Poli- ir oligosacharidas Ulva Sp. Frakcijos iš ekstrahavimo fermentais moduliuoja tarpląstelinės matricos metabolizmą

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Santrauka:Ulva sp. yra žinomas kaip biologiškai aktyvių junginių, tokių kaip furgonai, šaltinis, tačiau apie jų biologinį aktyvumą žmogaus odos fibroblastų ekstraląstelinėje matricoje (ECM) pranešama mažai. Šiame darbe pirmą kartą buvo ištirtas ECM reguliavimas tiek proteominiu, tiek transkriptominiu lygiu normaliuose žmogaus odos odos fibroblastuose, po 48 valandų inkubacijos su Ulva sp. poli- ir oligosacharidų frakcijomis. gautas po ekstrahavimo ir depolimerizacijos naudojant fermentus. Ląstelių proliferacijos padidėjimas (iki plius 68 proc.), nerodant jokio citotoksinio poveikio fibroblastams, buvo parodytas esant 50 ir 1000 ug/ml abiejose frakcijose. Proteominiu lygmeniu 1000 ug/ml polisacharidų frakcijos labiausiai pagerino glikozaminoglikanų (GAG, iki plius 57 proc.), bendro kolageno, ypač I tipo (iki plius 217 proc.) ir Ⅲ, sintezę, taip pat sintezę. ir MMP-1 (matricos metaloproteinazė-1, iki plius 309 proc.) aktyvumas. Priešingai, oligosacharidų frakcijos neturėjo įtakos GAG sintezei, tačiau turėjo panašumų kolagenų ir MMP{12}} reguliavimo atžvilgiu.puritanai vitaminas cTranskriptominiu lygiu COL1A1 ir COL1A2 ekspresijos sumažėjimas bei COL3A1 ir MMP{6}} ekspresijos padidėjimas patvirtino abiejų frakcijų ECM metabolizmo moduliavimą. Mūsų tyrimai pabrėžia, kad poli- ir oligosacharidas Ulva sp. Frakcijos pasižymi įdomiu biologiniu aktyvumu ir palaiko jų galimą naudojimą odos atnaujinimo srityje senėjimą stabdančiose dermosetikos srityse.

spustelėkite čia norėdami sužinoti daugiau

Raktiniai žodžiai:kolageno; ekstraląstelinė matrica; žmogaus odos fibroblastas; matricos metaloproteinazė; jūros dumbliai; Ulva sp.

