Anti-senėjimo poveikis Leontopodium Alpinum (Edelweiss) Callus kultūros ekstraktas per transkripcijos profiliavimą

Prašome spustelėtioscar.xiao@wecistanche.comdaugiau informacijos

Abstraktus:Edelweiss(Leontopodium Alpinum) šeimoje Asteraceae yra laukinė gėlė, auganti uolėtose kalkakmenio vietose. Čia mes ištyrėme edelweiss callus kultūros ekstrakto (Leontopodium Alpinum callus kultūros ekstrakto) veiksmingumą; LAKCE)naudojant kelis bandymus nuo in vitro iki in vivo, taip pat transkriptomų profiliavimą. Keli in vitro tyrimo rezultatai parodė stiprų LAKCE antioksidacinį aktyvumą reaguojant į gydymą UVB. Be to, LAKCE slopino uždegimą ir raukšlėjimąsi; tačiau drėkinamąjį aktyvumą padidino LACCE. Klinikinis bandymas in vivo parodė, kad nuolatinis LAKO naudojimas ant veido ir odos audinių pagerino antiperiorbitalines raukšles, odos elastingumą, odos tankį ir odos storį, palyginti su placebu. RNR sekos nustatymo rezultatai parodė, kad bent 16,56% žmogaus genų buvo išreikšti keratinocitų ląstelėse. LAKO reguliuojami genai, koduojantys kelis KRT baltymus; DDIT4, BNIP3 ir IGFBP3 dalyvavo teigiamai reguliuojant vystymosi procesą, užprogramuotą ląstelių mirtį, keratinizaciją ir karnizaciją, formuodami odos barjerus, kurie suteikia daug privalumų žmogaus odai. Priešingai, žemyn reguliuojami genai buvo į stresą reaguojantys genai, įskaitant metalą, oksidaciją, žaizdą, hipoksiją ir virusinę infekciją, o tai rodo, kad LAKCE nesukėlė jokio kenksmingo streso odai. Mūsų išsamus tyrimas parodė, kad LAKCE yra perspektyvus anti-senėjimo kosmetikos agentas.

Raktažodžiai:anti-senėjimas; callus; edelweiss;odos ląstelės;transkriptomas

1. Įvadas

Edelweiss(Leontopodium noble sub sp. Alpinum(Cass.) Greuter) šeimoje Asteraceae yra laukinė gėlė, auganti uolėtose kalkakmenio vietose dideliame aukštyje, pavyzdžiui, Šveicarijos Alpėse [1,2]. Dėl savo trumpalaikių baltų gėlių retumo edelweiss atstovauja grožiui ir grynumui, susijusiam su Alpėmis ir Karpatais. Be to, daugelis šalių, įskaitant Austriją, Bulgariją, Rumuniją, Slovėniją ir Šveicariją, Edelweissą laiko nacionaliniu simboliu.

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

Ilgą laiką edelweiss buvo naudojamas kaip tradicinė medicina nuo pilvo skausmų, bronchito, viduriavimo, dizenterijos ir karščiavimo [3, A]. Neseniai keli tyrimai parodė edelweiss ekstraktų veiksmingumą pelių ir žiurkių uždegimui [3] ir žmogaus keratinocitams bei endotelio ląstelėms [4]. Be to, edelweiss šaknų ekstraktuose yra sudedamųjų dalių, kurios sustiprina cholinerginę neurotransmisiją, nurodydamos jo potencialą antidementijos sukėlėjams [5] ir antioksidantams, tokiems kaip

leontopodinė rūgštis A ir 35-caffeoilchino rūgštis, kuri gali būti naudojama kaip anti-senėjimo agentai [6]. Be to, edelweiss ekstraktai parodė antibakterinį aktyvumą prieš Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniją ir Streptococcus pyogenes, o tai rodo galimą etnomedicininį jų naudojimą kvėpavimo takų ir pilvo sutrikimams gydyti [7].

