to the maturation medium did not significantly (p>0.05) neturėjo įtakos pagamintų 1, 2 ir 3 klasių embrionų kokybės rodikliams, taip pat senėjimo poveikis ar visi tirti poveikiai kartu (3 lentelė). Tačiau puikios / geros kokybės embrionų, pagamintų, kai UA buvo papildyta 22 valandas brandintais oocitais, skaičius padvigubėjo (3 lentelė).

3.3.2 eksperimentas

3.3.1.Genų raiškos lygiai

Siekiant ištirti UA poveikį ir motinos amžiaus įtaką Nrf2 signalizacijos keliui, NFE2L2 ir NQO1 genų ekspresijos lygių analizė priešbrendusių ir suaugusių karvių GC kultūroje buvo įvertinta RT-qPCR. Nepriklausomai nuo kitų tirtų veiksnių, patelės amžius reikšmingai paveikė NFE2L2 geno ekspresiją, o tai atsispindi aukštesniu NFE2L2 transkriptų lygiu ikibrendimo patelių GC (mRNR lygiai prieš brendimą=0).{11}}0015 ±0,0012 proc., palyginti su suaugusiuoju=0,00011±0,0012, p=0,048).

The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly(p>0.05) turi įtakos NFE2L2, NQOl ir mt-ND5 genų genų ekspresijos lygiams. 4 paveiksle pavaizduoti šių genų ekspresijos lygiai, kurie buvo normalizuoti naudojant atitinkamą kontrolę, tiek UA gydytuose priešbrendimo, tiek suaugusiųjų GC.

3.3.2.mt-DNR kopijos numeris

Analysis of mt-ND5 DNA content in GC culture from prepubertal and adult cows was assessed by qPCR. The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly (p>0.05) turi įtakos mt-ND5 geno kopijos skaičiui.prarasta imperija cistanche5 paveiksle pavaizduotas šio geno kopijų skaičius, normalizuotas su atitinkamomis kontrolėmis, tiek UA gydytuose priešbrendimo, tiek suaugusiųjų GC.

4. Diskusija

Per pastaruosius dešimtmečius buvo pastebėta, kad ART paklausa auga gyvuliams [8, 46, 47]. Be to, pavėluotas gimdymas, susijęs su vyresniu motinos amžiumi, dabar tapo pagrindiniu veiksniu, paskatinusiu moteris griebtis ART [5]. Oocitų kokybė yra labai svarbi sėkmingam pastojimui, o moters lytinių ląstelių senėjimas yra pagrindinis rūpestis dėl ART sėkmės. Nepaisant didėjančios pažangos šioje srityje, taikomos technologijos dar negali atkurti vaisingumo, atsukti biologinį laikrodį [7]. Šiame darbe buvo sukurtas su amžiumi susijusio galvijų oocitų nevaisingumo tyrimo modelis. Dėl panašumų į žmogaus nėštumą, folikulinius ir endokrininius reiškinius[48,49], šis modelis taip pat gali būti naudingas atliekant žmogaus tyrimus, išvengiant etinių ir fizinių apribojimų, trukdančių šiems žmogaus oocitų tyrimams. Mūsų sukurtas moterų lytinių ląstelių senėjimo modelis pasirodė esąs labai efektyvus ir tinkamas tirti įvairias problemas, susijusias su reprodukciniu senėjimu ir vaisingumo sutrikimais, šiuo metu vienu iš svarbiausių iššūkių pasaulyje. Be to, šiame darbe taip pat labai svarbu ieškoti naujų būsimų antioksidantų terapijų, galinčių užkirsti kelią nevaisingumui, kurį sukelia moterų lytinių ląstelių senėjimas.