1. Įvadas

Didelio masto žali potvyniai, kuriuos sukelia Uloa sp. pasikartojo Bretanėje (Prancūzija) dėl jūrų eutrofikacijos. Žaliųjų jūros dumblių plotai turi didelį neigiamą ekologinį poveikį, įskaitant ekosistemos struktūros pokyčius, vietinės biologinės įvairovės sumažėjimą ir ekonominius nuostolius [1,2]. Išskyrus panaudojimą kaip dirvožemio pakeitimą, gyvulių pašarą arba paprastą skilimą dėl skilimo ar degimo, labai mažai žinoma apie Uloa sp. žmonių sveikatai [1]. Tačiau Ulloa sp. yra svarbus junginių, tokių kaip ulvanai, šaltinis. Evans, vandenyje tirpūs sulfatuoti ląstelės sienelės polisacharidai, daugiausia sudaryti iš ramnozės, urono rūgščių ir ksilozės, gali sudaryti iki 36 procentų Ulloa sausos masės [3]. Du pagrindiniai pasikartojantys ulvano disacharidiniai vienetai yra aldobiurono rūgštys (ulvanobiurono rūgštys), A tipas: -D-gliukurono rūgštis (1,4), susieta su -L-ramnozės 3-sulfatu, ir B tipas: -L- idurono rūgštis (1,4), susieta su -L-ramnozės 3-sulfatu. Smulkių disacharidų aldozės, vadinamos ulvanobiozėmis (U tipas), taip pat galima rasti ulvane[3.4]. Ulvano ekstrahavimo kiekybinis derlius ir kokybė gali labai skirtis, atsižvelgiant į biomasei taikomus ekstrahavimo ir frakcionavimo metodus. Ulvanai paprastai ekstrahuojami vandeniniame tirpale aukštoje temperatūroje (80-90 laipsnis), vadinamą maceravimo procesu. Tačiau Evansą galima atkurti naudojant naują ekologišką technologiją, pavadintą fermentais padedama ekstrahavimo (EAE)[5]. EAE leidžia ekstrahuoti dominančius junginius nenaudojant denatūravimo sąlygų, tokių kaip tirpikliai ar aukšta ekstrahavimo temperatūra, be to, ji turi įvairių privalumų, pvz. didelis katalizinis efektyvumas, didelis specifiškumas, švelnios reakcijos sąlygos ir junginių biologinio aktyvumo išsaugojimas. EAE taip pat pagerina derlių ir sumažina sąnaudas bei energijos sąnaudas, palyginti su klasikiniu maceravimo procesu [6-9]. Po maceracijos vandens ekstrahavimo arba naujo proceso, pvz., EAE, ulvano sodrinimas dažnai atliekamas taikant etanolio nusodinimo procedūrą [3]. Ulvanai in vitro ir in vivo parodė keletą biologinių veiklų, tokių kaip imunomoduliacija, antioksidantas, priešvėžinis, antikoaguliantas, antihiperlipideminis arba antivirusinis [3,5,10-14].SistancheEvanso struktūrinė ypatybė (sulfatacijos laipsnis, sulfatacijos modelis, monosacharidų sudėtis, glikozidiniai ryšiai, šakojimosi laipsnis, taip pat molekulinė masė) turi įtakos jo biologiniam aktyvumui [3]

Odos senėjimas yra sudėtingas procesas, kurį sudaro du vienas kitą papildantys procesai: vidiniai (genetiniai, ląstelių metabolizmas ir kt.) ir išoriniai (UV poveikis, tarša, tabako rūkymas ir kt.)[15-17]

