Beta Vulgaris Rubra L. (burokėlių) žievelės metanolio ekstraktas sumažina oksidacinį stresą ir skatina ląstelių dauginimąsi didindamas VEGF ekspresiją H2O2 sukeltose oksidacinio streso patiriančiose žmogaus bambos venų endotelio ląstelėse

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comsužinoti daugiau

Laila Naif Al-Harbi 1,*, Subash-Babu Pandurangan 1, Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1, Ghalia Shamlan 1, Ahmad Mohammad Salamatullah 1, Ali A Alshatwi 1 ir Amna Abdullah Alotiby 2

Santrauka:Polifenolių antioksidacinės savybės irflavonoidųMaisto medžiagose esantis kiekis padeda sustabdyti reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) vystymąsi ir apsaugoti endotelio lygiųjų raumenų ląsteles nuo oksidacinio streso / sukeltos nekrozės. Burokėliai (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) yra dažnai vartojama daržovė, turtingaantioksidantai. Burokėlių žievelės biologiškai aktyvūs junginiai ir jų vaidmuo žmogaus bambos venų endotelio ląstelėse (HUVEC) vis dar nepakankamai ištirtos. Šiame tyrime buvo paruoštas burokėlių žievelės metanolio ekstraktas (BPME) ir jo poveikis biologiniam efektyvumui, branduolio vientisumui, mitochondrijų membranos potencialui, kraujagyslių ląstelių augimui ir su imunoreguliacija susijusiems genų ekspresijos lygiams HUVEC su indukuotais.oksidacinisbuvo analizuojamas stresas. Dujų chromatografijos-masių spektroskopijos (GC-MS) rezultatai patvirtino, kad BPME sudėtyje yra 5-hidroksimetilfurfurolo (32,6 proc.), metilpiruvato (15,13 proc.), furfurolo (9,98 proc.) ir 2,3-dihidro{{11} },5-dihidroksi-6-metil-4H-piran-4-onas (12,4 proc.). BPM ekstraktas veiksmingai sustiprino ląstelių proliferaciją ir buvo patvirtintas MTT tyrimu; branduolio vientisumas patvirtintas dažymo propidžio jodidu (PI) tyrimu; mitochondrijų membranos potencialas (∆ψm) buvo patvirtintas JC-1dažymo tyrimu. Aneksino V tyrimas patvirtino, kad BPME gydyti HUVEC parodė 99 procentus gyvybingų ląstelių, tačiau tik 39,8 procentai HUVEC, apdorotų vien H2O2. Be to, HUVEC gydymas BPME 48 valandas sumažino lipidų peroksido (LPO) mRNR ekspresiją ir padidino NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endotelio azoto oksido sintazę (eNOS). ) ir kraujagyslių ląstelių augimo faktoriaus (VEGF) mRNR ekspresijos lygiai. Mes nustatėme, kad gydymas BPME sumažino priešuždegiminį (branduolinį faktorių-κ (F-κ), audinių nekrozės faktorių (TNF-), į rinkliavą panašų receptorių-4 (TLR-4), interleukiną{{37} } (IL-1 ))ir kraujagysliųuždegimas(intracelulinės adhezijos molekulės (ICAM), kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulės (VCAM), EDN1, IL-1 ) susijusios mRNR ekspresijos. Apibendrinant galima teigti, kad burokėlių žievelės gydymas efektyviai padidino kraujagyslių lygiųjų ląstelių augimo faktorius ir mikrotubulų vystymąsi, o sumažino kraujagyslių uždegimo reguliatorius. BPM gali būti naudingas kraujagyslių lygiųjų ląstelių regeneracijai, audinių atstatymui ir anti-senėjimo potencialui.

Raktiniai žodžiai:Burokas; oksidacinis stresas; mitochondrijos; angiogenezė; uždegimas

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

1. Įvadas

Angiogenezė yra fiziologinis vaskulogenezės procesas iš esamų organizmo kraujagyslių [1]. Tai būtina ne tik embriono vystymuisi ir dauginimuisi, bet ir ląstelių ciklui bei audinių taisymui [2,3]. Tačiau tai siejama su įvairių ligų, tokių kaip naviko augimas, reumatoidinis artritas, įvairios išeminės ir uždegiminės ligos, patogeneze [3–5]. Kraujagyslių endotelis vaidina svarbų vaidmenį palaikant kraujagyslių hemostazę, reguliuojant kraujagyslių tonusą ir imunines bei uždegimines reakcijas [6,7]. Endotelio ląstelės (EC) yra ploni vienaląsčiai sluoksniai, kurie iškloja visus vidinius kraujagyslių paviršius ir gamina įvairias molekules, veikiančias lokaliai arba tolimose vietose [7]. Endotelis yra esminis kūno homeostazės pagrindas, o bet koks endotelio ląstelių atsako pakitimas sukelia pirminius uždegiminių ir kraujagyslių ligų procesų įvykius, tokius kaip aterosklerozė ir hipertenzija [6, 8, 9]. Šios ligos sukelia oksidacinį stresą, kuris keičia EB struktūrą ir funkcijų vientisumą bei sukelia endotelio disfunkciją [9]. Žmogaus bambos venų EC (HUVEC) buvo plačiai naudojami kaip su žmogaus kraujagyslių endoteliu susijusių tyrimų modelis. Be to, jie yra naudingas modelis tiriant pagrindinius biologinius kelius, susijusius su endotelio funkcija [10]. Bioaktyvių junginių ir fitocheminių medžiagų gausu randama vaisiuose, daržovėse, žaliosiose žolelėse ir daugelyje augalų, kurie turi daug naudos sveikatai, pavyzdžiui, priešuždegiminių, antioksidacinių, antikancerogeninių ir angiogeninių savybių [11–13]. Šiuo atžvilgiu raudonieji burokėliai (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) priklauso Amaranthaceae šeimai ir yra priskiriami prie geriausių didelio antioksidantų kiekio šaltinių [14,15]. Tiksliau, jame yra daug biologiškai aktyvių fitocheminių medžiagų, įskaitantbetalainų, flavonoidai,polifenoliai, terapiniai fermentai, askorbo rūgštis, dehidroaskorbo rūgštis (DHAA) ir neorganinis nitratas (NO3) [16–18]. Be to, jame yra vertingų esminių maistinių medžiagų, tokių kaip kalis, kalcis, magnis, natris, geležis, cinkas, fosforas, varis ir manganas [19]. Keletas tyrimų parodė, kad raudonųjų burokėlių ekstraktas (šaknis) turi daug teigiamo poveikio dėl savo hipoglikeminių, lipidų kiekį mažinančių, priešuždegiminių, antihipertenzinių ir antiproliferacinių savybių [20–22]. Visos šios naudingos savybės gali būti susietos su biologiškai aktyvių junginių laisvųjų radikalų šalinimo gebėjimais. Taigi, raudonųjų burokėlių vartojimas buvo susijęs su daugybe maistinių medžiagų ir naudos sveikatai. Dėl savo maistinės vertės jis gali būti naudojamas kaip funkcinis maisto šaltinis nuo oksidacinio streso, sukeliančio lėtines medžiagų apykaitos ligas, tokias kaip 2 tipo diabetas ir širdies ir kraujagyslių ligos [23]. Remiantis literatūros apžvalga, Beta vulgaris pasižymi stipriomis antioksidacinėmis, imunoreguliacinėmis ir angiogeninėmis savybėmis. Apigenino rasta burokėlių lapuose; jis turi antiproliferacinį poveikį kepenų ir žarnyno ląstelėse ir gali pagerinti riebios dietos sukeltą nutukimo gretutinį susirgimą, aktyvindamas AMPK [24, 25]. De Silva ir kt., (2020) [26] nustatė, kad Beta vulgaris apsaugo kraujagyslių EC nuo išoriškai sukelto oksidacinio streso, kuris gali būti dėl kelių šiame augale esančių bioaktyvių junginių bendro poveikio. Iki šiol mechaninis Beta vulgaris šaknų žievelės EB proliferacijos ir angiogenezės poveikis buvo nepakankamai ištirtas. Taigi, mes siekėme atlikti šį tyrimą, kad ištirtume kraujagyslių ląstelių proliferaciją, mikrotubulų vystymąsi, oksidacinį stresą ir angiogenezės pajėgumą, susijusį su Beta vulgaris šaknies žievele, naudojant ląstelių morfologiją ir genų ekspresijos analizę HUVEC. Ištirtas angiogeninis raudonųjų burokėlių žievelės metanolio ekstrakto poveikis, susijęs su branduolio vientisumu, mikrotubulų vystymusi, mitochondrijų efektyvumu ir ląstelių ciklo stimuliavimu žmogaus kraujagyslių EC.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Burokėlių paruošimas(Beta vulgaris rubra L.) Metanolio ekstraktas Šviežių burokėlių (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) pavyzdžiai iš pradžių buvo gauti iš daržovių parduotuvių Rijade, Saudo Arabijos Karalystėje (KSA). Švieži burokėliai buvo nuplauti distiliuotu vandeniu, kad būtų pašalinti stiebai ir teršalai. Išorinė oda buvo nulupta, kad būtų pašalinta ir supjaustyta mažais gabalėliais. Mėginiai buvo džiovinami karšto oro krosnyje 40 ◦, o po to sumalti iki miltelių naudojant elektroninį maišytuvą. Tada 5{{10}}0 g miltelių buvo ekstrahuojami steriliame butelyje su 1 l metanolio (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV) 24 valandas kambario temperatūroje purtyklė ir pakartokite tris kartus. Vėliau ekstraktui filtruoti buvo naudojamas Whatmanfifilter (Whatman, Clifton, NJ, JAV). Galiausiai, sumažinus slėgį, tirpiklis buvo atskirtas nuo ekstrakto, o ekstraktas surenkamas kaip kieta sausa medžiaga, išgarinus metanolį. Išskirtas mėginys iki tolesnio naudojimo buvo laikomas šaldytuve 4 ◦C temperatūroje. 2.2. Dujų chromatografijos ir masių spektroskopijos analizė Burokėlių žievelės metanolio ekstraktas (BPME) buvo įšvirkščiamas į silicio dioksido kapiliarinę kolonėlę (30 m × {{60}},25 mm ID × 0). .25 µm plėvelės storio) GC-MS prietaisas (Agilent 6890N/5973I, Kalifornija, CA, JAV) su masės atrankiniu detektoriumi cheminėms sudėtims aptikti. Prietaiso temperatūra buvo nustatyta kaip pradinė 7{{90}} ◦C, palaikant 2 min., iki 305 ◦C esant 20 ◦C/min., po to palaikoma 1 min. Bendras GC veikimo laikas buvo nustatytas 45 min., kai helio dujos (99,999 proc.) yra nešančiosios dujos (pastovus greitis 1,2 ml/min), 250 ◦C kaip injektoriaus temperatūra ir 230 ◦C kaip jonų šaltinis. temperatūros. Remiantis GC-MS spektru, buvo apskaičiuotas atitinkamo komponento santykinis procentas, o nežinomo komponento masės spektrai buvo nustatyti lyginant su žinomais 62,{29}} modeliais, esančiais Nacionaliniame standartų ir technologijų institute. kompiuterių biblioteka (NIST08). 2.3. Ląstelių kultūros medžiagos ir chemikalai HUVEC buvo įsigyti iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC, Manassas, VA, JAV). Ląstelių kultūros medžiagos, tokios kaip Dulbecco modifikuota erelio terpė (DMEM), EDTA, tripsinas ir kt., buvo gautos iš Gibco (Paislis, JK). Penicilinas-streptomicinas (PS) ir vaisiaus galvijų serumas (FBS) buvo įsigyti iš Hyclone Laboratories, JAV. Molekulinės biologijos eksperimente naudotos cheminės medžiagos buvo gautos iš Sigma-Aldrich, ypač MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolio bromidas], PI ir JC-1 dėmė. SYBR Green PCR Master Mix ir cDNR sintezės rinkinys buvo gauti iš Qiagen (Hilden, Vokietija). 2.4. HUVECs HUVEC buvo auginami DMEM ir papildyti 1 procentu PS ir 10 procentų FBS kompleksu. Ląstelės buvo inkubuojamos drėgnoje atmosferoje 37 ◦C temperatūroje, 5 proc. CO2, ir subkultūrinamos maždaug kas 3 dienas. 2.5. Ląstelių gyvybingumas ir ląstelių dauginimasis pagal MTT tyrimą HUVEC (1 × 104 ląstelių/šulinėlių) buvo kultivuojami su palaikomąja terpe ir leista per naktį prilipti 96-šulinėlių auginimo plokštelėje. Tada terpė buvo pakeista nauja auginimo terpe, turinčia didėjančias BPME koncentracijas (0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 ir 3,2 µg/mL), kaip nurodyta MTT tyrimo plokštelės žemėlapyje, ir inkubuojama 24 ir 48 h; neapdorotos ląstelės buvo naudojamos kaip kontrolė. Pasibaigus inkubaciniam laikotarpiui, eksperimentinės ląstelės buvo apdorotos 20 µl/šulinėliais 5 mg/mL MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2, 5-difeniltetrazolio bromidas, kuris buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO)) ir papildomai inkubuojamas 4 valandas 37 ◦C temperatūroje. Tada terpė buvo išmesta, o pagamintas purpurinis formazanas buvo ištirpintas 100 µl 100 procentų DMSO. Tirpalo absorbcija buvo matuojama naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (Thermo Scientific, Waltham, MA, JAV) esant 570 nm bangos ilgiui. Ląstelių proliferacijos procentas (procentai) buvo apskaičiuotas pagal šią lygtį: (mėginio absorbcija / vidutinė kontrolinės medžiagos absorbcija) × 100. 2.6. Eksperimentinis planas Pagal dabartinį ląstelių proliferacijos tyrimą, ištirta mažesnė BPME koncentracija (0,1 ir 0,2 µg/mL) parodė proliferuojančius HUVEC ir mikrotubulų morfologiją be toksiškumo. Buvo parinkti 0,1 ir 0,2 µg/mL BPME dozės tūriai ir 48 valandas buvo gydomi normaliais HUVEC ir 10 mM H2O2-sukeltais oksidacinio streso paveiktais HUVEC, siekiant nustatyti ląstelių proliferaciją, priešuždegiminį, angiogeninį ir apoptotinį potencialą. (Figūra 1). Transporto priemonės kontrolė taip pat buvo palaikoma 48 valandas abiejose grupėse. Kvercetinas (10 µM) buvo naudojamas kaip etaloninė kontrolė abiejose eksperimentinėse grupėse. Po inkubacijos neapdorotose ir eksperimentinėse ląstelėse buvo ištirta ląstelių ir branduolio morfologija bei mitochondrijų membranos potencialas, naudojant BDTM MitoScreen (JC{105}}) rinkinį; apoptozė buvo nustatyta aneksino V / apoptozės pagrindu veikiančiu ląstelių rūšiavimo metodu kolegų citometrijoje. Buvo tiriamas oksidacinis stresas, priešuždegiminis ir su angiogeneze susiję genų ekspresijos lygiai.

2.7. Propidžio jodido dažymo tyrimas branduoliniam pažeidimui nustatyti Ląstelių morfologijos, siekiant nustatyti būdingus branduolio pažeidimus, piknozę arba apoptozinius morfologinius pokyčius po apdorojimo 0,1 ir 0,2 µg/mL BPME (su H2O2 arba be jo) HUVEC. buvo nustatytas naudojant PI dažymo analizę naudojant apverstą fluorescencinę mikroskopiją, kaip aprašyta Leite ir kt. [27].

2.8. Mitochondrijų membranos potencialo (∆ψm) tyrimas naudojant JC-1 dažymą Mitochondrijų membranos potencialas (∆ψm) buvo nustatytas JC-1 tyrimu, siekiant įvertinti mitochondrijų efektyvumą nešiklio kontrolėje ir {{4} }.1 ir 0.2 µg/mL BPME apdorotų HUVEC (su H2O2 ir be jo). Trumpai tariant, JC-1 dažymo tirpalas buvo sumaišytas su panašaus tūrio auginimo terpės, tada pridedamas prie eksperimentinių HUVEC ir inkubuojamas tamsoje 20 minučių 37 ◦C temperatūroje. Tada nesurišti JC-1 dažai buvo švelniai du kartus nuplauti, naudojant 200 µL JC-1 dažymo plovimo buferio 4 ◦C temperatūroje. Vėliau, fluorescencinės mikroskopijos būdu, naudojant fluorescencinį mikroskopą, buvo stebimas j-agreguotas prieš JC-1 dažymą, ir buvo užfiksuoti vaizdai. Be to, mitochondrijų membranos potencialas buvo išmatuotas srauto citometrijoje, naudojant BDTM MitoScreen (JC-1) rinkinį.

2.9. Aneksino V / apoptozės analizė naudojant srauto citometriją Gyvybingoms, proapoptotinėms, ankstyvoms apoptozinėms ir nekrozinėms ląstelėms nustatyti buvo naudojamas kitas citometrijos pagrindu sukurtas aneksino V / PI aptikimo rinkinys (Sigma Chemicals, JAV). Oksidacinio streso sukeltos HUVEC (1 × 105/šulinėlyje) buvo dedamos į 24-šulinėlių plokšteles ir inkubuojamos su BPME (0.1 ir 0,2 µg/mL) arba nešiklio kontrole. 48 val. Po inkubacijos ląstelės buvo inkubuojamos 400 µl 5 µL aneksino V-fluoresceino izotiocianato (FITC) ir 5 µl PI, turinčio rišamąjį buferį; po to ląstelės 15 minučių buvo laikomos kambario temperatūroje (RT) tamsoje. Ląstelės buvo analizuojamos kolegų citometrijos metodu (BD Biosciences, San Chosė, Kalifornija, JAV), siekiant nustatyti apoptotines (PI neigiamas ir aneksino V teigiamas) ir vėlyvąsias apoptozes (PI teigiamas ir aneksino V teigiamas) ląsteles [28].

2.10. Kiekybinė realaus laiko PGR analizė Fastlane® ląstelių į cDNR rinkinys (Qiagen, Hilden, Vokietija) buvo naudojamas bendrai RNR išgauti ir cDNR sintezei iš nešiklio kontrolės, BPME apdorotų HUVEC (su H2O2 ir be jo), naudojant kiekybinę PGR (qPCR) pusiau automatizuotą. instrumentas (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV). Oksidacinio streso ekspresijos lygiai, įskaitant (lipidų peroksidą, NOS-3), antioksidantą (Nrf-2, GSK-3 ir GPx), priešuždegiminį (branduolinis faktorius-κ (NF-κ), naviko nekrozės faktorius (TNF-), interleukinas-1 (IL-1), kraujagyslių ląstelių augimo faktorius (VEGF), į rinkliavas panašus receptorius-4 (TLR-4)) , ir kraujagyslių uždegimas (intracelulinė adhezijos molekulė (ICAM), kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulė (VCAM), EDN1 ir endotelio azoto oksido sintazės (eNOS)) susiję genai ir etaloninis genas -aktinas buvo išanalizuoti HUVEC ir kiekybiškai įvertinti metodu. Yuan ir kt. [29]. Amplifikacijos vertės (∆Ct) buvo apskaičiuotos pagal skirtumą tarp Ct (apdorotas) ir Ct (kontrolė). Genų ekspresija buvo pavaizduota naudojant 2−∆∆Ct reikšmės išraišką.

2.11. Statistinė analizė Visi eksperimentai buvo atlikti tris kartus, o gauti duomenys buvo išreikšti kaip vidutinės vertės ± standartinis nuokrypis (SD). Statistinė skirtumų tarp grupių analizė atlikta taikant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), naudojant SPSS programinę įrangą (28.5 versija, SAS Institute Inc., Cary, NC, JAV). Tada, jei buvo rasta reikšmingų skirtumų, buvo atliktas daugkartinis Tukey palyginimo testas. Visi rezultatai buvo pateikti kaip šešių pakartojimų kiekvienoje grupėje vidurkis ± SD. P reikšmė < 0,05="" buvo="" laikoma="" reikšminga="">

Cistanche imunitetui gerinti

3. Rezultatai

3.1. Bioaktyvios BPME molekulės Cheminės BPME sudedamosios dalys buvo patvirtintos naudojant GC-MS (Turbomass, PerkinElmer). Burokėlių žievelės ekstrakto cheminė sudėtis buvo nustatyta lyginant turimus masės spektrus su Nacionalinio standartų ir technologijos instituto (NIST) spektrų duomenų baze. GC-MS rezultatai patvirtino, kad BPME sudėtyje yra hidroksiacetono (8,18 proc.), 5-hidroksimetilfurfurolo (32,6 proc.), metilpiruvato (15,13 proc.), beta-d-alopiranozės (1,48 proc.), furfurolo (9,98 proc.), 2-hidroksi-gama-butirolaktonas (1,32 proc.) ir 2,3-dihidro-3,5-dihidroksi- 6-metil-4H-piranas -4-vienas (12,4 proc. ; 2a pav., 1 lentelė). 3.2. Ląstelių dauginimasis BPME ląstelių dauginimosi potencialas prieš HUVEC parodytas 2b paveiksle. Eksperimentinėse grupėse, palyginti su nešiklio kontrole, reikšmingo ląstelių augimo slopinimo nepastebėta. Šis tyrimas patvirtino, kad padidinus HUVEC gydytų BPME koncentraciją, po 48 valandų (112 proc.) padidėjo ląstelių proliferacija ir gyvybingumas, palyginti su 24 val. (1{51}}3 proc.) gydymo. Be to, šviesos mikroskopiniai BPME apdorotų HUVEC vaizdai po 48 valandų patvirtino normalias ląsteles, turinčias vienodą prilipusios ląstelių morfologijos formą, buvo akivaizdus padidėjęs proliferuojančių (replikacijos) ląstelių skaičius be jokios žalos (2c pav.). 3.3. Ląstelių ir branduolių morfologijos, mikrotubulių formavimosi ir JC-1 dažymo HUVEC analizė 3 paveiksle parodyta mikrotubulių vystymosi morfologija FL fluorescenciniuose mikroskopiniuose vaizduose. H2O2-sukelti oksidacinio streso paveikti HUVEC, palyginti su kontroliniais HUVEC, prilipusių ląstelių proliferacija ir netaisyklinga morfologija. Įprasti HUVEC, apdoroti 0,2 µg/mL BPME, parodė, kad ląstelės dauginasi per replikaciją arba neogenezę su mikrotubulų morfologija. Tuo tarpu 0.1 µg/mL BPME apdorotų ląstelių dozė parodė 100 procentų prilipusių ląstelių su ankstyvomis mikrotubulių stadijomis. Oksidacinio streso paveikti HUVEC, apdoroti 0, 2 µg / ml BPME, nustatė, kad daugėja naujų ląstelių, turinčių mikrotubulų morfologiją ir sumažintą oksidacinį ląstelių pažeidimą. Be to, 0, 1 µg / ml BPME taip pat padidino normalią kraujagyslių ląstelių morfologiją su proliferuojančiomis ląstelėmis.

4a paveiksle parodyta normali sferinės formos branduolinės struktūros morfologija kontroliniuose ir BPME (0.1 arba 0.2 µg/mL) apdorotuose HUVEC. 4b paveiksle pavaizduoti normalių ir HUVEC PI dažymo vaizdai su oksidaciniu stresu, kurį sukelia H2O2. H2O{{10}}apdoroti HUVEC rodo netaisyklingos formos branduolius, po 30 min. atsiranda kondensatas ir piknozė. Tačiau 0,2 µg/mL BPME gydant HUVEC, esant oksidaciniam stresui, buvo apvalūs normalios morfologijos branduoliai. Palyginti su 0,2 µg/mL BPME ekstrakto, 0,1 µg/mL BPME turėjo mažesnį apsauginį poveikį nuo H2O2- sukelto oksidacinio streso HUVEC.

2 pav. Burokėlių žievelės metanolio ekstrakto (a) GC-MS chromatogramos, ląstelių proliferacijos in vitro (b) ir šviesos mikroskopijos vaizdų, skirtų ląstelių morfologijai (c) nustatyti HUVEC, apdoroti didėjančia burokėlių žievelės metanolio ekstrakto (BPME) koncentracija. ) (vienoda prilipusių ir dauginančių ląstelių forma, minima raudona rodyklės antgaliu). Visos reikšmės yra vidurkiai ± SD (n=6). * p Mažesnis arba lygus 0.05, palyginti su transporto priemonės valdymu.

3 pav. Mikrovamzdelių susidarymo analizė, pagrįsta fluorescencine mikroskopu nešiklio kontrolėje, 0,1 ir 0,2 µg/mL burokėlių žievelės metanolio ekstrakto (BPME) dozės, apdorotos normaliu ir H2O{{6} }sukelti oksidacinio streso paveikti HUVEC po 48 val. Po 48 valandų H2O2-sukelti oksidacinio streso paveikti HUVEC, palyginti su nešiklio kontrole, morfologija pasikeitė. 0.1 ir 0.2 µg/mL burokėlių žievelės metanolio ekstraktu (BPME) apdorotų HUVEC morfologiniai rodikliai buvo normalūs su kraujagyslių mikrotubuliais su proliferuojančiomis ląstelėmis, panašiomis į įprastą lygiųjų raumenų ląstelių elgesio morfologiją.

4 pav. Propidžio jodido (PI) dažymo analizė branduolio morfologijai tiriant nešiklio kontrolę, 0,1 ir 0,2 µg/mL burokėlių žievelės metanolio ekstrakto (BPME) apdoroto normalaus (3a) ir H2O2-sukelti oksidacinio streso (3b) HUVEC po 48 val. Atliekant PI dažymą, nešiklio kontrolė parodė, kad branduolys buvo normalus, be susitraukimo, piknozės ar apoptozinio branduolio požymių. Vien H2O2 apdorotose ląstelėse po 48 valandų buvo poliarizuota branduolinė membrana. Gydymas 0,2 µg/mL BPME normalizavo H2O2- sukeltą branduolinės membranos poliarizaciją, palyginti su 0,1 µg/mL BPME arba 10 µM kvercetinu.

5a paveiksle parodyti HUVEC, įskaitant kontrolines ir BPME apdorotas ląsteles, JC-1 dažymo rezultatai; paveiksle pavaizduotos sveikos ląstelės su aktyviomis mitochondrijomis, ką patvirtina ekstramitochondrijų lipofilinio katijoninio JC-1 (žalios spalvos) ir J agregatų, paverčiamų raudona spalva, neigiamai įkrautos mitochondrijos. 5b paveiksle pavaizduoti JC-1 dažymo rezultatai 0.2 µg/mL BPME, suleidžiamo HUVEC su oksidaciniu stresu, kurį sukelia H2O2; rezultatai patvirtino, kad beveik 94 procentai neigiamo krūvio mitochondrijų lipofilinį katijoninį JC-1 (žalia spalva) pavertė raudonos spalvos J agregatais, palyginti su 0.1 µg/mL BPME (61,4 proc.) arba H2O{{20}}sukeltas oksidacinis stresas HUVEC (2 proc.). Pastebėta, kad BPME apdorotose ląstelėse mitochondrijų membranos potencialas (MMP) yra didesnis, palyginti su etaloniniu vaistu kvercetinu. 3.4. FACS padedamo mitochondrijų membranos potencialo (∆ψm; BD MitoScan) ir aneksino V / apoptozės analizė HUVEC 6 paveiksle parodytas mitochondrijų membranos potencialo pajėgumas BD MitoScan analizėje po 0.2 µg/mL BPME gydymo normaliais HUVEC ir HUVEC su oksidaciniu stresu, kurį sukelia H2O2. Mes nustatėme, kad 0,2 µg/mL BPME padidino MMP (∆ψm) iki 92,7 proc. ± 3,7 proc., palyginti su HUVEC, gydytais vien H2O2 (27,9 proc. ± 7,2 proc.). Priešingai, kvercetinu apdorotose ląstelėse MMP (∆ψm) padidėjo 41,4 procento ± 1,6 procento, palyginti su HUVEC, apdorotais BPME ir H2O2 arba vien H2O2.

5 pav. Mitochondrijų membranos potencialo analizė naudojant JC-1 dažymą nešiklio kontrolei, 0,1 ir 0,2 µg/mL burokėlių žievelės metanolio ekstrakto (BPME), apdoroto normaliu (a ) ir H2O2-sukelti oksidacinio streso (b) HUVEC po 48 val. JC{{10}}fluorescenciniai vaizdai, kuriuose rodomi sujungti dažų raudono ir žalio signalo vaizdai, atitinkantys JC-1 J agregatuose ir monomerinėje formoje. Mes nustatėme mažiau J-agregatų, vien H2O2 apdorotų HUVEC. 0.2 µg/mL BPME apdorotuose HUVEC, kuriuose rodomi dideli j agregatai, tiesiogiai atspindintys (didelis MMP, ∆ψm) didelį mitochondrijų membranos potencialą, palyginti su 0,1 µg/mL BPME arba 10 µM kvercetino.

4. Diskusija

Esant ekstraląsteliniam ar intraceluliniam stresui, reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) biologinis prieinamumas pranoksta antioksidacinę apsaugą, o oksidacinis stresas sutrikdo redokso signalizaciją ir kontrolę [31]. Oksidacinio streso išsivystymas yra susijęs su lėtinių sutrikimų, tokių kaip neurodegeneracinės ligos, diabetas ir aterosklerozė, patogenezėmis. Pavyzdžiui, oksidacinis stresas sukelia endotelio disfunkciją ir skatina sisteminį uždegimą bei makrofagų prisitraukimą [32]. Suaktyvintos imuninės ląstelės migruoja į kraujagysles ir išskiria citokinus ir chemokinus, susijusius su kraujagyslių susiaurėjimu ir lygiųjų raumenų ląstelių kraujagyslių remodeliavimu bei uždegimu, paveikiančiu kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles ir kraujagyslių sienelę [33]. Padidėjęs kraujagyslių oksidacinis stresas baigiasi kraujagyslių pažeidimu, lygiųjų raumenų ląstelių standumu ir struktūriniais elastino sutrikimais. Be to, kraujagyslių oksidacinis stresas buvo skatinamas sergant kitomis patologinėmis sąlygomis, tokiomis kaip visceralinis nutukimas ar aterosklerozė, dėl padidėjusio NADPH oksidazės (NOX-2) aktyvumo perivaskuliniame riebaliniame audinyje [34]. Kraujagyslių oksidacinis stresas sukelia pagrindinius epigenetinius pokyčius, atsirandančius senėjimo metu ir baigiasi ankstyvu senėjimo procesu [35]. ROS gamybos ir oksidacinio streso vystymasis biologinėje sistemoje labai priklauso nuo mitochondrijų disfunkcijos, be NOX-2, endotelio ksantino oksidazės, atsietos eNOS ir lipoksigenazės [36]. Maistinių medžiagų antioksidacinės savybės gali neutralizuoti ROS susidarymą padidindamos antioksidacinį pajėgumą [26]. Ginkmedžio ekstraktas apsaugo nuo aterosklerozės išsivystymo sumažindamas ROS susidarymą ir lipoksigenazės aktyvumą esant OxiLDL sukeltai endotelio disfunkcijai [37]. Be to, įvairūs fenoliniai junginiai irflavonoidų išvalgomieji augalai ir grūdai turi savybę pašalinti ROS ir lipidų peroksidaciją [38]. Burokėlių žievelės (Beta vulgaris) metanolinis ekstraktas turi antioksidacinį potencialą, nes jame yra daug skaidulų, antocianinų ir flavonoidų, tokių kaip viteksinas ir betaninas [39]. Šiame tyrime BPME buvo pasirinktas siekiant nustatyti nuo mitochondrijų priklausomą mechaninį metodą, siekiant išsiaiškinti jo poveikį mitochondrijų membranos potencialui, LPO gesinimui ir su kraujagyslių uždegimu susijusių mRNR ekspresijos lygių slopinimui. MTT tyrimas patvirtino, kad BPME reikšmingai padidino ląstelių proliferaciją, ką patvirtino padidėjęs branduolio vientisumas dažant PI naudojant efektyvią 0,2 µg/mL BPME dozę, palyginti su ištirta 0,1 µg/mL BPME. Mažos koncentracijos ir didžiausio aktyvumo veiksmingos dozės nustatymas gali būti laikomas fiziologiškai saugiu. Mes nustatėme FL fluorescencinį mikroskopinį JC-1 dažymą, o mitochondrijų membranos potencialas buvo atkurtas tiek normalioje, tiek H2O{{10}} sukeltame išoriškai stimuliuojamuose oksidacinio streso paveiktuose HUVEC po 0,2 µg/mL BPME. gydymas. Mitochondrijų disfunkcija pakeičia oksidacinį fosforilinimą, kuris glutationo peroksidaze nepaverčia deguonies (O2·−) radikalų į H2O2 ir H2O. Dėl nepakankamos ROS detoksikacijos arba nekontroliuojamos ROS gamybos, padidėjęs mitochondrijų oksidacinis stresas yra susijęs su ateroskleroze [40]. Burokėlių žievelės ekstraktai efektyviai atkūrė mitochondrijų membranos potencialą, kas sėkmingai padidino ROS detoksikaciją ir H2O2 susidarymą. Aneksino V / PI dažymo analizė patvirtino, kad gydymas BPME palaikė gyvybingų ląstelių procentą ir padidino ląstelių proliferacijos stadiją tiek normaliuose HUVEC, tiek HUVEC, kurių oksidacinis stresas sukėlė H2O2. Šiame kontekste Choo ir kt. [41] patvirtino, kad išeminėje vietoje susidarius per dideliam ROS arba egzogeniniam H2O2, persodintos mezenchiminės kamieninės ląstelės (MSC) gali pakenkti savaiminiam proliferacijai ir daugialypėms linijoms. Regeneracinėje medicinoje kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelės yra pagrindiniai susitraukimo tonuso arterijų reguliatoriai, palaikydami arterijų periferinį pasipriešinimą, kraujospūdžio reguliatorius, kraujo kolegą ir arterijų taisymą [42]. Be to, amžiaus sukeltas EC fenotipo moduliavimas yra susijęs su sumažėjusiu ląstelių susitraukimu ir padidėjusiu ląstelių senėjimu. Esant nuolatiniam stresui arba dėl sumažėjusio mechaninio jautrumo, senstančiose lygiųjų raumenų ląstelėse nustatomas sumažėjęs mikroaplinkos signalų prisitaikymas [43]. Šie rezultatai patvirtino, kad gydymas BPME išlaikė gyvybingų ląstelių populiaciją, kaip rodo angiogenezės pajėgumas. Nustatytas BPME proliferacijos pajėgumas HUVEC buvo paremtas LPO ekspresijos sumažėjimu ir padidėjusia antioksidantų genų ekspresija. ROS ir LPO iš pradžių susidaro iš mitochondrijų komplekso (I ir III) ir NOX-4 ląstelių proliferacijos arba diferenciacijos metu [44]. Pernelyg didelis ROS kiekis reaguoja ir pažeidžia biomolekules, ypač pakeisdamas genominės DNR vientisumą, kuris yra labai svarbus ląstelių dauginimuisi ir funkcijoms [45]. Tačiau buvo patvirtinta, kad antioksidantų polifenolių, tokių kaip epigalokatechinas ir tokoferolis, suvartojimas su maistu apsaugo ląsteles nuo oksidacinio streso ir padidina proliferacijos pajėgumą [46]. Mūsų tyrime sumažėjo LPO mRNR ekspresijos lygiai, o NOS-3, Nrf-2 ir eNOS padidėjo dvigubai HUVEC, turint oksidacinį stresą, kurį sukelia H2O2. eNOS yra vyraujanti NOS izoforma, atsakinga už daugumą NO · produktų lygiųjų raumenų ląstelėse ir kraujagyslių audiniuose. NO · plečia visų tipų kraujagysles ir apsaugo nuo trombocitų agregacijos bei leukocitų adhezijos EC [47]. Iki šiol buvo gauta daug prieštaringų pranešimų apie širdies ir kraujagyslių sistemos rizikos veiksnius, o endotelio disfunkcija buvo susijusi su sumažėjusia arba padidėjusia eNOS ekspresija [48]. Padidėjusi eNOS ekspresija pastebėta sergant kraujagyslių ligomis, kuri greičiausiai yra per didelės H2O2 gamybos pasekmė. O2·−, dismutacijos produktas, gali padidinti eNOS ekspresiją per transkripcijos ir potranskripcijos mechanizmus [49]. Kraujagyslių ligos patogenezę lydi pagreitėjęs NO· irimas po reakcijos su O2·− ir galiausiai ONOO− forma, dėl kurios atsiranda eNOS atsijungimas ir NOX fermento disfunkcija [50]. Oksidacinis stresas buvo slopinamas antioksidantų fermentų, o po gydymo BPME padidėjo GSK-3 ir GPX mRNR lygis. BPME sudėtyje yra daug biologiškai aktyvių fitocheminių medžiagų, įskaitant betalainus, flavonoidus, polifenolius, gydomuosius fermentus, askorbo rūgštį, dehidroaskorbo rūgštį (DHAA) ir neorganinį nitratą (NO3), ir jie gali būti susiję su HUVEC antioksidacinio pajėgumo reguliavimu. Šiame kontekste Cha ir kt. (2014) [51] pranešė, kad chlorogeno rūgštis veiksmingai apsaugo nuo oksidacinio streso sukeltos DNR pažeidimo žmogaus keratinocituose. Endotelinas -1 (Edn-1), iš endotelio gautas vazokonstriktorius, vykdo lygiųjų raumenų ląstelių migraciją ir veikia kaip antiapoptotinis faktorius ląstelėse, patiriančiose azoto oksido sukeltą stresą [52,53]. Kraujagyslių remodeliavimosi, migracijos, proliferacijos ir ekstraląstelinės matricos kaupimosi procesus stimuliavo ir Edn{60}}, ir NO [54,55]. Stebėjome padidėjusią Edn-1 ekspresiją po gydymo BPME HUVEC, turintiems oksidacinį stresą. Esant oksidaciniam stresui arba LPO kaupimuisi, ankstyvoji kraujagyslių uždegimo stadija yra leukocitų sukibimas su endotelio lygiųjų raumenų ląstelėmis, jis yra ryškus kritiniams išemijos ir aterosklerozės įvykiams [56]. Tai tarpininkauja VCAM ir ICAM išraiškos; jį stimuliavo daugelis chemokinų ir chemotaksinių medžiagų, tokių kaip NF-κB, IL-1 ir TNF ekspresijos [57]. IL-1 aktyvacijos, o po to adhezijos molekulės ekspresijos slopinimas buvo pasiektas naudojant dietinį fenolio junginį ellago rūgštį [58]. Išoriškai stimuliuojamų HUVEC, turinčių oksidacinį stresą, gydymas BPME žymiai sumažino kraujagyslių ląstelėms būdingus priešuždegiminius veiksnius, tokius kaip VCAM, ICAM, NF-κB, IL-1 ir TNF ekspresijos lygiai. Šiame kontekste Crespo ir kt. [59] pranešė, kad kaempferolis ir kvercetinas slopino priešuždegiminius genus, tokius kaip VCAM, ICAM, NF-κB ir IL-1 ekspresija. Apskritai BPME oksidacinio streso ir su kraujagyslių uždegimu susijusio genų ekspresijos potencialo slopinimas paskatino kraujagyslių ląstelių augimo faktorių ekspresiją ir galbūt padėjo kraujagyslių ląstelių proliferacijai ir augimui.

5. Išvados

Šios išvados patvirtina, kad padidėjusi antioksidantų genų ekspresija buvo susijusi su oksidacinio streso slopinimu, padedančiu įveikti HUVEC proliferacijos ir angiogenezės sutrikimus. Juodasis česnakas, kurio sudėtyje yra hidroksimetilfurfurolo, slopina uždegiminį TNF sukeltų monocitų ląstelių adhezijos prie HUVEC poveikį ir toliau slopina ROS susidarymą, VCAM{1}} ekspresiją ir NF-κB aktyvaciją [60]. Be to, He ir kt. [61] patvirtino, kad hidroksimetilfurfurolis gali apsaugoti EC nuo hipoksijos. Taip pat nustatyta, kad burokėlių žievelės sudėtyje yra flavonoidų, furano ir antioksidantų komponentų, tokių kaip 5-hidroksimetilfurfurolas, metilpiruvatas, furfurolas ir 2,3-dihidro-3,5- dihidroksi-6-metil-4H-piran-4-onas; šie komponentai yra atsakingi už sustiprintą antioksidacinį pajėgumą ir priešuždegiminių kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelių adhezijos molekulių slopinimą. Burokėlių žievelės buvo naudojamos kaip antioksidantų telkinių stimuliatorius, numalšinantis išorinį arba vidinį patologinį peroksidacinio ląstelių streso dirgiklį. Mūsų išvados parodė, kad burokėlių komponentai padeda sumažinti metabolinį stresą ir uždegimą HUVEC, o tai gali būti naudinga kraujagyslių ląstelių proliferacijai ir angiogenezei.

Autoriaus indėlis:

Konceptualizacija, LNA-H. ir S.-BP; metodika, LNA-H. ir S.-BP; programinė įranga, GS; patvirtinimas, LNA-H. ir S.-BP; formali analizė, S.-BP, AMA-D., AAA (Ali A Alshatwi) ir GS; tyrimas, LNA-H., S.-BP ir AMA-D.; ištekliai, LNA-H.; duomenų tvarkymas, S.-BP ir LNA-H.; rašymas-pirmalio projekto rengimas, LNA-H. ir S.-BP; rašymas – peržiūra ir redagavimas, LNA-H., AMS, GS ir AAA (Amna Abdullah Alotiby); vizualizacija, S.-BPand AAA (Ali A Alshatwi); priežiūra, LNA-H. ir S.-BP; projektų administravimas, LNA-H.; finansavimo įsigijimas, LNA-H. Visi autoriai perskaitė ir sutiko su paskelbta rankraščio versija. Finansavimas: autoriai dėkoja King Saudo universiteto Mokslinių tyrimų dekanatui už šio darbo finansavimą per tyrimų grupę Nr. RG-1442-432. Institucinės peržiūros tarybos pareiškimas: netaikomas. Informuotas sutikimo pareiškimas: netaikomas. Duomenų prieinamumo pareiškimas : Šiame tyrime pateiktus duomenis galima gauti atitinkamo autoriaus prašymu. Interesų konfliktai: Šiame tyrime nėra interesų konflikto.

Nuorodos

1. Abdolmaleki, Z.; Arabas, H.-A.; Amanpour, S.; Muhammadnejad, S. Antiangiogeninis Artemisia sieberi etanolinio ekstrakto poveikis, palyginti su jo veikliąja medžiaga artemizininu. Rev Bras. Farmacogn. 2016, 26, 326–333. [CrossRef]
2. Yoo, SY; Kwon, SM Angiogenezė ir jos terapinės galimybės. Mediat. Uždegimas. 2013, 2013, 127170. [CrossRef] [PubMed]
3. Folkman, J. Angiogenezė sergant vėžiu, kraujagyslių, reumatoidinėmis ir kitomis ligomis. Nat. Med. 1995, 1, 27–31. [CrossRef]
4. Hoebenas, A.; Landuitas, B.; Highley, MS; Wildiers, H.; Van Oosteromas, AT; De Bruijn, EA Kraujagyslių endotelio augimo faktorius ir angiogenezė. Pharmacol. Rev. 2004, 56, 549–580. [CrossRef]
5. Ferara, N.; Alitalo, K. Angiogeninių augimo faktorių ir jų inhibitorių klinikiniai pritaikymai. Nat. Med. 1999, 5, 1359–1364. [CrossRef]
6. Galley, HF; Webster, NR Endotelio fiziologija. Br. J. Anaesth. 2004, 93, 105–113. [CrossRef]
7. Onat, D.; Brilonas, D.; Kolombas, kompiuteris; Schmidt, AM Žmogaus kraujagyslių endotelio ląstelės: modelio sistema kraujagyslių uždegimui tirti sergant diabetu ir ateroskleroze. Curr. Diabetas Rep. 2011, 11, 193–202. [CrossRef] [PubMed]
8. Packard, RR; Libby, P. Aterosklerozės uždegimas: nuo kraujagyslių biologijos iki biomarkerio atradimo ir rizikos numatymo. Clin. Chem. 2008, 54, 24–38. [CrossRef]
9. Esperas, RJ; Nordby, RA; Vilariño, JO; Paragano, A.; Cacharrón, JL; Machado, RA Endotelio disfunkcija: išsamus įvertinimas. Širdies ir kraujagyslių. Diabetolis. 2006, 5, 4. [CrossRef]
10. Baudinas, B.; Bruneel, A.; Bosselut, N.; Vaubourdolle, M. Žmogaus bambos venų endotelio ląstelių išskyrimo ir kultivavimo protokolas. Nat. Protok. 2007, 2, 481–485. [CrossRef] [PubMed]
11. Cao, Y.; Cao, R. Angiogenezę slopina arbatos gėrimas. Nature 1999, 398, 381. [CrossRef] [PubMed]
12. Yen, G.-C.; Duh, P.-D.; Tsai, H.-L. Askorbo rūgšties ir galo rūgšties antioksidacinės ir prooksidacinės savybės. Food Chem. 2002, 79, 307–313. [CrossRef]
13. Dalaria, R.; Verma, R.; Kumaras, D.; Puri, S.; Tapwal, A.; Kumaras, V.; Nepovimova, E.; Kuca, K. Bioaktyvūs valgomųjų vaisių junginiai su jų senėjimą stabdančiomis savybėmis: išsami apžvalga, skirta prailginti žmogaus gyvenimą. Antioksidantai, 2020, 9, 1123. [CrossRef] [PubMed]
14. Baião, DdS; da Silva, D.; Del Aguila, EM; Paschoalin, VMF Įvairių burokėlių formų maistinės, bioaktyvios ir fizikinės bei cheminės savybės. Maisto priklausomas. 2017, 6. [CrossRef]
15. Lalonde, R.; Roitberg, B. Apie poravimosi elgesio raidą medžiuose: plėšrūnas ar oras? Esu. Nat. 1992, 139, 6. [CrossRef]
16. Silva, D.; Baiao, DDS; Ferreira, VF; Paschoalin, VMF Betaninas kaip daugialypis oksidacinio streso ir uždegimo moduliatorius: burokėlių pigmentas, turintis apsauginį poveikį širdies ir kraujagyslių ligų patogenezei. Krit. Rev. Food Sci. Nutr. 2020, 1–16. [CrossRef]
17. Baiao, DDS; Silva, D.; Paschoalin, VMF Nuostabi daržovė: jos nitratų ir fitocheminių medžiagų kiekis gali būti koreguojamas naujose formulėse, kad būtų naudinga sveikatai ir paremti širdies ir kraujagyslių ligų gydymą. Antioksidantai, 2020, 9, 960. [CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar, EA; Hegazi, NM; Saad, HH; Soliman, MM; El-Raey, MA; Šehata, SM; Barakatas, A.; Jasiras, A.; Sobeh, M. HPLC-ESI- MS/MS burokėlių (Beta vulgaris) lapų ir jo naudingų savybių analizė 1 tipo cukriniu diabetu sergančioms žiurkėms. Biomed. Pharmacother. 2019, 120, 109541. [CrossRef]
19. Singhas, B.; Nathan, BS Burokėlių cheminė sudėtis, funkcinės savybės ir apdorojimas – apžvalga. Tarpt. J. Sci. inž. Res. 2014, 5, 679.
20. Ninfali, P.; Angelino, D. Beta vulgaris cicla ir rubra mitybos ir funkcinis potencialas. Fitoterapija 2013, 89, 188–199. [CrossRef]