Peptidų formulės (Gal2–Pep), konjuguotos su galo rūgštimi, antioksidantas ir senėjimą stabdantis potencialas

Oda yra labai pažeidžiama priešlaikiniam senėjimuidėl išorinio streso, todėl šiame tyrime peptidinė formulė (galloilas)2–KTPPTTP (gal2–Pep) buvo susintetintas sujungiant TPPTTP peptidą ir galinį peptidąrūgštis (GA). Visi peptidai buvo susintetinti ant 2-chlorotrilo chlorido dervos, naudojant kietosios fazės peptidąsintezė (SPPS) ir analizuojama naudojant elektropurškimo jonizaciją (ESI) / kvadrupolio laiką.FLFLight (Q-TOF) tandeminės masės spektroskopijos (MS) sistema. Iš pradžių gal2–Pep neparodė toksiškumo žemiau 100 koncentracijosmM, kurio ląstelių išgyvenamumas yra 88 procentai keratinocitų irfibroblastai. Thereaktyviosios deguonies rūšys(ROS) valymo veikla Gal2–Pep buvo stabilesnis, palyginti su vien GA; ir po keturių savaičių kambaryjetemperatūra, josROS šalinimo veiklaišliko didesnis nei 50 proc . Be to, peptidinė formulė,Gal2–Pep taip pat rodė elastazę slopinantį poveikį CCD{0}}Skfibroblastųląstelės. Remiantis RT-qPCR rezultatais, šiame tyrime buvo įrodyta, kad Gal2–Pep padidino PGC išraišką-1a įužkirsti keliąoksidacinis stresas, ir patvirtino savo potencialą kaipanti-senėjimo agentaspateikėdidinant išraiškąI tipo kolagenasir pagalmatricos metaloproteinazės-1 (MMP1) raiškos mažinimas. Theišvadų gauti patvirtina teiginį, kad šiame tyrime susintetinta peptidų formulė gali būti naudojama kaip anatūralus antioksidantasiranti-senėjimo agentaskosmetikos reikmėms.

Spustelėkite čia, jei norite gauti daugiau informacijos apie „Cistanche“ senėjimą stabdančius produktus

1. Įvadas

Odos senėjimasatsiranda dėl laipsniško keratinocitų ir brolių ląstelių dalijimosi sumažėjimo ir galiausiai sustabdymo.sprogimai odoje. Sumažėjus ląstelių skaičiui ant odos atsiranda raukšlių, dėl kurių denatūruojasi tarpląstelinė matrica, dėl kurios išsausėja ir praranda elastingumą.tikėjimas odoje.1 Intraląstelinės mitochondrijų DNR pažeidimastaip pat sumažėja baltymų sintezės greitisodos senėjimo proceso metu.2 Odos senėjimas turi du pagrindinius keliusvidiniai ir išoriniai būdai, veikiant ultravioletiniams (UV) spinduliams

pagrindinis variklisišorinis senėjimas. UV spinduliai reaguoja su pagrindiniais odos komponentais, įskaitant lipidus, baltymus ir nukleino rūgštis, gaminti reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS), kurios veda į ląstelę.mirtis.3–5 Per didelis ROS lygis taip pat sukelia skilimą irnenormalus kolageno arba elastino grandinių surišimas ir skatina matricos metaloproteinazių (MMP), tokių kaip MMP{0}}, kurios skaido kolageną, raišką, todėl oda susiraukšlėja irpagreitina odos senėjimą.6,7 Todėl antioksidantų terapija pašalintiROS ir mitochondrijų potencialo aktyvinimas turi privalumų apsaugoti odą nuo senėjimo.

Be ROS, elastazė atlieka svarbų vaidmenį praradusodos elastingumą, kuris skaido elastiną, svarbų odos baltymąekstraląstelinė matrica.8 Elastinas dėl didelio elastingumo atatrankossavybių, suteikia odai elastingumo, o elastazė turigebėjimas skaidyti elastiną ir kitus baltymus.8 Todėl inhibifermento elastazės vartojimas gali būti pagrindinė odos suglebimo strategija užkirsti kelią odos elastingumo praradimui.

Šiame tyrime sukūrėme naują medžiagą, kuri sujungiaperoksisomų proliferatoriaus aktyvuotas receptorių gama koaktyvatorius1-alpha (PGC-1a) išvestas peptidas TPPTTP ir galo rūgštis (GA)skirtas naudoti kosmetikoje nuo senėjimo. GA yra fitocheminė medžiaga, randama įvairiuose vaisiuose ir daržovėse, įskaitant vynuoges, pomidorus ir žaliąją arbatą, kuri, kaip žinoma, turi daug antioksidantų ir antibakterinių savybių. eFfir kt.9 Nors GA naudojamas kosmetikos ir maisto pramonėje dėl šių naudingų eFfects, jo formuluotė yra nestabili.10 Mes taip sukūrėme (galoilą)2–KTPPTTP (gal2–Pep), kad padidintų GA stabilumą, susiejant jį su PGC-1a-išvestas peptidas TTPTTP.

Šiame tyrime mes susintetinome (galoilą)2–KTPPTTP (gal2– Pep) peptido formulė konjugacijoje su galo rūgštimi ir patvirtintajo, kaip antioksidanto ir senėjimo agento, potencialas.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Medžiagos

Dulbecco modifikuotasEagle's Medium (DMEM), penicilinas / streptomicinas, galvijų vaisiaus serumas (FBS), fosfatas-buFfatsiradofiziologinis tirpalas (PBS) ir tripsinas buvo įsigyti iš Gibco (Carls

blogai, CA). Hidroksibenzotriazolas (HOBt), diizopropilo karbodiimidas (DIC), 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diizopropiletilaminas (DIEA), galo rūgštis irN-sukcinil-tri-alanilas-pnitroanilidas buvo gautas iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Suformuoti aminorūgštis (Fmoc-Lys (Boc))–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH ir Fmoc-Pro–OH) buvo įsigyti iš Bead-Tech (Seulas,Korėja).

2.2. Peptidų ir su galinės rūgštimi susietų peptidų sintezė

Visi peptidai buvo susintetinti ant 2-chlorotrilo chlorido dervos (200mmol skalė, pakaitinė vertė¼ 1,46 mmol g 1) naudojant HOBt–DIC tarpininkaujama kietosios fazės peptidų sintezė (SPPS).

Peptidų sintezė naudojant SPPS metodą buvo atlikta su nedideliais pakeitimaiskatijonų, susijusių su ankstesniais tyrimais.11–13 2-chlorotrilo chlorido (CTC) derva buvo išbrinkusi dichlore

metano (DCM, 8 ml) 30 min. Derva buvo nuplaunamadimetilformamidas (DMF). Visos reakcijos buvo vykdomos kambario temperatūroje. Fmoc apsaugoti aminorūgščių dariniai (2 ekvivalentai(Ekvivalentas), skirtasfiPirmoji prijungta aminorūgštis arba 5 ekv. kitoms aminorūgštims) buvo sujungtos su DIEA (5 ekv. prijungtai aminorūgščiai) arba HOBt/DIC (6 ekv./5 ekv.) DMF a.FterFmoc apsaugos pašalinimas naudojant 2 procentus (t/v) DBU DMF (2 kartus, 2 min. per kartą, 8 ml). Ir visi žingsniai buvo nuplauti 5 kartus su DMF. Galutinė galo rūgštis buvo sujungta su lizinu prijungtais peptidais.Sujungus galo rūgštį, derva buvoafiltruojamas, skalbiamas,ir džiovinami dideliame vakuume. Skilimo tirpalas (TFA:dejonizuotas [DI] vanduo: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, t/t/t proc.) buvo gydomas 2 val.gauti neapdorotus peptidus. Neapdoroti peptidai buvo nusodinti ir tris kartus plauti šaltu dietilo eteriu.

Analitinė atvirkštinės fazės didelio efektyvumo skysčių chromatografija(RP-HPLC) buvo atliktas Waters 2695 SeparationsModulis su Capcell Pak C18 kolonėle (4,6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). Mobiliąją fazę sudarė 0,05 proc. TFA H2O (judrioji fazė A) ir 0,05 proc. TFA acetonitrile (judri B fazė).

Eliucija buvo pasiekta naudojant linijinį gradientą mobiliesiems telefonamsB fazė nuo 5 procentų iki 65 procentų per 30 mingreitis 1.{1}} ml min 1. Peptidų smailės buvo aptiktos esant 230 nm bangos ilgiui. Pusiau paruošiamasis RP-HPLC buvo atliktas Waters HPLC sistema (Pump 600E, detektorius UV-484) su Gemini RP-C18stulpelis (21,2 mm 250 mm, 5mm, Phenomenex). Mobiliąją fazę sudarė 0,05 proc. TFA H2O (mobilioji A fazė)ir 0,05 proc. TFA acetonitrile (judrioji B fazė). Eliucija buvo pasiekta naudojant linijinį gradientą judriajai B fazeinuo 7 iki 22 procentų per 15 minltekėjimo greitis 10 ml min 1. Thepeptidų smailės buvo aptiktos spektrofotometriškai, kai bangos ilgis 230 nm.

Susintetinti peptidai buvo ištirpinti 5 procentų skruzdžių rūgštyje vandenyje ir analizuojami naudojant elektropurškimo jonizaciją (ESI)/keturpolis laikaslight (Q-TOF) tandeminė masės spektroskopija(MS) sistema (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Mėginiai buvo įšvirkšti į Q-TOF sistemą sunano-purškimo šaltinis alnorma 1mL min 1. ESI jonasšaltinio parametrai buvo tokie: jonų purškimo įtampa 1,5 kV, užuolaidinės dujos 10 psi ir apvalkalo dujos 5 psi. Spektrai vidujeViso nuskaitymo režimas ir MS / MS buvo surinkti diapazonem/z

100–1200 Da, kai kaupimo laikas yra 25 ms vienam spektrui.Susidūrimo energija buvo padidinta nuo 10 iki 80. Rezultatasduomenys buvo gauti naudojant Analyst TF sogaminiai ir automatiškaipriskiriamas 80 procentų centroidas su minimaliu maksimumu, triukšmo mažinimas 10 procentų, vidutinis deizotopo pašalinimas su 3 procentų slenksčiu, be triukšmo mažinimo ir be išlyginimo. Buvo nustatyti susintetinti peptidaisu masės tolerancija 0.05 Da ir rankiniu būdu seka naudojant MS/MS toleranciją 0.01 Da.

2.3. Ląstelių kultūros ir gyvybingumo tyrimai

Žmogaus, suaugusiojo, mažai kalcio, aukštos temperatūros (HaCaT) ląstelėsir CCD{0}}Sk (normali žmogaus odafibroblastų) ląstelės buvokultivuotas DMEM su 10 procentų FBS ir 1 procentu penicilino /streptomicinas. Ląstelės buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje C drėgno oro kameroje su 5 procentais CO2.Gyvybingumo tyrimams buvo naudojamas ląstelių skaičiavimo rinkinys-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Pekinas, Kinija). HaCaT ir CCD-1064Sk ląstelėsbuvo pasėtos į 96-šulinėlių mikroplokštes (5 103 ląstelės vienoje duobutėje) ir inkubuojamos 37 °C temperatūroje C 5 proc. CO2 24 val. Tada kultūros buvo veikiamos skirtingomis susintetintų peptidų arba GA koncentracijomis ir inkubuojamos 37 °C temperatūroje. C 5 proc. CO2 24 val. Ląstelių gyvybingumasvėliau buvo išmatuotas naudojant CCK{0}} pagal gamintojo gaires.

2.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas

2.4.1. DPPH tyrimas.Susintetintų medžiagų antioksidacinis aktyvumaspeptidai ir GA buvo vertinami atskirai, naudojant DPPH tyrimą. DPPH tyrimai buvo atlikti pagal anksčiau praneštą

metodika su nedideliais pakeitimaiskatijonas.12,14–16 Pirma, 0,12 mg ml 1 DPPH tirpalas buvo paruoštas metanolyje, tada 100mL DPPH tirpalo ir 100mL susintetintų peptidų arba GA buvo sumaišyti skirtingomis koncentracijomis ({{0}},1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM ir 1mM) 96-šulinėlių mikroplokštelėse. Orbitiniame kratymo inkubatoriujemišiniai buvo reaguoti 30 min 37 °C temperatūroje C ir 100 aps./min bešviesos. Tada buvo išmatuota absorbcija esant 517 nm ir apskaičiuotas antioksidacinis pajėgumas.

2.4.2. ROS šalinimo veikla.

Intraląstelinis ROS pašalinimo aktyvumas buvo įvertintas naudojant 20 70-dichlorfluoresceino diacetato rinkinį(DCF-DA, Abcam, JAV). HaCaT ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių mikroplokštes (5 103 ląstelės vienoje duobutėje) ir inkubuojamos 37 °C temperatūroje C 24 val.AFtInkubuojant, kultūros buvo veikiamos susintetintais peptidais arba GA (100mM) ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje C 24 val. Tada ląstelės buvo veikiamos 10mM DCF-DA tirpalas ir inkubuojamas 30 min. AftInkubuojant, tirpalas buvo plaunamas PBS. Theląstelės buvo analizuojamos naudojant mikroplokštelių skaitytuvą sužadinimo metu ir

emisijos bangos ilgiai atitinkamai 485 nm ir 530 nm.

1 pavPeptidų sintetinis žingsnis ir sekos patvirtinimas naudojant kvadrupolio laikąskrydis(Q-TOF) masės spektrometrija: a) išsami sintetinė procedūra, b) TPPTTP, c) galoilas–TPPTTP ir d) (galoilas)2–KTPPTTP.

2.5. Mitochondrijų membranos potencialo tyrimas

Mitochondrijoms buvo naudojami JC-1 dažai (Thermo Fisher, JAV).membranos potencialo (MmP) tyrimas. CCD-1064Sk ir HaCaT ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių mikroplokštes (5 10 3ląstelės vienoje duobutėje)

ir inkubuojamas 37 m C ir 5 proc. CO2 24 val. Afte inkubacija,kultūros buvo veikiamos skirtingomis susintetintų peptidų koncentracijomis ir inkubuojamos 37 °C temperatūroje C 5 proc. CO2 24 val.JC-1 dažų buvo pridėta prie CCD-1064Sk ir HaCaT ląsteliųgaminti a galutinė koncentracija 10mM. AFtPo 10 minučių inkubacijos ląstelės du kartus plaunamos 37 C PBS. Žalia ir raudonafluorescencijabuvo išmatuoti naudojant Varioskan LUXDaugiamodis mikroplokštelių skaitytuvas (ThermoFisher, JAV) ekscitacija (lPvz)/emisija (lEm) 475/530 nm ir alPvz/lEmiš 475/590 nm, atitinkamai.

2.6. Elastazės slopinimo aktyvumo tyrimas

CCD-1064Sk ląstelės buvo pasėtos į 6-šulinėlių plokšteles ir inkubuojamos 37 °C temperatūroje C 5 proc. CO2 24 val. Tada kultūros buvo veikiamos iki 100 koncentracijosmM susintetintų peptidų arba GA ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje C 5 proc. CO2 24 val. Ląstelės du kartus buvo plaunamos dPBS ir kiekvieną ląstelę surinkome naudodami ląstelių grandiklį. Apridedant 0.2 mln. Tris–HCl (pH 8.0) su 0,1 proc. Triton-X į surinktąląstelės buvo homogenizuotos ultragarsu. Homogenizuotas tirpalas centrifuguojamas 20 min 3000 aps./minir 4 C. Tada aFter imant supernatantą, baltymų kiekį-katijonas buvo atliktas naudojant BCA baltymų tyrimą. Baltymai kiekvienammėginys buvo išduotasfigalutinė koncentracija 100mgmL 1, irN-sukcinil-tri-alanilas-p-nitroanilidas buvo pridėtasgalutinė koncentracija 1,6 mM ir reagavo 36 °C temperatūroje C 1 val.Tada absorbcija buvo išmatuota esant 405 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą.

2.7. RT-qPCR

Senėjimą stabdančių žymenų mRNR lygiai CCK-1064Sk ląstelėsebuvo įvertinti naudojant RT-qPCR. Bendra RNR buvo surinkta naudojant TRIzol reagentą (Life Technologies, Carlsbad, CA) ir atvirkščiai

perrašyta naudojant PrimeScript RT reagentų rinkinį (Takara BioInc., Kusatsu, Japonija). CFX96 sistema („Bio-Rad Laboratories“, Hercules, CA) ir „iQ SYBR Green Supermix“ („Bio-Rad Labora“)

buvo naudojami RT-qPCR.b-Aktinas buvo naudojamas I tipo kolageno, MMP{1}} ir PGC-1 mRNR lygiams normalizuoti.a. 

2.8. Statistinė analizė

 Duomenys pateikiami kaip vidurkis standartinis nuokrypis nuotrys nepriklausomi matavimai ir analizuojami naudojant Studentot-testai, su ap < 0.05 considered to be a signinegaliu skirtis.

Paprašyk daugiau:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plius 86 15292862950