Keli ankstesni tyrimai analizavo edelweiss ekstraktų junginius. Pavyzdžiui, kapiliarinės chromatografijos metodas atskleidė 12 farmakologiškai svarbių junginių, įskaitant flavonoidus, kofeino rūgštis ir leontopodinę rūgštį, iš edelweisso oro dalių [8]. Antioksidantams iš edelweiss augalų išgauti buvo sukurti išcentrinės pertvarų chromatografijos (KSK) ir efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodai [6]. Yra žinoma, kad aktyvūs edelweiss ekstraktų junginiai tarp oro dalių ir šaknų yra įvairūs[3]. Pavyzdžiui, plaukuotos edelweiss šaknys gamina farmakologiškai aktyvius lignanus, tokius kaip loginis ir 5-metoksi-loginis, kuriuos gali stimuliuoti keli kiti komponentai, tokie kaip sidabro nitratas, sacharozė, metil jasmonatas ir mielių ekstraktas [9].cistanche ekstrakto naudaBe to, 11 skirtingų Leontopodžio rūšių metaboliniai modeliai buvo atskleisti branduolinio magnetinio rezonanso (1H NMR) spektroskopijos ir skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos (LC-MS) taksonomijos santykiuose [10].

Cistanche gali anti-senėjimą

Augalų nuospauda gali būti apibrėžiama kaip neorganizuotos arba nediferencijuotos ląstelių masės, kurios lengvai sukeliamos žaizdomis, kad padengtų augalo žaizdą arba dirbtinai atliktų in vitro sistemą. Augalų kallusas dirbtinai kultivuojamas pridedant maistinių medžiagų ir augalų augimo reguliatorių antiseptinėmis augimo sąlygomis. Šiuo metu bioreaktoriuje galima gaminti daug specifinių augalų ląstelių, kurių kokybė yra vienoda. Be to, augalo ląstelė turi gebėjimą, vadinamą totipotencija, kuri yra genetinis augalo ląstelės potencialas gaminti visą brandų augalą [11]. Taigi galima sukurti brandų augalą iš konkretaus augalo kalluso. Be to, nuospauda gali būti plačiai naudojama augalų regeneracijai, siekiant išsaugoti retus ir nykstančius augalus [12,13].

Kaip ir gyvūnų ląstelės, augalų ląstelės turi sugebėjimų palengvinti augalų stimuliavimą ir regeneraciją po sužalojimo [14]. Nors augalų kamieninės ląstelės kosmetikos pramonėje laikomos naujomis medžiagomis, turimų medžiagų yra nedaug. Svarbu nustatyti naujus augalų šaltinius ir įvertinti jų funkcinius komponentus, susijusius su kosmetika.

Edelweiss ekstraktai yra gerai žinomi dėl jų naudojimo farmaciniuose agentuose; tačiau retai pranešama apie edelweiss ekstrakto, kaip natūralaus kosmetikos šaltinio, poveikį. Čia mes ištyrėme edelweiss callus ekstrakto (Leontopodium Alpinum callus kultūros ekstrakto) veiksmingumą; LACCE) gautas iš edelweiss lapų, naudojant kelis tyrimus nuo in vitro iki in vivo, ir atskleidė molekulinį mechanizmą, kurį sukelia LAKCE, naudojant transkripcijos profiliavimą.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Edelweiss Callus gamyba

