Criporia Lacerata grybienos auginimo terpė kaip nauja senėjimą stabdanti mikrobinė medžiaga, skirta naudoti kosmeceutikoje
Mar 27, 2023
Raktiniai žodžiai:Cistanchelacerata; anti-senėjimo; priešuždegiminisn; antioksidacija; antikolagenazė; filagrino reguliavimas;balinimas; žaizdų gijimas
Spustelėkite čia, kad sužinotumėte, kaip „Cistanche“ veikia odos priežiūrai
1. Įvadas
Be kitų organų, žmogaus oda yra avangardinė sąsaja, nuolat veikiama žalingų išorinių dirgiklių, tokių kaip bendros medžiagų apykaitos reakcijos, kosmetika ir ultravioletinė (UV) spinduliuotė. Dėl šių veiksnių susidaro nepageidaujami biocheminiai šalutiniai produktai, įskaitant reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS), matricos metaloproteinazes (MMP) ir pažangius glikacijos galutinius produktus (AGE), kurie gali paskatinti odos senėjimą, įskaitant raukšles, pigmentaciją ir odos tonuso praradimą.1,2]. ROS, pavojingos deguonies molekulės, kaip pleiotropinio fiziologinio signalo siųstuvas, daugiausia skatina kolageno ir elastino kryžminį ryšį, kad sukeltų raukšles ir sumažintų odos atsigavimą, o tai yra laikoma pagrindine UV spindulių ir taršos sukelto senėjimo jėga.3]. MMP yra fermentai, aktyvuojami veikiant UV spinduliams arba uždegimui, kurie prisideda prie kolageno skaidymo ir slopina naujo kolageno susidarymą.1]. AGE susidaro dėl gliukozės reakcijos su baltymais, įskaitant odos kolageną, o tai gali prisidėti prie elastingumo praradimo, raukšlių, uždegimų, odos ląstelių augimo slopinimo ir paspartėjusio senėjimo.2]. Kadangi oksidacinis stresas yra vienas iš medžiagų apykaitos veiksnių ir kelių, labiausiai susijusių su ląstelių senėjimu, funkcionalaus maisto ir funkcinės kosmetikos, pasižyminčios antioksidaciniu aktyvumu, vartojimas žymiai didėja. Todėl antioksidantai gali būti naudingi žmogaus organizmui, tiesiogiai arba netiesiogiai neutralizuodami ROS, reguliuodami medžiagų apykaitos kelius ir genų ekspresiją kaip pagrindinius ląstelių aktyvinimo mechanizmus. Natūralūs metabolitai, gauti iš mikrobų šaltinių, buvo naudojami įvairiais tikslais kaip mitybos šaltinis ir kaip odos priežiūros priemonė [4]. Tarp jų, iš grybų gaunamuose metabolituose yra didelės komercinės vertės biologiškai aktyvių ingredientų, įskaitant oligosacharidus, egzopolisacharidus (EPS), fermentus, peptidus, vitaminus ir biosurfaktantas. Šie metabolitai plačiai naudojami kaip pagrindinės žaliavos vaistams, funkciniams maisto produktams ir kosmetikos gaminiams (5-9]). Gausu tūkstančiais antioksidantų ir priešuždegiminių savybių, jie buvo plačiai naudojami kovojant su senėjimu gerinant odos būklę. natūralią apsaugą, atkuria odos elastingumą, didina drėgmės kiekį, skatina kolageno sintezę, pasižymi odą balinančiomis savybėmis (4,5) Be to, šie junginiai, pakeičiantys tradicines chemines sudedamąsias dalis, naudojami įvairiuose kosmetikos gaminiuose, skirtuose gerinti sveikatą ir grožį. žmonijai saugiu ir detoksikuojančiu būdu. Visų pirma kosmetikos pramonėje plačiai naudojamas unikalus grybelinės EPS biologinis suderinamumas, netoksiškumas ir funkcionalumas (4). Pavyzdžiui, metaboliniai junginiai, tokie kaip šizofilanas, p{ polisacharidas Yra žinoma, kad iš Schizophyllum commune išgautas {7}},3 P-gliukanas su p-1,6 išsišakojimu padeda sumažinti odos uždegimą ir apsaugo nuo UV spindulių (101. Išskirtas Galactomyces fermentinis filtratas (GFF). iš Galactomycescandidum, siekiant ištirti kosmeceutinį poveikį veido odos porų mažinimui, odos pigmentacijai ir oksidacinio streso mažinimui, o GFF EPS veikimo mechanizmai ir informacija apie jo sudėtį vis dar nenustatyti (11). Cistanche lacerate yra baltojo puvimo siūlinio grybelio tipas, kuris atlieka svarbų vaidmenį bioremediacijoje, skaidydamas celiuliozę ir ligniną (12,13]. C. lacerata micelio bioaktyvus efektyvumas (CLMculture buvo tiriamas siekiant kontroliuoti hiperglikemijos lygį (14)) , insulino sekrecija per citoprotekcinį poveikį (15), o insulino signalizacija aktyvinant AMP aktyvuotą proteinkinazę (AMPK) ir 4 tipo gliukozės transporterį (GLUT4) (16,17. Tačiau farmakologinis CLM poveikis antioksidaciniam ir antioksidaciniam poveikiui -senėjimas dar nežinomas.
KultūringiejiC. laceratasusideda iš mikroskopinių poliporų; taigi jis atrodo kaip baltos samanos (Pav1a). Skystos kultūros proceso metu, priklausomai nuo aplinkos sąlygų, susidaro įvairūs antriniai metabolitai, pvz., egzometabolitai (pav.1b). Tačiau nėra pranešimų apie C. lacerate ar CLM apie su odos priežiūra susijusį poveikį. Todėl šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti CLM antioksidacinį, žaizdų gijimą, raukšlių gerinimą, drėkinimą ir balinamąjį poveikį odos ląstelių senėjimo mechanizmui. Mūsų žiniomis, šis tyrimas yra pirmoji ataskaita, kurioje siūlomas naujas odos priežiūros būdas ląstelių lygmeniu, pagrįstas senėjimą stabdančiu mechanizmu, naudojant antidiabetinius ingredientus, gautus iš besiformuojančio mikroorganizmo CLM kultūros.14–17].
1 pav. Žaliosios gamybos metodasCistanche lacerataegzofarmacinė medžiaga (CLEPS), įskaitant kietąją kultūrą
a) ir tolesnius procesus (b), tokius kaip išankstinė kultūra (i), pagrindinė kultūra (i) ir filtravimas (i).
2.2. Antioksidacinio aktyvumo matavimas2.2.1. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilhidratas (DPPH)
Valymo aktyvumo tyrimas CLEPS laisvųjų radikalų pašalinimo gebėjimas buvo išbandytas DPPH radikalų šalinimo fotometriniu tyrimu pagal metodiką, aprašytą Choi ir kt. (18] ir Kedare et al. (19. CLEPS buvo sumaišytas su 90 mM metanolio DPPH, kad susidarytų galutinės tirpalo koncentracijos 0,5, 1 ir 5 mg/ml {{7} }šulinėlių plokštelės, kurios buvo inkubuojamos 30 min 25 laipsnių temperatūroje, o absorbcija (OD) buvo nuskaityta mikroplokštelių skaitytuvu (Multiskan GOThermofisher Scientific, Waltham, MA, JAV) esant 517 nm bangos ilgiui. Trys nepriklausomi eksperimentai Askorbo rūgštis (AA, 1 mg/mL) buvo naudojama kaip teigiama kontrolė. DPPH slopinimo procentas buvo apskaičiuotas pagal toliau pateiktą formulę: DPPH pašalinimo procentas=kontrolinis A0 - mėginys A1/kontrolė A0] x 100, kur A1 rodo mėginio absorbciją, o A0 – kontrolinio (metanolinio DPPH tirpalo) absorbciją.
2.2.2. 2,2-Azinobis-(3-etilbenzotiazolino sulfonrūgštis) (ABTS)
Radikalų šalinimo aktyvumas CLEPS tirpalų laisvųjų radikalų šalinimo aktyvumas buvo nustatytas ABTS radikalų katijonų spalvos pašalinimo tyrimu pagal metodiką, aprašytą bKedare ir kt. (19]. ABTS katijonų radikalų generavimas buvo atliktas sumaišius 10mg ABTS ir 2 mg kalio persulfato vandenyje. Tirpalas prieš naudojimą buvo dedamas į tamsiai 25 laipsnių temperatūrą apie 12 val. ABTS tirpalas (1) ml) buvo atskiestas 60 ml metanolio, tada CLEPS buvo sumaišytas su 90 uM metanolio ABTS, kad susidarytų galutinės tirpalo koncentracijos 0,5, 1 ir 5 mg/ml 96-šulinėlių plokštelėse. Plokštelės buvo inkubuojamos25 ◦C 30 minučių, o OD buvo matuojamas esant 734 nm bangos ilgiui, naudojant MultiskanGO instrumentas. Buvo atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. Askorbo rūgštis (AA,1 mg/ml) buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. ABTS slopinimo procentas buvo apskaičiuotas pagalvadovaudamiesi žemiau pateikta formule:ABTS valymo procentas {{0}} [kontrolė A0− A1 pavyzdys/kontrolė A0]× 100 kur A1 nurodomėginio absorbcija, o A{0}} rodo kontrolinio (metanolio tirpalo) absorbcijąABTS).
2.3. Ląstelių gyvybingumo tyrimas
su 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS) (WelGENE, Gyeongsan, Korėja) ir 1 procento varposcilinas / streptomicinas (WelGENE, Gyeongsan, Korėja) 37 m.◦C 5 procentų CO2 inkubatorius (UP50H,Forma Scientific, Marietta, OH, JAV). Ląstelės buvo inkubuojamos 7× 104ląstelės / šulinys12-šulinėlįplokštelė. Patvirtinus ląstelių adheziją, ji buvo perkelta į be serumoterpė ir tirpalai buvo apdorojami darbine koncentracija kiekviename šulinyje 72 valandas. Tiazolilo mėlynojo tetrazolio bromido (MTT) (Sigma, St. Louis, MO, JAV) tirpalaskoncentracijaiš 100µg/ml buvo įpilta į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojama 37 °C temperatūroje◦C, 5 procentai CO2 dėl2 val. Tada visa auginimo terpė buvo pašalinta ir 500µL DMSO (Duchefa Biochemicals, Harlemas, Nyderlandai) buvo pridėta į kiekvieną šulinį. Absorbcija ties 570 nm buvomatuojama ELISA skaitytuvu (Epoch, Bio-tek INC, Winooski, VT, JAV). Ląstelių kultūraterpė buvo naudojama kaip neigiama kontrolė (kontrolė (-)).
2.4. Filaggrino išraiškos lygis
Norint parodyti, kaip CLEPS veikia odos barjerinę funkciją, filaggrino mRNR ekspresijos lygis buvo išmatuotas RT-PGR. HaCaT ląstelė buvo kultivuojama esant 2× 104 ląstelių/šulinėlių 24-šulinėlių plokštelėje, naudojant DMEM terpę, kurioje yra 10 proc. FBS, 1 proc. penicilino ir 1 proc. streptomicino, ir tada kultivuojama 37◦C, 5 procentai CO2 inkubatorius 24 val. Pašalinus supernatantą, kiekvienas mėginys buvo dedamas į DMEM terpę, išskyrus FBS, 24 valandas 37 ° C temperatūroje.◦C, 5 procentai CO2 inkubatorius. Po inkubacijos supernatantas buvo pašalintas ir RNR buvo surinkta pagal vadovą, naudojant Easy Blue lizės reagentą (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korėja). RT PreMix (BIONEER, Daejeon, Korėja) buvo naudojamas 42 m◦C 60 minučių ir 95◦C 5 min., kad susintetintų cDNR. PGR pradmenys (Macrogen, Daejeon, Korea) buvo sukurti taip, kaip parodyta lentelėje1 ir Western blot buvo atliktas siekiant nustatyti filaggrino ekspresijos kiekį.
Lum G (Aplegen, Pleasanton, CA, JAV). Kaip standartinis vidinis baltymas, - aktinas (Sigma,Sent Luisas, MO, JAV) buvo naudojamas.
2.5. B16 melanomos ląstelių melanogenezės slopinimo testas
Norint rasti saugias dozes melanino slopinimo tyrimui ir stebėti melanino slopinimo aktyvumą apdorojant CLEPS mėginį, B16 melanomos ląstelės (ATCC) 1 val.× 105 ląstelės/šuolinė buvo kultivuojamos 6-šulinėlių auginimo plokštelėje, kurioje buvo DMEM terpė su 10 % FBS ir 1 % penicilino-streptomicino, pridėta 37 °C.◦C ir 5 procentai CO2 sąlyga. melanino sintezės induktorius, - melanocitus stimuliuojantis hormonas ( -MSH), buvo paruoštas ištirpinant jį 10 procentų DMSO, kurio koncentracija yra 50µM. Po 24 valandų inkubacijos buvo pridėti CLEPS tirpalai ir nedelsiant apdoroti -MSH (50 nM), po to papildomai inkubuojama 72 val. Tada ląstelių plokštelės buvo du kartus plaunamos PBS ir tripsinizuojamos, o po to gautos ląstelės centrifuguojamos 5000 aps./min. greičiu 10 minučių, kad būtų pašalintas supernatantas, o po to buvo gauta ląstelių nuosėdų. Intraląstelinis melanino kiekis buvo nustatytas pagal anksčiau aprašytą metodą su nedideliais pakeitimais [20]: melaninas buvo surinktas ištirpinant jį 2 N NaOH, kuriame yra 10 procentų DMSO, esant 60 °C◦C 4 valandas, kuri buvo perkelta į 96-šulinėlių plokštelę. DMSO (0,1 procv/v) buvo kontrolinis ir tiriamųjų mėginių tirpiklis -MSH. Absorbcija buvo matuojama esant 475 nm, naudojant ELISA skaitytuvą.
2.6. Azoto oksido (NO) priešuždegiminis tyrimas
kaip neigiama kontrolė buvo naudojama terpė be LPS (normali grupė).
2.7. Indukuojamos azoto oksido sintazės (iNOS), ciklooksigenazės-2 (COX2) ir naviko nekrozės faktoriaus priešuždegiminis tyrimas (TNF )
2.8. Kolageno sintezė ir kolagenazės slopinimas
NHDF ląstelės buvo kultivuojamos ir iš anksto apdorotos CLEPS, kad būtų ištirtas veiksmingumasCLEPS dėl kolageno susidarymo ir kolagenazės slopinimo, vartojant I tipo prokolagenąC-peptido PAV rinkinys (Takara, Kusatsu, Japonija) ir žmogaus pro-MMP{2}} Quantikine ELISArinkinys (atitinkamai R&D sistema, Mineapolis, MN, JAV). Kaip metodas kolagenazės, kolageną skaidančio fermento, antikūno priešbuvo naudojama kolagenazė (MMP{0}}), o forbolo 12-miristato 13-acetatas (PMA) (Sigma)naudojamas MMP išraiškai suaktyvinti-1. 10 ng/mL TGF- (Sigma) buvo ištirpintaauginimo terpėje ir buvo naudojama kaip teigiama kontrolė, o auginimo terpė buvoneigiama kontrolė.
2.9. In vitro žaizdų gijimo tyrimas
Norint ištirti CLEPS poveikį žaizdų gijimui, HaCaT ląstelės (1× 104ląstelės / šulinys)buvo dedami į 12-šulinėlių plokšteles 48 valandoms ir išaugo iki ~100 procentų susiliejimo. Vienasluoksnis buvosužeistas naudojant sterilaus 200 galiukąµL pipetė. Ląstelių nuolaužos buvo pašalintos plaunantdu kartus su PBS. Tada šios ląstelės buvo pakeistos šviežia 1 procento serumo terpe su arbabe CLEPS (100, 500 ir 1000µg/mL), po to stimuliuojama 0–48 val. Kontrolėgrupė buvo naudojama žaizdų gijimo savybėms palyginti esant ir nesantiš CLEPS. Žaizdų uždarymo (ląstelių migracijos) mikrofotografijos darytos 0–48 valtų pačių sužeistų vietų naudojant apverstą mikroskopą (Zeiss, Jena, Vokietija). Theprocentinis žaizdos ploto pokytis pikseliais buvo kiekybiškai įvertintas rankiniu būdu kiekvienam vaizdui naudojant ImageJPrograminė įranga (v1.52a, Nacionaliniai sveikatos institutai, Bethesda, MD, JAV).
2.10. Statistinė analizė
CLEPS biologiniai funkciniai tyrimai kiekvienoje platformoje buvo atlikti trimis egzemplioriais. Therezultatai buvo išreikšti kaip vidurkis± standartinis nuokrypis. Buvo atlikta statistinė analizėnaudojant ANOVA, po to Tukey HSD posthoc testą arba Studento testąt- testas. Šie testaibuvo atlikti naudojant SPSS programinę įrangą (v25, International Business Machines, Armonk, NY,JAV) ir „Microsoft Excel“ (v1905, „Microsoft“, JAV). Ap-reikšmėapie<0.05 was considered statistiškai reikšmingas.
El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950
