Aristolochinė rūgštis sukelia pelėms inkstų fibrozę ir senėjimą
Mar 23, 2022
Santrauka:Inkstai yra vienas jautriausių organų su amžiumi susijusiems pažeidimams. Paprastai inkstų senėjimą lydi inkstų fibrozė, kuri yra paskutinis dažnas lėtinės ligos keliasinkstų ligos. Aristolocho rūgštis (AA), nefrotoksinė medžiaga, sukelia AA nefropatiją (AAN), kuriai būdinga progresuojanti inkstų fibrozė ir funkcinis silpnėjimas. Nors inkstų fibrozė yra susijusi su inkstų senėjimu, ar AA skatina inkstų senėjimą, lieka neaišku. Šio tyrimo tikslas – ištirti galimą AAN panaudojimą kaip inkstų senėjimo modelį. Čia mes ištyrėme su senėjimu susijusius veiksnius AAN modeliuose, chroniškai skirdami AA C57BL / 6 pelėms. Palyginti su kontrolinėmis grupėmis, AA grupė parodė senėjimąinkstasfenotipai, tokie kaip inkstų atrofija, inkstų funkcijos susilpnėjimas ir tubulointersticinė fibrozė. Be to, AA ypač skatino ląstelių senėjimąinkstusir padidino inkstų p16 mRNR ekspresiją ir su senėjimu susijusį -galaktozidazės aktyvumą. Be to, AA gydytos pelės pasižymėjo proksimaliniais kanalėlių mitochondrijų anomalijomis, taip pat reaktyviųjų deguonies rūšių kaupimu. Klotho, senėjimą stabdančio geno, taip pat buvo žymiai sumažintasinkstusAA gydytų pelių. Bendrai šio tyrimo rezultatai rodo, kad AA keičia su senėjimu susijusius veiksnius ir kad inkstų fibrozė yra glaudžiai susijusi su inkstų senėjimu.
Raktiniai žodžiai:lėtinė inkstų liga; inkstų fibrozė; aristolochinė rūgštis; senėjimas; ląstelių senėjimas
CISTANCHE PAGERINS INKSTŲ/INKSTŲ LIGĄ
ĮvadasNuolat ilgėjant žmonių gyvenimo trukmei, vis daugiau žmonių kenčia nuo su amžiumi susijusių sutrikimų.Inkstaipaprastai yra paveikti su amžiumi susijusių audinių pažeidimų ir lėtinių ligų atvejųinkstų ligadidėja su amžiumi [1]. Inkstų senėjimas pagreitina bendrą senėjimą, o tai lemia trumpesnę gyvenimo trukmę. Todėl būtini inkstų senėjimo tyrimai, nors tinkami gyvūnų modeliai nebuvo iki galo sukurti. Inkstų senėjimą lydi įvairūs patologiniai pokyčiai, įskaitant inkstų atrofiją, glomerulosklerozę ir tubulointersticinę fibrozę [2]. Inkstų tubulointersticinė fibrozė yra paskutinis dažnas daugelio progresuojančios inkstų ligos formų būdas, o tai rodo, kad inkstų fibrozė yra glaudžiai susijusi su senyvo amžiaus žmonėmis.inkstas. Atliekant senėjimo tyrimus, pelės yra patikima priemonė dėl jų genetinio artumo žmonėms, gebėjimo genetiškai manipuliuoti savo genomu ir dėl to, kad per visą savo gyvenimą jos turi panašius su senėjimu susijusius fenotipus [3]. Išilginiai stebėjimai naudojant inbredines peles yra idealus senėjimo modelis, nors sekti peles visą jų gyvenimo trukmę reikia daug laiko. Be to, yra keletas genetiškai modifikuotų pelių senėjimo modelių. Pelė, kuriai trūksta Kloto, yra priešlaikinio senėjimo modelis, naudojamas senėjimo tyrimams. Tačiau šiame modelyje inkstų funkcija nepaveikiama, o kai kurie organai, išskyrus inkstus, yra pažeisti [4]. Taigi šis pelės modelis gali būti netinkamas inkstų senėjimo tyrimams.Aristolocho rūgšties (AA) vartojimas sukelia specifinį inkstų pažeidimą, žinomą kaip AA nefropatija (AAN), kuriai būdinga didelė intersticinė fibrozė [5,6]. AA yra toksiškas inkstų kanalėlių epiteliui, nes skatina DNR aduktų susidarymą inkstų audiniuose [7]. Tikėtina, kad AA neturės įtakos kitiems organams, išskyrus šlapimo sistemą, ir gali būti naudinga vertinantinkstas- specifiniai pakeitimai. Todėl AA dažniausiai naudojamas pelių inkstų fibrozės modeliams nustatyti [8, 9]. Tačiau lieka neaišku, ar AA sukelti pokyčiai yra susiję su senėjimuinkstus. Šiame tyrime mes ištyrėme su amžiumi susijusius fenotipus ir molekulinius veiksnius AAN pelėms
Rezultatai 2.1. AA administracija sukėlė reikšmingą svorio kritimą, inkstų atrofiją ir inkstų funkcijos sumažėjimąPradinis kūno svoris (KW) ir sistolinis kraujospūdis (BP) buvo identiški nešiklio kontrolinės ir AA grupėse. Transporto priemonės kontrolinės grupės kūno masė nuolat didėjo per 8 savaites. Tačiau svorio padidėjimas buvo slopinamas vartojant AA, o AA grupė turėjo žymiai mažesnį BW po 4 ir 8 savaičių nuo AA vartojimo pradžios (1A pav.). Nebuvo reikšmingo sistolinio AKS ar širdies susitraukimų dažnio skirtumo tarp nešiklio kontrolinės ir AA grupės (1B, C pav.). Širdies svorio ir kūno masės santykis tarp grupių nesiskyrė praėjus 8 savaitėms po AA vartojimo pradžios (1D pav.), tuo tarpuinkstassvorio ir kūno masės santykis buvo žymiai mažesnis AA grupėje praėjus 8 savaitėms po AA vartojimo pradžios (1E pav.). Toliau ištyrėme inkstų funkciją transporto priemonės kontrolės ir AA grupėse. Kreatinino ir karbamido azoto (JT) koncentracijos plazmoje buvo žymiai didesnės AA grupėje nei nešiklio kontrolinėje grupėje praėjus 8 savaitėms nuo AA vartojimo pradžios. Be to, praėjus 8 savaitėms nuo AA vartojimo pradžios, gydymas AA reikšmingai sumažino kreatinino klirensą, palyginti su kontroline grupe nešikliu (1F–H pav.).
2.2. AA administravimas sukėlė akivaizdžią tubulointersticinę fibrozę ir reikšmingą su fibroze susijusių genų ekspresijos reguliavimą inkstuoseHistologinis tyrimas naudojant periodinį Šifo (PAS) dažymą atskleidė, kad glomerulų plotas buvo žymiai sumažintas AA grupėje, palyginti su nešiklio kontroline grupe (2A pav.). Didelė tubulointersticinė fibrozė, įvertinta naudojant Massono trichromo (MT) dažymą, buvo pastebėta AA grupėje (2B pav.), taip pat su padidėjusiu su inkstų fibroze susijusių genų, kolageno I ir III ir transformuojančio augimo faktoriaus, mRNR lygių reguliavimas. TGF)- (2C–E pav.).
2.3.AA administravimas pagreitintas ląstelių senėjimas, mitochondrijų disfunkcija ir reakcijos deguonies/gen rūšių (ROS) kaupimasis inkstuoseNorėdami įvertinti ląstelių senėjimą, ištyrėme p53, p21, p16 ir glutaminazės (GLS) inkstų mRNR ekspresiją. AA grupė parodė žymiai didesnį šių su senėjimu susijusių genų mRNR lygį.inkstus(3A-D pav.). Be to, su senėjimu susijęs -galaktozidazės (SA- -gal) dažymo intensyvumasinkstusbuvo padidėjęs AA grupėje ir beveik nebuvo nešiklio kontrolinėje grupėje (3E pav.). AA grupėje elektroninė mikroskopija parodė, kad proksimalinėse kanalėlių ląstelėse išnyko mitochondrijų kristalai, mitochondrijų fragmentacija, citoplazminė vakuolizacija ir autolizosomos. BCL2/adenoviruso E1B 19-kDa sąveikaujančio baltymo 3 (Bnip3), su mitochondrijomis susijusio geno, reguliavimas (3FG pav.). Nox2 inkstų mRNR ekspresija. nikotinamido adenino dinukleotido fosfato (NADPH) oksidazės komponentas, buvo žymiai padidėjęs AA grupėje, palyginti su nešiklio kontroline grupe (3H pav.). Be to, Western blot analizė atskleidė, kad inkstų 4-hidroksi-2-vardinis (4-HNE) lygis buvo reikšmingai padidėjęs AA grupėje (3I pav.). Šie rezultatai parodė, kad AA vartojimas sukėlė ląstelių senėjimą, mitochondrijų disfunkciją ir ROS kaupimąsiinkstus.
2.4. AA Sumažėjusi inkstų Kloto baltymų ekspresijaMes ištyrėme senėjimą stabdančių baltymų ekspresiją inkstuose nešiklio kontrolės ir AA grupėse. Klotho ekspresija buvo žymiai sumažinta AA grupėje, palyginti su nešiklio kontroline grupe (4A pav.), o nikotinamido fosforiboziltransferazės (NAMPT) ir sirtuino1 (SIRT1) inkstų ekspresija grupėse buvo panaši (4B, C pav.).
3. DiskusijaMūsų žiniomis, šis tyrimas yra pirmasis, kuriame daugiausia dėmesio skiriama su inkstų senėjimu susijusių AAN pokyčių įvertinimui naudojant senėjimo žymenis, tokius kaip p16 ir SA- -gal aktyvumas. Gydymas AA skatino inkstų atrofiją, tubulointersticinę fibrozę ir inkstų funkcijos nuosmukį, kartu su padidėjusiu inkstų p16 mRNR reguliavimu ir SA- -gal teigiamu dažymu. Be to, AA grupė parodė su inkstų senėjimu susijusių mechanizmų ypatybes, tokias kaip mitochondrijų anomalijos, padidėjęs oksidacinis stresas ir antisenėjimo geno Klotho reguliavimas. Apibendrinant, mūsų stebėjimai rodo, kad lėtinis AA vartojimas iš dalies imituoja inkstų senėjimą.
Ląstelių senėjimas yra nuolatinis ląstelių dauginimosi sustabdymas reaguojant į įvairius stresorius, tokius kaip DNR pažeidimas, ir prisideda prie senėjimo ir su senėjimu susijusių ligų. P16, nuo ciklino priklausomo kinazės inhibitoriaus, ekspresija koreliuoja su senėjimu įvairiuose organuose, įskaitant inkstus. Kalorijų apribojimas padidina gyvenimo trukmę, nes slopina pl6 ekspresiją [10]. Be to, p16-ekspresuojančių senstančių ląstelių pašalinimas iš INK-ATTAC pelių suleidžiant AP20187, FK506-surišantį baltymų dimerizatorių [11], susilpnina inkstų senėjimo fenotipus, tokius kaip glomerulų sklerozė ir inkstų liga. funkcinis nuosmukis. Todėl p16 yra vienas iš svarbiausių su senėjimu susijusių veiksnių. Senstančias ląsteles galima aptikti naudojant SA- -gal dažymą, kuris rodo padidėjusį -galaktozidazės aktyvumą, kai pH 6,0 [12], ir yra plačiai naudojamas senstančių ir pasenusių ląstelių biomarkeris. Senyvoms žiurkėms padidėja pl16 inkstų mRNR ekspresijainkstusir kartu su padidėjusiu SA- -gal aktyvumu inkstų epitelyje [13I. Šiame tyrime parodėme padidėjusią inkstų p16 mRNR ekspresiją ir SA- -gal dažymą, o tai rodo, kad AA sukelia inkstų senėjimą. Neseniai buvo pranešta, kad GLS yra būtinas senstančių ląstelių išlikimui dėl sustiprintos glutaminolizės ir tarpląstelinio pH neutralizavimo [14]. Nustatyta, kad nuo GLS priklausomos glutaminolizės slopinimas senoms pelėms pašalina senstančias ląsteles ir pagerina su amžiumi susijusį organų disfunkciją. Šiame tyrime padidėjęs inkstų GLS mRNR reguliavimas parodė, kad grupėje inkstuose kaupiasi senstančios ląstelės. Taigi lėtinis AA vartojimas sukėlė ląstelių senėjimą inkstuose.
CISTANCHE PAGERINS INKSTU/INKSTŲ FUNKCIJĄ
Be ląstelių senėjimo, mitochondrijų disfunkcija yra esminis su amžiumi susijusių audinių pažeidimo mechanizmas, kurį lydi ROS kaupimasis [15, 16. Mitochondrijų disfunkcija skatina ir palaiko ląstelių senėjimą [17], o ląstelių senėjimas tiesiogiai prisideda prie mitochondrijų disfunkcijos [18]. Bnip3, pirmiausia esantis išorinėje mitochondrijų membranoje, gali vaidinti vaidmenį reguliuojant mitofagiją kultivuojamose inkstų proksimalinėse kanalėlių ląstelėse, reaguojant į oksidacinį stresą ir hipoksiją. Senyvų pelių kalorijų apribojimas padidina autofagiją kanalėlių ląstelėse, padidindamas Bnip3 reguliavimą, ir pagerina amžiaus sukeltą inkstų funkcijos degeneraciją [19]. Šiame tyrime elektroninė mikroskopija atskleidė mitochondrijų anomalijų ypatybes, kurias gali paveikti sumažėjusi inkstų Bnip3 ekspresija arba ląstelių senėjimas. Mitochondrijos yra pagrindinis tarpląstelinis ROS šaltinis. Norėdami įvertinti mitochondrijų anomalijų poveikį inkstų ROS, ištyrėme 4-HINE kaupimąsi inkstuose ir parodėme AA sukeltą ROS kaupimąsi inkstuose.inkstus.NADPH oksidazės yra pagrindinis ROS šaltinis. Ūminės AAN fazės metu pelėms buvo padidėjusi Nox2 inkstų mRNR ekspresija, sumažėjo azoto oksido prieinamumas, dėl to išsivystė ilgalaikė hipoksija ir išemija [20. Pagyvenusioje žiurkėjeinkstus, ROS kaupimąsi lydi padidėjusi Nox2 ekspresija [21]. Šie radiniai rodo, kad AA gali sukelti su amžiumi susijusius fenotipus per ROS kaupimąsi, kurį sukelia mitochondrijų disfunkcija ir NADPH oksidazių reguliavimas.
Inkstų Klotho geno ekspresija sumažėjo AA grupėje, o NAMPT ir SIRTl ekspresija buvo panaši tarp grupių. Klotho yra senėjimą stabdantis genas, koduojantis vieno praėjimo transmembraninį baltymą, kuris veikia kaip senėjimo slopiklis. Kloto trūkumo pelių senėjimo procesas buvo panašus į žmonių, įskaitant trumpesnę gyvenimo trukmę, nevaisingumą, aterosklerozę, odos atrofiją, osteoporozę ir emfizemą [22]. Hipomorfinėms mutantėms Klotho pelėms taip pat pasireiškė pagreitinto senėjimo fenotipas, kuris buvo atkurtas p16 abliacija [23]. Kadangi Klotho yra svarbus senėjimo veiksnys, Klotho genų modifikuotos pelės buvo plačiai naudojamos senėjimo tyrimams. Tačiau Klotho genu modifikuotos pelės gali būti netinkamos inkstų senėjimo tyrimams dėl sisteminių su senėjimu susijusių šių pelių sutrikimų ir dėl to, kad inkstų funkcija nepatvirtinta (ty kreatinino kiekis). Priešingai, AAN pelės modelis gali būti naudojamas kaip vaistų sukeltas inkstų senėjimo modelis mokslinių tyrimų tikslais, nes jis turi keletą privalumų, tokių kaip santykinis įgyvendinimo paprastumas ir galimybė įvertinti intervencijų poveikį inkstų funkcijos sutrikimui. .
Šis tyrimas turėjo tam tikrų apribojimų. Mes įvertinome inkstų senėjimą, daugiausia dėmesio skirdami ląstelių senėjimui, mitochondrijų morfologijai ir su senėjimu susijusiai genų ekspresijai. Tačiau senėjimo mechanizmai yra sudėtingi ir vis dar menkai suprantami. Be to, nors Klotho geno ekspresija sumažėjo reaguojant į AA, negalėjome įrodyti priežastinio ryšio su patologiniais AAN pokyčiais. Reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant nustatyti įvairių molekulių, dalyvaujančių kuriant AAN, vaidmenį. Nepaisant to, šis tyrimas suteikia naujų įžvalgų apie Avan naudojimą kaip inkstų senėjimo modelį. Svarbu pažymėti, kad fenotipiniai pokyčiaiinkstasyra glaudžiai susiję su gyvenimo trukme. norsinkstasyra lengvai paveikiamas su senėjimu susijusių pokyčių, inkstų senėjimo slopinimas gali pailginti bendrą gyvenimo trukmę. Todėl tolesni inkstų senėjimo tyrimai naudojant AAN modelius gali padidinti ilgaamžiškumą ateityje.
4. Medžiagos ir metodai4.1. GyvūnaiŠis tyrimas buvo atliktas pagal Nacionalinių sveikatos institutų gaires dėl eksperimentinių gyvūnų naudojimo. Visi eksperimentai su gyvūnais buvo patvirtinti Jokohamos miesto universiteto gyvūnų tyrimų komiteto (patvirtinimo numeris: FA20-027) ir buvo atlikti laikantis ARRIVE gairių. Buvo stengiamasi sumažinti naudojamų gyvūnų skaičių ir jų kančias. Pelės buvo laikomos kontroliuojamoje aplinkoje 12-h šviesos/12-h tamsos ciklu 25 °C temperatūroje. Pelės turėjo laisvą prieigą prie maisto ir vandens.
CISTANCHE PAGERINS INKSTŲ/INKSTŲ INFEKCIJĄ
Aštuonių savaičių amžiaus C57BL/6 pelių patinai buvo įsigyti iš Charles River Laboratories (Wilmington, MA, JAV) ir po 1 savaitės aklimatizacijos priskirti nešiklio kontrolei arba AA grupėms. -Aldrich, St. Louis, MO, JAV), kuris buvo ištirpintas nedideliame kiekyje dimetilsulfoksido. Prieš šį tyrimą atlikome preliminarų tyrimą, naudodami kelis protokolus. Pirmasis protokolas apėmė AA (3 mg/kg) skyrimą C57BL/6 pelėms į pilvaplėvės ertmę du kartus per savaitę 4 savaites be remodeliavimosi laiko; Šiame protokole AA sukėlė akivaizdžius ūminius inkstų pažeidimus, tokius kaip išsiplėtę proksimaliniai kanalėliai, praradę šepetėlio kraštą (papildomas S1 paveikslas). Pagal antrąjį protokolą pelėms C57BL/6 buvo skiriama AA (2,5 mg/kg) į pilvaplėvės ertmę kartą per savaitę 4 savaites, po to 4 savaites buvo remodeliavimosi laikas; šių pelių kreatinino kiekis plazmoje buvo 0,19 ± {{20}}.080 mg/dL, palyginti su 0,18 ± 0,010 mg/dL (atitinkamai transporto priemonės kontrolė ir AA; vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida (SEM), p=0.86, nesuporuotas Stjudento t testas, n=4 grupėje) ir plazmos UN buvo 31,3 ± 5,95 mg/dL, palyginti su 30,4 ± 3,87 mg/dL (atitinkamai transporto priemonės kontrolė ir AA; vidurkis ± SEM, p=0,90, nesuporuotas Stjudento t testas, n=4 grupėje). Todėl nustatėme, kad šis protokolas netinka inkstų pažeidimo modeliui, nes AA nesukėlė reikšmingo inkstų funkcijos sumažėjimo. Trečiajame protokole C57BL/6 pelėms buvo skiriama AA (3 mg/kg) į pilvaplėvės ertmę du kartus per savaitę 10 savaičių be remodeliavimosi laiko; šių pelių mirtingumas AA grupėje buvo 83 procentai (n=6), o nešiklio kontrolinės grupės pelių nenumirė (n=4). Šiame protokole negalėjome statistiškai įvertinti AA sukelto inkstų fenotipo dėl didelio mirtingumo. Ketvirtajame protokole pelėms C57BL/6 buvo skiriama AA (3 mg/kg) į pilvaplėvės ertmę du kartus per savaitę 4 savaites, po to 4 savaites buvo atliktas remodeliavimo laikas; Šioms pelėms buvo pastebėti lėtiniai inkstų pažeidimai, tokie kaip tubulointersticinė fibrozė ir inkstų funkcijos sumažėjimas [9]. Todėl, remdamiesi šių preliminarių tyrimų rezultatais, mes priėmėme ketvirtąjį protokolą eksperimentams atlikti šiame tyrime.
4.2.BP matavimasSistolinis AKS ir širdies susitraukimų dažnis buvo matuojami naudojant anksčiau aprašytą uodegos manžetės metodą (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokijas, Japonija)[24,25]. Visi matavimai buvo atlikti nuo 9:00 iki 14:00. Kiekvienai pelei buvo atlikta mažiausiai 10 matavimų, o analizei buvo naudojama vidutinė vertė.
4.3. Realaus laiko kiekybinė atvirkštinės transkripcijos PGR analizė Bendra RNR buvo išgauta iš inkstų audinių naudojant ISOGEN (Nippon Gene, Tokijas, Japonija), o komplementari DNR (cDNR) buvo susintetinta naudojant SuperScript IⅢFirst-Strand System (Invitrogen, Waltham, MA, JAV). Realaus laiko kiekybinė atvirkštinės transkripcijos PGR analizė buvo atlikta naudojant CFX96 Touch Real-Time PGR aptikimo sistemą (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, JAV), o atvirkštinės transkripcijos produktai buvo inkubuoti su TaqMan PCR Master Mix ir pasirinktiniu TaqMan zondas (Applied Biosystems, Waltham, MA, JAV), kaip aprašyta anksčiau [26]. Buvo naudojami TaqMan zondai prieš šiuos genus: kolagenas I (Mm00801666_g1), kolagenas II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1), p53 (Mm00441964 g1), p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) ir Nox2 (Mm00627011_m1).mRNR lygiai buvo normalizuoti į 18S ribosominė RNR.
4.4. Western blot analizė Baltymų ekspresija buvo analizuojama naudojant Western blot audinių homogenatų analizę, naudojant anksčiau aprašytą metodą [27, 28]. Iš audinių buvo paruošti bendri baltymų ekstraktai, naudojant natrio dodecilsulfato turintį mėginio buferį. Kiekvieno mėginio baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant plovikliui suderinamo baltymų tyrimo rinkinį (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, JAV) ir NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV), naudojant galvijų serumo albuminą. standartinis. Vienodas kiekis baltymų ekstraktų iš audinių mėginių buvo frakcionuotas 5-20 procentų poliakrilamido gelyje (ATTO Corp., Tokijas, Japonija). Tada atskirti baltymai buvo perkelti į polivinilideno difluorido membranas, naudojant pusiau sausą perkėlimo sistemą (ATTO Corp., Tokijas, Japonija). Membranos buvo blokuojamos 1 valandą kambario temperatūroje fosfatiniu buferiniu tirpalu, kuriame yra 5 procentai nugriebto pieno miltelių. Membranos buvo inkubuojamos su pirminiais antikūnais prieš Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Kembridžas, JK), NAMPT (sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1 (07-131 1:1000, MilliporeSigma). , Burlington, MA, JAV), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japonija) ir gliceraldehido -3-fosfato dehidrogenazę (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, JAV). Membranos buvo plaunamos ir inkubuojamos su antriniais antikūnais 60 minučių kambario temperatūroje. Antikūnų ir antigenų reakcijų vietos buvo vizualizuotos naudojant sustiprintą chemiliuminescencinį substratą (Merck, Kenilworth, NJ, JAV). GAPDH buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. Vaizdai buvo kiekybiškai išanalizuoti naudojant ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, JAV).
4.5. Histologinė analizė buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [29]. Pelių inkstų audiniai buvo fiksuoti 4 procentų paraformaldehidu ir vėliau įterpti į parafiną. Pjūviai (4 um storio) buvo nudažyti PAS ir MT dėmėmis. Norint įvertinti glomerulų plotą, buvo išmatuota 50 glomerulų vienai pelei ir apskaičiuotas vidurkis. Visi vaizdai buvo gauti naudojant BZ-9000 mikroskopą (Keyence Corp., Osaka, Japonija).
CISTANCHE PAGERINS INKSTU/INKSTŲ DIALIZĘ
4.6. SA- -al dažymas Pelių inkstų audiniai buvo greitai užšaldyti ir sudėti į optimalios pjovimo temperatūros mišinį (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokijas, Japonija). Pjūviai (4 μm storio) buvo paruošti naudojant kriostatą (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) ir montuojamas ant stiklinių stiklelių. SA- -gal aktyvumas buvo matuojamas naudojant senėjimo aptikimo rinkinį (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, JAV) pagal gamintojo protokolus. Mėginiai buvo apžiūrėti šviesiame lauke, padidinus × 100, naudojant BZ-9000mikroskopą (Keyence Corp.. 4.7. Electron MicroscopyElektroninė mikroskopinė analizė buvo atlikta taip, kaip aprašyta anksčiau [30]. Pelės buvo anestezuotos izofluranu ir perfuzuotos per dešinįjį aortos lanką heparinizuotu (5 U/mL) fiziologiniu tirpalu ir 2,5 procento glutaraldehidu 0,1 mol/l fosfatiniame buferyje, esant 7,4 pH. Transmisijos elektronų mikroskopijos mėginiai buvo panardinami į 1% osmio tetroksidą 2 valandoms, nuosekliai dehidratuojami etanolyje ir įterpiami į Epon mišinį. Ulitratino sekcijos buvo nudažytos uranilo acetatu ir švino citratu ir tiriamos naudojant Hitachi H-7500 perdavimo elektronų mikroskopą, veikiantį 80 kV įtampa (Hitachi, Ltd., Tokijas, Japonija). Pjūviai buvo stebimi padidinus × 5000 ir nufotografuoti naudojant įkrovimo prijungtą įrenginio kamerą.
4.8.Biocheminė analizėKraujo mėginiai buvo paimti širdies punkcija pavalgius. Viso kraujo mėginiai buvo centrifuguojami esant 3000 aps./min. (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokijas, Japonija) 10 minučių 4 laipsnių temperatūroje, kad būtų atskirta plazma. Gauti plazmos mėginiai buvo laikomi -80 laipsnių temperatūroje. Kreatinino kiekis plazmoje, UN ir šlapimo kreatinino kiekis buvo matuojamas naudojant Hitachi 7180 autoanalizatorių (Hitachi, Ltd., Tokijas, Japonija).
4.9. Statistinė analizė Statistinė analizė buvo atlikta naudojant GraphPad Prism programinę įrangą (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, JAV). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Nesuporuotas Stjudento f testas buvo naudojamas skirtumams tarp nešiklio kontrolinės ir AA grupių palyginti.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. IšvadosAA administravimo priežastysinkstassenėjimas, kartu su tubulointersticine fibroze ir inkstų atrofija. Rezultatai rodo, kad inkstų fibrozė yra glaudžiai susijusi su inkstų senėjimu ir kad AAN gali būti naudingas kaip ainkstas-specifinis senėjimo modelis.