Cistanche ekstrakto anti-senėjimo poveikis

EB kultūra

Žmogaus bambos venų endotelio ląstelės buvo gautos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (Manassas VA, JAV). Ląstelės buvo kultivuojamos 37 °C temperatūroje su 5 procentų CO2 endotelio augimo terpe -2 (EGM-2; Lonza, Walkerville, MD, JAV), papildytu 10 procentų galvijų vaisiaus serumu (FBS). EC buvo auginami 48 valandas 37 °C temperatūroje su 5 procentais CO, EGM -2 (kontrolė) arba HG 30 mM terpėje, pridedant arba nepridedant skirtingų koncentracijų Cistanche (1040 ug/ml).

Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Ląstelės buvo kultivuojamos 37 °C temperatūroje 72 valandas EGM-2 terpėje, papildytoje 2 procentais FBS ir įvairių koncentracijų Cistanche, ir 4 valandas buvo apdorotos MTT tirpalu. Susidariusios formazano nuosėdos buvo ištirpintos dimetilsulfoksidu, kur absorbcija buvo matuojama esant 570 nm, naudojant VersaMax ELISA mikroplokštelių skaitytuvą (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, JAV).

Įbrėžimų-žaizdos migracijos tyrimas

Ląstelės buvo sužeistos, o tada auginimo terpė buvo pakeista šviežia terpe, turinčia įvairių koncentracijų Cistanche. Ląstelės buvo palaikomos 24–48 valandas. Visiškai migruojant ląstelės buvo vaizduojamos naudojant mikroskopą (Olympus Optical Co, Ltd., Tokijas, Japonija). Migruotos ląstelės buvo suskaičiuotos naudojant optinį mikroskopą 200 kartų padidinimu ir kiekybiškai įvertintos rankiniu būdu

SA-P-gal dažymas

To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >500 ląstelių suskaičiuota naudojant tris nepriklausomus laukus.

Western blot analizė

Ląstelės buvo surinktos ir lizuojamos baltymų ekstrahavimo tirpale (Intron Biotechnology, Inc, Gyeonggi, Korea), kuriame yra proteazės ir fosfatazės inhibitorių (10 min. 4 °C temperatūroje). Bendra baltymų koncentracija supernatantuose buvo išmatuota naudojant Bradfordo tyrimus. Pakaitinus 95 laipsnių temperatūroje 5 minutes, baltymų mėginiai (30 ug) buvo atskirti 8-12 procentų natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze. Tada baltymai buvo perkelti ant polivinilideno fluorido membranų (MilliporeBedford, MA, JAV) esant 100 V įtampai 60 minučių. Membranos buvo inkubuojamos 5 procentų galvijų serumo albumino (BSA) tirpale Tris-buferiniame fiziologiniame tirpale (TBS), papildytu 0,05 procento TBS su Tween-20 (TBST) (30 min. kambario temperatūroje), tada inkubuojamos 5 procentų BSA. TBST, papildytu pirminiais antikūnais (1:200 iki l,000) (per naktį 4 °C temperatūroje). Tada membranos buvo inokuliuotos HRP konjuguotais ožkų antikūnais prieš triušius arba prieš pelę (1:5, 000), o baltymų juostos buvo aptiktos naudojant patobulintą chemiliuminescencijos aptikimo rinkinį (Intron Biotechnology, Inc. ) ir LAS-1000 vaizduoklis („Fuji Film Corp.“, Tokijas, Japonija). Pusiau kiekybinė densitometrijos rezultatų analizė buvo atlikta naudojant Image J (Nacionaliniai sveikatos institutai, Bethesda, MD, JAV).

NO gamybos matavimas NO koncentracijos buvo nustatytos nustatant nitrito koncentraciją naudojant NO tyrimo rinkinius pagal gamintojo instrukcijas. Optinis tankis buvo nustatytas esant 560 nm naudojant mikroplokštelių skaitytuvą, o koncentracijos apskaičiuotos naudojant kalibravimo kreivę

Statistinė analizė

Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis plius standartinis nuokrypis (SD). Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas taikant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA). Post hoc palyginimai tarp grupių buvo atlikti naudojant Bonferroni kelių palyginimų testus. Visi skaičiavimai buvo atlikti naudojant SPSS sistemoje Windows (v.23.0; IBM Corp, Armonk, NYUSA) ir P reikšmes<0.05 were considered statistically significant.

REZULTATAI IR DISKUSIJA

Cistanche citotoksiškumas

Norint nustatyti Cistanche citotoksiškumą EC, ląstelės buvo inkubuojamos su įvairiomis Cistanche koncentracijomis (nuo 0 iki 100 ug/ml) 72 valandas. Cistanche pasireiškė reikšmingas citotoksiškumas (P<0.05) at concentrations >50 ug/ml visais gydymo momentais (1 pav.). Todėl Cistanche koncentracija<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.

Mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės (MAPK) kelias reguliuoja pagrindinius procesus, susijusius su kraujagyslių EK vystymusi, pvz., ląstelių proliferacija, invazija, metastazėmis ir išgyvenimu bei angiogeneze (Pišlar ir kt., 2015). MAPK apima ERK, c-Jun N-galo kinazę ir p38 (Kim ir Choi, 2010). ERK ir p38 yra svarbūs signaliniai baltymai, susiję su žaizdų gijimu, o ERK vaidina svarbų vaidmenį kontroliuojant ląstelių migraciją, proliferaciją, diferenciaciją ir išgyvenimą (Roskoski, 2012). Neseniai atliktame tyrime buvo pasiūlyta, kad p38 MAPK signalizacijos kelias būtų įtrauktas į žaizdų gijimą (Loughlin ir Artlett, 2011; Kim ir kt., 2019; Wang ir kt., 2019). Šiame tyrime ištyrėme ERK ir p38 baltymų ekspresiją, kad nustatytų signalizacijos kelius, susijusius su Cistanche reguliuojama EB migracija. Gydymas cistanche (40 g/mL) padidino EK migraciją 1.{16}}kartą, palyginti su kontroline medžiaga (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2.{1}}karto didesnis nei kontrolinis (P<0.01) (Fig. 2B). These results show that 

1 pav.PoveikisCistanche(Cistanche) dėl ląstelių gyvybingumo. Ląstelės buvo apdorotos Cistanche (nuo 0 iki 100g/ml) 72 val. Ląstelių gyvybingumasbuvo apskaičiuotas kaip gyvybingų ląstelių, kultivuotųCistanche nebuvimas. Rezultatai rodo vidurkį±SD. *P<0.05.