Askorbo rūgštis reguliuoja Abalone Haliotis Discus Hannai Ino imunitetą, antioksidaciją ir apoptozę 1 dalis

Abstraktus: Šis tyrimas buvo atliktas siekiant ištirti askorbo rūgšties (AA) vaidmenį imuniniame atsake, antioksidacijoje ir apoptozėje abalone (Haliotis discus hannai Ino). Abalonas buvo šeriamas septyniais pusiau išgrynintais pašarais, kurių AA lygis buvo graduotas (0, 50, 100, 200, 500, 1000 ir 5000 mg/kg). svoris: 12,01 ± 0,001 g, pradinis apvalkalo ilgis: 48,44 ± 0,069 mm) 100 dienų. Mitybos AA neturėjo įtakos išgyvenamumui, svorio padidėjimui ir kasdieniniam apvalkalo ilgio padidėjimui. AA kiekis abalono žiaunose, raumenyse ir virškinimo liaukose žymiai padidino AA su maistu. Kalbant apie imunitetą, dietinis AA žymiai pagerino bendrą hemocitų skaičių, kvėpavimo sprogimą ir fagocitinį aktyvumą hemolimfoje bei lizocimo aktyvumą hemolimfoje be ląstelių (CFH). Virškinimo liaukose TLR-MyD88-priklausomi ir TLR-MyD88-nepriklausomi signalizacijos keliai buvo slopinami papildant AA maistu. AA dieta žymiai padidino defenzino ir arginazės-I mRNR lygį virškinimo liaukoje. Žiaunose tik nuo TLR-MyD{26}}priklauso signalizacijos kelias buvo slopinamas dėl su maistu gaunamo AA, kad sumažėtų abalo uždegimas. Mitų kūrimo 6 lygį žiaunose žymiai padidino mitybos AA. Po Vibrio parahaemolyticus infekcijos TLR signalizacijos kelias virškinimo liaukoje buvo slopinamas dietiniu AA, kuris sumažino uždegimą abalone. Kalbant apie antioksidaciją, superoksido dismutazės, glutationo peroksidazės ir katalazės aktyvumas, taip pat bendras antioksidacinis pajėgumas ir sumažintas glutationo kiekis CFH buvo žymiai padidintas. Malondialdehido kiekis buvo žymiai sumažintas dėl dietos AA. Antioksidacinis gebėjimas buvo pagerintas suaktyvinus Keap{31}}Nrf2 kelią abalone. Kalbant apie apoptozę, dietinis AA gali sustiprinti anti-apoptozės gebėjimą per JNK-Bcl-2/Bax signalizacijos kaskadą abalone. Apibendrinant galima pasakyti, kad dietinis AA dalyvavo reguliuojant imunitetą, antioksidaciją ir apoptozę abalone.

Cistanche glikozidas taip pat gali padidinti SOD aktyvumą širdies ir kepenų audiniuose ir žymiai sumažinti lipofuscino ir MDA kiekį kiekviename audinyje, efektyviai pašalindamas įvairius reaktyvius deguonies radikalus (OH-, H2O₂ ir kt.) ir apsaugodamas nuo DNR pažeidimo. OH-radikalais. Cistanche feniletanoidiniai glikozidai pasižymi stipriu laisvųjų radikalų šalinimo gebėjimu, didesne redukcine galia nei vitaminas C, pagerina SOD aktyvumą spermos suspensijoje, mažina MDA kiekį ir turi tam tikrą apsauginį poveikį spermos membranos funkcijai. Cistanche polisacharidai gali sustiprinti SOD ir GSH-Px aktyvumą eksperimentiškai senstančių pelių eritrocituose ir plaučių audiniuose, kuriuos sukelia D-galaktozė, taip pat sumažinti MDA ir kolageno kiekį plaučiuose ir plazmoje bei padidinti elastino kiekį. geras sugeriantis poveikis DPPH, pailgina senstančių pelių hipoksijos laiką, pagerina SOD aktyvumą serume ir lėtina fiziologinę plaučių degeneraciją eksperimentiškai senstančiose pelėse Dėl ląstelių morfologinės degeneracijos, eksperimentai parodė, kad Cistanche pasižymi geru antioksidaciniu gebėjimu. ir gali būti vaistas, skirtas odos senėjimo ligų prevencijai ir gydymui. Tuo pačiu metu Cistanche esantis echinakozidas turi didelį gebėjimą sunaikinti DPPH laisvuosius radikalus ir geba pašalinti reaktyviąsias deguonies rūšis ir užkirsti kelią laisvųjų radikalų sukeltam kolageno skaidymui, taip pat turi gerą atkuriamąjį poveikį timino laisvųjų radikalų anijonų pažeidimams.

Spustelėkite Cistanche Tubulosa

【Daugiau informacijos:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Raktažodžiai: abalone; askorbo rūgštis; imuninis; antioksidacija; apoptozė

1. Įvadas

Askorbo rūgštis (AA), taip pat žinoma kaip vitaminas C, yra žinomas kaip esminis mikroelementas, kuris yra kofaktorius, susijęs su daugelio žmogaus fermentų aktyvumo didinimu ir prisideda prie imuninio atsako bei žmogaus nervų sistemos vystymosi [1,2 ]. Dėl riboto AA gebėjimo išsilaikyti organizme, norint išvengti AA trūkumo, būtina reguliariai ir tinkamai jį vartoti. Daugumos žinduolių vidutiniam augimui, fiziologinei veiklai, dauginimuisi ir sveikatai reikalingas nedidelis AA kiekis iš egzogeninių šaltinių [3–5]. Kalbant apie imunines funkcijas, AA prisideda prie imuninio barjero vientisumo palaikymo ir žaizdų gijimo [1]. Jis gali sustiprinti fagocitų funkciją, pavyzdžiui, pagerinti jų judrumą, chemotaksę, fagocitozę ir mikrobų naikinimą [6–9]. Ankstesni tyrimai pranešė apie įvairius AA imuninius poveikius žinduolių B ląstelėms, T ląstelėms ir NK ląstelėms [10–12]. Tuo tarpu AA taip pat yra susijęs su apoptoze. Jis slopina miokardo apoptozę, užkertant kelią Bax (BCL-2 susijusiam X baltymui) ir padidina Bcl-2 (apoptozės reguliatoriaus bcl-2) gebėjimą slopinti citochromo-C išsiskyrimą iš mitochondrijų į citoplazmą. ir vėliau sumažina kaspazę{15}}, kuri inicijuoja apoptozę [13]. Kaip natūralus antioksidantas, AA sumažina reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS) ir reaktyviąsias azoto rūšis (RNS), aprūpindamas jas elektronais ir neleisdamas oksiduotis kitiems junginiams [14–17]. AA taip pat gali padėti kitoms antioksidacinėms molekulėms, tokioms kaip glutationas (GSH), karotinas, uratai ir tokoferolis, atsinaujinti iš atitinkamų laisvųjų radikalų [18, 19].

Priešingai nei sausumos gyvūnai, yra palyginti nedaug pranešimų apie vandens gyvūnų imuninį atsaką ir apoptozę. Dietai tinkamas AA kiekis gali optimizuoti vandens gyvūnų augimą, sveikatą ir atsparumą stresui [20]. Daugumoje vandens gyvūnų AA tyrimų daugiausia dėmesio skiriama minimaliems AA reikalavimams maksimaliam augimui įvertinti ir mažiausiai kainuojančios dietos suformulavimui. AA reikalavimai skiriasi priklausomai nuo rūšies, dydžio, dietos ir auginimo sąlygų. Rekomenduojamas AA kiekis maiste svyruoja nuo 10 iki 10,000 mg/kg [21]. Minimalus AA reikalavimas, kad būtų palaikomas didžiausias augimo greitis (WG), buvo 53–186 mg/kg Nilo tilapijos (Oreochromis niloticus), 1200 mg/kg Ramiojo vandenyno paprastųjų tunų (Thunnus orientalis) ir 5000–1000 mg/kg Kuruma krevetės (Marsupenaeus japonicas) [22–24]. Tačiau kai kurių žuvų rūšių, pvz., Sibiro eršketo (Acipenser baerii), raudonojo karšio (Pagrus major) ir japoninio ungurio (Anguilla japonica) mitybos AA reikšmingos įtakos WG ar specifiniam augimo greičiui (SGR) neturėjo [25–27]. ].

Įrodyta, kad AA papildai stiprina daugelio rūšių žuvų imunines funkcijas, tokias kaip fagocitozė ir lizocimo aktyvumas [28–30]. Buvo pranešta, kad Nilo tilapijos, azijinių šamų (Clarias batrachus) ir Ramiojo vandenyno baltųjų krevečių (Litopenaeus vannamei) padaugėjo patogenų (pvz., bakterijų ir parazitų) išgyvenamumas po AA suvartojimo su maistu [31–34]. Dėl AA trūkumo sumažėjo lizocimo (LZM) aktyvumas, 3 komplemento komponento (C3) ir C4 kiekis amūruose (Ctenopharyngodon idella) [35]. Jis taip pat gali sumažinti antimikrobinių peptidų, tokių kaip -defenzinas ir hepcidinas, ir priešuždegiminių citokinų, įskaitant interleukiną (IL) 4/13A, IL-10, ir transformuojančio augimo faktoriaus (TGF) 1/2, kiekį; kartu reguliuodamas priešuždegiminius citokinus, įskaitant IL-1 ir branduolinį faktorių κB (NF-κB) amūruose [35]. Be to, AA trūkumas padidino apoptotinės proteazės aktyvacijos faktoriaus -1, kaspazės-3 ir kaspazės-7–9 reguliavimą, kad pasunkintų amūrų ląstelių apoptozę [35, 36].

Abalone yra viena iš svarbiausių komercinių rūšių moliuskų archeogastropodų būryje. Tai svarbus pavyzdinis gyvūnas tiriant pilvakojų (Mollusca) ekologinę ir vystymosi biologiją [37,38]. Tarp ūkiuose auginamų ešerių rūšių Ramiojo vandenyno ešeriai (H. discus hannai Ino) yra labiausiai pageidaujama ūkiuose auginamų rūšių Kinijoje. Mai pranešė, kad AA papildai nuo 0 iki 8000 mg/kg reikšmingai nepaveikė jauniklių ešerių SGR arba išgyvenamumo rodiklio (SR) [39]. Wu ir kt. pranešė, kad dietinis AA paveikė genų, susijusių su antioksidaciniais atsakais, ekspresiją abalono virškinimo liaukoje, kad pagerintų jo atsparumą stresui [40]. Be to, ligų protrūkis gali sukelti didžiulius ekonominius nuostolius ešerių pramonei [41,42]. Moliuskai neturi prisitaikančio imuniteto ir remiasi įgimtu imunitetu [43]. Taigi, šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti AA vaidmenį reguliuojant abalone H. discus hannai imunitetą, antioksidaciją ir apoptozę, ir bus pateikti moksliniai nurodymai, kaip sveikai reguliuoti abalone.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Etinis pareiškimas

Visos šiame tyrime atliktos gyvūnų priežiūros ir tvarkymo procedūros buvo patvirtintos Kinijos vandenyno universiteto gyvūnų priežiūros komiteto (patvirtinimo Nr. SPXY2020012).

2.2. Eksperimentinė dieta

Bazinė dieta (AA{{{{10}}}}) buvo sudaryta iš išgrynintų ingredientų, kad joje būtų maždaug 30 procentai maisto baltymų ir 3,5 procentai maistinių lipidų (1 lentelė). Kazeinas (be vitaminų) ir želatina buvo naudojami kaip baltymų šaltiniai, o sojų aliejus ir menhadeno žuvų taukai (1:1) buvo naudojami kaip lipidų šaltiniai, kurių gali pakakti optimaliam H. discus hannai augimui palaikyti [44–46 ]. Siekiant sudaryti septynias eksperimentines dietas, į bazinę dietą buvo įtraukta graduotų AA lygių (0, 50, 100, 200, 500, 1000 ir 5000 mg/kg). AA buvo pridėta prie dietos L-askorbil{18}monofosfato pavidalu. Šios dietos buvo atitinkamai pažymėtos kaip AA0, AA50, AA100, AA200, AA500, AA1000 ir AA5000. Analizuotas AA kiekis dietoje buvo atitinkamai 0,00, 47,31, 78,25, 189,05, 451,73, 919,99 ir 4821,17 mg/kg. AA kiekiui maiste analizuoti naudotas didelio efektyvumo skysčių chromatografijos metodas [40]. Maisto žalių baltymų, žalių lipidų ir pelenų kiekis buvo išmatuotas pagal standartinius Analitinių chemikų asociacijos metodus [47].

2.3. Išplovimo testas

Maisto AA išplovimas buvo pateiktas kaip sulaikymo efektyvumas (RE). Eksperimentinės dietos su trimis pakartojimais buvo panardintos į jūros vandenį esant 23.0 ± 0,5 ◦C. Panardintos dietos buvo išimtos nustatytu laiku (atitinkamai 1, 3, 6 ir 12 valandų) ir liofilizuotos AA kiekio analizei.

RE (procentais)=(AA, išlikusi dietoje po panardinimo)/(AA, esanti dietoje prieš panardinant) × 100.

2.4. Maitinimo bandymas

Abalon jaunikliai buvo gauti iš žuvininkystės įmonės Fudžou mieste (Fudzianas, Kinija) ir dvi savaites buvo aklimatizuojami prie laboratorinių sąlygų su baziniu maistu recirkuliacinėje vandens sistemoje su rezervuarais (10{{1{{21). }}}} × 50 × 40 cm). Po to panašaus dydžio ešeriai (pradinis svoris: 12,01 ± 0,{16}}1 g, pradinis apvalkalo ilgis: 48,44 ± 0,069 mm) atsitiktine tvarka buvo suskirstyti į 21 rezervuarą (45 ešeriai viename bake). Kas trys bakai buvo laikomi vienu apdorojimu. Visos cisternos buvo laikomos silpnoje šviesoje su juodomis plastikinėmis užuolaidomis. Abalai buvo šeriami rankomis kartą per dieną 17:00. Išmatos ir nesuvalgytos dietos buvo pašalintos kiekvieną rytą 8 val. Per 100-dienos šėrimo bandymą vandens temperatūra buvo 23,0 ± 0,5 ◦C, druskingumas 30–33 ‰, pH 7,4–7,9, o ištirpusio deguonies kiekis buvo didesnis arba lygus 7,0 mg/l.

2.5. Vibrio Parahaemolyticus iššūkio testas

Po šėrimo bandymo penkiolika ešerių iš kiekvieno rezervuaro buvo panaudota bandymui su patogeniniu V. parahaemolyticus. Abalonai buvo užkrėsti 100 µL V. parahaemolyticus (1,2 × 106 cfu/mL), sušvirkštus į raumenis in vivo. Virškinimo liauka buvo surinkta atitinkamai 0, 6, 12, 24, 48 ir 72 val., ir laikoma –80 ◦C temperatūroje qPCR analizei.

2.6. Pavyzdžių kolekcija

Pasibaigus šėrimo bandymui, abalonai buvo nevalgę tris dienas, prieš juos suskaičiuodami ir pasverdami. Prieš imant mėginius, visi abalonai buvo anestezuoti 5 procentų etilo alkoholiu. Hemolimfa buvo surinkta iš keturių abalonų kiekviename rezervuare, siekiant išanalizuoti bendrą hemocitų skaičių (THC), kvėpavimo sprogimą (RB) ir fagocitinį aktyvumą (PA). Norint išanalizuoti fermento aktyvumą hemolimfoje be ląstelių (CFH), hemolimfa buvo paimta iš dar dešimties abalonų kiekviename rezervuare ir centrifuguojama (3000 × g 4 ◦C temperatūroje) 10 min.; CFH iki naudojimo buvo laikomas –80 ◦C temperatūroje. Virškinimo liaukos, žiaunų, raumenų ir mantijos mėginiai buvo paimti iš dešimties hemolimfoje paimtų ešerių viename rezervuare ir iki panaudojimo laikomi –80 ◦C temperatūroje.

2.7. Askorbo rūgšties kiekis

AA kiekis CFH, raumenyse, mantijoje, žiaunose ir virškinimo liaukose buvo aptiktas naudojant geležies kiekį mažinantį askorbato tyrimo rinkinį (BioVision, Milpitas, CA, JAV). CFH gali būti naudojamas tiesiogiai matuoti AA kiekį pagal gamintojo instrukcijas. 0,1 g raumenų, mantijos, žiaunų ir virškinimo liaukos mėginiai buvo homogenizuoti 1 ml iš anksto atšaldyto distiliuoto vandens. AA kiekis buvo matuojamas pagal absorbciją esant 593 nm.

2.8. Imuniniai parametrai hemolimfoje

Hemolimfa buvo kruopščiai sumaišyta naudojant vienodą tūrį iš anksto atšaldyto antikoagulianto (100 mmol/l EDTA Na2, 450 mmol/l NaCl, 10 mmol/l KCl, 10 mmol/l HEPES, pH 7,3, 850 mOs mol/kg). praskiedžiama hemolimfa.

THC buvo skaičiuojamas naudojant hemocitometrą po mikroskopu (CX31, OLYMPUS, Tokijas, Japonija).

Nitromėlynojo tetrazolio (NBT) kiekio sumažėjimas hemocituose, kurį galima pavaizduoti RB aktyvumu, buvo išmatuotas Anderson ir kt. metodais, su tam tikrais pakeitimais [48]. Trumpai tariant, naudojant antikoaguliantą hemolimfa buvo sureguliuota iki 5 × 106 ląstelių/ml ir centrifuguojama 3000 × g greičiu 4 ◦C temperatūroje 10 min. Ląstelių nuosėdos buvo nudažytos 100 µl 1 µg/ml PMA (forbolio miristato acetatas, Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), ištirpinto DMSO (dimetilsulfoksidas, Solarbio, Pekinas, Kinija), ir inkubuojamos 37 ◦C temperatūroje. 30 min. Po inkubacijos į ląsteles buvo pridėta 100 µl 0,3 procento NBT, ištirpinto Hanko subalansuotu druskos tirpalu (Solarbio, Pekinas, Kinija), ir inkubuojama 37 ◦ C temperatūroje 30 minučių prieš centrifugavimą (560 × g 4 ºC temperatūroje 10 min.) . Supernatantas buvo švelniai pašalintas, o reakcija buvo nutraukta naudojant 200 µL metanolio 10 min. Po to ląstelė tris kartus plaunama 70 procentų (t/v) metanoliu, prieš išdžiovindama ore. Formazano mėlynasis kristalas buvo ištirpintas naudojant 120 µL 2 M KOH ir 140 µL DMSO. Optinis tankis (OD) buvo nuskaitytas spektrofotometru, esant 630 nm, lyginant su KOH/DMSO tuščiuoju mėginiu.

Hemolimfos PA buvo nustatytas pagal anksčiau aprašytus Xue ir kt. [49]. Trumpai tariant, 50 µL praskiestos hemolimfos buvo dedama ant stiklelio ir inkubuojama 25 ◦ C temperatūroje 20 minučių, kad būtų skatinamas sukibimas. Tada į hemocitų monosluoksnį prieš inkubaciją (25 ◦ C 30 min.) buvo pridėta 50 µl mielių (Saccharomyces cerevisiae) su 1 × 106 ląstelių/ml. Objektyvas du kartus švelniai nuplaunamas sterilizuotu fosfatiniu buferiniu fiziologiniu tirpalu (PBS) ir fiksuojamas metanoliu 5 minutes. Po to stiklelis buvo nudažytas Giemsa tirpalu 20 min. Ląstelės buvo suskaičiuotos po alyvos imersiniu lęšiu. Fagocitų greitis parodė fagocitinį aktyvumą.

2.9. Biocheminiai parametrai CFH

Antioksidacinis fermentų aktyvumas (pvz., SOD, katalazė (CAT) ir glutationo peroksidazė (GPX)), bendras antioksidacinis pajėgumas (T-AOC) ir malondialdehido (MDA) bei GSH kiekis CFH buvo nustatyti naudojant komerciniai tyrimų rinkiniai (Nanjing Jiancheng Bioinžinerijos institutas, katalogas: T-AOC, A015-2-1; SOD, A001-3-2; CAT, A007- 1-1; GSH, A006-2-1; GPX , A005-1-2; MDA, A003-1-2). T-AOC buvo pagrįstas žaliųjų ABTS (2, 20 -azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-sulfonrūgštis)) radikalų susidarymu, kai ABTS buvo oksiduotas. SOD, GSH ir GPX buvo išmatuoti pagal absorbciją atitinkamai 450 nm, 405 nm ir 421 nm, naudojant ultravioletinių spindulių spektrofotometrą (Ultrospec 2100 pro, Biochrom, Holliston, MA, JAV). CAT ir MDA buvo nustatyti naudojant amonio molibdato ir TBA (tiobarbitūro rūgšties) metodus [50,51].

LZM aktyvumas ir C3 bei C4 kiekis CFH buvo matuojamas naudojant komercinius tyrimų rinkinius (Nanjing Jiancheng Bioinžinerijos institutas, Nankinas, Kinija. Katalogas: LZM, A050-1-1; C3, E032-1-1; C4 , E033-1-1). LZM buvo matuojamas pagal pralaidumą esant 530 nm. C3 ir C4 buvo nustatyti esant 340 nm.

2.10. Viso RNR ekstrahavimas ir kiekybinė realaus laiko PGR

Visa RNR iš virškinimo liaukos ir žiaunų buvo išgauta naudojant viso audinio RNR izoliavimo rinkinį (Vazyme, Nanjing, Kinija) ir TRIzol reagentą (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Išskirtos bendros RNR koncentracija ir grynumas buvo nustatyti naudojant Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Komplementari DNR (cDNR) buvo susintetinta naudojant atvirkštinės transkripcijos rinkinį (PrimeScript® RT reagentų rinkinys su gDNA Eraser, Takara, Japonija).

Visi pradmenys buvo sukurti naudojant Primer Premier 6.{1}} (papildoma lentelė S1) ir susintetinti Sangon Biotech (Šanchajus, Kinija). Amplifikacijos reakcija buvo atlikta naudojant bendrą 25 µL tūrį, kuriame buvo 0,5 µL tiesioginių ir atvirkštinių pradmenų, 12,5 µL 2 × SYBR Green Realtime Master Mix (Vazyme), 1 µL cDNR ir 10,5 µL. sterilizuoto ddH2O. Kiekvieno geno ekspresijos profiliams nustatyti buvo naudojamos šios termociklo sąlygos: 95 ◦C 30 s; 40 ciklų 95 ◦ C 10 s ir 60 ◦ C 30 s; su vėlesnėmis inkubacijomis 95 ◦ C temperatūroje 15 s, 60 ◦ C temperatūroje 1 min. ir 95 ◦ C temperatūroje 1 s, kad būtų galima nustatyti fluorescenciją. Tikslinio geno ekspresijos lygiai buvo normalizuoti iki dviejų stabiliausių etaloninių genų (-actin ir gapdh), kurie buvo patvirtinti naudojant geNorm ir NormFinder [52,53]. Santykinės genų ekspresijos buvo apskaičiuotos naudojant 2−∆∆CT metodą [54].

2.11. Western Blot

Bendras virškinimo liaukos ir žiaunų baltymas buvo ekstrahuotas RIPA (Solarbio) metodu [55] su proteazės ir fosfatazės inhibitorių kokteiliais (Roche, Bazelis, Šveicarija). Vadovaujantis vadovu, virškinimo liaukos ir žiaunų branduolinis baltymas buvo išgautas naudojant branduolinių ir citoplazminių baltymų ekstrakcijos rinkinį (Beyotime, Šanchajus, Kinija). Baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant BCA baltymų kiekio nustatymo rinkinį (Vazyme, Nanjing, Kinija), o visi baltymų mėginiai buvo atskiesti iki ekvivalentinės koncentracijos 1,5 µg/µL naudojant RIPA reagentą. Baltymų mėginiai iš virškinimo liaukos ir žiaunų buvo atskirti naudojant SDS-PAGE ir vėliau perkelti į 0,45 µm PVDF membraną. PVDF buvo užblokuotas naudojant 5 procentų neriebaus pieno miltelius (Beyotime, Šanchajus, Kinija), ruošiantis TBST kambario temperatūroje 1 val. Membrana tris kartus plaunama TBST prieš inkubaciją naudojant pirminį antikūną per naktį 4 ◦ C temperatūroje 60 aps./min. Po to inkubuota membrana tris kartus plaunama TBST ir inkubuojama naudojant ožkos anti-triušio krienų peroksidazės konjuguotą antrinį antikūną (Beyotime, Šanchajus, Kinija) 1 valandą kambario temperatūroje. PVDF membrana buvo vizualizuota naudojant ECL chemiliuminescencijos rinkinį (Vazyme, Nanjing, Kinija). GAPDH (1:500, AB-P-R001, Goodhere Biotechnology, Hangdžou, Kinija) ir Lamin B (1:500, WL01775, Wanleibio, Shenyang, Kinija) buvo naudojami kaip etaloniniai baltymai. Pirminiai tiksliniai antikūnai buvo mieloidinės diferenciacijos pirminis atsakas 88 (MyD88, 1:500, WL02494, Wanleibio, Shenyang, Kinija), c-Jun N-galo kinazė (JNK, 1:500, WL01295, Wanleibio, Shenyang, Kinija), subrendusi -IL-1 (1:500, WL00891, Wanleibio, Shenyang, Kinija), NF-κB p65 (1:500, WL01980, Wanleibio, Shenyang, Kinija), į kelchą panašus ECH susiejantis baltymas 1 (Keap1, 1) :1000, WL03285, Wanleibio, Shenyang, Kinija) ir suskaldytą kaspazę3 (1:500, WL02117, Wanleibio, Shenyang, Kinija). Western blot kiekybinis įvertinimas buvo apskaičiuotas naudojant ImageJ (1.53 versija, Wayne'as Rasbandas ir bendradarbiai, Nacionalinis sveikatos institutas, Bethesda, MD, JAV).

2.12. Skaičiavimai ir statistinė analizė

Statistinei analizei buvo naudojama SPSS 24 programinė įranga (IBM, Armonk, NY, JAV). Vienpusė ANOVA buvo pritaikyta naudojant Tukey kelių diapazonų testą, siekiant nustatyti statistinius skirtumus tarp šių grupių, kai reikšmingumo lygis yra 0,05. Visi duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± SE (standartinė paklaida).

SR, WGR (svorio padidėjimo greitis) ir DISL (kasdienis apvalkalo ilgio prieaugis) buvo apskaičiuoti taip:

SR (procentai )=(išgyvenusių geldelių skaičius / pradinio abalo skaičius) × 100;

WGR (procentai )=[(galutinis svoris (g) – pradinis svoris (g)) / pradinis svoris (g)] × 100;

DISL (µm/dieną)=[galutinis apvalkalo ilgis (mm) – pradinis apvalkalo ilgis (mm)]/dienos × 1000.

3. Rezultatai

3.1. Askorbo rūgšties sulaikymo dietoje efektyvumas

Dietinės AA RE skirtingais intervalais, panardintos į jūros vandenį, parodyta papildomame S1 paveiksle. Apskritai, AA RE kiekis dietoje sumažėjo panardinant į jūros vandenį. Šėrimo eksperimento metu dieta jūros vandenyje išbuvo maždaug 12 valandų. Todėl išplovimo bandymas truko 12 valandų jūros vandenyje tomis pačiomis maitinimosi sąlygomis. Po 3 valandų panardinimo AA RE kiekis dietoje svyravo nuo 95,25 procento iki 97,43 procento. Panardinant 6 valandas AA RE buvo išlaikytas daugiau nei 95 proc. Panardinus 12 valandų, AA RE AA50, AA100, AA200, AA500, AA1000 ir AA5000 buvo atitinkamai 89,78 proc., 90,88 proc., 89,38 proc., 91,03 proc., 87,4 proc.

3.2. Augimo efektyvumas ir askorbo rūgšties pasiskirstymas audiniuose

The SR and growth performance of abalone-fed gradient levels of AA supplementation are shown in Table 2. The SR (%), WGR (%), and DISL (µm/day) were not significantly affected by dietary AA levels (p>0.05). SR svyravo nuo 80,74 procentų iki 88,15 procentų, o WGR ir DISL atitinkamai svyravo nuo 29,32 procento iki 31,52 procento ir nuo 17,92 iki 20,01 µm per dieną.

The AA distribution in tissues, including CFH, muscle, mantle, gill, and digestive gland, is shown in Figure 1. No significant differences in AA content in CFH and mantle of abalone after dietary AA were observed (p>0.05). AA kiekis CFH ir mantijoje svyravo atitinkamai nuo 2,89 µg/mL iki 4,52 µg/mL ir 81,63 µg/g iki 103,08 µg/g. AA kiekis raumenyse, žiaunose ir virškinimo liaukose žymiai padidėjo (p<0.05) and reached their peak at the AA5000 group. The AA content in the muscle, gill, and digestive gland was 64.88–128.20 µg/g, 308.98–382.19 µg/g, and 130.08–206.09 µg/g, respectively.

3.3. Hemolimfos imuniniai parametrai

Hemolimfos THC, RB ir PA pateikti 3 lentelėje. THC reikšmingai padidėjo padidėjus AA kiekiui su maistu, svyruoja nuo 1,07 × 107–1,65 × 107 ląstelių/ml, o aukščiausią tašką pasiekė AA1000 grupėje.

Abalonų hemocitų RB žymiai padidėjo ir pasiekė aukščiausią lygį AA10{{10}}{{20}} grupėje (0 .35 OD630/107 ląstelių·mL−1). AA papildymui su maistu padidėjus nuo 189,05 mg/kg iki 919,99 mg/kg, RB žymiai padidėjo nuo 0,20 OD630/107 ląstelių·mL–1 iki 0,35 OD630/107 ląstelių·mL–1 (p < 0,05). Dietinis AA gali turėti įtakos abalono hemocitų PA (p < 0,05). Abalono PA AA1000 ir AA5000 grupėje buvo žymiai didesnis nei AA0, AA50 ir AA100 grupėse, o didžiausias (48,92 proc.) buvo pasiektas AA5000 grupėje.

Su imunitetu susiję ešerių CFH parametrai, įskaitant LZM, C3 ir C4 kiekį, pateikti 4 lentelėje. LZM aktyvumas buvo žymiai padidėjęs (p < 0.{{10} }5) ir pasiekė aukščiausią lygį AA1000 grupėje, kur jo aktyvumas buvo 56,25 U/mL. Duomenys neatskleidė jokio reikšmingo poveikio C3 kiekiui tarp visų gydymo būdų (p > 0,05); tačiau C3 kiekis toliau didėjo papildant AA. Maisto AA C4 kiekiui reikšmingos įtakos neturėjo (p > 0,05).

3.4. Antioksidaciniai parametrai CFH

Antioksidacinis fermentų aktyvumas abalono, kurio sudėtyje yra SOD, CAT ir GPX, CFH, taip pat T-AOC talpa ir MDA bei GSH kiekis parodytas 5 lentelėje. Mitybos AA reikšmingai paveikė SOD, CAT, ir GPX, ir T-AOC bei GSH ir MDA turinį. SOD, CAT ir GPX aktyvumas, T-AOC ir GSH kiekis buvo žymiai padidintas (p < 0.05), o MDA kiekis buvo žymiai sumažintas ežiuolėse (p < 0,05). ). AA1000 ir AA5000 grupėse nepastebėta jokių reikšmingų šių antioksidacinių parametrų skirtumų tarp abalono CFH.

【Daugiau informacijos:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】