Cistanche gali kovoti su senėjimu

Naujai atsirado jūros dumblių bioaktyvių medžiagų, kaip didelės pridėtinės vertės produktų šaltinių, naudojimas dermosetikos pramonei. Tarp šių biologiškai aktyvių junginių ulvanai turi didelį potencialą. Iš tiesų, vartotojų poreikiai natūraliems produktams pastaraisiais metais auga, todėl jūros produktai ir ypač jūros dumbliai yra įdomus natūralių ingredientų šaltinis, skirtas odos grožiui ir sveikatai [18-22]. Oda, kuri yra kosmetikos gaminių taikinys, yra sudaryta iš trijų pagrindinių skirtingų persidengiančių sluoksnių: epidermio, dermos ir hipodermio.kas yra cistancheDerma palaiko epidermį ir saugo svarbias odos ląsteles, žinomas kaip fibroblastai. Fibroblastai, pagrindinės papiliarinės dermos ląstelės, esančios tiesiai po epidermiu, iš esmės sintezuoja ir organizuoja ekstraląstelinę matricą (ECM). ECM sudaro įvairios makromolekulės, įskaitant kolagenus (70 procentų sausos masės), daugiausia I ir III tipo, elastino (2-4 procentų), glikoproteinų (fibronektiną, lamininą ir kt.), glikozaminoglikanus (GAG) arba sulfatuotus (heparaną). sulfatas, dermatano sulfatas, keratano sulfatas, chondroitino sulfatas) ir nesulfatuotas (hialurono rūgštis), proteoglikanai ir skaidantys komponentai, tokie kaip MMP (matricos metaloproteinazės)[23,24]. I tipo kolagenas sudaro iki 80 procentų viso kolageno [25] ir yra viena iš pagrindinių odos dermos ECM sudedamųjų dalių; jis yra susijęs su odos elastingumu, lankstumu ir įtempimu. I tipo kolagenas yra heterotrimeras, trigubos spiralės baltymas, sudarytas iš dviejų cl grandinių ir vienos c2 grandinės, atitinkamai koduojamos COL1Al ir COL1A2 genų [26]. I ir II tipo fibriliniai kolagenai sudaro daugiau nei 90 procentų viso kolageno ir yra glaudžiai susiję su oda [27, 28]. II tipo kolagenas yra labiau paplitęs jaunoje odoje nei senoje odoje ir ypač dalyvauja gydant žaizdas [29, 30]. Siekiant sukurti ECM surinkimo molekulinį tinklą, GAG yra susieti su baltymais ir sudaro proteoglikanus (pvz., dekoriną arba versikaną), kurie sąveikauja su I tipo kolagenu [31] ECM viduje MMP, kurie yra ECM katabolinio kelio fermentai, latentine arba aktyvia forma yra susieti su jų audinių inhibitoriais metaloproteinazėmis, žinomomis kaip TIMP, kurios reguliuoja jų aktyvumą [32]. MMP-1(kolagenazė-1) yra pagrindinis fermentas, atsakingas už I tipo kolageno skaidymą, o TIMP-1 yra atitinkamas jo inhibitorius [334]. Fibroblastai yra pagrindiniai ECM homeostazės reguliatoriai. Sintezės tarp odos ECM komponentų, dalyvaujančių anabolizme, pvz., I ir II tipo kolagenų, GAG arba TIMP, ir katabolizmo, pvz., MMP, pusiausvyra ir susiejimas leidžia atnaujinti ir tęsti šio ECM rekonstrukciją[25]. Odos senėjimo metu , pagrindinė pasekmė yra ECM reguliavimo disbalansas su fibroblastų proliferacijos sumažėjimu, ECM komponentų lygio moduliavimas ir reikšmingas I tipo kolageno sintezės, GAG sekrecijos ir TIMP{24}} sintezės sumažėjimas, taip pat padidėjęs MMP-1 lygis [24,35].

Kol kas tik keli tyrimai ištyrė Ulva sp. frakcijos, susijusios su fibroblastų odos ląstelių metabolizmu tiek proteominiu, tiek transkriptominiu lygiu[36-39], ir iki šiol nebuvo atliktas joks išsamus proteominio ir transkriptominio lygio tyrimas su Ulua poli- ir oligosacharidų frakcijomis, gautomis iš EAE proceso.Anti-senėjimo cistancheŠiuo požiūriu šis tyrimas in vitro tiria Ulva sp. poli- ir oligosacharidų frakcijų poveikį. gauta naudojant naują žaliąją EAE technologiją, susijusią su žmogaus odos fibroblastų metabolizmu. Buvo tiriamas jų poveikis fibroblastų proliferacijai ir gyvybingumui bei ECM anabolizmui ir katabolizmui proteominiu ir transkriptominiu lygiu, siekiant pabrėžti jų potencialą odos priežiūroje (pvz., stabdant senėjimą).

2. Rezultatai

2.1. Ulva sp. poli- ir oligosacharidų frakcijos.

iš EAE parodo skirtingą biocheminę sudėtį ir molekulinio svorio pasiskirstymą

Poli- ir oligosacharidų frakcijų gamybos mechanizmai išsamiai aprašyti skyriuje „Medžiagos ir metodai“: „4.2 Poli- ir oligosacharidų frakcijų gamyba ir apibūdinimas“. poli- ir oligosacharidų frakcijų masės pasiskirstymas iš Ulloa sp. buvo atlikti iš EAE [36]. Duomenys sujungti 1 lentelėje.

Trumpai tariant, neapdorotų ulvanų (UE) ir dializuotų ulvanų (DS-UE) polisacharidų frakcijas sudaro didelės molekulinės masės ulvanai (neapdoroti furgonai), kuriuose yra 23.5-37.4 proc. angliavandenių,18.5-37. 0 proc. urono rūgščių, 29.9-49.1 proc. sulfatų grupių ir 10.5-12,8 proc. baltymų. Angliavandenių sudėtis daugiausia buvo ramnozė (50 proc.) ir gliukurono rūgštis (11 proc.). DS-UE frakcija yra daug turtingesnė ulvanų nei UE frakcija. Oligosacharidų frakcijos, depolimerizuoti furgonai iš HzO2 (DEP-HD PP-UE) ir depolimerizuoti furgonai iš Amberlite dervos (DEP-AD PP-UE), sudaryti iš mažos molekulinės masės furgonų, kuriuose yra 24.4-30,4 proc. angliavandenių ( ramnozė 44.9-55.4 proc. ir gliukurono rūgštis 7.5-11.0 proc.), 21.6-30.8 proc. urono rūgščių ir 12.8-16.8 proc. baltymai.

Tačiau depolimerizacijos procesas lėmė dalinį sulfatų praradimą (neaptikta DEP-ADPP ir tik 6,6 proc. DEP-HD PP-UE). Oligosacharidų frakcijų molekulinės masės (Mw) pasiskirstymas parodė vidutinį mažą 8 kDa Mw DEP-HD PP-UE ir mažesnį DEP-AD PP-U (1,5 kDa).

2.2. Ulva sp. poli- ir oligosacharidų frakcijos. Skatinkite medžiagų apykaitą, bet neturėkite įtakos fibroblastų gyvybingumui

Normalių žmogaus odos fibroblastų (NHDF), 48 valandas veikiamų poli- ir oligosacharidų Ulloa frakcijomis (50 ir 100 ug/ml 48 val.), metabolinis aktyvumas buvo įvertintas WST-1 (1 pav.). Šiuose eksperimentuose (n=9) ​​Ullva frakcijos iš EAE padidino fibroblastų proliferaciją iki plius 68 proc., palyginti su kontroline grupe.cistanche benefíciosŽymus metabolinio aktyvumo padidėjimas (p<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

Norint nustatyti, ar šie poveikiai nebuvo susiję su ląstelių toksiškumu, Ulou ekstraktu apdorotų ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas matuojant LDH (laktatdehidrogenazės) išsiskyrimą, naudojant CytoTox96 laipsnio testą po 48 h inkubacijos (n=3) (pav. 2). Citotoksiškumo tyrimas parodė, kad visos frakcijos neparodė reikšmingo citotoksiškumo, lyginant su kontrole.

2.3. Ulva sp. poli- ir oligosacharidų frakcijos. Skatinkite ekstraląstelinės matricos metabolizmą fibroblastuose

Poli- ir oligosacharidų Ulloa frakcijų poveikis fibroblastų sulfatuotų ir nesulfatuotų glikozaminoglikanų (GAG) sintezei buvo įvertintas dažant Alcian mėlyna spalva po 48 valandų inkubacijos (n=4) (3 pav.). Reikšmingas sintezės padidėjimas buvo pastebėtas tik UE ir DS-UE esant 100 ug/mL, atsižvelgiant į abu sulfatus (p<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

Įdomu pastebėti, kad DS-UE, turtingiausia ulvanų frakcija, labiausiai sustiprino GAG sintezę. Esant 50 ug/ml, UE ir DS-UE padidino nesulfatuotų GAG sintezę, bet ne reikšmingai (atitinkamai plius 14,2 proc. ir plius 22,7 proc.). Oligosacharidų frakcijos DEP-AD PP-UE, esant 1000 ug/ml, šiek tiek sumažino nesulfatuotų GAG sintezę, bet nežymiai ({12}} proc.), o DEP-HD PP-UE šiek tiek padidino, bet nežymiai, GAG sintezę esant 100 ug/ml. ml (plius 4,1 proc. sulfatiniam ir plius 10,9 proc. nesulfatui).

Bendra kolageno sintezė (4 pav.) buvo įvertinta Red Sirius tyrimu po 48 valandų fibroblastų poveikio poli- ir oligosacharidų Ulloa frakcijoms (n=7 esant 100 ug/ml ir n{5}} esant 50 ug/mL). .

Visos frakcijos parodė nuo koncentracijos priklausomą kolageno sintezės padidėjimą. Nežymus ir nežymus kolageno sintezės sumažėjimas buvo pastebėtas visoms frakcijoms esant 50 ug/mL, palyginti su kontroline. Priešingai, esant 1000 ug/ml, visos frakcijos padidino bendrą kolageno sintezę ir reikšmingai padidino UE (plius 22 proc.<><0.01),and dep-hd=""><>

Poli- ir oligosacharidas Po gautos EAE frakcijos poveikis I tipo kolageno sintezei (n=6) ir MMP-1 sintezei (n=4) buvo įvertintas ELISA tyrimais (5 pav.).

Visos frakcijos pagerino I tipo kolageno sintezę ir MP{0}} sintezę, bet ne visada reikšmingai. I tipo kolageno sintezės padidėjimas priklausė nuo koncentracijos. Nustatyta, kad polisacharidų frakcijos, UE ir DS-UE, esant 1000 ug/ml, reikšmingai sumažino (p<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

Poli- ir oligosacharidų Ulloa frakcijų, kurių koncentracija yra 100 ug/ml, po 48 valandų ekspozicijos fibroblastais, poveikis I(n=5) ir Ⅲ(n=4) tipo kolagenų sintezei. MMP-1(n=6) ir TIMP-1(n=5) ​​gamyba buvo įvertinta Western blot (WB) analize su normalizavimo metodu, naudojant viso juostos baltymo metodą ( 6 pav.).

6a, e ir WB paveiksluose paryškintas atitinkamai subrendusio I tipo kolageno (≈130 kDa) ir brandaus III tipo kolageno (≈190 kDa) sintezės padidėjimas visose frakcijose. Baltymų kiekybinis įvertinimas I tipo kolageno 6c paveiksle ir III tipo kolageno 6g paveikslas atskleidė NS (statistiškai nereikšmingą) jų sintezės padidėjimą, esant tiek poli-, tiek oligosacharidams Ulloa sp. trupmenomis. Tuo tarpu WB 6b,d paveiksle leido mums kiekybiškai įvertinti reikšmingą （p<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

MMP-1 kolagenazės aktyvumas buvo nustatytas zimografiniu tyrimu, kai buvo poli- ir oligosacharido Ulloa frakcijos esant 100 ug/ml (7a pav.), kiekybiškai įvertintas ir lyginamas su kontroline medžiaga (7b pav.), po 48 valandų ekspozicijos fibroblastais (n =4).

Rezultatai atskleidė, kad tiek poli-, tiek oligosacharidas Ulva sp. frakcijos nežymiai padidino fibroblastų MMP{1}} aktyvumą.

2.4. Ulva sp. poli- ir oligosacharidų frakcijos. Skirtingai moduliuokite fibroblastų ECM geno ekspresiją

Ištirtas poli- ir oligosacharidų Ulloa EAE frakcijų poveikis kelių ekstraląstelinės matricos komponentų (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1 ir TIMP-1) pastovios būsenos mRNR lygiams. =4)(8 pav.).

Pastebėjome, kad visos frakcijos esant 1000 ug/ml žymiai sumažėjo (p<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

2 lentelėje pateikti jungtiniai genų mRNR pastovios būsenos lygio rezultatai po fibroblastų poveikio frakcijoms esant 1000 ug/ml.

2 lentelė rodo, kad UE labai sumažėjo (p<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

Šis straipsnis Kov. Narkotikai 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs