Trumpas sevoflurano įkvėpimas gali sumažinti glialinių randų susidarymą po naujagimių žiurkių hipoksinio išeminio smegenų pažeidimo 2 dalis

Realaus laiko PGR

Bendra RNR buvo išskirta iš jauniklių hipokampo audinių praėjus 12, 24 ir 48 valandoms po operacijos naudojant TRIzolreagentą (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV). Papildoma DNR buvo susintetinta naudojant pažangų Superscript II RT-PCR rinkinį (Invitrogen).

Hipoksinis-išeminis pažeidimas reiškia patologinę būseną, kurią sukelia smegenų išemija, hipoksija, medžiagų apykaitos sutrikimas ir nervų ląstelių pažeidimas dėl širdies ir kraujagyslių bei smegenų kraujagyslių sistemos sutrikimų. Su socialine pažanga ir gyvenimo būdo pokyčiais, hipoksinis-išeminis pažeidimas tampa vis dažnesnis. Ši būklė gali padaryti daug žalos žmonių sveikatai, įskaitant intelektą ir atmintį.

Nors hipoksija ir išemija gali sukelti smegenų funkcijos pablogėjimą, tai nereiškia, kad atmintis bus neigiamai paveikta. Priešingai, tinkamais metodais galime pagerinti atmintį ir padidinti smegenų efektyvumą. Štai keletas būdų, kaip pagerinti atmintį:

1. Sveika mityba: dietos įtaka atminčiai yra labai svarbi. Maistas, kuriame gausu baltymų, vitaminų ir mineralų, gali padėti palaikyti sveiką nervų sistemą ir mąstymo funkciją.

2. Daugiau mankštinkitės: fiziniai pratimai gali skatinti kraujotaką, padidinti deguonies srautą, sustiprinti organizmo imunitetą ir sumažinti ligų riziką. Atlikdami pratimus galite pagerinti savo atmintį.

3. Stiprinti pasitikėjimą savimi: pasitikėjimas yra svarbus veiksnys žmogaus atmintyje. Jei tikėsite, kad galite atlikti tam tikrą užduotį, nesunkiai pasieksite norimų rezultatų, taip pat galėsite efektyviai pagerinti atmintį.

Matyti, kad hipoksinis-išeminis pažeidimas nėra būklė, kuri neišvengiamai pakenks žmogaus atminčiai. Kol įvaldome teisingus metodus ir gerai rūpinamės savo smegenimis, sveiką ateitį galime priimti pozityviai. Matyti, kad turime gerinti atmintį, o Cistanche deserticola gali žymiai pagerinti atmintį, nes Cistanche deserticola turi antioksidacinį, priešuždegiminį ir senėjimą stabdantį poveikį, kuris gali padėti sumažinti oksidaciją ir uždegimines reakcijas smegenyse ir taip apsaugoti nervų sistemos sveikata. Be to, Cistanche deserticola taip pat gali skatinti nervų ląstelių augimą ir taisymą, taip pagerindama neuroninių tinklų ryšį ir funkciją. Šis poveikis gali padėti pagerinti atmintį, mokymąsi ir mąstymo greitį, taip pat gali užkirsti kelią pažinimo sutrikimų ir neurodegeneracinių ligų vystymuisi.

Spustelėkite žinokite būdus, kaip pagerinti smegenų veiklą

Fluorescenciniai SYBR Green I dažai (SYBR Green PCRMaster Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV) ir 1 μL atvirkštinės transkribuotos papildomos DNR buvo naudojami DNR sintezei aptikti realiuoju laiku naudojant PGR naudojant specifinius HIF{2} pradmenis.

Rotoriaus geno realaus laiko DNR amplifikacijos sistemoje (Corbett Research, Sidnėjus, Australija) PGR buvo atlikta šiais ciklais: denatūravimas 95 laipsnių temperatūroje 15 minučių; 40 ciklų 95 laipsnių (20 sekundžių), atkaitinimas 58 laipsnių temperatūroje 25 sekundes. ir patraukite žemyn 72 laipsnių kampu 35 sekundes. Fluorescencinio produkto stebėjimas buvo atliktas ilgą laiką 72 laipsnių temperatūroje.

Rotoriaus genų analizės programinė įranga (Corbett Research) buvo naudojama namų tvarkymo genui GAPDH standartizuoti ir santykinei genų ekspresijai nustatyti. Visos pradmenų sekos parodytos 1 lentelėje.

Nissl dažymas
Žiurkių smegenys buvo paruoštos griežinėliais praėjus 28 dienoms po operacijos, kaip aprašyta aukščiau imunohistochemijai. Kiekviena smegenys buvo išpjautos iš eilės, o Nissl dažymui buvo atrinktos trys panašios smegenų dalys.

Naudojant Nikon C1 skaitmeninę mikroskopo kamerą (Nikon Corporation, Tokijas, Japonija), buvo užfiksuotos tipinės hipokampo CA1, CA3 ir DGareas mikrofotografijos. Kelios ląstelės, suskaičiuotos kiekvienoje iš trijų sekcijų, buvo atliktos aklu būdu, naudojant „ImageJ“ programinę įrangą.

Elgesio testai

Žiurkės buvo nujunkytos 3 savaites, suskirstytos į tris–penkias grupes ir laikomos narvuose pagal grupės priskyrimą. Kaip aprašyta anksčiau, P28–P33 (ty praėjus 21–26 dienoms po operacijos) žiurkėms buvo atlikti elgsenos testai (Wang ir kt., 2019a). ), bet su nedideliais pakeitimais. Siekiant atmesti estrinio ciklo įtaką graužikų elgesiui, buvo išbandyti tik žiurkių patinai.

Morriso vandens labirintas

Morriso vandens labirinto bandymai buvo naudojami P28–P33 žiurkių erdvinio mokymosi ir atminties gebėjimams įvertinti (Wang ir kt., 2019a).

Testavimą sudarė du etapai, įskaitant mokymo skyrių ir erdvinės paieškos testą. 5 dienas iš eilės kasdien buvo vykdomos keturios treniruočių sekcijos, pradedant 8:00val. Platformos aptikimo bandymams 10 žiurkių iš kiekvienos grupės buvo atskirai įdėtos į vandenį įvairiose vietose, stochastiškai, atsuktos į baseino sieną.

Jei žiurkė sėkmingai aptiko platformą per 90 sekundžių, ji buvo priversta likti ant platformos 20 sekundžių, o laikas, per kurį platforma buvo aptikta, buvo įrašytas kaip pabėgimo delsa. Kiekvienas bandymo ciklas truko 90 sekundžių, o pabėgimo delsa buvo matuojama kaip laikas nuo žiurkės padėjimo į vandenį iki sėkmingo įlipimo į platformą.

Jei žiurkei nepavyko rasti platformos per 90 sekundžių, įrašymas buvo sustabdytas, buvo vykdomas mokymasis ir atminties nurodymai (eksperimentuotojas naudojo ilgą strypą, kad nukreiptų žiurkę į platformą ir leido jai likti platformoje 20 sekundžių, kad galėtų mokytis). Bandymo metu žiurkių, kurios nepateko į sceną, pabėgimo delsa buvo užfiksuota kaip 90 sekundžių.

Atliekant erdvinio zondo testą, atliktą šeštąją bandymo dieną, platforma buvo pašalinta, žiurkė paguldyta į priešingą kvadrantą ir leista plaukti 90 sekundžių. Plaukimo greitis, pabėgimo delsa ir kartų, kai jie kirto vietą, kurioje anksčiau buvo platforma, skaičius buvo užfiksuotas vaizdo stebėjimo sistemos (Shanghai MobileDatum Ltd., Šanchajus, Kinija).

Pakabos testas

Suspensijos testas buvo atliktas su P28–P32 žiurkėmis, siekiant įvertinti jų motorinę funkciją, pradedant 15 val. kiekvieną dieną. Horizontali plastikinė virvė, kurios skersmuo 0,5 cm, buvo pastatyta 45 cm atstumu nuo žemės, o žiurkės buvo nukreiptos laikyti plastikinę virvę abiem viršutinėmis galūnėmis, o laikas, kol žiurkė nukrito, buvo matuojamas kaip pakabos delsa.Bandymas baigtas, jei: i) žiurkė pargriuvo; ii) sustabdymo laikas buvo ilgesnis nei 60 sekundžių; arba iii) virvę užkliuvo užpakalinės galūnės.

Atviro lauko bandymas

Atviro lauko bandymai buvo atlikti su P28 žiurkėmis, naudojant lauko įrangą, sudarytą iš plexiglas dėžutės (100 cm × 100 cm; Borj Sanat, Teheranas, Iranas), apsuptos 45- cm aukščio siena, o grindys padalytos į 16 kvadratų. Centrinis plotas buvo 50 cm × 50 cm plotas arenos centre. Kiekviena žiurkė buvo atskirai patalpinta arenos centre ir jai buvo leista be apribojimų tyrinėti 10 minučių.

Vaizdo stebėjimo sistema (Borj Sanat) buvo naudojama norint įrašyti ir analizuoti bendrą programą (kaip mankštos rodiklį) ir laiką, praleistą centrinėje srityje (kaip nerimo elgesio rodiklį) (Zhai etal., 2019).

Golgi dažymas

Atlikus elgsenos testą (ty praėjus 26 dienoms po operacijos), iš kiekvienos grupės atsitiktine tvarka buvo atrinktos penkios žiurkės. Golgi dažymas buvo atliktas 150-μm storio sušaldytose smegenų dalyse, naudojant FD Rapid Golgi dėmių rinkinį (FDNeuroTechnologies, Kolumbija, MD, JAV) pagal gamintojo protokolą.

„ImageJ“ programinė įranga buvo naudojama kiekvieno neurono stuburo tankiui (stuburo skaičius 10 μm) analizuoti. Spygliai buvo suskaičiuoti ant dviejų ar trijų antrinių dendrito segmentų.

Statistinė analizė

Duomenims analizuoti buvo naudojamas SPSS 17.0, skirtas Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, JAV), kurie rodomi kaip vidurkis ± standartinė vidurkio klaida (SEM). Shapiro-Wilk testas buvo naudojamas norint patikrinti visų nuolatinių kintamųjų normalumo prielaidą. Be to, atliekant eksperimentus buvo atlikta vienpusė dispersijos analizė, po kurios buvo atlikti Tukey's post hoc daugkartiniai palyginimo testai.

Jei duomenys neatitiko normalumo prielaidos, Kruskal-Wallis H testas arba Mann-Whitney Utest buvo atliktas atskirai. Pabėgimo delsa buvo analizuojama remiantis dvipuse pasikartojančių matavimų dispersijos analize. P reikšmės < 0,05 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis.

Rezultatai

SPC pagerina hipokampo neuronų ląstelių praradimą

Hipokampas, įskaitant tris ištirtus regionus, yra susijęs su mokymusi ir atmintimi (Jung ir kt., 2020). Po elgsenos bandymų buvo atliktas Nissl dažymas, siekiant ištirti hipokampo architektūrą.

HI grupėje gyvybingų neuronų tankis buvo sumažintas, palyginti su fiktyviąja grupe. Tačiau SPC paveiktuose gyvūnuose neuronų skaičius padidėjo; šį efektą panaikino YC{0}}, kuris sumažino neuronų tankį (1A pav.). Šis reiškinys buvo pastebėtas hipokampo CA1, CA3 ir DG regionuose (P< 0.05; Figure 1B–D).

SPC pagerina ir sumažina dendritinį stuburo tankį hipokampo CA1 srityje

Golgi dažymas buvo naudojamas CA1 piramidės neuronaldendritinio stuburo tankiui nustatyti (2A pav.). Kadangi dyglių dydžiai yra labai įvairūs (pvz., šakoti dendritai, ploni arba grybingi), nustatėme tik tai, kad dendritinių spyglių tankis buvo žymiai didesnis HIS grupėje, palyginti su HI grupe (P < 0). }}5), o dendritinių spygliuočių tankis buvo sumažintas HIS + YC -1 grupėje, palyginti su HIS grupe (P < 0,01; 2B pav.).
SPC pagerina PSD95 ir GAP43 ekspresiją hipokampe

Mes įvertinome su sinapsėmis susijusių baltymų GAP43 ir PSD95 ekspresiją, kad nustatytų, ar juos slopina glialiniai randai. HI reikšmingai sumažino PSD95 (P < 0.01) ir GAP43 (P < 0,05) baltymų ekspresiją, palyginti su fiktyviąja grupe (2C–E pav.). Palyginti su HIS grupe, PSD95 ir GAP43 ekspresijos lygiai po YC{12}}injekcijų buvo žymiai sumažėję.

Astrogliozės ir glijos randų susidarymas pažeidžia hipokampo architektūrą po HI

Toliau bandėme patikrinti, ar sevofluranas pagerino mokymosi ir atminties funkciją, apsaugodamas hipokampo architektūrą ir susilpnindamas astrogliozę. Naujagimių HIE sukelta neuronų apoptozė hipokampe, taip pat reaktyvioji astrogliozė infarkto srityje, kuri vėliau išsivysto į glialinį randą (Rolls ir kt., 2009).

HI grupėje CA1 ir CA3 piramidiniuose sluoksniuose ir DG regione buvo pastebėtas akivaizdus neuronų sumažėjimas (P < 0.01, P < 0.001; 3E ir 4C pav.), taip pat padidėjęs astrocitų su aiškiais morfologiniais pokyčiais skaičius (P < 0,001; 3C ir 4B paveikslai). Mes įvertinome GFAP ir NeuN ekspresiją trijose kairiojo hipokampo srityse, taikydami imunohistocheminę ir Western blot analizę.

Mūsų rezultatai parodė, kad, palyginti su netikra grupe, astrocitai buvo aktyvuoti HI grupėje, įterpti į CA1 (4A pav.) ir CA3 (3A pav.) piramidinį sluoksnį ir apsupti neuronus DG (3B pav.). Pernelyg didelė astrogliozė lėmė tolesnį glijos procesų išplitimą link normalių neuronų struktūrų, sudarant aberrantinį sienelės pavidalo astrocitų tinklą (3A, B ir 4A paveikslai).

Be to, padidėjo GFAP imunoreaktyvumas (3C, D ir 4B, E pav.) ir baltymų kiekis (P < 0.01; 4E pav.), o NeuN imunoreaktyvumas sumažėjo (P < {{7} },01 arba P < 0,001. 3E, F ir 4C paveikslai. Norėdami toliau patikrinti glijos randų susidarymą, įvertinome neurokanproteinų ekspresijos lygį ir imunoreaktyvumą hipokampe (5A, B ir 6A pav.).

Dvigubo žymėjimo imunofluorescencijos rezultatai atskleidė žymius neurocan+/GFAP+ imuninės dažymo fluorescencijos intensyvumo skirtumus tarp HI ir fiktyvių grupių (P < 0.001, P < 0,05, P < 0,01; 5G, H ir 6D paveikslai atitinka Western blot rezultatus (P< 0.01; Figure 6F).

SPC susilpnina astrogliozę ir glijos randų susidarymą hipokampe

Toliau mūsų tyrimas ištyrė, ar SPC susilpnino glijos randų formavimąsi. Palyginti su HI grupe, GFAP (5C, D ir 6C paveikslai) ir neurokano (5E, F ir 6B pav.) imunoreaktyvumas HIS grupėje buvo žymiai sumažintas hipokampe (P < 0). }1 arba P < 0,001).

Priešingai, GFAP ir neurokanų ekspresija HIS + YC-1 grupėje buvo žymiai padidėjusi, palyginti su HIS grupe, ir nesiskyrė nuo HIS + YC-1 ir HI grupių (P > 0.05; 6E ir F pav.).

Be to, NeuN imunopozityvumas buvo padidintas ir struktūros atrodė tvarkingesnės HIS grupėje, palyginti su HI grupe, kurią pakeitė YC -1 (3E, F ir 4C paveikslai).

For more information:1950477648nn@gmail.com