Pateikti rezultatai pirmą kartą pranešė apie teigiamą UA poveikį ART rezultatams. UA yra maisto metabolitas, galintis užkirsti kelią su amžiumi susijusių disfunkcinių mitochondrijų kaupimuisi, sukeldamas jų mitofagiją ir pailgindamas ląstelių gyvenimo trukmę [28]. Kadangi UA niekada anksčiau nebuvo išbandytas galvijų dauginimosi srityje, buvo naudojamos įvairiose ląstelių linijose sėkmingai pritaikytos dozės, rodančios jo priešvėžinį, priešuždegiminį ir senėjimą stabdantį poveikį [28,35,39]. Mūsų tyrime ankstesnė dozė buvo atliktas atsako tyrimas ir 1 uM UA koncentracija buvo aiškiai nustatyta kaip perspektyviausia. Be to, žalingas poveikis buvo įrodytas didesnėmis dozėmis, ypač 50 uM UA doze, pakenkdamas branduolio brendimo progresavimui iki MII. Šis poveikis atsispindėjo embriono vystymosi sutrikime. Atitinkamai, Liu ir kolegos (2019) pastebėjo žymiai sumažėjusį ląstelių gyvybingumą ir žmogaus senstančių odos fibroblastų proliferaciją, kai UA koncentracija yra 50 uM. Jie nurodė, kad didelės UA dozės sumažina ląstelių gyvybingumą ir padidina ląstelių, sulaikytų G/M ląstelių cikle, skaičių [35]. Priešingai, 7 dieną po 1 uM UA papildymo brandinimo terpėje, palyginti su kitomis dozėmis, susiformavo didesnis embrionų skaičius. Siekiant toliau tirti galimus UA veikimo mechanizmus patelių dauginimuisi, buvo atliktas oocitų senėjimo tyrimas ir naudojant skirtingo amžiaus pateles kaip oocitų donores. Yamamoto ir bendradarbiai (2010) pranešė apie su amžiumi susijusį senų karvių tręšimo greičio mažėjimą, parodydami, kad šie oocitai buvo labiau linkę atnaujinti pirmąjį mejozinį dalijimąsi brendimo metu ir dažnai jau buvo inicijuoti mejozinį brendimą renkant oocitus [50]. Šie duomenys leido manyti, kad vyresnio amžiaus karvių oocitai branduolyje brendo greičiau ir MII fazę pasiekė greičiau nei jaunų patelių oocitai dėl mažesnės oocitų kompetencijos [51]. Atitinkamai, mūsų tyrimas atskleidžia, kad moterų donorų amžius ir oocitų senėjimo procesas reikšmingai įtakoja oocitų chromosomų konfigūraciją brendimo metu. Tiesą sakant, iki brendimo sulaukusių karvių oocituose buvo didesnis uždelsto etapų, pvz., Al/TI fazių, dažnis (ikibrendimo =21,1 proc., palyginti su suaugusiųjų =6,8 proc.), o tai rodo lėtesnį branduolio progresavimą. brendimo, kurį gali lemti mažesnė oocitų kompetencija, kaip pasiūlė Soto-Heras ir kolegos (2018). Senyvuose oocituose taip pat yra mažesnis kiekis oocitų, pasiekusių MII fazę per 30 valandų laikotarpį (7,6 proc.), palyginti su fiziologiniu periodu (93,2 proc.). Be to, buvo nustatytas teigiamas gydymo UA poveikis fiziologinio brendimo metu, taip pat senėjimą stabdantis poveikis tiek iki brendimo, tiek suaugusioms patelėms.

Remiantis mūsų išvadomis, tyrimas parodė, kad melatonino papildymas brendimo in oitro metu gali paskatinti galvijų SGK mejozės atsinaujinimą, o kontroliniai oocitai, auginami be hormonų, turėjo lėtesnį mejozės atsinaujinimo greitį [52]. Priešingai, papildymas kitais antioksidantais, tokiais kaip kvercetinas, vitaminas C ar resveratrolis, neturėjo jokio poveikio branduolio brendimo greičiui, net jei buvo pastebėtas sumažėjęs ROS kiekis arba padidėjęs antioksidantų fermentų kiekis [53, 54].mikronizuota išgryninta flavonoidų frakcija 1000 mgAtvirkščiai, mūsų rezultatai rodo, kad UA gali išgelbėti oocitus nuo senėjimo poveikio tiek suaugusioms, tiek iki brendimo moterims, kurios turi mažesnę kompetenciją ir pagerina brendimo greitį.