Edelweiss sėklos buvo perkamos komerciškai. Edelweiss sėklos 30-aisiais buvo mirkomos 70% etanolyje, po to plaunamos distiliuotu vandeniu. Vėlgi, sėklos buvo pakratomos 0,3% natrio hipochloritu (Waco, Osaka, Japonija)20 min. ir plaunamos distiliuotu vandeniu. Sterilizuotos sėklos buvo sudygusios ant pagrindinės Murashige ir Skoog(MS) terpės(Duchefa Biochemie, Haarlem, Nyderlandai). Aseptinės būklės edelweiss lapai buvo supjaustyti į mažus gabalus (nuo 0,5 iki 1 cm). Mes sukėlėme ankstyvąją augalų ląstelių stadiją MS terpėje, kurioje yra 0,5-3 mg/ml 6-benzilaminopurino (6-BAP)(Duchefa Biochemie) ir 0,3-1 mg/ml 2,4-dichlorfenoksiacto rūgšties (2,4-D)(Duchefa Biochemie) tamsoje 25± 2 °C temperatūroje [15]. MS terpės pH buvo pakoreguotas iki 5,8, naudojant 1N NaOH (Duchefa Biochemie). Sukeltas nuospauda buvo dauginamas Petri lėkštelėje. Pasirinkta nuospaudos linija buvo kultivuojama bioreaktoriuje BIO-FD&C Co., Ltd. anti-senėjimo tyrimų institute, Inčone, Korėjoje. Kultivuotas kallusas buvo nuimtas ir tris kartus plaunamas distiliuotu vandeniu.cistanche čingischanasNuospauda buvo dehidratuota naudojant šaldymo džiovintuvą (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Korėja) pagal gamintojo instrukcijas. Džiovintas edelweiss callus buvo maišomas distiliuotame vandenyje 50 °C temperatūroje 8 h. Kalluso ekstraktai buvo gaunami 10 min. termiškai ekstrahuojant 98 °C temperatūroje.

2.2. Žmogaus odos ląstelių kultūra

Įvertintas edelweiss ekstraktų poveikis žmogaus odos ląstelėms, keratinocitų (HaCaT) ląstelėms ir normaliam žmogaus Detroito 551 fibroblastui (ATCC, Manassas, VA, JAV) buvo auginamas Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM)(Welgene, Gyeongsan-si, Korėja), papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumu (FBS)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV) ir 1% antibiotikų antimikoziniu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV) 37 °C temperatūroje su 5% CO2 būkle.

2.3. Ląstelių metabolinio aktyvumo vertinimas MTT tyrimo metu

Siekiant įvertinti LAKCE citotoksiškumą žmogaus odos ląstelių augimui, dauginimuisi ir išlikimui, buvo atliktas MTT(3-(45-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromido) tyrimas, kaip aprašyta anksčiau[16,17]. Trumpai tariant, HaCaT ir Detroito 551 ląstelės, kurių tankis buvo atitinkamai 5×10* ląstelių viename šulinyje, buvo inkubuojamos 96 duobučių plokštelėje 24 val.Po to galutinė koncentracija 0,1%, 0,5% ir 1% LAKO buvo gydoma 24 valandas. Distiliuotas vanduo buvo naudojamas kaip kontrolė. Po LAKCE gydymo terpė buvo pašalinta, po to pridėta 4 μLof 5 mg/ml MTT (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) ir inkubuojama 4h. Pašalinus terpę, 100 μL dimetilsulfoksido (DMSO)(Sigma)buvo pridėta ir ištirpinta 10 min.cistanche gyvenimo pratęsimasBangos ilgio absorbcija buvo išmatuota esant 570 nm bangos ilgiui, naudojant "Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer" ("Fisher Scientific Ltd.", Vantaa, Suomija). Ląstelių gyvybingumas buvo gautas naudojant šią formulę. Ląstelių gyvybingumas (%)=(apdorotų ląstelių absorbcijos kiekis/kontrolinių ląstelių absorbcijos kiekis)× 100.

2.4. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas pagal DPPH tyrimą

LAKCE antioksidacinis aktyvumas buvo matuojamas DPH (2,2-difenil-1-pikrilo-hidrazino-hidrato) tyrimu, kaip aprašyta anksčiau [18]. Trumpai tariant, 0,1 ml galutinių 0,1%, 0,5% ir 1% LAKCE koncentracijų buvo apdorota 0,1 ml 0,1 ml 0,1 mM DPPH (Sigma-Aldrich), esant 0,4 ml etanolio. Mes naudojome 0,001% askorbo rūgšties (vitamino C)(Sigma-Aldrich) kaip teigiamą kontrolę. Mėginiai buvo gerai sumaišyti 10s ir inkubuojami kambario temperatūroje tamsiomis sąlygomis 30 min. Bangos ilgio optinis tankis buvo išmatuotas esant 517 nm bangos ilgiui, naudojant "Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer" ("Thermo Fisher Scientific", Waltham, MA, JAV). Radikalus valymo aktyvumas buvo apskaičiuotas pagal šią formulę. Plovimo aktyvumas (%)=[1-(bandomojo mėginio optinis tankis/kontrolinio bandinio optinis tankis)]×100.

2.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas vandenilio peroksidu (H2O2) tyrimas

Vandenilio peroksidas ląstelėse gamina deguonies neturinčius radikalus, dėl kurių ląstelės miršta. Mes išbandėme ląstelių mirtingumo koeficientą, kurį sukelia vandenilio peroksidas, t. y. LAKSU apdorotuose mėginiuose. HaCaT ląstelės, kurių tankis buvo 5×105 ląstelės vienoje duobutėje, buvo inkubuojamos 24 duobučių plokštelėje 24 valandas. Po to galutinės 0,1%,0,5% ir 1% LAKO koncentracijos buvo gydomos esant 1 mM H, O, 8h. Kaip teigiama kontrolė buvo naudojama 0,033% NAC (Sigma-Aldrich). MTT tyrimas buvo naudojamas išmatuoti HO2 sukeltų LAKAIS apdorotų mėginių ląstelių išgyvenamumą. Be to, stebėjome ląstelių morfologiją metileno mėlynojo dažymo būdu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV).

2.6. Atvirkštinė transkripcija realiuoju laiku (RT)-PGR

Norėdami ištirti LAKCE poveikį raukšlių, drėkinimo ir uždegimo anti-uždegimui, mes atlikome realaus laiko RT-PCR su žinomais gruntais, stiprinančiais žymeklių genus, naudodami "QuantiTect Primer Assays" (Qiagen, Hilden, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas. Detroito 551 ląstelė, kurios tankis buvo 5×104 ląstelės viename šulinyje, buvo inkubuojamos 96 duobučių plokštelėje 24 valandas. Po to galutinė koncentracija buvo 0,1%,0,5%, o 1% LAKCE buvo apdorota 24 val. cDNR buvo susintetinta iš atitinkamų Detroito 551 ląstelių, apdorotų skirtingomis LAKC koncentracijomis, naudojant SuperPrep Cell Lysis & RT rinkinį qPCR (Toyobo, Osaka, Japonija), kuriame yra lizės reagentų ir RT reagentų pagal gamintojo instrukcijas. Siekiant išvengti raukšlių poveikio gydant LAKCE, geno kodavimo matricos metalloproteinazės-2 (MMP-2) ekspresija buvo kiekybiškai įvertinta realaus laiko RT-PGR, naudojant "Thunderbird SYBR qPCR Mix" rinkinį (Toyobo) pagal gamintojo instrukcijas. Siekiant įvertinti drėkinimą gydant LAKCE, realaus laiko RT-PCR buvo tiriama Vandensporin 3 (AOP3) koduojančio geno ekspresija. Priešuždegiminio tyrimo atveju HaCaT ląstelės, kurių tankis yra 5×104 ląstelės vienoje duobutėje, buvo inkubuojamos 96 duobučių plokštelėje 24 valandas. Pašalinus terpę, UVB buvo apšvitintas HaCaT ląstelėse. UVB švitinimui 5 mJ/cm' naudojo CL-1000 UV dėžutė (Analytik Jena AG, Jena, Vokietija). Po to galutinė koncentracija 0,1%,0,5% ir 1% LAKCE buvo gydomos 4 val. Mes naudojome deksametazoną(Dex)(Sigma-Aldrich) kaip teigiamą kontrolę. Siekiant priešuždegiminio gydymo LAKCE poveikio, genų, koduojančių COX2 ir iNOS, ekspresija buvo kiekybiškai įvertinta realaus laiko RT-PGR. Atskirų genų ekspresija buvo normalizuota iki GAPDH genų ekspresijos. 2.7. Lakce kaip kosmetikos priemonės Vioo klinikinis įvertinimas

Klinikinį tyrimą, skirtą įvertinti LAKCE veiksmingumą veido pakėlimui ir periorbitalinių raukšlių, odos elastingumo, odos tankio ir odos storio gerinimui, "Ellead" kompanija atliko po to, kai buvo patvirtintas Ellead irB standartinėmis veiklos procedūromis (Ver. 3.0) (Ver. 3.0) (Ellead, Seongnam, Korėja) pagal Korėjos geros klinikinės praktikos gaires (B1-2015-4-002), aprašytas Maisto ir vaistų saugos ministerijos (MFDS) ir "Ellead Standard Operating Procedures" (EL-P-7400).

Norėdami ištirti LAKCE poveikį in vivo, atlikome klinikinį LAKCE vertinimą dėl keturių skirtingų veiksnių: veido pakėlimo ir periorbitalinių raukšlių gerinimo, odos elastingumo, odos tankio ir odos storio. Tam iš viso per keturias savaites klinikiniame vertinime dalyvavo 21 savanorė moteris, kurios vidurkis buvo 48,04 ± 4,28 metų, kurios buvo dar suskirstytos į 12 savanorių, sulaukusių 40-ies, ir devynias savanores, sulaukusias 50-ies.

Klinikinis testas buvo atliktas trimis skirtingais laiko momentais, t. y. pradiniu, 2 savaitėmis ir 4 savaitėmis, visiems savanoriams. Nuo savaitės iki tyrimo pradžios iki pabaigos visi savanoriai neatliko papildomų procedūrų, kad pagerintų odą, kosmetiką ir sanitarinę pagalbą, o tai galėjo turėti įtakos rezultatams. Nusiprausę savanorių veidus valymo putomis, savanoriai mažiausiai 30 min. stovėjo kontroliuojamoje patalpoje su pastovia temperatūra (20–24 °C) ir drėgme (40–60 proc. santykine drėgme). Matavimą atlikome atsitiktinai kairėje arba dešinėje savanorių veidų pusėje. Mūsų testas buvo dvigubai aklas testas, kurio metu nei tiriamieji, nei tyrėjai nežinojo, kuris produktas yra bandomasis mėginys. Preparatai, skirti apskaičiuoti sumažėjusius ir padidėjusius dažnį, buvo aprašyti 1 lentelėje.

2.8. Veido pakėlimo matavimas ir periorbitalinių raukšlių gerinimas

Iš pradžių visiems savanoriams buvo matuojamos periorbitalinės raukšlės, odos elastingumas, odos tankis, odos storis ant skruosto ir veido pakėlimas burnos kampe. Po to du skirtingi mėginiai, LAKCE ir placebas (kontrolinis), buvo naudojami tam skirtoje veido vietoje du kartus per dieną (ryte ir naktį). Savanoriai buvo suskirstyti į dvi skirtingas grupes: I grupę (LAKK buvo taikomas kairiajai veido sričiai, o placebas – dešinei veido sričiai) ir II grupę (placebas buvo taikomas kairiajai veido sričiai, o LAKCE – dešinei veido sričiai). Praėjus dviem ar keturioms savaitėms po gydymo, buvo atlikti tie patys matavimai, siekiant įvertinti LAKCE poveikį, palyginti su placebo poveikiu.

Periorbitalinės raukšlės buvo analizuojamos naudojant optinę 3D(dimensijos) odos matavimo sistemą PRIMOS High Resolution (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, JAV), kuri idealiai tinka odos mikrostruktūros ir raukšlių tyrimui. Buvo išmatuoti du skirtingi šiurkštumo parametrai Ra(vidutinis šiurkštumas), kuris yra šiurkštumo profilio profilio profilio aukščių absoliučiųjų verčių vidurkis, ir Rg(šaknies vidurkis kvadratinis šiurkštumas), kuris yra šiurkštumo profilio profilio aukščių vidutinis vidutinis kvadratinis vidurkis.

Šis straipsnis paimtas iš Genų 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes