Kalmia Angustifolia ekstrakto antioksidantas, priešuždegiminis ir senėjimą stabdantis potencialas ir kai kurių pagrindinių junginių identifikavimas 1 dalis

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Santrauka:Odos senėjimas yra labiausiai matomas senėjimo proceso elementas, keliantis didelį susirūpinimą daugeliui žmonių. Ericaceae šeimos augalai paprastai turi antioksidacinių ir priešuždegiminių savybių, todėl jie gali būti aktyvūs senėjimą stabdantys ingredientai. Šiuo tyrimu buvo siekiama įvertinti Kalmia angustifolia ekstrakto saugumą ir senėjimą stabdantį veiksmingumą naudojant rekonstruotus odos pakaitalus. Saugumo vertinimas atliktas naudojant 3-(4,5-dimetiltiazolilo-2)-2,5-difeniltetrazolio bromido (MTT) tyrimą, o veiksmingumas buvo nustatomas įvertinus antioksidacinį ir priešuždegiminį aktyvumą bei analizuojant odos pakaitalus, rekonstruotus pagal savaiminio susijungimo metodą histologiniu ir imunofluorescenciniu dažymu (elastinas, kolagenas-1, kolagenas-3, akvaporinas-3) . Ląstelių gyvybingumo tyrimas parodė ekstrakto saugumą, kai koncentracija yra iki 200 ug/mL. Deguonies radikalų absorbcijos talpos (ORAC) tyrimas ir ląstelių tyrimas, naudojant 2',7'-dichlorfluoresceino diacetatą (DCFH-DA), atskleidė stiprų antioksidacinį aktyvumą, kurio ORAC vertė buvo 16 μmol Trolox Equivalent/mg ir pusė. maksimali slopinanti koncentracija (IC50) yra 0,37 ± 0,02 ug/mL, o įdomus priešuždegiminis aktyvumas buvo rastas slopinant NO gamybą, kai NO gamybos slopinimo procentas buvo 49 ± 2 procentai esant 80 ug/mL. Ekstrakto išskyrimas ir apibūdinimas leido nustatyti junginius, kurie gali būti atsakingi už šią biologinę veiklą, o du iš jų pirmą kartą buvo nustatyti K.cistanche stiebasAngustifolia: avicularia ir epikatechin-(2 -O-7, 4 -6)-ent-epikatechinas. Odos pakaitalų, apdorotų ekstraktu, histologinės analizės parodė, kad odos storis padidėjo, palyginti su kontroline medžiaga. K. Angustifolia ekstraktas sustiprino elastino ir kolageno -1 raišką, kurių paprastai mažėja senstant odai. Šie rezultatai rodo, kad K. Angustifolia turi daug žadantį antioksidacinį efektyvumą ir senėjimą stabdantį potencialą.

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

Raktažodžiai: odos pakaitalai; odos senėjimas; natūralūs produktai; veikliosios medžiagos; Avies lauras; antioksidacinis aktyvumas; priešuždegiminis aktyvumas; audinių inžinerija

1. Įvadas

Odos senėjimas yra natūralus fiziologinis procesas, keliantis susirūpinimą daugeliui žmonių. Tai pirmasis „matomas senėjimo ir odos degeneracijos požymis. Taigi anti-senėjimo formuluotė: kosmetikos gaminiai per pastaruosius kelerius metus įgavo svarbą dėl noro apriboti šį senėjimo požymį. Odos senėjimui būdinga daugybiniai biologinio lygmens pokyčiai, įskaitant ląstelių proliferacijos sumažėjimą, dėl kurio atsiranda epidermio atrofija, ir odos komponentų, tokių kaip fibroblastai, elastinas ir kolageno skaidulos, sumažėjimas, taigi ir odos storio sumažėjimas vyresnio amžiaus žmonėms [1,2] Borealinis miškas yra pilnas neištirtų išteklių, turinčių didelį potencialą kosmetinėms veikliosioms medžiagoms sukurti Kalmia angustifolia, taip pat žinomas kaip Sheep Laurel, yra Ericaceae šeimos gaubtasėklis augalas.cistanche tubulosa nauda ir šalutinis poveikisŠio augalo tėvynė yra rytinė Šiaurės Amerika, tačiau daugiausia aptinkama Kanados borealiniuose miškuose [3]. Tradicinėje Amerikos indėnų medicinoje K. Angustifolia buvo naudojama įvairioms sveikatos problemoms, susijusioms su uždegimu, gydyti, pavyzdžiui, skrandžio skausmui, patempimui ir patinimui. rodo, kad šis augalas turi priešuždegiminių savybių [4]. Įvairūs Ericaceae šeimos augalai taip pat turi priešuždegiminių ir antioksidacinių savybių, todėl jie yra įdomios kosmetinės veikliosios medžiagos. Cheminė K.angustifolia sudėtis dar nėra gerai dokumentuota. Kai kuriuose tyrimuose buvo nustatyti toksiški junginiai, tokie kaip grajanotoksinai, kurie yra žmonėms nuodingi, bet retai mirtini neurotoksinai, ir arbutinas (4-hidroksifenil-D-gliukopiranozidas), tirozinazės inhibitorius, randamas K. Angustifolia lapuose. ir naudojamas kaip depigmentavimo priemonė [5-8]. Nepaisant šių potencialiai toksiškų K. Angustifolia junginių, kiti tyrimai taip pat parodė, kad augale gausu flavonoidų, fenolio rūgščių, taninų ir terpenų [9-15]. Kai kurie iš šių junginių pasižymi įdomiu biologiniu aktyvumu, todėl gali suteikti K. Angustifolia daug žadantį senėjimą stabdantį poveikį, kaip ir kitiems augalams.

Cistanche gali kovoti su senėjimu

Net jei reikia kurti naujus dermokosmetikos gaminius, padedančius užkirsti kelią odos senėjimui, nauji įstatymai, draudžiantys arba ribojantys bandymus su gyvūnais kosmetikos pramonėje, apsunkina tai padaryti. Todėl reikalingos kitos produkto veiksmingumo testavimo galimybės. In vitro ląstelių kultūrų arba odos pakaitalų naudojimas yra gera alternatyva kosmetikos sudedamųjų dalių patikrai. Kai kurie modeliai yra patvirtinti Europos alternatyvių metodų patvirtinimo centro (ECVAM, Ispra, Italija) ir parduodami komerciškai kosmetikos įmonėms, kad jos galėtų atlikti saugos testus ir išvengti nereikalingų kančių naudojant gyvūnus [16,17] . Tačiau dauguma parduodamų modelių turi tik diferencijuotą epidermį ir neturi sąveikos tarp keratinocitų ir fibroblastų [16]. Per pastaruosius kelerius metus atsirado naujų viso storio modelių, kurie, be kita ko, leido ištirti senėjimo kelius ir senėjimą stabdančius junginius, todėl jie tapo naudingomis priemonėmis pakeičiant gyvūnų naudojimą kosmetikos srityje [18, 19].cistanche tubulosa ekstraktasŠio tyrimo tikslas buvo pirmiausia įvertinti K. Angustifolia ekstrakto biologinį aktyvumą ant kultivuotų ląstelių vienasluoksnių sluoksnių, o po to įvertinti šio ekstrakto anti-senėjimo potencialą naudojant odos pakaitalus, rekonstruotus pagal savaiminio susikaupimo metodą [20,21]. . Šio odos pakaitalo modelio pranašumas yra tas, kad jame nėra egzogeninių medžiagų ir jis priklauso nuo askorbo rūgšties gebėjimo skatinti tarpląstelinės matricos gamybą odos fibroblastais, todėl modelis yra visiškai žmogus.cistanche tubulosa apžvalgosŠiame tyrime pristatoma nauja veiklioji medžiaga, kurią būtų galima naudoti dermosetikos gaminiuose, ir siūloma naudoti in vitro modelius kaip alternatyvą kosmetikos tyrimams.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Augalinės medžiagos ir ekstraktų paruošimas

