Diskusija

Sukūrėme kiekybinę realaus laiko techniką, skirtą SNCA perdavimo iš ląstelės į ląstelę tyrimui.C. elegans. Modelis pasižymi daugybe pagrindinių sinukleinopatijos požymių, įskaitant laipsnišką SNCA agregatų kaupimąsi,nervų degeneracija,elgesio trūkumai, irsumažinta gyvenimo trukmė. Tiek genetinės, tiekfarmakologinės manipuliacijosgyvūnų parodė stiprią koreliaciją tarpsenėjimo tempai, transląstelinis SNCA perdavimas ir neurodegeneraciniai fenotipai, taip pat įvairios manipuliacijos, susijusios suanti-senėjimo poveikisgali sulėtinti šių įvykių progresavimą.Nuo senėjimo priklausomas sinukleinopatijos progresavimaslydi baltymų skilimo sumažėjimas.Anti-senėjimo procedūrosgali atkurti sistemas, tarpininkaujančias baltymų skaidymui. Be to, lizosomų funkcijos atkūrimas palengvino agregatų plitimą ir su tuo susijusią neurodegeneraciją šiuose senėjimo modeliuose. BiFC yra plačiai naudojamasfluorescencijos technika, kuri buvo sėkmingai pritaikyta vertinant baltymų ir baltymų sąveiką ir baltymų dimerizaciją ir (arba) oligomerizaciją gyvose ląstelėse.7 Įrodyta, kad V1S-SV2 BiFC porafluorescuoja po SNCA dimerizacijos / oligomerizacijos, kai šie baltymai yra kartu ekspresuojami žinduolių ląstelėse.7 Ankstesniame tyrime,17 generuodami neuroblastomos ląstelių linijas, ekspresuojančias vieną iš V1S ir SV2, parodėme, kad SNCA baltymų pernešimas iš ląstelės į ląstelę ir perkeltų baltymų koagregacija suendogeninį SNCA galima vizualizuoti naudojant BiFCfluorescencijašių ląstelių auginimo metu.

Sveiki atvykę į mano parduotuvę, kurioje rasite vaistažolių Cistanche, skirtą senėjimui stabdančiam gydymui

Nemokamas pristatymas ir pristatymas visame pasaulyje.

Vienas iš svarbių BiFC sistemos techninių klausimų yra patikrinti kiekvieno baltymo ląstelių tipui būdingą ekspresiją.Nors kiekybinė SNCA transgeninės ekspresijos kiekvieno tipo ląstelėse analizė nėra techniškai įmanoma, mes turime daugybę duomenų, patvirtinančių argumentą, kad SNCA yra išimtinaiišreikštas tik numatytais ląstelių tipais. Pirma, DsRednesėkmesvėžys aptinkamas tik apverstas-21 neuronų, visai ne ryklės raumenų ląstelėse. Antra, imunofluorescencinis SNCA dažymas labai specifiniu ir jautriu antikūnu parodė šio baltymo ekspresiją konkrečiai numatytoje ląstelėje.tipai. Trečia, tos pačios BiFC poros išraiška kirmėlėsesudyn-1mutacijos ženklaififismarkiai sumažino BiFCfluorescencijos signalas, nurodantis, kad BiFC generavimasfluoresreikia endocitozės. Tai rodo, kad BiFC signalas kilo ne iš BiFC poros koekspresijos tuose pačiuose ląstelių tipuose, o dėl tarpląstelinio baltymų perdavimo.

naujų genetinių moduliatorių identifikavimo sistema. Be to, išskirtinė C. elegans ryklės struktūra leistų patogiai identifikuoti sinukleinopatijos perdavimo pokyčius atliekant didelio masto genetinių ir mažų molekulių modifikatorių atranką.

Senėjimo poveikis„Perdavimo“ procesai, o ne pats agregavimas, yra pagrindinė šio straipsnio tema. Dabar norėtume aiškiai pasakyti, kad nebandome teigti, kad senėjimas ir lizosomų disfunkcija veikia tik agregatų perdavimą, nedarant įtakos pačiai ląstelių autonominei agregacijai. Mūsų BiFC sistema yra puiki sistema, skirta kiekybiškai įvertinti perdavimo įvykį, bet nėra skirta stebėti savarankišką skambučių agregaciją. Ankstesni tyrimai,25-27 įskaitant mūsų,28 nagrinėja lizosomų disfunkcijos poveikį ląstelių autonominės SNCA agregacijos pašalinimui. Tačiau taip pat norėtume atkreipti dėmesį į tai, kad nėra galutinių įrodymų, kad šie tyrimai stebėjo tik autonominę ląstelių agregaciją, neįskaitant transląstelinio agregato perdavimo ir amplifikacijos poveikio. Taip pat norėtume pabrėžti, kad agregavimo inicijavimas yra absoliutus reikalavimas agregatiniam perdavimui. Tiesą sakant, mes parodome, kad bazinio lygio ląstelių autonominė agregacija vyksta spontaniškai net ir pavieniams transgeniniams gyvūnams (8F pav.).

TheGlcNAc anti-senėjimo poveikisbuvo aprašyta kaip DAF{0}}nepriklausoma.12 Tai rodo, kad GlcNAc išsaugo daf-16 fenotipą ne tiesiogiai paveikdamas DAF-16 kelią, bet veikdamas per nepriklausomus senėjimo kelius. Mūsų pateikti duomenys rodo, kad SNCA perdavimo nekontroliuoja konkretus senėjimo kelias, o veikiau reguliuoja bendras senėjimas.

Mūsų dabartinis tyrimas suteikia pagrindą apsvarstyti galimybę naudoti bendruosius senėjimą stabdančius metodus kaip terapines strategijas PD ir susijusių sinukleinopatijų progresavimui sustabdyti arba sulėtinti. Be to, lizosomų funkcijos stiprikliai gali būti laikomi kandidatais į gydymą, kuriuo siekiama sustabdyti arba sulėtinti šių ligų progresavimą. Tas pats metodas teoriškai gali būti taikomas ir kitoms su amžiumi susijusioms neurodegeneracinėms ligoms, kurių daugelis, kaip manoma, progresuoja plintant specifiniams baltymų agregatams. Darant prielaidą, kad skirtingų baltymų agregatų plitimas turi tą patį pagrindinį principą, mes atsargiai spėliojame, kad senėjimo ir prolizosomų strategijos galėtų būti sukurtos į bendrą daugelio neurodegeneracinių ligų progresavimo stabdymo terapiją. Šią hipotezę galima išspręsti taikant BiFC pagrįstą gyvūnų modelį kitiems perdavimo modeliams, apimantiems MAPT, poliglutamino baltymus ir TARDBP.1

medžiagos ir metodai

Padermės ir nematodų auginimas Visos padermės buvo apdorotos taikant standartines procedūras ir auginamos nematodų auginimo terpės (NGM) lėkštelėse, kuriose buvo Escherichia coli (E. coli) padermės OP50 veja 20 °C temperatūroje.29 Laukinio tipo Bristol N2 ir mutantų padermės. unc-119(ed3), dyn-1(ky51) ir asp-4(ok2693) buvo gauti iš Caenorhabditis Genetics Center (CGC; Minesotos universitetas, St. Paul, MN , JAV). Mutantinę padermę asp{11}}(tm666) pateikė C. elegans nacionalinis bioresursų projektas (NBRP; Tokijo moterų medicinos universiteto medicinos mokykla, Tokijas, Japonija). Mutantinės padermės daf-2(e1370) ir daf-16(mu86) buvo dosnios dovanos iš profesoriaus Kyuhyung Kimo (DGIST, Tegu, Korėja).

C. elegans plazmidžių konstrukcija

V1S ir SV2 šablonų plazmidės buvo dosnios daktarės Pamelos McLean (Massachusetts General Hospital, Boston, MA, JAV) dovanos. Pirmas) Pmyo-2::EGFP Myo-2 promotorius (Pmyo-2) buvo PGR amplifikuotas iš genominės DNR, gautos iš laukinio tipo N2 kirminų.

Buvo naudojamas sensorinis pradmuo, turintis HindIII vietą 50 -GACAAGCTTGGGGTTTTGTGCTGTG GACGTT-30, ir antisensinis pradmuo su BamHI vieta 50 - GACGGATCCTTCTGTGTCTGACGATCGAGG-30. Pmyo-2::EGFP buvo sukurtas įterpiant PGR produktą į pFX_EGFPT vektoriaus HindIII ir BamHI vietas.30 Du) Pmyo-2::SNCA(Myc) Pojūtis pradmuo, turintis SalI vietą, 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 ir antisensinis pradmuo, turintis myc žymos seką ir BglII vietą, 50 - AGCA GATCTCTACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCGCTCampl}GTTC buvo naudojamas-{1GTAGCampl}GTTC. pažymėtas žmogaus SNCA, gautas iš pcDNA3.1 MycHis SNCA vektoriaus.28 Pmyo-2::EGFP EGFP fragmentas buvo pakeistas PCR amplifikuotu Myc pažymėtu žmogaus SNCA fragmentu, kad būtų sukurtas Pmyo-2::SNCA (Mano C). Trys) Pmyo-2::V1S Jutimo pradmenys su SalI vieta 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGTGAGCAAGGCCGAGG-30 ir antisensinis pradmuo su BglII vieta 50 -AGCAGATCTTTAGGCTT CAGGTTCGTAGTC 25}} buvo naudojami V1S sustiprinti. Be to, Pmyo-2::EGFP EGFP fragmentas buvo pakeistas PCR sustiprintu V1S fragmentu, kad būtų sukurtas Pmyo-2::V1S. Keturi) Pmyo-2::V1Q25 jutimo pradmenys su claI vieta 50 - TAAGCAATCGA TATGGCGACCCTGGAAAAGCTG-30 ir antisensinis pradmuo su claI vieta 50 -TGCTTAATCGATAGGTCGCCGTGCA 38}} buvo naudojami Q25 sustiprinti. Tada žmogaus Pmyo-2::V1S SNCA fragmentas buvo pakeistas PCR sustiprintu Q25 fragmentu, kad būtų sukurtas Pmyo-2::V1Q25. Keturi) Pflflp-21::SV2 pFX_EGFPT EGFP fragmentas buvo pakeistas PCR amplifikuotu SV2 fragmentu, kad būtų sukurtas SV2 vektorius.

Naudotas sensorinis pradmuo su SpeI vieta 50 -AGCACTAGTGCCACCATGGATG TATTCATGAAAGG-30 ir antisensinis pradmuo, turintis BglII vietą, 50 -AGCAGATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC CG-30. Flip-21 promotorius (Pflflp-21) buvo PGR amplifikuotas iš N2 genominės DNR ir subklonuotas į SV2 vektoriaus KpnI ir SalI vietas, kad būtų sukurtas Pflflp-21::SV2. Flpl{15 sustiprinti buvo naudojamas sensorinis pradmuo, turintis KpnI vietą 50 - AGCGGTACCAACTAGGTCCAGTGACCGAAAG-30 ir antisensinis pradmuo su SalI vieta 50 -AGCGTCGACGCCAC CATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30. } reklamuotojas. Penki) Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed Kad būtų sukurtas SV2 vektorius, kartu ekspresuojantis DsRed kaip ryklės neuronų žymeklį, Pflflp{20}} buvo subklonuotas į pFX{ KpnI ir SalI vietas {21}}DsRedxT vector30 ir pavadintas Pflflp-21::DsRed. SV2 ir DsRed koekspresija po flflp-21 promotoriumi buvo pasiekta tarp SV2 ir DsRed įdėjus tarp cistroninę sritį (ICR), kuri buvo PGR amplifikuota iš N2.31 SV2 fragmentas suliejant buvo sulietas su ICR sritimi. PCR32 ir subklonuotas į Pflflp-21::DsRed, kad būtų sukurtas Pflflp-21::SV2-ICR DsRed. PCR reakcijoje buvo naudojamas sensorinis pradmuo su SalI vieta 50 -AGCGTC GACGCCACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 ir antisensinis pradmuo, turintis persidengiantį regioną su ICR, 50 -CGATCATTTTGGAGATTACTTGTACAGCTTGTCC{38}} skirtas SV2. ICR sritis buvo sustiprinta sensoriniu pradmeniu, turinčiu persidengiančią sritį su SV2, 50 -GGACGAGCTGTACAAGTAATCTCCAAAAT CATCG-30, ir antisensiniu pradmeniu, turinčiu SpeI vietą 50 - AGCACTAGTTACCCTGTAATAATATATTAAAC{{44}

BiFC transgeninių kirminų sukūrimas

Pmyo-2::V1S ir Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed plazmidės buvo sušvirkštos į vėlyvosios L4- stadijos N2 kirminų lytines liaukas su atrankos žymekliu pRF4 kuris išreiškia mutantinį kolageno geną rol- 6(su1006), 33, kad sudarytų dvigubą transgeninę liniją, ekspresuojančią BiFC porą. Kaip neigiama BiFC kontrolė, vien Pmyo-2::V1S buvo sušvirkštas į N2 kirminus su pRF4, o Pflflp-21::SV2-ICR DsRed buvo švirkščiamas tik į unc{{18 }}(ed3) mutantiniai kirminai su atrankos žymekliu pCFJ151, kuris ekspresuoja unc-119(C) geną.34 Plazmidė Pmyo-2::V1 buvo sukurta BiFC dalinei sekai išreikšti tik įvedant stop kodonas prieš pat SNCA kodavimo seką Pmyo-2::V1S naudojant Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, 200521). Tada Pmyo-2::V1 ir Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed plazmidės buvo sušvirkštos į N2 su pRF4. Plazmidė Pmyo-2::V1Q25 buvo sukurta siekiant ekspresuoti huntingtino egzoną 1 su 25 glutamino ruožu, pakeičiant SNCA Q25 fragmentu Pmyo-2:: V1S. Tada Pmyo-2::V1Q25 ir Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed plazmidės buvo sušvirkštos į N2 su pRF4. Be to, Pflflp-21::DsRed buvo sušvirkštas į N2 su pRF4 kaip bendros baltymų perteklinės ekspresijos neuronuose kontrolė. Įvestų plazmidžių chromosomų integracijai įšvirkštos linijos buvo veikiamos UV spinduliuote. Po UV švitinimo kiekviena integruota linija buvo 4 kartus perbraukta N2. Dvigubos transgeninės linijos, turinčios Pmyo-2::V1S ir Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed, buvo sukurtos sujungus integruotą Pmyo-2::V1S liniją su integruota Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed linija. Visi šie transgeniniai kirminai parodė ritininį fenotipą ir DsRed ekspresiją

fluorescencija ryklės neuronuose.

Nepažymėtų SNCA modelių generavimas Pmyo-2::SNCA ir Pflflp-21::SNCA plazmidės buvo sukurtos taip, kad išreikštų SNCA tik įvedant stop kodoną iškart po SNCA koduojančios sekos, naudojant QuikChange į vietą nukreiptą mutagenezę rinkinys. Kaip neigiama kontrolė, vien Pmyo-2::SNCA buvo sušvirkštas į N2 kirminus su pRF4. Pmyo-2::SNCA ir Pflflp-21:: SNCA plazmidės buvo sušvirkštos į vėlyvosios L4- stadijos N2 kirminų lytinius liaukas su pRF4. Visi šie kirminai parodė ritininį fenotipą ir eksperimentams buvo naudojamos 3 reprezentacinės kiekvieno genotipo linijos. Su senėjimu susijusių BiFC modelių generavimas Pmyo-2::V1S ir Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed plazmidės buvo injektuotos į vėlyvosios L4-daf stadijos lytines liaukas. -2(e1370) ir daf-16 (mu86) mutantiniai kirminai su pRF4. Kaip su senėjimu susijusių BiFC modelių kontrolė, Pmyo-2::V1S arba Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed buvo švirkščiamas tik į vėlyvojo L{{30} lytines liaukas. }N2 stadija ir daf-16(mu86) mutantiniai kirminai su pRF4. Po to, kai buvo gautos kelios transgeninės linijos, turinčios įvestas plazmides, eksperimentams buvo naudojamos 3 reprezentacinės linijos kiekviename mutantiniame fone.

hlh-30p::hlh-30 transgeninių linijų generavimas

Plazmidė, išreiškianti hlh-30p::hlh-30::gfp, buvo dosni dr. Malene Hansen (Sanfordo-Burnhamo medicinos tyrimų instituto, CA, JAV) dovana. Plazmidė hlh-30p::hlh-30 buvo sukurta įvesti stop kodoną prieš GFP koduojančią seką, naudojant QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, kad slopintų GFP ekspresiją. Kaip kontrolė, kiekvienas Pmyo-2::V1S arba Pflflp-21::SV2-ICRDsRed ir hlh-30p::hlh-30 buvo įtrauktas į vėlyvosios L4-stadijos N2 kirminų lytinės liaukos su pRF4. Plazmidės, ekspresuojančios Pmyo-2::V1S, Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed ir hlh-30p::hlh-30, buvo sušvirkštos vėlyvosios L4-stadijos daf-16(mu86) mutantinių kirminų, turinčių pRF4, lytinių liaukų. Lizosomų disfunkcijai analizuoti buvo naudojami asp-4(ok2693) ir asp-1(tm666) mutantiniai kirminai, kuriuose inaktyvuotas lizosomų fermento katepsino genas. Pmyo-2::V1S ir Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed plazmidės buvo sušvirkštos į vėlyvosios L4- stadijos mutantinių kirminų lytinius liaukas su pRF4. Gavus transgenines linijas, kuriose buvo įvestos plazmidės, eksperimentams buvo naudojamos 3 reprezentacinės kiekvieno genotipo linijos.

Imunofluorescencinė mikroskopija

Imunofluorescenciniam kirminų dažymui buvo surinkti laukinio tipo N2 ir transgeniniai kirminai, nuplauti M9 buferiu (22 mM KH2PO4, 22 mM Na2HPO4, 85 mM NaCl, 1 mM MgSO4) ir iš anksto fiksuoti 4 procentais paraformaldehidu (MRWB). 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 1{{60}} mM EGTA, 5 mM spermidino [Sigma-Aldrich, S0266], 50 procentų metanolio). Siekiant sumažinti odelių sluoksnio standumą, kad būtų galima prasiskverbti, kirmėlės buvo kelis kartus užšaldomos / atšildytos naudojant skystą azotą ir 2 valandas inkubuojamos maišant 4 ° C temperatūroje. Kadangi redukcijos ir oksidacijos etapai padidina slieko pralaidumą, kirminai buvo plaunami Tris-Triton buferiu (100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 proc. Triton X-100 [Bio-Rad laboratories Inc., 161– 0407], 1 mM EDTA) ir inkubuojamas su 1 % b-merkaptoetanoliu (Sigma-Aldrich, M7522) Tris-Triton buferyje kambario temperatūroje (RT) 2 valandas. Vėliau kirminai buvo inkubuojami kolagenazės tirpale (100 vienetų IV tipo kolagenazės [Worthington Biochemical Co., LS004188] 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM CaCl2, 0,1 proc. Triton X{50}}). 4 valandas kambario temperatūroje. Tada kirminai buvo inkubuojami Tris-Triton buferyje, papildytame 0,3 procento H2O2 (Sigma-Aldrich, H1009), 15 minučių kambario temperatūroje. Po inkubacijos blokuojančiame buferyje (0,1 proc. galvijų serumo albumino [BSA; Sigma-Aldrich, A7906], 0,5 proc. Triton X-100, 1 mM EDTA fosfatiniu buferiniu tirpalu [PBS; GenDEPOT, CAP{69}} ]), kirminai buvo inkubuojami su monokloniniu antikūnu 274 mAb10 per naktį 4 C temperatūroje pirminiame antikūnų tirpale (1 proc. BSA, 0,5 proc. Triton X-100, 1 mM EDTA PBS). Kitą dieną kirminai buvo plaunami blokuojančiu buferiu ir 2 valandas inkubuojami su rodamino raudonuoju X konjuguotu ožkos anti-pelės IgG (1:100; Jackson Immunoresearch Laboratories, 115-295-166). Tada kirminai buvo nuplauti blokuojančiu buferiu ir sumontuoti antifade reagente (Invitrogen, P36930). Mėginiai buvo analizuojami naudojant Olympus FV1000 konfokalinį lazerinį skenavimo mikroskopą (Olympus, Tokijas, Japonija).

Gyvų kirminų fluorescencinė mikroskopija

Kirminai buvo imobilizuoti 10 mM natrio azidu M9 buferyje ir uždengti dengiamuoju stikleliu. Kirminų vaizdai buvo gauti naudojant Olympus FV1000 konfokalinę lazerinę skenavimo mikroskopiją.

Western blotingas

Suaugę kirminai buvo plaunami M9 buferiu ir vėliau PBS, turinčiu 1 procentą Triton X-100. Sliekų nuosėdos buvo apdorotos ultragarsu PBS, kuriame yra 1 % Triton X-100, 1 % (tūrio/tūrio) proteazės inhibitorių kokteilio (Sigma-Aldrich, P8340), ir centrifuguojamos, kad gautų Tritone tirpų (supernatantą) ) ir -netirpios (granulių) frakcijos. Baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant BCA baltymų tyrimą (Pierce Biotechnology, 23223 ir 23224). Baltymų mėginiai (3 mg SNCA ekspresijos tyrimui, 50 mg poliubikvitino baltymams aptikti ir 20 mg (V1S, V1SCSV2 linijos) ir 40 mg (SV2 linijos) skirtingam SNCA tirpumui buvo įkelti į 12 procentų SDS-PAGE gelius. Pirminiai antikūnai, naudojami Western blot tyrimui, buvo monokloniniai anti-SNCA antikūnai, 274 mAb (1:1 500) ir Syn-1 (1:1 500; BD BioScience, 610787) ir antikūnas prieš ubikvitiną (1:3,{). {35}}; Abcam, ab7254). Chemiliuminescencijos aptikimas buvo atliktas naudojant LAS-3000 liuminescencinio vaizdo analizatorių („Fujifilm“, Tokijas, Japonija) ir „Amersham imager 600“ („Ge Healthcare Life Sciences“, Marlborough, MA, JAV) ir „Multi Gauge“ (v3.0) programinę įrangą („Fujifilm“). , Tokijas, Japonija).

Taškinis blotingas

Kiekvienos padermės suaugę kirminai buvo plaunami M9 buferiu ir vėliau PBS, turinčiu 1 procentą Triton X-100. Sliekų nuosėdos buvo apdorotos ultragarsu PBS, kuriame yra 1 % Triton X-100 ir 1 % (tūrio/tūrio) proteazės inhibitorių kokteilio. Baltymų mėginiai (500 ng) buvo įkelti ant nitroceliuliozės membranų, kurios vėliau buvo išdžiovintos ir inkubuojamos blokuojančiame tirpale. Pirminiai antikūnai, naudojami taškiniam blotavimui, buvo monokloniniai anti-SNCA antikūnai 274 mAb ir Syn-O2,13, pastarieji yra specifiniai SNCA agregatams. Chemiliuminescencijos aptikimas buvo atliktas naudojant LAS-3000 liuminescencinio vaizdo analizatorių ir Amersham imager 600 bei Multi Gauge (v3.0) programinę įrangą.

Gydymas anti-senėjimo agentu

N-acetilgliukozaminas (GlcNAc) (Sigma-Aldrich, A8625) buvo ištirpintas distiliuotame vandenyje iki 1 M kaip pradinis tirpalas. Pradinis tirpalas buvo praskiestas LB skysta terpe (Sigma-Aldrich, L3022). Kiekvienos transgeninės linijos L4- stadijos kirminai buvo perkelti į NGM plokšteles, kuriose galutinė koncentracija buvo 10 mM GlcNAc. Vieno kirmėlio PGR Sunkus vienas kirminas iš kiekvienos linijos buvo lizuojamas lizės buferyje (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,45 proc. NP-40 [IGEPAL; Sigma-Aldrich, I3021], 0,45 procento Tween 20 [Sigma-Aldrich, P1379]) su 0,1 mg/ml proteinazės K (Sigma Aldrich, P4850). Vienam buferyje esančiam kirminui buvo atlikti keli užšaldymo-atšildymo ciklai, naudojant skystą azotą, 1 val. inkubuojamas 65 C temperatūroje, kad išsiskirtų genominė DNR, o po to 15 min kaitinama 95 C temperatūroje, kad būtų inaktyvuota proteinazė K. Buvo atlikta vieno kirmino PGR analizė. atlikta naudojant Ex TaqTM polimerazę (Takara Biotechnology, RR001A) Bio-Rad MyCycler PCR Thermal Cycler sistemoje (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, JAV).

PGR restrikcinio fragmento ilgio polimorfizmo genotipų nustatymas

Gravid 5 kirminai iš kiekvienos linijos buvo lizuojami lizės buferyje su 0,1 mg/ml proteinaze K. Buferyje esantys kirminai buvo paveikti kelis užšaldymo-atšildymo ciklus naudojant skystą azotą, inkubuojami 65 C temperatūroje 1 val. atpalaiduoja genominę DNR, o po to 15 min kaitinama 95 C temperatūroje, kad būtų inaktyvuota proteinazė K. Atlikus PGR, PGR produktai buvo virškinami NcoI fermentu (New England Biolabs Inc., R3193S), 37 C temperatūroje per naktį ir elektrofore buvo atlikta restrikcijos aptikimas. fragmento ilgio polimorfizmas.

Kiekybinė PGR (qPCR)

Suaugę transgeniniai kirminai buvo surinkti ir nuplauti M9 buferiu. Buferyje esantys kirminai buvo apdoroti ultragarsu, o mėginiai buvo paveikti kelis užšaldymo ir atšildymo ciklus, naudojant skystą azotą. RNR buvo ekstrahuota Trizol Reagent (Invitrogen, 15596-026) ir išgryninta naudojant RNeasy mini rinkinį (Qiagen, 74106). Kiekviena kDNR buvo susintetinta iš 500 ng visos RNR, naudojant iScript cDNR sintezės rinkinį (Bio-Rad Laboratories Inc., 170–8891). Realaus laiko PGR atveju tiksliniai genai ir specifiniai pradmenys buvo sumaišyti su SYBR Premix Ex Taq II (Takara Biotechnology, RR081A) 96-šulinėlių plokštelėse. Buvo naudojami specifiniai pradmenys, anksčiau sukurti kitų grupių.14 DNR produktai buvo analizuojami naudojant 7500 Real-Time PGR sistemą (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV). Santykiniai tikslinių genų mRNR lygiai buvo normalizuoti, kad veiktų-1.

Dyn-1 mutanto apdorojimas šilumos smūgiu

Dvigubai transgeniniai kirminai (Pmyo-2::V1S C Pflflp-21::SV2-ICR DsRed) buvo suporuoti su dyn-1(ky51) mutantiniais kirmėlėmis.20 Suaugę dvigubos transgeninės linijos motininės kirmėlės su dyn-1(ky51) mutacija arba be jos buvo kultivuojamos NGM plokštelėse, kuriose yra E. coli OP50, 4 valandas 20 C temperatūroje, kad būtų galima dėti kiaušinius, ir tada buvo pašalintos. Kiekvienos padermės sinchronizuoti palikuonys L4- stadijoje buvo auginami 30 C temperatūroje stebėjimui.

Ryklės siurbimo analizė

Ryklės siurbimas buvo skaičiuojamas 1 minutę kambario temperatūroje, naudojant fluorescencinį mikroskopą. Buvo analizuojami laukinio tipo N2, mutantai ir transgeniniai kirminai. Duomenys buvo išreikšti PPM (siurbliai per minutę).

Gyvenimo trukmės tyrimas

Suaugusių motininių kirmėlių kiaušinėliai buvo sinchroniškai auginami iki L4 lervos stadijos NGM lėkštelėse, pasėtose E. coli OP50 20 C temperatūroje. L4- stadijos kirminai buvo perkelti į NGM lėkšteles, kuriose yra 100 mM 5- flfluoro-20 -deoksiuridinas (Sigma-Aldrich, F0503), kad jie negalėtų susikurti palikuonių. Gyvų ar negyvų kirminų skaičius buvo registruojamas kas 2 dienas. Kirminai, kurie plyšo, įsiravo ar nuropojo nuo plokštelių, buvo cenzūruojami, bet įtraukti į gyvenimo trukmės analizę kaip cenzūruoti gyvūnai. Išgyvenamumo duomenys buvo analizuojami naudojant OASIS (internetinę programą, skirtą gyvenimo trukmės tyrimų išgyvenamumo analizei.

Statistinė analizė

Visi eksperimentai buvo atlikti aklai koduojami ir kartojami mažiausiai 3 kartus. Paveiksluose pateiktos reikšmės išreiškiamos kaip vidurkis. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais, jei P reikšmės buvo § < SEM. 0.05. Grafikai buvo nubraižyti naudojant Prism 5 programinę įrangą (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, JAV). Vertės buvo palygintos naudojant vienpusį ANOVA su Tukey posthoc testu, naudojant InStat (3.05 versija) programinę įrangą (Graphpad Software Inc., San Diegas, CA, JAV).

Santrumpos

ACTB aktinas, b

AD Alzheimerio liga

Ab amiloidas b

ALS amiotrofinė šoninė sklerozė

BiFC bimolekulinės fluorescencijos papildymas

GlcNAc N-acetilgliukozaminas

PD Parkinsono liga

Galimų interesų konfliktų atskleidimas

Jokių galimų interesų konfliktų nebuvo atskleista.

Finansavimas

Šis darbas buvo paremtas Nacionalinio tyrimų fondo (NRF) dotacija, finansuojama Korėjos vyriausybės (MEST) (NRF-2015R1A2A1A10052540, NRF-2015R1A2A1A15053661) ir Korėjos sveikatos technologijų tyrimų ir plėtros projekto, Sveikatos apsaugos ministerijos & Welfare, Korėjos Respublika (HI14C0093), taip pat 2014 m. Konkuk universiteto KU „Brain Pool“ programa.

Nuorodos

[1] Brundin P, Melki R, Kopito R. Prioninis baltymų agregatų perdavimas sergant neurodegeneracinėmis ligomis. Nat Rev Mol Cell Biol 2010; 11:301-7; PMID:20308987;http://dx.doi.org/10.1038/nrm2873

[2] Lee SJ, Desplats P, Sigurdson C, Tsigelny I, Masliah E. Neprioninių baltymų agregatų perdavimas iš ląstelės į ląstelę. Nat Rev Neurol 2010; 6:702-6; PMID:21045796; http://dx.doi.org/10.1038/nrneurol.2010.145

[3] Jucker M, Walker LC. Patogeninių baltymų agregatų savaiminis dauginimasis sergant neurodegeneracinėmis ligomis. Gamta 2013; 501:45-51; PMID:24005412;http://dx.doi.org/10.1038/nature12481

[4] Bae EJ, Lee HJ, Rockenstein E, Ho DH, Park EB, Yang NY, Des plats P, Masliah E, Lee SJ. Antikūnų padedamas ekstraląstelinio a-sinukleino klirensas neleidžia perduoti agregatų iš ląstelės į ląstelę. J Neurosci 2012; 32:13454-69; PMID:23015436; http://dx.doi.org/ 10.1523/JNEUROSCI.{11}}.2012

[5] Tran HT, Chung CH, Iba M, Zhang B, Trojanowski JQ, Luk KC, Lee VM. Alfa-sinukleino imunoterapija blokuoja netinkamai sulankstyto a-sinukleino įsisavinimą ir šabloninį plitimą bei neurodegeneraciją. Cell Rep 2014; 7:2054-65; PMID:24931606; http://dx.doi.org/10.1016/j. ląstelių rep.2014.05.033

[6] Lee HJ, Bae EJ, Lee SJ. Ekstraląstelinis a-sinukleinas - naujas ir esminis Lewy kūno ligų veiksnys. Nat Rev Neurol 2014; 10:92-8; PMID:24468877;http://dx.doi.org/10.1038/nrneurol.2013.275

[7] Outeiro TF, Putcha P, Tetzlaff JE, Spoelgen R, Koker M, Carvalho F, Hyman BT, McLean PJ. Toksiškų oligomerinių a-sinukleino rūšių susidarymas gyvose ląstelėse. PLoS One 2008; 3:e1867; PMID:18382657; http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0001867

[8] McKay JP, Raizen DM, Gottschalk A, Schafer WR, Avery L. valgyti-2 ir valgyti-18 yra būtinas nikotino neurotransmisijai Caenorhabditis elegans ryklėje. Genetika 2004; 166:161-9; PMID:15020415; http://dx.doi. org/10.1534/genetics.166.1.161

[9] Rogers C, Reale V, Kim K, Chatwin H, Li C, Evans P, de Bono M. Caenorhabditis elegans socialinio maitinimo slopinimas su FMRFamidu susijusiu peptidiniu NPR aktyvavimu-1. Nat Neurosci 2003; 6:1178-85; PMID:14555955;http://dx.doi.org/10.1038/nn1140

[10] Lee HJ, Bae EJ, Jang A, Ho DH, Cho ED, Suk JE, Yun YM, Lee SJ. Su fermentais susiję imunosorbento a-sinukleino tyrimai su rūšies ir multimerinės būsenos specifiškumu. J Neurosci Methods 2011; 199:249-57; PMID:21658411; http://dx.doi.org/10.1016/j. Nemetas.2011.05.020

[11] Kenyon C, Chang J, Gensch E, Rudner A, Tabtiang R. A C. elegans mutantas, gyvenantis dvigubai ilgiau nei laukinis tipas. Gamta 1993; 366:461-4; PMID:8247153;http://dx.doi.org/10.1038/366461a0

[12] Denzel MS, Storm NJ, Gutschmidt A, Baddi R, Hinze Y, Jarosch E, Sommer T, Hoppe T, Antebi A. Heksozamino kelio metabolitai pagerina baltymų kokybės kontrolę ir pailgina gyvenimą. Ląstelė 2014; 156:1167-78; PMID:24630720; http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.061

[13] Vaikath NN, Majbour NK, Paleologou KE, Ardah MT, van Dam E, van de Berg WD, Forrest SL, Parkkinen L, Gai WP, Hattori N ir kt. Naujų konformacijai specifinių monokloninių antikūnų, skirtų a-sinukleino patologijai, generavimas ir apibūdinimas. Neuro biol Dis 2015; 79:81-99; PMID:25937088; http://dx.doi.org/ 10.1016/j.nbd.2015.04.009

[14] Lapierre LR, De Magalhaes Filho CD, McQuary PR, Chu CC, Visvikis O, Chang JT, Gelino S, Ong B, Davis AE, Irazoqui JE ir kt. TFEB ortologas HLH-30 reguliuoja autofagiją ir moduliuoja Caenorhabditis elegans ilgaamžiškumą. Nat Commun 2013; 4:2267; PMID: 23925298

[15] Vilchez D, Morantte I, Liu Z, Douglas PM, Merkwirth C, Rodrigues AP, Manning G, Dillin A. RPN-6 nustato C. elegans ilgaamžiškumą proteotoksinio streso sąlygomis. Gamta 2012; 489:263-8; PMID:22922647;http://dx.doi.org/10.1038/nature11315

[16] Hansen C, Angot E, Bergstrom AL, Steiner JA, Pieri L, Paul G, Outeiro TF, Melki R, Kallunki P, Fog K ir kt. a-sinukleinas plinta iš pelių smegenų į skiepytus dopaminerginius neuronus ir sėklų agregaciją kultivuotose žmogaus ląstelėse. J Clin Invest 2011; 121:715-25; PMID:21245577;http://dx.doi.org/10.1172/JCI43366

[17] Bae EJ, Yang NY, Song M, Lee CS, Lee JS, Jung BC, Lee HJ, Kim S, Masliah E, Sardi SP ir kt. Gliukocerebrozidazės išeikvojimas padidina a-sinukleino perdavimą iš ląstelės į ląstelę. Nat Commun 2014; 5:4755; PMID:25156829; http://dx.doi.org/10.1038/ncomms5755

[18] Lee HJ, Suk JE, Bae EJ, Lee JH, Paik SR, Lee SJ. Nuo surinkimo priklausoma endocitozė ir ekstraląstelinio a-sinukleino klirensas. Int J Biochem Cell Biol 2008; 40:1835-49; PMID:18291704; http://dx.doi.org/ 10.1016/j.biocel.2008.01.017

[19] Desplats P, Lee HJ, Bae EJ, Patrick C, Rockenstein E, Crews L, Spen cer B, Masliah E, Lee SJ. Inkliuzijos formavimasis ir neuronų ląstelių mirtis perduodant a-sinukleiną iš neurono į neuroną. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106:13010-5; PMID:19651612; http://dx.doi. org/10.1073/pnas.0903691106

[20] Clark SG, Shurland DL, Meyerowitz EM, Bargmann CI, van der Bliek AM. Dinamino GTPazės mutacija sukelia greitą ir grįžtamą temperatūros indukuojamą C. elegans judėjimo defektą. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:10438-43; PMID: 9294229; http://dx.doi.org/ 10.1073/pnas.94.19.10438

[21] Lee HJ, Cho ED, Lee KW, Kim JH, Cho SG, Lee SJ. Autofaginis nepakankamumas skatina egzocitozę ir tarpląstelinį a-sinukleino perdavimą. Exp Mol Med 2013; 45:e22; PMID:23661100; http://dx.doi.org/ 10.1038/emm.2013.45

[22] Syntichaki P, Xu K, Driscoll M, Tavernarakis N. C. elegans neurodegeneracijai reikalingos specifinės aspartilo ir kalpaino proteazės. Gamta 2002; 419:939-44; PMID:12410314; http://dx.doi.org/ 10.1038/nature01108

[23] Sardiello M, Palmieri M, di Ronza A, Medina DL, Valenza M, Gennarino VA, Di Malta C, Donaudy F, Embrione V, Polishchuk RS ir kt. Genų tinklas, reguliuojantis lizosomų biogenezę ir funkciją. Mokslas 2009; 325:473-7; PMID: 19556463

[24] Grove CA, De Masi F, Barrasa MI, Newburger DE, Alkema MJ, Bulyk ML, Walhout AJ. Daugiaparametras tinklas atskleidžia didelį skirtumą tarp C. elegans bHLH transkripcijos faktorių. Ląstelė 2009; 138:314-27; PMID:19632181; http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2009.04.058

[25] Klucken J, Poehler AM, Ebrahimi-Fakhari D, Schneider J, Nuber S, Rockenstein E, Schlotzer-Schrehardt U, Hyman BT, McLean PJ, Masliah E ir kt. Alfa-sinukleino agregacija apima bafilomicinui A 1- jautrų autofagijos kelią. Autofagija 2012; 8:754-66; PMID:22647715; http://dx.doi.org/10.4161/auto.19371

[26] Yu WH, Dorado B, Figueroa HY, Wang L, Planel E, Cookson MR, Clark LN, Duff KE. Metabolinis aktyvumas lemia patologinio oligomerinio a-sinukleino makro-autofaginio klirenso efektyvumą. Am J Pathol 2009; 175:736-47; PMID: 19628769; http://dx.doi.org/10.2353/ ajpath.2009.080928

[27] Kilpatrick K, Zeng Y, Hancock T, Segatori L. Genetinis ir cheminis TFEB aktyvavimas tarpininkauja agreguoto a-sinukleino klirensui. PloS one 2015; 10:e0120819; PMID:25790376; http://dx.doi.org/ 10.1371/journal.pone.0120819

[28] Lee HJ, Khoshaghideh F, Patel S, Lee SJ. A-sinukleino oligomerinių tarpinių produktų klirensas per lizosomų skilimo kelią. J Neurosci 2004; 24:1888-96; PMID:14985429; http://dx.doi.org/ 10.1523/JNEUROSCI.3809-03.2004