Vienas iš pagrindinių prastų vaisingumo rezultatų, turinčių įtakos oocitų kokybei, veiksnių yra susijęs su mitochondrijų funkcijomis, kurios pablogėja senstant motinai ir senstant po ovuliacijos [21,55]. MMP buvo plačiai ištirtas įvairiais modeliais, atskleidžiant, kad tiek senstančios gametos po ovuliacijos, tiek motinos senėjimas sukelia mitochondrijų funkcijos praradimą [56]. Todėl MMP praradimas neigiamai atsiliepė oocitų ir embrionų vystymuisi [26,57]. Remiantis šiais duomenimis, mūsų tyrime buvo nustatytas sumažėjęs MMP santykis senyvo amžiaus oocituose iš ikibrendimo ir suaugusių karvių. Be to, UA papildymas auginimo terpėje padidino ikibrendimo ir suaugusių oocitų MMP, kurie subrendo 22 valandas, ir pasireiškė didesniu skilimo greičiu. Šie duomenys atitinka rezultatus, gautus Liang ir bendradarbių (2017), kurie pastebėjo MMP padidėjimą, kai galvijų oocitai buvo papildyti melatoninu 22 valandas [26]. Tačiau mes taip pat nustatėme MMP sumažėjimą senuose oocituose, papildytuose UA, o tai reiškia, kad UA gali nepajėgti pakeisti neigiamo MMP senėjimo poveikio. Buvo pastebėti prieštaringi rezultatai, susiję su MMP, papildžius senus oocitus antioksidaciniais junginiais. Iš tiesų, keli autoriai pranešė apie didesnį MMP kiekį oocituose po papildymo melatoninu [26] ir laminarinu [21], o kiti pastebėjo priešingą – sumažėjusį MMP senyvuose oocituose, gydomuose L-karnitinu [58] ir melatoninu [38]. Be to, Ryu ir kolegos (2016) parodė, kad pelių mioblastuose, auginamuose UA, sumažėjo MMP [28]. Atsižvelgiant į mūsų rezultatus, reikėtų atlikti tolesnius tyrimus, siekiant pagilinti žinias apie UA veikimo mechanizmą oocitų mitochondrijose ir paaiškinti nustatytą skirtingą poveikį senyviems ir fiziologiškai subrendusiems oocitams.

Buvo plačiai pranešta, kad vidinė oocitų kokybė yra pagrindinis tolesnio embriono vystymosi veiksnys. Sukaupti įrodymai atskleidė, kad kai kurie ląstelių ir molekuliniai sutrikimai atsiranda per ilgesnį in vitro brendimo laikotarpį, taip pat per in oivo senėjimą po ovuliacijos [57]. Be to, šie anomalijos gali turėti reikšmingą poveikį oocitų kokybei, o tai atsiliepia embrionų gamybai [52]. Norėdami parodyti, kad UA gali veikti kaip senėjimą stabdantis junginys ir pagerinti oocitų kokybę, atitolindamas oocitų senėjimą, ištyrėme senų oocitų vystymosi gebėjimus po apvaisinimo in vitro. Mūsų tyrime buvo pastebėtas reikšmingas (p Mažiau arba lygus 0,01) žalingas lytinių ląstelių senėjimo poveikis skilimo ir 7 dienos embrionų gamybos greičiui. Atitinkamai, keli autoriai nurodė, kad senų patelių reprodukciniai gebėjimai mažėja dėl amžiaus, o tai atsispindi mažesniu vaisingumu ir prasta embriono kokybe [44,55]. Kita vertus, ankstesniuose tyrimuose, kuriuose buvo tiriamos kitos antioksidantų molekulės, skirtos seniems oocitams išgelbėti, buvo pranešta apie kelių šių junginių teigiamą poveikį brendimo in vitro metu įvairių rūšių pagyvenusių patelių, pavyzdžiui, galvijų [58], kiaulių [58], embrionų vystymuisi. 38] ir pelėms [6]. Pavyzdžiui, L-karnitinas buvo ištirtas su galvijų senyvo amžiaus oocitais ir reikšmingų skirtumų pagal gautus skilimo rodiklius nenustatyta. Tačiau buvo nustatytas reikšmingas zigotų, išsivysčiusių iki blastocistos stadijos, skaičiaus padidėjimas, palyginti su senais oocitais be L-karnitino [59]Mūsų rezultatai taip pat rodo, kad UA papildymas fiziologinio brendimo metu pagerino ikibrendimo ir suaugusių patelių skilimo greitį. Nors UA amžiaus oocitų skilimo greitis reikšmingai nesiskyrė nuo kontrolinio amžiaus oocitų, didesnis D7 embrionų dažnis buvo nustatytas UA amžiaus oocituose tiek iki brendimo, tiek suaugusių patelių. Šie rezultatai parodė, kad senėjimą stabdantis UA poveikis, anksčiau nustatytas skirtingose ​​ląstelių kultūrose [28, 35], galioja oocitams ir embrionams. Oocitų senėjimas yra daugiafaktorinis procesas, kuris sutrikdo embriono vystymąsi, o senų oocitų vystymosi gebėjimų atkūrimas yra svarbus tikslas, kuris buvo pasiektas atliekant šį tyrimą.