K.angustifolia buvo nuimta gegužės 2015 d. Lac-St-Jean regione Kvebeke, Kanadoje. Augalą identifikavo M. Patrick Nadeau, o kupono pavyzdys (nr. QFA0617265) buvo deponuotas Lavalo universiteto Louis Marie herbariume, Uébeke, Kanadoje. Antžeminės K.angustifolia dalys (2,1 kg) buvo sumaltos naudojant Fritsch Pulverisette 25 Cutting Mill (Fritsch, Laval, QC, Kanada) ir ekstrahuojamos su grįžtamu šaldytuvu bevandeniu etanoliu (1,5 l, tris kartus) ir EtOH-H2O3:1 ( 1,5 l, du kartus). Po pirmųjų ekstrahavimo (EtOH ir EtOH-H, O) gauti ekstraktai filtruojami ir sujungiami. Po EtOH išgarinimo vakuume, vandeninė fazė buvo padalinta su dichlormetanu (DCM, CHCl; 300 ml, penkis kartus) ir etilo acetatu (EtOAc; 300 ml, penkis kartus). EtOAc fazė sumažintame slėgyje išgarinama iki sausumo ir gaunamas K.angustifolia ekstraktas (222,6 g, 10,6 proc.). Dieną prieš gydymą miltelių pavidalo ekstraktas buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO; Sigma, Oakville, ON, Kanada), kad būtų gautas pradinis tirpalas, ir tada buvo laikomas -20 laipsnių temperatūroje, kol prireiks. Norimos K.angustifolia koncentracijos buvo gautos praskiedžiant pradinį tirpalą (12,5 arba 25 mg/mL) tiesiai į auginimo terpę eksperimento dieną. Galutinė DMSO koncentracija buvo 0,2 procento (ofo), kad būtų išvengta tirpiklio toksiškumo.

2.2.Pagrindinių K. Angustifolia ekstrakto junginių išskyrimas

Iš anksčiau aprašyto EtOAc ekstrakto 30 g buvo atskirti chromatografijos būdu per Diaion kolonėlę (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, JAV), naudojant MeOH/H2O kaip eliuentą gradiento sąlygomis (40 proc. , 50 procentų, 60 procentų, 70 procentų ir 100 procentų), kad gautų keturias prisodrintas frakcijas (AD). Frakcija B (2 g) buvo paveikta silikagelio kolonėlėje (200 g) ir eliuuojama MeOH-DCM nuo 5 procentų iki 15 procentų gradiento sąlygomis, kad gautų keturias frakcijas (B1-B4). Frakcija C (6 g) taip pat buvo paveikta silikagelio kolonėlėje (300 g) ir eliuuojama MeOH-DCM nuo 5 procentų iki 25 procentų gradiento sąlygomis, kad gautų septynias frakcijas (C1-C7). Frakcija C3 (500 mg) buvo išgryninta atvirkštinės fazės chromatografija C18 kolonėlėje (120 g, FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18, Silicycle, Kvebekas, QC, Kanada), naudojant 0,1 proc. skruzdžių rūgštį H, O-MeOH iš nuo 40 iki 60 procentų. Gautos keturios subfrakcijos: C3A-C3D su C3B ir didelio grynumo C3C, kuriose yra pagrindinių junginių. Frakcija C4 (2g) taip pat buvo išgryninta atvirkštinės fazės chromatografija C18 kolonėlėje, naudojant 0,1 % skruzdžių rūgšties H2O-MeOH nuo 30 % iki 45 %. Atskyrimo metu gautos trys subfrakcijos: C4A-C4C su didelio grynumo C4A ir C4C, kurių kiekvienas turi vieną junginį. Frakcija D (8,7 g) buvo dedama į silikagelio kolonėles (2 × 200 g) ir eliuuojama CHCl3-MeOH gradiento sąlygomis (15:1; 10:1; 5:1), kad gautų aštuonias frakcijas (D). 1-D8). Frakcijos nuo D1 iki D4 kiekvienoje buvo pagrindinis junginys.

2.3. BMR ir GC-MS analizė

Branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektrai buvo užfiksuoti Bruker Avance 400 spektrometru (Bruker, Milton, ON, Kanada) 400 MHz H branduoliams ir 100 MHz 13C branduoliams, naudojant deuteruotą chloroformą (CDCl3) arba deuteruotą metanolį (CH3OD). kaip tirpiklis. Cheminiai poslinkiai nurodomi ppm, palyginti su tirpiklio likučio smaile. Didelės skiriamosios gebos masės spektrometrija (HRMS) buvo užregistruota Agilent 6224 MS-TOF masės spektrometru (Agilent, Saint-Laurent, QC, Kanada), turinčiu elektropurškimo šaltinį.

2.4.Biopsijos ir ląstelių ekstrahavimas

Pirminiai keratinocitai ir fibroblastai buvo gauti iš krūtų mažinimo operacijų biopsijų. Donorės buvo moterys nuo 18 iki 52 metų amžiaus. Keratinocitai ir fibroblastai buvo išgauti iš biopsijų naudojant anksčiau aprašytą išskyrimo metodą [22, 23]. Biopsijos buvo inkubuojamos termolizine 4 laipsnių temperatūroje 16 valandų, siekiant atskirti epidermį nuo dermos. Vėliau keratinocitai buvo išskirti iš epidermio naudojant tripsiną 30 minučių, o fibroblastai buvo išskirti iš dermos naudojant kolagenazę 4 valandas. Tada ląstelės buvo kultivuojamos iki pageidaujamo pasažo. Keratinocitai buvo naudojami 1 pasėjime, o fibroblastai - 4 pasėjime.

2.5. Ląstelių kultūros

Pirminiai fibroblastai (4 pasažas) buvo pasėti 4 × 103 ląstelių/cm² ir kultivuojami Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM), papildytoje 10 procento FB Essence serumu (FBI; Seradigm, Solt Leik Sitis). , UT, JAV), 100 UI/ml penicilino G (Sigma, Oakville, ON, Kanada) ir 25 ug/ml gentamicino (Gemini, West Sacramento, CA, JAV). Pirminiai keratinocitai (1 pasažas) buvo pasėti 4 × 103 ląstelių/cm² ant apšvitintų pelių 3T3 fibroblastų maitinimo sluoksnio ir kultivuojami DMEM ir Ham's F12 derinyje santykiu 3:1 (DMEMH), papildytu 5 procentų vaisiaus klonu. Ⅱ serumas (Hyclone, Scarborough, ON, Kanada), 5 ug/mL insulino (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV), 0,4 ug/mL hidrokortizono (Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, Kanada), 0,212 ug /mL izoproterenolio hidrochlorido (Sandoz Canada, Boucherville, QC, Kanada), 10 ng/ml žmogaus epidermio augimo faktoriaus (EGF; Austral Biological, San Ramon, CA, JAV), 100 UI/mL penicilino G (Sigma, Oakville, ON, Kanada) ) ir 25 ug/ml gentamicino (Gemini, West Sacramento, CA, JAV). Ląstelių kultūros buvo inkubuojamos 37 °C temperatūroje 8 procentų anglies dioksido (CO2) atmosferoje. Ląstelių kultūros terpė buvo keičiama kas dvi dienas, iš viso tris kartus per savaitę.

2.6. Citotoksiškumo tyrimas

K.angustifolia ekstrakto toksiškumas pirminiams keratinocitams buvo įvertintas naudojant {{0}}(4,5-dimetiltiazolilą-2)-2,{{5} }difeniltetrazolio bromido (MTT) tyrimas. MTT tyrimas yra kolorimetrinis tyrimas, pagrįstas fermentiniu geltonosios tetrazolio druskos (MTT) redukavimu iki purpurinių formazano kristalų. Šią fermentinę reakciją katalizuoja mitochondrijų sukcinato dehidrogenazė metaboliškai aktyviose ląstelėse. Taigi jis naudojamas ląstelių gyvybingumui įvertinti pagal ląstelių metabolinį aktyvumą. Trumpai tariant, 0 dieną sveikų donorų P3 keratinocitai buvo dedami po 5 × 103 ląstelių/šulinėlių 96-šulinėlių plokštelėje ant apšvitintų 3T3 pelių fibroblastų maitinimo sluoksnio. 2 dieną buvo pridėtas gydymas. 4 dieną į plokštelę buvo pridėta MTT dažų (Tiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma, St. Louis, MO, JAV) 0,5 mg/ml koncentracijos steriliame fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) 1 X. Tada plokštelė buvo inkubuojama 3 valandas (37 laipsniai, 8 proc. CO), o formazanas ekstrahuojamas šviežiu izopropanolio ir druskos rūgšties (HCl) tirpalu. Absorbcija buvo nuskaityta esant 570 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San Chosė, CA, JAV). 2.7. Deguonies radikalų absorbcijos talpos (ORAC) tyrimas

Siekiant įvertinti K.angustifolia ekstrakto antioksidacines savybes, buvo atliktas deguonies radikalų absorbcijos gebos (ORAC) tyrimas, kaip aprašyta Ou et al. su tam tikrais pakeitimais [24]. Trumpai tariant, tyrimas buvo atliktas 384-šulinėlių plokštelėje naudojant Fluoroskan Ascent FLTM plokštelių skaitytuvą (Labsystems, Milford, MA, JAV). Skirtingos koncentracijos Trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksirūgštis; vitamino E analogas) buvo paruoštos, kad būtų sudaryta standartinė kreivė. palyginti tiriamuosius mėginius su šia teigiama kontrole. Eksperimentas buvo atliktas 37,5 laipsnio su puse 7,4 laipsnių temperatūroje lygiagrečiai su tuščiuoju mėginiu.cistanche UKFluoresceino fluorescencija buvo registruojama kas 60 s fluorometru, pridėjus 2,2'-azobis(2-amidinopropano) dihidrochlorido. Fluorescencija buvo matuojama esant 485 nm sužadinimo bangos ilgiui ir 538 nm emisijos bangos ilgiui. Rezultatai buvo apskaičiuoti naudojant skirtumus tarp plotų po fluoresceino skilimu iš tuščiojo ir mėginio kreivės. ORAC verčių rezultatai buvo išreikšti mikromoliais Trolox ekvivalento (TE) viename miligrame (μmol TE/mg) arba mikromoliais TE vienam mikromoliui (umol TE/mol).

2.8. Antioksidacinis aktyvumas įvertintas naudojant ląstelių tyrimą

Antioksidacinis aktyvumas buvo įvertintas naudojant ląstelėje pagrįstą tyrimą, naudojant 2',7/-dichlorfluoresceino diacetatą (DCFH-DA), kaip aprašė Girard-Lalancette ir kt., su tam tikrais pakeitimais [25]. Trumpai tariant, žmogaus odos WS1 fibroblastai (ATCC⑧ CRL-1502, Manasas, VA, JAV) buvo inkubuojami 60 minučių su 100 μL 5 μM DCFH-DA Hanks subalansuotame druskos tirpale (HBSS, HyClone, Marlborough, MA, JAV). . Tada, siekiant įvertinti ekstrakto antioksidacinį aktyvumą, ląstelės buvo inkubuojamos 60 minučių, didėjant K.angustifolia ekstrakto ir teigiamų kontrolinių medžiagų (kvercetino ir trolox) koncentracijoms. Esant oksidaciniam stresui, buvo pridėta 100 μl 400 μM tretbutilo hidroperoksido (t-BuOOH), kad gautų galutinę 200 μM t-BuOOH koncentraciją šuliniuose. Tada fluorescencija buvo išmatuota iš karto ir po 90 minučių naudojant automatinį Fluoroskan Ascent FLTM plokštelių skaitytuvą (Labsystems, Milford, MA, JAV). Fluorescencija buvo įvertinta esant 485 nm sužadinimo bangos ilgiui ir 538 nm emisijos bangos ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas buvo išreikštas kaip DCFH oksidacijos slopinimo procentas.

2.9. Priešuždegiminis aktyvumas, įvertintas nitritų kiekiu

Priešuždegiminis aktyvumas buvo įvertintas įvertinus K.angustifolia ekstrakto azoto oksido (NO) gamybos slopinimą, kaip aprašyta Legault ir kt. [26]. Trumpai tariant, pelių makrofagai RAW 264.7 (ATCC⑧ TIB-71, Manassas, VA, JAV) buvo inkubuojami su didėjančiomis K. Angustifolia ekstrakto koncentracijomis ir stimuliuojami 100 ng/mL lipopolisacharidu (LPS). Taip pat buvo naudojama teigiama kontrolė, Nw-nitro-L-arginino metilo esterio hidrochloridas (L-NAME), esant dviem skirtingoms koncentracijoms – 250 μM (67 ug/mL) ir 1 mM (270 ug/mL). Supernatantai be ląstelių buvo surinkti praėjus 24 valandoms po LPS stimuliacijos, o NO koncentracija buvo nedelsiant įvertinta naudojant Griess reakciją. Absorbcija buvo nuskaityta esant 540 nm, naudojant Multiskan plokštelių skaitytuvą (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Nitritų buvimas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant NaNO, standartinę kreivę. Inaktyvuotos ląstelės (veikiamos tik terpėje) buvo naudojamos kaip neigiama kontrolė, o aktyvuotos ląstelės - kaip teigiama kontrolė.

2.10.Odos pakaitalų gamyba

Sveikos odos pakaitalai buvo gaminami pagal savaiminio surinkimo metodą, iš dalies modifikuoti naudojant 6-šulinėlių plokšteles [20,21]. Trumpai tariant, sveikų donorų P5 fibroblastai buvo pasėti 1,5 × 105 ląstelių/šulinėlių kiekiu ir 26 dienas kultivuojami DMEM, papildytu 50 ug/ml (plius)-natrio L-askorbato (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV). kol suformavo manipuliuojamus lapus. Tada du fibroblastų lakštai buvo atskirti ir uždėti, kad susidarytų odos ekvivalentas. Odos ekvivalentai buvo inkubuojami 37 laipsnių temperatūroje 8 procentų CO atmosferoje dar dvi dienas, kad lakštai susijungtų ir taip susidarytų naujas odos pakaitalų sluoksnis. Po šio laikotarpio sveikų donorų P2 keratinocitai buvo pasėti ant odos ekvivalento 1 × 10 laipsnių ląstelių/ekvivalentu, kad susidarytų odos pakaitalų epidermio sluoksnis, ir septynias dienas kultivuojami DMEMH, papildytu 50 ug/mL (plius). -natrio L-askorbatas (Sigma, St. Louis, MO, JAV), kad būtų galima daugintis keratinocitams. Tada odos pakaitalai buvo pakelti į oro ir skysčio sąsają, kad būtų skatinama ląstelių diferenciacija. Oro ir skysčio sąsajoje odos pakaitalai buvo auginami terpėje, kurioje trūko EGF, kad būtų gautas sluoksniuotas epitelis, reprezentuojantis in vivo odą. Praėjus keturiolikai dienų po pakėlimo į oro ir skysčio sąsają, odos pakaitalai tris kartus per savaitę vieną savaitę buvo apdorojami pradiniu ekstrakto tirpalu, praskiestu auginimo terpėje (galutinė K. Angustifolia ekstrakto koncentracija buvo 25 ug/mL). Iš viso po 56 dienų kultivavimo buvo paimtos odos pakaitalų biopsijos ir ištirtos histologinis bei imunofluorescencinis dažymas.

2.11. Histologinės analizės

Kiekvienos būklės odos pakaitalų biopsijos buvo fiksuotos HistoChoice tirpale (Amresco, Solon, OH, JAV) ir įterptos į parafino vašką. Tada 5 μm storio pjūviai buvo nupjauti ir nudažyti Massono trichromu, naudojant Weigert hematoksiliną, fuksino-ponceau ir anilino mėlynos spalvos dažus. Dermos ir gyvojo epidermio storis buvo matuojamas naudojant ImageJ programinę įrangą (Nacionaliniai sveikatos institutai (NIH), Bethesda, MD, JAV). Atliekant storio matavimus, buvo analizuojamos trys skirtingos ląstelių populiacijos ir kiekvienai iš jų buvo padarytos dvi reprezentacinės nuotraukos kiekvienai būklei ir 10 matavimų vienoje nuotraukoje, iš viso 60 matavimų kiekvienai sąlygai.

2.12. Imunofluorescencinis dažymas

Kiekvienos būklės odos pakaitalų biopsijos buvo įterptos į Tissue-Tek OCT junginį (Sakura Finetek, Torrance, CA, JAV), užšaldytos skystame azote ir laikomos -80 laipsnių temperatūroje, kol prireiks. Užšaldytos normalios žmogaus odos dalys buvo naudojamos kaip teigiamos kontrolės. Netiesioginis imunofluorescencinis dažymas buvo atliktas 6 um storio kriosekcijose, fiksuotose acetone. Pirminiai naudojami antikūnai buvo: triušio polikloninis anti-elastinas (gG) (skiedimas 1:800, Abcam, Kembridžas, MA, JAV), triušio polikloninis antikolagenas-1 (IgG) (skiedimas 1:300, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada), triušio polikloninis antikolagenas-3 (IgG) (skiedimas 1:200, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada) ir triušio polikloninis anti-akvaporinas-3(IgG) (skiedimas 1:500, Abcam, Kembridžas, MA, JAV). Naudotas antrinis antikūnas buvo asilo anti-triušio IgG (H plius L)Alexa 488 (skiedimas 1:1600, Life Technologies, Eugene, OR, JAV). Ląstelių branduoliai buvo pažymėti po antrinio antikūno tvirtinimo terpe DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingemas, AL, JAV). Norint iš dalies kiekybiškai įvertinti kiekvieno baltymo fluorescencijos intensyvumą, imunofluorescencinio dažymo pikselių intensyvumas buvo išmatuotas naudojant ImageJ programinę įrangą (Nacionaliniai sveikatos institutai (NIH), Bethesda, MD, JAV). Trumpai tariant, visas tiriamo baltymo odos sluoksnis (derma arba gyvas epidermis) buvo išanalizuotas matuojant kiekvienos srities vidutinę pilkumo vertę. Apdorotų odos pakaitalų fluorescencijos intensyvumas buvo lyginamas su kontrolinių odos pakaitalų fluorescencijos intensyvumu, siekiant įvertinti baltymų ekspresijos pokytį, pastebėtą gydymo metu.

2.13. Statistinė analizė

Rezultatai buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis. Statistinė MTI tyrimo, antioksidantinių ląstelių tyrimo ir priešuždegiminio aktyvumo analizė buvo atlikta naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), po kurios buvo atliktas Dunnett post hoc testas (p vertė).<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">

Šis straipsnis ištrauktas iš Antioxidants 2021, 10, 1373. https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants