Tolerancija NADH/NAD ir disbalansas numato senėjimą ir senėjimą stabdančius veiksmus

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

SANTRAUKA

Redokso poros koordinuoja ląstelių funkciją, tačiau jų disbalanso pasekmės neaiškios. Tai šiek tiek siejama su jų eksperimentinio kiekybinio įvertinimo apribojimais. Čia mes apeiname šiuos sunkumus pateikdami metodą, apibūdinantį fitnesu pagrįstus tolerancijos profilius redokso poros disbalansui, naudojant metabolizmo pateikimą silikone. Sutelkdami dėmesį į NADH / NAD1 redokso porą mielėse, parodome, kad redukcinė pusiausvyra sukelia metabolinius sindromus, panašius į tuos, kurie stebimi vėžio ląstelėse.cistanche ekstrakto privalumaiMielių mutantų tolerancija redokso disbalansui taip pat gali paaiškinti 30 procentų eksperimentiškai išmatuoto chronologinio gyvenimo trukmės kintamumo. Be to, numatydami kai kurių metabolitų svarbą, padedančią atlaikyti disbalansą, teisingai nustatome maistines medžiagas, pagrindžiančias patologijos mechanizmus, gyvenimo trukmę saugančias molekules arba kalorijų apribojimo mimetikus. Tolerancija redokso disbalansui tokiu būdu tampa patikima sistema, leidžiančia atpažinti senėjimo fenotipo savybes, kartu su biologiniu pagrindu vertinant senėjimą stabdančias intervencijas.

ĮVADAS

Per pastaruosius du dešimtmečius redokso homeostazės tyrimai labai išsiplėtė, nuolat keičiant klasikines oksidacinio ląstelių pažeidimo sampratas (Halliwell ir Gutteridge, 2015). Tarp labiausiai paradigminių molekulinių agentų, kuriais grindžiama ši homeostazė, atsiranda redokso porų, tokių kaip glutationo, NADPH ir NADH konjuguotų formų, santykiai. Glutationas ir NADPH veikia kaip esminiai reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) šalinimo mechanizmai mitochondrijose, o NADPH ir NADH atitinkamai susieja anabolinius ir katabolinius kelius su ląstelės redokso būsena.

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

Nepaisant to, ir toliau atpažįstami nauji mechanizmai, jungiantys NADPH / NADP * ir NADH / NAD * poras su redokso homeostaze. Pavyzdžiui, NADPH / NADP plius balansas iš dalies paaiškina AMP aktyvuotos baltymų kinazės pasekmes išgyvenimui (She ir kt., 2014). Be to, jis susieja cirkadinį laiko matavimą su redokso būsenomis (Rey ir kt., 2016). Šiuo metu manoma, kad NADH/NAD plius santykis yra susijęs su mitochondrijų ir branduolinių funkcijų koordinavimu, epigenetiniu DNR atstatymo ir ląstelių tapatumo reguliavimu bei energijos apykaitos derinimu prie aplinkos kintamųjų (Canto ir kt., 2015; Gomes ir kt. al. 2013). Nepatologinėmis sąlygomis NADH/NAD* santykis svyruoja atsižvelgiant į deguonies įtampą, esant hipoksinėms sąlygoms ir didesniam deguonies prieinamumui, atitinkamai kartu su redukciniais ir oksidaciniais nukrypimais (Clanton, 2007; Graef ir kt., 1999).

Tačiau augantis susidomėjimas redokso porų santykiais daugiausia kyla dėl jų įtakos patologijai.cistanche ČingischanasROS atsiradimas tiek redukciniame (hipoksinis, linkęs į NADH), tiek oksidacinis (hiperoksinis, NAD plius linkęs) pojūčiuose buvo susijęs su nukrypimais nuo optimalaus redokso potencialo, užtikrinančio geriausią mitochondrijų veikimą (Aon ir kt., 2010). Clanton, 2007). Kalbant apie vėžį, sumažėjęs NADH / NAD plius gali būti glioblastomų mirtingumo pagrindas (Gujar ir kt., 2016) ir skatinti gaubtinės žarnos vėžio progresavimą (Hong ir kt., 2019), tačiau jis taip pat gali išgelbėti kai kuriuos sveikus fenotipus skirtingo laipsnio ląstelėse nuo kitų tipų navikų (Garrido ir Djouder, 2017).

Cistanche gali kovoti su senėjimu

NADH taip pat tapo Toronto biologijos lankytinu objektu. Šiame kontekste, padidinus NAD plius telkinį, iš dalies pasikeitė senėjimas ir kiti susiję patologiniai fenotipai tarp organizmų (Das ir kt., 2018; Mendelsohn ir Larrick, 2014; Wei ir kt., 2017; Zhu et al. , 2017), o senstančios ir neoplastinės ląstelės sukelia NADH/NAD plius santykio disbalansą (Braidy ir kt., 2011; Schwartz ir Passonneau, 1974; Wiley ir kt., 2016). Be to, naujai atrasti NADPH vaidmenys ir atsirandanti NADH / NADH, kaip pagrindinio redokso homeostazės ir senėjimo reguliatoriaus, koncepcija atitinka senėjimo metabolinio stabilumo teoriją (Demetrius, 2004). Ši teorija siūlo, kad senėjimo priežastis yra pastovių redokso lygių pažeidžiamumas dėl atsitiktinių aplinkos sutrikimų, susijusių su fermentų reakcijos greičiu, ir pateikia keletą įdomių prognozių, taikomų žmonėms.

Atsižvelgiant į visas šias pasekmes, daugelis tyrimų išnagrinėjo redokso poros santykio fenomenologiją pasyviai pranešdami apie jų lygius arba aktyviai juos modifikuodami. Tačiau eksperimentinės manipuliacijos yra sudėtingos. Tradiciškiausi kaltina gilius eksperimentinius įspėjimus (Sun ir kt., 2012), o naujesniuose vis dar nepastebimos tam tikros biologinės aplinkybės, nes apsiriboja temperatūros ir pH intervalais (Hung ir kt., 2011; Zhao ir kt., 2015). Be to, eksperimentiškai brangu stebėti platų fenotipų spektrą po kofermentų telkinių pakeitimo papildant metabolitais (Hou ir kt., 2010) ir dėl mutacijų arba per didelės NAD(H) vartojančių fermentų ekspresijos (Bait al., 2011; Felipe ir kt., 1998). Taigi, reikia alternatyvių strategijų, skirtų redokso homeostazės kontrolei manipuliuojant redokso poromis, taip pat mūsų supratimui apie šios kontrolės biologines pasekmes.

In silico modeliai tampa praktine tyrimo strategija, kai eksperimentiniai metodai yra riboti, o tai suteikia galimybę visapusiškai mechanistiškai įvertinti stebimus reiškinius. Genomo masto metaboliniai modeliai, kuriuos galima ištirti naudojant srauto balanso analizę (FBA) (Orth ir kt., 2010), tapo sistemų biologijos standartu, tiriant medžiagų apykaitos sutrikimų pasekmes ląstelių funkcijai (S1 metodai). Be kitų indėlių, jie padėjo atrasti naujus antibiotikus ir chemoterapinius vaistus, sukurti bakterijų padermes, optimizuotas pramoninei dominančių medžiagų gamybai, ir geriau suprasti žmogaus medžiagų apykaitos ligas (Burgard ir kt., 2003; Pagliarini et al. 2016; Ramanas ir kt., 2009). FBA naudojimas turi papildomą pranašumą, nes suteikia įžvalgos apie medžiagų apykaitos reiškinius be nemetabolinių veiksnių (genetinių, epigenetinių, mechaninių ir kt.) įtakos. Taigi genomo masto metaboliniai modeliai yra ypač tinkami tirti nukrypimų nuo redokso homeostazės metabolines pasekmes.

Čia mes naudojame FBA, kad ištirtume redokso porų pusiausvyrą vienaląsčio eukarioto Saccharomyces cerevisiae genomo masto rekonstrukcijos metu, kai apibūdiname metabolines ir su ilgaamžiškumu susijusius kontroliuojamo turimo NADH / NAD ir srauto per skirtingus genetinius sutrikimus pasekmes. fonų. Tiksliau, mūsų rezultatai atskleidžia, kad tolerancija šiam disbalansui sukelia specifinį metabolinį maršruto pakeitimą, primenantį patologiją, taip pat paaiškina daugiau nei ketvirtadalį specifinio pomitozės gyvenimo trukmės kintamumo. Be to, ši sistema padeda mums apibūdinti skaičiavimo protokolą (kurį taip pat taikome gyvūnų ir žmonių metaboliniams modeliams), skirtą metabolitų ir fermentų, galinčių kaip terapiniais tikslais, identifikavimui su amžiumi susijusių patologijų kontekste.

REZULTATAI

Fitneso pagrindu sukurtas tolerancijos profilis apibūdina redokso poros sutrikimus

Norėdami parodyti disbalansą tarp konjuguotų redokso poros formų, į atitinkamo metabolinio tinklo genomo masto rekonstrukciją (STAR ​​metodai) įtraukėme dirbtinę grįžtamąją reakciją – „disbalanso reakciją“. Reakcija oksiduoja arba sumažina porą, atsižvelgiant į specifinius ląstelių skyrius (pvz., Citozolį, mitochondrijas ir kt.), o jos aktyvumas gali būti fiksuotas iki bet kokios norimos greičio vertės. Bet kuriai iš šių verčių galima apskaičiuoti augimo greitį („tinkamumą“), kuris veikia kaip mielių ląstelės tolerancijos tam tikrai būklei tarpinis rodiklis. Galiausiai tolerancijos profilis apibrėžiamas skaičiuojant augimo tempą diapazone. disbalanso verčių (1A pav.; atkreipkite dėmesį, kad redukcinės / oksidacinės sąlygos visame rankraštyje vaizduojamos atitinkamai mėlyna / raudona spalva).

Tolerancijos profiliai paprastai rodo maksimalų augimą aplink nulinį disbalanso tašką, o apytiksliai bet koks nuokrypis (ty reakcijos vertė, kuri nėra nulinė), sumažina tinkamumą. Tai pabrėžia faktą, kad norint, kad medžiagų apykaita veiktų, reakcijų, reguliuojančių redokso poros santykį viena prasme, aktyvumas turi būti proporcingas tų, kurios jį suderina kita prasme, aktyvumui. Tiksliau, citozolinis NADH / NADt disbalansas S.cistanche gyvenimo pratęsimascerevisiae, augantis gliukozės ir aerobinėmis sąlygomis, sukuria profilį, kurio maksimalus augimas yra žymiai pasislinkęs link oksidacinės pusės disbalanso profilio taške, kuriame ~ 50 mmol/DW/val. NADH paverčiama NADH (1B pav.). Vietoj to, atsižvelgdami į mitochondrijų disbalansą, mes pastebėjome maksimumą nulinio disbalanso taške (1C pav.), modelį, kurį panašiai stebėjome ir kituose profiliuose (S1 pav.). Apskritai tampa redukcinės sąlygos

1 pav. Tolerancijos profilis apibūdina atsaką į redokso disbalansą

(A) Viršuje. Įvedėme dirbtinę reakciją į organizmo (šiuo atveju mielių) metabolinės rekonstrukcijos modelį, kad paverstume dvi konjuguotas redokso kofermento formas (čia NADH / NADH pora). Esant kiekvienai disbalanso sąlygų serijai, ty dirbtinės reakcijos greičio reikšmėms, augimo greičiui apskaičiuoti taikome srauto balanso analizę. Apačia. Numatomos augimo reikšmės brėžiamos pagal disbalanso greičio vertes, kurios nusako tolerancijos profilį; medžiagų apykaitos tolerancijos pavyzdžiu, kai susiduriama su pasirinktu sutrikimu.cistanche nz(B) mielių tolerancijos profilis, susijęs su disbalansu, esančiu citozolyje.

(C) mielių tolerancijos profilis, susijęs su disbalansu, esančiu mitochondrijose. Mėlynas/raudonas atspalvis atitinkamai reiškia sumažėjusį ir oksiduotą disbalanso režimą, o pilki taškai rodo reikšmes, atitinkančias disbalanso nebuvimą arba didelį redukcinį/oksidacinį disbalansą, nesukeliantį augimo. žalingi ir mirtini greičiau nei oksidaciniai režimai. Dviem atvejais (konjuguotos citozolinio NADH arba mitochondrijų tioredoksino poros) švelni dirbtinė poros oksidacija pagerina augimą (S1 pav.).

NADH/NAD* perturbacijos sukelia metabolinius sindromus, kurie primena patologiją

Mielių energijos apykaita, kai nėra disbalanso, atitinka būdingą aerobinį metabolizmą esant gliukozei (tirtos auginimo sąlygos), kai glikolizė yra susieta su trikarboksirūgšties ciklu (TCA) ir oksidaciniu fosforilinimu. Pentozės fosfato kelias oksiduoja gliukozę ir suteikia ribozės -5P nukleotidų sintezei ir NADPH sukeliamą redukcinę galią anabolizmui, o anapleroziniai keliai nutraukia TCA ciklą, panašiai kaip ir glutamino metabolizmo metu, yra saikingai naudojami pirmiausiai maitinti pirimidiną ir aminorūgščių sintezė. FBA leidžia mums kiekybiškai įvertinti šių kelių pokyčius ir tai, kaip jie galiausiai išsamiai apibūdina medžiagų apykaitos ypatybes, kuriomis grindžiamas bet koks konkretus disbalanso režimas.

Konkrečiai, 2A paveiksle parodyta, kaip redukcinis citozolinio NADH / NADH disbalansas padidino glikolitinį srautą, sumažino TCA ciklo ir elektronų transportavimo grandinės aktyvumą ir padidino glutamino metabolizmą. Šis pseudohipoksinis metabolinis požymis – esant deguoniui – panašus į anaerobinį metabolizmą, kai glikolizė yra susieta su alkoholio arba pieno fermentacija, pažeidžiant mitochondrijų kelius; deguoninė pentozės fosfato kelio dalis sustabdoma ir glutamino metabolizmas, kuris yra aktyvesnis, gali būti nukreiptas gaminant piruvatą, be to, prisidedant prie anabolizmo. Pažymėtina, kad šis fenotipas užfiksuoja kai kuriuos paradoksalaus derliaus metabolizmo ypatumus, pastebėtus skirtingų tipų vėžinėse ląstelėse (Warburgo efektas) (Potter ir kt., 2016).

2 pav. Pagrindinių energijos valdymo būdų, kuriais grindžiamas mielių tolerancijos profilis, srautai (A) Citozolinis NADH/NAD disbalansas (viršuje) ir penkių reprezentatyvių takų srauto vertės (apačioje); i/glikolizė (glikolizė, šerdis), ii/Krebso ciklas (TCA, rožinė), ili/pentozės fosfatas (Penphos, žalias), iv/oksidacinis fosforilinimas (Oxphos, pilka) ir glutamino metabolizmas (glutaminas, violetinė). Pavaizduoti srauto vektoriai yra visų konkretaus kelio reakcijų srauto vidurkio rezultatas.

(B) Tas pats kaip (A) dėl mitochondrijų disbalanso. Atkreipkite dėmesį, kad glikolizės metu neigiami srautai (A skydelis, apačioje) rodo padidėjusią gliukoneogenezę. Daugiau informacijos rasite pagrindiniame tekste.

Priešingai, energijos apykaita, kuriai būdinga oksidacinė tolerancija (citozolio atžvilgiu, 2A pav.), pasižymėjo labiau aerobine konfigūracija, tačiau su ypatumais, tokiais kaip ypač aktyvus poliamino metabolizmas; ir ekstremalios savybės, įskaitant padidėjusį gliukoneogenezę, oksidacinį fosforilinimą ir TCA ciklo aktyvumą, taip pat labai didelį (iki 12-kartų didesnį už įprastą lygį) srautą per pentozės fosfato kelią. Vis dėlto pastarasis gali būti biomasės pseudoreakcijos skirtumų artefaktas, esant labai dideliam (daugiau nei 55 mmol/gDW/h) oksidaciniam disbalansui (žr. S1 metodus).

Kai disbalanso reakcija yra mitochondrijose, NADH sumažinimas vėl sukėlė tam tikrą pseudohipoksinį elgesį su vienu skirtumu (2B pav.). Glikolizės ir glutamino metabolizmo srautas padidėjo, kartu prarandant TCA ciklo dalis ir pentozės fosfato kelią. Tačiau, skirtingai nei citozoliniu atveju, oksidacinis fosforilinimas žymiai padidėjo. Kita vertus, oksidacinė mitochondrijų profilio pusė buvo labiau savita: glikolitinis aktyvumas didėjo lygiagrečiai su TCA ciklu, tačiau oksidacinis fosforilinimas dažniausiai veikė žemesniu lygiu nei įprastai, o glutamino metabolizmas buvo mažai svarbus.

Metaboliniai sindromai atsiranda dėl kompromiso tarp redokso balanso, biomasės gamybos ir ATP/NADH kompromiso.

Mes nustatėme keletą pagrindinių elementų, kurie suformavo ankstesnius sindromus.cistanche varpos dydisOksidacinis sutrikimas susilaukė sustiprėjusio aerobinio atsako kaip kompromiso tarp augimo palaikymo ir disbalanso sutrikimo slopinimo. Tai apėmė srauto nukreipimą per maksimalų įmanomą reakcijų skaičių, sumažinančių NAD plus, išsaugant visuotinį srauto pasiskirstymą, galintį generuoti biomasės sudedamąsias dalis. Šie du mechaniniai elementai (perturbacijos buferis ir biomasės maksimizavimas) yra svarbiausi optimizavimo problemos reikalavimai ir jų pakanka apibūdinti tolerancijos profilio oksidacinį režimą.

3 pav. Konkuruojantys mechanizmai sukelia pseudohipoksinį mielių elgesį

(A) NADH, ATP ir biomasės pirmtakų gamybos pusiausvyra skatina reakcijos modulius, kurie gamina kuo daugiau ATP ir kuo mažiau NADH, kad būtų kompensuojamos redukcinių režimų pasekmės, pvz., glikolizės naudojimas TCA. Atkreipkite dėmesį, kad purpurinės rodyklės žymi ATP gamybą, geltonos rodyklės žymi NAD(H) gamybą, o balti apskritimai rodo biomasės pirmtakų susidarymą. (B) NADH linkęs NADH/NADt trikdymas (x ašis) sutampa su dirbtiniu ADP. fosforilinimo reakcija (y ašis), kuri stipriai įveda redukcinę galią ATP pavidalu į nesubalansuotą medžiagų apykaitą. Žalia spalvos gradientas rodo santykį tarp glikolitinio ir Krebso ciklo srauto, normalizuoto pagal normaliąją vertę (iki 100- karto). Galima pastebėti, kad ADP fosforilinimas sumažina pseudohipoksinį fenotipą ir atitolina ramybę.

Tačiau redukcinei pusei reikėjo papildomos įžvalgos. Kadangi vis daugiau NADH yra atskiriamas NADH reakcijose, kuriose naudojamas NADt ir kurios yra tiesiogiai ar netiesiogiai būtinos biomasės sudedamosioms dalims gaminti, tampa vis labiau ribojamos, todėl energijos apykaita turi būti nukreipta iš naujo, kad būtų galima padidinti NADH konversiją į NAD ir apriboti NAD' sumažinimas iki NADH. To vis dar nepakanka norint susidoroti su trikdymu, nes dauguma redukcinės galios NADH pavidalu iš esmės nenaudingos daugeliui medžiagų apykaitos tikslų, reakcijų ir augimo: NADH sukaupta energija turi būti perskirstyta į ADP. Taigi, metabolizmas turi teikti pirmenybę reakcijos moduliams, kurie gamina kuo daugiau ATP ir kuo mažiau NADH; jis turi remtis šuntais ir keliais, turinčiais didelę ATP/NADH išeigą, pvz., glikolizę ir oksidacinį fosforilinimą.

Šie rezultatai, be kita ko, sumažino TCA ciklą ir padidino glikolitinį srautą (3A pav.). Norėdami toliau tirti šio ATP/NADH kompromiso poveikį, redukcinį NADH/NAD trikdymą sutapome su dirbtine reakcija, leidžiančia fosforilinti ADP. . Modeliavimas parodė, kad padidėjęs glikolizės ir TCA ciklo srauto santykis, apibūdinantis redukcinį metabolizmą, priklauso nuo ATP / NADH išeiga.

4 pav. Tolerancijos balas, kaip chronologinės mielių gyvavimo trukmės prognozė

(A) mielių mutantų tolerancijos profiliai; mėlyni / raudoni kreivės sektoriai rodo NADH / NADH disbalanso redukcinį / oksidacinį režimą.

(B) Ryšys tarp normalizuoto tolerancijos balo (proporcingo disbalanso verčių pločiui ir oksidaciniu, ir redukciniu režimu, STAR metodais) ir chronologinės gyvavimo trukmės. Koreliacija paaiškina ~30 procentų visos dispersijos (R'= 0). 29, p reikšmė=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Kaip alternatyvų būdą peržiūrėti šią asociaciją, gavome regresijos nuolydžio verčių histogramą, gautą iš dešimties tūkstančių atsitiktinai sugeneruotų asociacijų tarp tolerancijos balo ir gyvenimo trukmės. Iš šio pavyzdžio randame tik 3 atvejus, kai ryšys tarp tolerancijos balo ir gyvenimo trukmės duomenų yra stipresnis nei nustatytas (nurodytas raudona vertikalia linija).

(3B pav.). Stipriai fosforilinamas ADP sumažina šį pseudohipoksinį požymį net ir esant labai stipriam NADH disbalansui.

Tolerancija paaiškina eksperimentinius chronologinius skirtingų mielių mutantų gyvenimo trukmės skirtumus

Toliau paklausėme, kokiu mastu tolerancijos profilis galėtų nuspėti gyvenimo trukmę, atsižvelgiant į tai, kad redokso poros buvo aptariamos kaip galimi gyvenimo trukmę lemiantys veiksniai. Vienas iš būdų tai ištirti yra apskaičiuoti skirtingų mutantų profilį (4A pav.) ir kiekybiškai įvertinti, kaip jis atitinka tikslius gyvenimo trukmės matavimus, normalizuotą chronologinį gyvenimo trukmę (CLS), gautas iš eksperimentiškai išmatuotų mutantų išgyvenimo kreivių (Garay ir kt., 2014). CLS apskaičiuojami pagal šias mutantų išgyvenamumo kreives kaip išgyvenamumo padidėjimą stacionarioje fazėje, palyginti su laukiniu tipu.

FBA atveju konkrečių genų mutacijos yra imituojamos apribojant su jais susijusių reakcijų srautą taikant Būlio taisykles, kurios susieja kiekvieną cheminę reakciją su ORF, kurios reiškia reakcijos fermentą (STAR ​​metodai). Kiekvienam iš šių mutantų apskaičiavome mutanto tolerancijos profilį (4A pav.) ir panaudojome disbalanso absoliučiųjų verčių sumą, kuriai esant augimo greitis sumažėja perpus (tiek redukciniame, tiek oksidaciniame režimuose), kaip skaliarinį tolerancijos balą (STAR). metodai).

Tačiau mūsų mutantų rinkinį ribojo kai kurie apribojimai (STAR ​​metodai). Pažymėtina, kad mes negalėjome atskirti tolerancijos skirtumų, mažesnių nei 10 ppm laukinio tipo vertės, nepasiekę pernelyg didelių skaičiavimo laikų, o daugelis mutantų turėjo ir nereikšmingus gyvenimo trukmės skirtumus, ir nereikšmingus tolerancijos skirtumus. Be to, paprastai manoma, kad FBA negali apibūdinti funkcijų padidėjimo ištrynimų ir, gana nuspėjama, nė vienas mutantas neviršijo laukinio tipo tolerancijos.

Be šių apribojimų, in silico tolerancijos profiliai galėjo paaiškinti -30 proc. eksperimentiškai išmatuoto gyvenimo trukmės kintamumo (4B pav., R2= 0.29, N=41,p reikšmė{{5). }}.2x 10-), turintis didelę reikšmę:10,000 atsitiktinių duomenų porų suskirstymas lėmė tik 3 atvejus su didesniu regresijos nuolydžiu (4C pav.).

Įprastos maistinės medžiagos leidžia toleruoti NADH / NADH disbalansą

Galiausiai ištyrėme, ar specifiniai dietiniai metabolitai buvo ypač lemiami reaguojant į redokso disbalansą. Šiuo tikslu naudojome papildomą FBA modelių funkciją, kuri yra galimybė pasiekti tam tikro metabolito naudojimą (apibrėžiama kaip vartojimo norma esant pastoviajai būsenai, STAR metodai). Ištyrėme, kaip šis greitis pasikeitė didėjant redukcinio ir oksidacinio NADH / NAD ir disbalanso vertėms.

Abiejose profilio pusėse ir daugumos metabolitų naudojimas buvo gana linijinis. Taigi mes pritaikėme šį besikeičiantį modelį tiesiniam modeliui ir laikėme (absoliutų) nuolydį kaip skaliarinį atitinkamo metabolito svarbą toleruojant redokso disbalansą (5A pav.). Tarp labiausiai reaguojančių iAZ900 maistinių medžiagų pastebėjome su maistu gaunamus metabolitus, kurie, kaip žinoma, atlieka svarbų vaidmenį reguliuojant mielių gyvavimo trukmę, pvz., acetatą (Burtner ir kt., 2009), taip pat daugelį, kurie eksperimentiškai padidina mielių, kirminų, arba net žmogaus ląstelės (Madeo ir kt., 2018; Mishur ir kt., 2016), įskaitant malatą, hidroksibutiratasą, spermidiną arba oksaloacetatą (5B-5D paveikslai, S1 lentelė).

Kai kurios maistinės medžiagos buvo labiau svarbios tolerancijai NADreduction, kitos - NADHoksidacijai, o kelios - abiem šiems režimams. Svarbiausi maisto metabolitai redukcinei tolerancijai buvo acetatas, beta-hidroksibutiratas (BHB), glutamatas ir glutaminas (5B pav.), tuo tarpu svarbiausi NADH oksidacijos tolerancija buvo acetatas, NADP plus, putrescinas ir spermidinas. (5D pav.). Tarp tų, kurie dalyvavo dėl tolerancijos abiejose profilio pusėse, svarbiausi buvo acetatas, glutamatas, oksaloacetatas ir oksoglutaratas (5C pav.).

Mes apsvarstėme medžiagų apykaitos modelius kituose organizmuose, kad dar labiau patvirtintume, kurios maistinės medžiagos yra lemiamos reakcijos į disbalansą (S1 metodai, taip pat žr. S2 paveikslą, kaip keičiasi pagrindinių kelių srautai). Visi šie pagrindiniai veiksniai pasikeitė, nors ir ne plačiai, nes alfa-keto rūgštys, redokso poros, tam tikri vitaminai ir tam tikros aminorūgštys buvo labai būtinos norint kontroliuoti NADH / NADt sutrikimus C.elegans ir žmogaus rekonstrukciją. Labiausiai paplitusi reakcija į redokso disbalansą šiuose organizmuose yra susijusi su metabolitais, kurie tarpininkauja pH homeostazei, pavyzdžiui, acetatu, bikarbonatu, bifosfatu, natriu, vandeniu ir kt. Panašiai glutamato, glutamino, aspartato, treonino, serino ir glicino svarba išskiria juos iš kitų aminorūgščių ir daugumos metabolitų. Vidutinio dydžio oksiduotos rūgštys, tokios kaip oksoglutaratas, malatas ir oksaloacetatas, taip pat nuolat vaidina toleranciją, kaip ir biotinas bei kai kurie folatai (išsamų sąrašą rasite S1 lentelėje).

DISKUSIJA

Čia siūlome alternatyvų metodą, kaip suprasti plačias biologines redokso porų pokyčių pasekmes. Šis metodas pagrįstas in silico metaboliniais modeliais ir įveda tolerancijos profilio sąvoką kaip priemonę, kuri kiekybiškai įvertina ląstelių atsparumą šiems pokyčiams.

5 pav. Homeostatinės maistinės medžiagos mielėse

(A) Maistinės medžiagos naudojimo profilio pavyzdys su atitinkama redukcine (mėlyna) ir oksidacine (raudona) tiesine regresija, atitinkamai apibūdinama nuolydžiais m ir m (absoliučiomis vertėmis). Fone kaip nuorodą įtraukėme citozolinio tolerancijos profilį.

(B) 4 geriausių homeostatinių maistinių medžiagų tiesinės regresijos šlaitai (m,) redukcine NADH / NAD ir trikdžių prasme.

(C) tiesinės regresijos šlaitai top4 maistinių medžiagų, kurios yra homeostatinės abiem perturbacijos prasmėmis; Mėlyna: redukcinės tiesinės regresijos nuolydis; Raudona: oksidacinės tiesinės regresijos nuolydis.

(D) 4 geriausių homeostatinių maistinių medžiagų tiesinės regresijos šlaitai (m.) oksidacine NADH / NAD ir trikdžių prasme.

Metaboliniai koregavimai, kuriais grindžiamas profilis, atskleidžia pseudohipoksinio fenotipo buvimą, susijusį su redukciniais NADH režimais. Šis fenotipas primena kai kuriuos akivaizdžiai paradoksalius mažo derlingumo energijos metabolizmus, pastebėtus sergant vėžiu (Warburgo efektas), taip pat atpažįstamas mielių (Crabtree efektas) ir bakterijų (perpildymo metabolizmas) ląstelėse (Basan ir kt., 2015; Mori ir kt., 2016; Potter ir kt., 2016). Pastaraisiais metais buvo pasiūlyta galimybė, kad tokį elgesį gali sukelti išteklių paskirstymo apribojimai, atsirandantys dėl palyginti didelio augimo ar gliukozės įsisavinimo (Basan ir kt., 2015; Mori ir kt., 2016). Tačiau mūsų stebimas pseudohipoksinis fenotipas nepriklauso nuo augimo greičio ir gliukozės įsisavinimo, o iš tikrųjų jis atsiranda kartu su mažais augimo tempais (STAR ​​metodai). Mes parodėme, kad jo priežastis slypi esminiame ATP/NADH kompromise – loginį pagrindą patvirtina neseniai atliktas eksperimentinis tyrimas (Maldo-nado ir Lemasters, 2014).

Be to, mūsų srauto analizė rodo, kad redukcinis NADH / NAD ir pusiausvyros sutrikimas gali neigiamai paveikti ATP palaikymą. Manoma, kad padidėjęs NADH yra sumažėjusio ATP prieinamumo koreliacija, nes dėl oksidacinio fosforilinimo sutrikimo gali padidėti NADH / NAD plius ir sumažėti ATP / ADP. Mes parodome, kad išoriškai susidaręs NADH disbalansas gali būti sumažėjusio energijos prieinamumo priežastis dėl stačiakampių medžiagų apykaitos mechanizmų, net jei oksidacinis fosforilinimas veikia virš normalaus lygio. Tai labai svarbu senėjimo tyrimų kontekste, nes sumažėjęs energijos prieinamumas ir ATP/ADP santykis yra išsaugotas ląstelių senėjimo ir su amžiumi susijusių patologijų požymis (Moreira ir kt., 2003; Pall, 1990; Yaniv ir kt., 2013). ) ir gali paskatinti toksinių atliekų kaupimąsi ir proteostazės praradimą (dar vieną senėjimo požymį), nes mažėja baltymų apykaita ir dėl to padidėja baltymų pusinės eliminacijos laikas (Anisimova ir kt., 2018).

Toliau siekiame nustatyti mūsų sistemos, kaip gyvenimo trukmės ir dietinių metabolitų, slopinančių redokso disbalansą, pagrįstumą. Tolerancija numato ląstelių gyvavimo trukmę su tam tikrais apribojimais dėl turimo duomenų rinkinio. Kontroliuodami šiuos apribojimus (Garay ir kt., 2014), pastebime, kad gautos koreliacijos vis dar yra pakankamas tolerancijos ir CLS skirtumų ryšio įrodymas.

Priešingai nei tikėjomės, ryškiausia mūsų mitybos metabolitų analizės pamoka yra ta, kad pagrindinė medžiaga, sukelianti atsaką į disbalansą, nėra ypač priklausoma nuo NADt gelbėjimo tinklo. Iš tiesų, geriausios „homeostatinės maistinės medžiagos“ yra TCA ciklo ir kitų centrinio metabolizmo dalių tarpinės medžiagos, kurių veikimas yra daug prasmingesnis nei NAD pirmtakų. Be to, reakcijų, kurios sumažino arba oksidavo NAD(H), veikdamos kaip tiltai tarp redokso poros ir pagrindinių medžiagų apykaitos takų, svarba yra daug pranašesnė nei NADt gelbėjimo ribojančių fermentų (tokių kaip nikotinamido mononukleotido adeniltransferazė).

Pavyzdžiui, oksaloacetatas ir oksoglutaratas mielių modelyje yra tarp keturių veiksmingiausių metabolitų, kurių tolerancija tiek redukcinėmis, tiek oksidacinėmis sąlygomis yra nuosekli savybė, patvirtinanti ankstesnius eksperimentinius rezultatus (Chin ir kt., 2014; Williams ir kt., 2009). . Kiti svarbūs metabolitai yra hidroksibutiratas, kuris, kaip buvo nuolat įrodyta, prailgina gyvenimo trukmę, reguliuoja NAD ir tarpininkauja reaguojant į badą (Edwards ir kt., 2014; Newman ir Verdin, 2014), ir spermidiną, kuris priklauso poliaminų šeimai ir yra žinomas kaip vaidina su amžiumi susijusius procesus, autofagiją ir DNR apsaugą (Eisenberg ir kt., 2009; Minois ir kt., 2011: Pietrocola ir kt., 2015).

Mes panaudojome C.elegans ir žmogaus modelius, kad sustiprintume ankstesnį vertinimą, atskleisdami platesnį vaizdą, kuris yra sutelktas į pH homeostazę, redokso poras ir TCA ciklą. Tai rodo, kad būdai, kuriais pH (Burtner ir kt., 2009) ir NADH disbalansas (Ayer ir kt., 2014) lemia ląstelių senėjimą, yra labai susiję. Be pH, labiausiai paplitusios ir svarbiausios maistinės medžiagos, reguliuojančios NADH/NAD ir disbalansą, yra alfa-keto rūgštys oksaloacetatas ir oksoglutaratas, jų aminuotos formos ir kiti su mitochondrijomis susiję metabolitai, tokie kaip malatas, piruvatas ir fumaratas, ty pagrindinis redokso balanso kontrolė yra TCA ciklas.

Iki šiol mechanizmai, per kuriuos aminorūgštys ir TCA ciklo tarpiniai produktai daro įtaką mielių ir C. elegans gyvenimo pratęsimui, lieka neaiškūs. Metabolitai, tokie kaip malatas, oksaloacetatas, fumaratas, valinas, serinas ar treoninas, iš tiesų gali pailginti organizmų gyvenimo trukmę, tačiau procesai, sukeliantys šį poveikį, yra diskutuojami ir sudėtingi (Edwards ir kt., 2013, 2015). Mūsų rezultatai rodo, kad bendras visų šių ilgaamžiškumą skatinančių reiškinių paaiškinimas yra maistinių medžiagų poveikis ląstelių gebėjimui toleruoti NADH / NAD plius santykio sutrikimus.

Tačiau galima teigti, kad kai kurie aptarti metabolitai atrodo savaime aiškūs, nes jie dalyvauja reakcijose, kurios tarpusavyje paverčia NADH ir NAD plus . Kyla klausimas, kodėl kiti metabolitai, kurie taip pat atrodo a priori savaime suprantami, mūsų rezultatuose neatsiranda. Atsakymas slypi mechanizmuose, užtikrinančiuose realistiškas FBA prognozes. Kad maistinė medžiaga būtų „homeostatinė“ prieš redokso disbalansą, ji turi ne tik padidinti NADHor NADt gamybą, bet ir atsidurti centriniame kelyje arba modulyje, turinčioje didelę ATP/NADH išeigą ir (arba) gebėjimą aprūpinti biomasės sudedamosiomis dalimis.

Galiausiai verta paminėti dar dvi mūsų rezultatų įžvalgas. Viena vertus, jie teigia, kad reaguodami į redokso disbalansą, medžiagų apykaitos tinklai yra pasirengę vis daugiau gaminti ir (arba) vartoti kai kuriuos metabolitus, kuriuos signalizacijos tinklai supranta kaip užkertančius kelią autofagijai, antioksidaciniams ir hormetiniams atsakams, taip pat daugeliui jų perteklius. arba buvo nustatyta, kad papildai padidina gyvenimo trukmę ir (arba) kitaip imituoja kalorijų apribojimo (CR) poveikį tokiu būdu, kuris priklauso nuo signalizacijos kelių, susijusių su CR tarpininkaujančiu gyvenimo trukmės pailgėjimu. Tai sustiprina ankstesnius įrodymus, siejančius CR ir NADH/NADH pusiausvyrą kaip to paties gyvenimo trukmę prailginančio ir sveikatą stiprinančio proceso dalį (Lin ir kt., 2004).

Kita vertus, mūsų tyrimas rodo, kad, reaguodama į pakitusius santykius, metabolizme vis dažniau naudojamos ir tam tikros medžiagos, galinčios chemiškai pažeisti ląstelę, pavyzdžiui, acetatas, putrescinas ar acetaldehidas; taip pat kai kurie, kurie gali skatinti naviko atsiradimą per medžiagų apykaitos keitimą, pavyzdžiui, glutaminas, sukcinatas ir fumaratas (Sciacovell ir kt., 2016). Tai gali iš dalies paaiškinti patologijas, susijusias su redokso disbalansu ir makroskopiniais procesais, kuriuose jis dalyvauja, pvz., degeneracinės ir onkologinės ligos: jei redokso disbalansas turi būti apsaugotas toksiškomis medžiagomis, šios medžiagos tikriausiai yra kartu sukeliančių patologijų mechanizmai. - atsiranda su redokso disbalansu.

Suprantame, kad mūsų požiūris į redokso disbalansą gali būti suprantamas kaip neįprastas medžiagų apykaitos tinklo tvirtumo tyrimo variantas ir kad jis gali apkaltinti tam tikrus įspėjimus, kurie palieka daug galimybių tobulėti. Kalbant apie tvirtumą, tyrimai, naudojantys FBA, tradiciškai apibrėžė jį kaip objektyvaus sprendimo pakeitimą (paprastai augimą), reaguojant į įvairų reakcijos greičio sumažėjimą, pvz., (Edwards ir Palsson, 2000), o ne į tam tikrą sutrikimą (redokso disbalansą). ) metabolituose, kaip ir mes. Kalbant apie mūsų analizės apribojimus, jie gali būti susieti su pačiais FBA apribojimais, pavyzdžiui, reguliuojančių genų nebuvimu. Galiausiai mūsų rezultatų patikimumas priklauso nuo metabolinių rekonstrukcijų nuspėjamumo: dabartiniai mielių modeliai yra nuspėjami ir pažangūs, tačiau jie nėra tobuli (Heavner ir Price, 2015), ir vis dėlto jie yra daug geresni nei dauguma. Galimos tikslios daugialąstės rekonstrukcijos. Nepaisant visų šių rūpesčių, yra daug įrodymų, patvirtinančių, kad medžiagų apykaitos modeliai vis labiau atitinka natūralią elgseną.

Šiuo metu vyraujantys tyrimai linkę ignoruoti galimas neigiamas pasekmes, atsirandančias beatodairiškai mažinant NADH / NADH santykį. Iš dalies taip yra dėl daug žadančios naudos, atsirandančios dėl nedidelio eksperimentiniu būdu pasiekto sumažėjimo, įskaitant neoplastinių fenotipų sumažėjimą, gyvenimo trukmę ir sveikatos pratęsimą. Tačiau yra naujų įrodymų, kurie rekomenduoja būti labai atsargiems dėl šių teigiamų rezultatų (Gujarat al., 2016; Hong ir kt., 2019), taip pat tvirta, eksperimentiškai palaikoma teorinė sistema, kuri numato neigiamas NADH / NADH santykio sumažėjimo pasekmes. slenkstis (Aon ir kt., 2010). Mūsų NADH/NADt disbalanso tolerancijos profiliai atitinka šį besiformuojantį vaizdą, nes nedideli oksidaciniai nukrypimai gali būti naudingi, tačiau didesni yra tokie pat žalingi kaip ir priešingas kraštutinumas.

Tiksliau tariant, mūsų tolerancijos profiliai rodo, kad be cheminių ar fiziologinių problemų, tiek žemas, tiek didelis NADH / NADH santykis taip pat turi būti susijęs su grynai metaboliniais trūkumais, įskaitant sumažėjusį energijos prieinamumą ir (arba) biosintetinę išeigą. Be to, kaip jau minėjome, riboti eksperimentiniai stebėjimai, kuriuos galima rasti kai kuriais klausimais, kuriuos sprendžiame, primena rezultatus, apie kuriuos pranešame čia.

Tyrimo apribojimai

Čia pateikti rezultatai pagerėtų, kai naudojami modeliai būtų toliau tobulinami. Mūsų darbas taip pat kenčia nuo esminių FBA kaip technikos apribojimų. Pavyzdžiui, dinaminė informacija nepasiekiama, nes šiuo metu turimos dinaminio srauto analizės versijos yra per siauros. Panašiai, nesant numanomų energijos apribojimų srauto balanse, sumažėja jo nuspėjamumas dėl didelių augimo tempų. Šis trūkumas paskatino pridėti tokius metodus kaip CAFBA, kaip mes svarstėme rankraštyje. Galiausiai būtų įdomu gauti reguliavimo informaciją, kurią būtų galima lengvai valdyti ir įjungti arba išjungti. Šiuo metu nėra standartizuotų metodų, kaip įgyvendinti genų reguliavimą FBA. Reakcijos aktyvumo balų taikymas apribojimo riboms šiuo atžvilgiu yra perspektyvus.

Šis straipsnis ištrauktas iš iScience 24, 102697, 2021 m. liepos 23 d.