Be to, mes taip pat įvertinome UA prevencinį vaidmenį su amžiumi susijusiam embriono kokybės pablogėjimui. Nors šiame tyrime reikšmingų embrionų kokybės skirtumų nenustatyta, kiaušialąstės, papildytos UA, padidino perkeliamų embrionų skaičių, palyginti su neapdorotais. Ankstesniame tyrime buvo pranešta, kad gydymas L-karnitinu gali pagerinti embrionų, susiformavusių iš senų galvijų oocitų, kokybę, sumažindamas ROS lygį ir didesnį glutationo bei kitų antioksidantų fermentų kiekį [58]. Šių ir mūsų rezultatų skirtumai gali atsirasti dėl skirtingų metodų, taikomų embriono kokybei įvertinti. Embriono kokybės morfologinis įvertinimas išlieka subjektyviu metodu, kuris priklauso nuo stebėtojo patirties. Ateityje reikėtų atlikti daugiau tyrimų, naudojant kitus metodus, siekiant tiksliai įvertinti embriono kokybę.

Plačiai žinoma, kad oksidacinis stresas vaidina lemiamą vaidmenį su amžiumi susijusiam vaisingumo mažėjimui. Oksidacinis stresas yra vienas iš pagrindinių veiksnių, lemiančių žemą oocitų brendimo efektyvumą ir kiaušialąsčių kokybės pablogėjimą, todėl pablogėja tolesnis embriono vystymasis [11]. Tarpląstelinis ryšys tarp gametos ir somatinių ląstelių yra labai svarbus tinkamam aukštos kokybės oocitų vystymuisi. Buvo pranešta apie senų kiaušidžių mikroaplinkos pokyčius, pavyzdžiui, sumažėjusį antioksidantų fermentinį aktyvumą, dėl kurio pablogėja ROS šalinimo efektyvumas.oteflavonoidasBe to, buvo įrodyta, kad jaunų ir vyresnių moterų GC turi skirtingai išreikštus genus, susijusius su antioksidacine veikla ir motinos amžiumi [2, 13]. Taigi labai svarbu, kad rasti mechanizmai valdytų oksidacinį stresą, siekiant išgelbėti oocitus nuo senėjimo ir įveikti nevaisingumo problemas. Nrf2-Keapl kelias buvo plačiai ištirtas dėl jo gebėjimo susidoroti su žalingu oksidacinio streso poveikiu ir turėti antioksidacinių savybių [60]Siekdami toliau tirti Nrf2 signalizacijos kelio aktyvavimą galvijų GC, įvertinome NFE2L2 ir jo pasroviui skirto antioksidanto (NQO1) mRNR ekspresijos lygis. Mūsų rezultatai parodė reikšmingą moterų amžiaus įtaką NFE2L2 transkriptų lygiui, kuris mažėja su amžiumi. Iš tiesų, didesnis mRNR ekspresijos lygis buvo pastebėtas iki brendimo laikomų karvių, palyginti su suaugusiomis. Tai atitinka ankstesnius tyrimus, kuriuose buvo pranešta apie labai išreikštą Nrf2 baltymo ir mRNR lygį vaisingų jaunų pelių ir 22–49 metų moterų kiaušidžių audiniuose, o vyresnio amžiaus pelėms ir moterims buvo nustatyta mažesnė ekspresija. Buvo pasiūlyta, kad sumažėjusi Nrf2 ekspresija gali turėti įtakos vyresnio amžiaus moterų reprodukcinio pajėgumo mažėjimui, o jos kontrolė gali turėti svarbių pasekmių lėtinant kiaušidžių senėjimą [15, 61]. Be to, Akino ir bendradarbiai (2019 m.) parodė, kad suaktyvinus Nrf{18}}Keapl kelią vartojant dimetilfumaratą, gali sumažėti ROS lygis ir uždelsti nevaisingumas [18]. Buvo pranešta apie panašius rezultatus, susijusius su UA poveikiu mažinant ROS senstančiose žmogaus odos fibroblastuose. Kai šios ląstelės buvo apdorotos UA, buvo pranešta apie reikšmingą Nrf2 tikslinių genų, tokių kaip SOD1, NQ01, GCLC ir HMOX1, mRNR ekspresijos padidėjimą. [35]. Savo tyrime pastebėjome, kad NFE2L2 ir NQO1 genų ekspresijos lygis GC neturėjo reikšmingos įtakos UA papildymui. Tačiau reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant patvirtinti ROS sumažėjimą ir vėlesnį pagamintos blastocistos pagerėjimą, taip pat UA poveikį minėtų genų mRNR ekspresijai senyvuose oocituose.

Įrodyta, kad be žalos mitochondrijų DNR (mt-DNR) [25,57], mitochondrijų genų ekspresijos sutrikimas taip pat prisideda prie mitochondrijų disfunkcijos su amžiumi. Zhang ir jo kolegos (2019) pranešė, kad kai kurie genai, dalyvaujantys OXPHOS, būtent mt-ND2, mt-ND3, mt-ND4, mt-ND4L ir mt-ND5, buvo žymiai sumažėję senų pelių oocitų GV stadijoje. palyginti su jaunų pelių rezultatais[62]. Mūsų tyrime reikšmingo skirtumo tarp mt-ND5 mRNR ekspresijos tarp GC, paimtų iš ikibrendimo ir suaugusių karvių, nenustatyta. Be to, mes taip pat įvertinome mt-DNR kopijų skaičių, nes mt-DNR kiekis GC buvo teigiamai susijęs su oocitų kokybe ir embriono vystymusi [63, 64]. Nors mūsų tyrime nenustatyta jokių reikšmingų skirtumų tarp mt-DNR kopijų skaičiaus GC iš ikibrendimo ir suaugusių karvių arba gydant UA, mes pastebėjome didesnį oocitų skaičių, kurie išsivystė iki blastocistos stadijos, palyginti su negydytomis grupėmis. Be to, Ryu ir bendradarbiai (2016) pranešė, kad mt-DNR kiekis ir baltymų kiekis iš kvėpavimo kompleksų nepakito pelių mioblastuose, papildytuose UA[28]. Reikėtų atlikti tolesnius tyrimus, siekiant atskleisti UA veikimo mechanizmą gerinant moterų vaisingumą.

5. Išvados

Šio tyrimo metu gauti rezultatai patvirtino žalingą oocitų senėjimo poveikį jų vystymosi kompetencijai. Be to, mūsų senstančių moterų lytinių ląstelių modelis pasirodė esąs labai efektyvus ir naudingas tiriant įvairias problemas, susijusias su reprodukciniu senėjimu ir dėl to kylančiu vaisingumo sutrikimu. Be to, UA papildymas senų oocitų brendimo metu pagerino brendimo greitį ir sukūrė embrionus. Todėl pirmą kartą buvo nustatytas senėjimą stabdantis UA poveikis gelbėjant senas lytines ląsteles, pagerinantis blastocistų vystymąsi, dėl ko padaugėja embrionų, skirtų perkelti patelėms recipientėms. Taip pat nustatytas teigiamas UA poveikis fiziologiniam brendimui, MMP ir embriono vystymuisi. Apibendrinant galima pasakyti, kad gydymas UA suteikia naują terapinį metodą, skirtą užkirsti kelią lytinių ląstelių senėjimui arba atitolinti jį ir pagerinti vėlesnį blastocistų susidarymą bei vaisingumo rezultatus atliekant ART.

Šis straipsnis ištrauktas iš Animals 2021, 11, 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals