5 skyrius fermento aktyvumo pokyčiai fermento fermentacijos metu

5 skyrius fermento aktyvumo pokyčiai fermento fermentacijos metu

 

Proteazė, lipazė irSuperoksido dismutazė (SOD)yra pagrindiniai funkciniai fermentaimikrobų fermento sveikas maistas. Tarp jų,proteazėvaidina svarbų vaidmenįskatinti baltymų hidrolizę maistežmogaus kūne. Be to, jis taip pat gali suskaidyti kai kurias mirštančias ląsteles, pašalinti nešvarumus ant odos paviršiaus ir porų bei atlikti vaidmenį eksfoliacijoje, todėl ji plačiai naudojama vonios gaminiuose. Lipazė veikia esterio ryšį tarp riebalų rūgščių ir glicerolio, o hidrolizės substratas paprastai yra natūralus aliejus. Todėl jis matomas daugelyje svorio metimo maisto produktų ir sveikatos produktų. Daugeliui moterų labai rūpi svorio metimo tema, todėl fermentai greitai išpopuliarėjo visame pasaulyje.Fermentuose gausu lipazės, o tai reiškia, kad jie turi aukštą tyrimų vertę ir taikymo perspektyvas.Sodyra specialus metalo fermentas, kuris katalizuoja distacijos reakcijąSuperoksido anijonų radikalai, taipsuperoksido anijonų radikalų pašalinimaskūne. Tai yra apsauginė kliūtis organizmams, todėl jis plačiai naudojamas medicinos srityje.
Šis skyrius yra „Apple“ fermento pavyzdys. Pradedant nuo pradinio fermentacijos etapo,Superoksido dismutazės veikla, amilazė, lipazė, proteazė ir celilazė eksperimentinėje grupėje ir kontrolinėje grupėje buvo matuojami kas 15 dienų, kad būtų išsamiai ir sistemingai atspindėta kintanti fermento aktyvumo tendencija per visą fermentacijos procesą.

Naujos žolelės cistanche

Spustelėkite, jei norite gauti daugiau informacijos

 

Palaikomoji „Wecistanche“ paslauga-didžiausia cisranche eksportuotoja Kinijoje:
El. Paštas: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Medžiagos ir metodai

5.1.1 Medžiagos

(1) Eksperimentinės medžiagos

Nuplaukite šviežius obuolius steriliu vandeniu steriliomis sąlygomis, natūraliai nusausinkite ant sterilios operacinio stalo, nulupkite ir supjaustykite vėliau. Įpilkite baltojo cukraus ir obuolių į sterilizuotą stiklinį indelį, kurio masės santykis yra 1: 1. Suaktyvinkite eksperimentą reikalingas bakterijas ir pasodinkite jas į fermentą pagal optimalią schemą (šis operacijos žingsnis praleidžiamas kontrolinei grupei), uždarykite ją ir padėkite vėsioje ir sausoje vietoje. Po 3 mėnesių kambario temperatūros fermentacijos paimkite mėginį, kad gautumėte visą fermento skystį, kuriame yra minkštimas, ir filtruokite. Paimkite supernatantą kaip eksperimentinį imtį. Po to, kai mėginys yra centrifuguojamas 10, 000 RPM 15 minučių greitaeigiu centrifuge, jis naudojamas atitinkamiems duomenims įvertinti. Verta paminėti, kad gaminant fermentus, siekiant išvengti nereikalingo užteršimo, visos mūsų operacijos buvo atliktos steriliomis sąlygomis.

(2) Pagrindiniai instrumentai
Eksperimentui reikalingi instrumentai yra tokie patys kaip 3.1.1 (2).

 

5.1.2 metodai

(1) Superoksido dismutazės (SOD) aktyvumo nustatymas [66]
„Pyrogallol“ tirpalas tam tikrą laiką buvo pašildytas 25 laipsnių nuolatinėje temperatūros vandens vonioje. Remiantis 5.1 lentele, į bandomąjį vamzdelį buvo įpiltas tinkamas buferio kiekis, distiliuotas vanduo ir tas pats druskos rūgšties ar pirogallolio tirpalo tūris. Nuolatinė temperatūros vandens vonia buvo nustatyta 25 laipsnių 2 laipsnių 2 0 min. Po to, kai mišrus skystis buvo greitai sukrėstas, jis buvo nedelsiant įpuršktas į kiuvetę. Mėginio absorbcijos vertė A0 buvo matuojama kas 30 sekundžių, kai bangos ilgis yra 325 nm, naudojant spektrofotometrą.

Tab.5.1 Pridėkite gretimo benzeno trijų fenolio reagento kiekį, kad būtų galima nustatyti autooksidacijos greitį

 

SOD aktyvumo nustatymo metodas iš esmės yra tas pats, kaip aukščiau pateikta operacija. Vienintelis skirtumas yra tas, kad prieš pridedant pirogallolio, {{0}}}. 5 ml skirtingų koncentracijų fermento mėginio tirpalo. Tuo pačiu metu pridedamas tas pats distiliuoto vandens tūris. Išmatuota absorbcija yra ASOD. Slopinimo greičio ir SOD fermento aktyvumas apskaičiuojamas pagal 5.1 formulę ir 5.2 formulę: slopinimo greitis (%)=(△ A 0-} △ asod)/△ {0 × 100 (5.1) fonso aktyvumas (u/ml)=inhibicijos inhibicija inhibicija inhibicija inhibicija inhibicija inhibicija inhibicija inhibicija inhibicija. (5.2) Kur: V1 yra bendras tirpalo tūris, ml; V2 yra fermento mėginio tirpalo tūris, ML; △ A0 yra pirogallolio automatinis oksidacijos greitis; △ ASOD yra mėginio absorbcijos vertės pasikeitimo greitis; N yra skiedimo daugialypė (2) amilazės aktyvumo nustatymas. Šis tyrimas pritaikė amilazės aktyvumą jodo-stimulio kolorimetriniame metode. Konkretūs operacijos veiksmai nurodo „Nacionalinės klinikinės laboratorijos operacijos procedūrą“ [67]. Tai daugiausia padalinta į šiuos du taškus:

 

① Sprendimo paruošimas
Buferinis krakmolo tirpalas ({{{0}}. 4G/L): tiksliai sverikite 9g natrio chlorido, 22,6 g bevandenio dezodžio vandenilio fosfato ir 12,5 g bevandenio kalio dihidrogeninio fosfato, ištirpinkite juos 5 0 {16} mL} ml., Ištirpkite juos 5 {0 {16} ml. kol tirpalas užvirs; Tiksliai pasverkite 0,4 g tirpaus krakmolo, ištirpinkite jį 10 ml distiliuoto vandens, tolygiai išmaišykite ir prisitaikykite prie pastos; Įšvirkškite krakmolo tirpalą, pritaikytą prie pastos į aukščiau esantį virimo tirpalą, ir pakartotinai nuplaukite stiklinę, kol krakmolas visiškai perkeltas į verdančio vandens tirpalą. Tolygiai maišant stikliniu strypu, atvėsinkite iki kambario temperatūros, įpilkite 5 ml 37% plaukų formaldehido tirpalo ir praskieskite iki 1L distiliuotu vandeniu. Tirpalo pH vertė yra 7,0 ± 0,1, ir ji dedama į šaldytuvą.
Jodo atsargų tirpalas (0. 1 mol/L): tiksliai sveria 1,7835 g kalio jodato ir 22,5 g kalio jodido švariame 500 ml.
Paplaukėjas, lėtai ir tolygiai įpilkite 4,5 ml koncentruotos druskos rūgšties, nuolat maišydami pridėjimo proceso metu, praskieskite į skalę distiliuotu vandeniu ir tolygiai maišykite. Įdėkite jį į šaldytuvą, kad galėtumėte naudoti, ir laikykite jį rudame reagento buteliuke.
Jodo taikymo tirpalas ({{{0}}}. 01mol/L): Paimkite tam tikrą kiekį jodo atsargų tirpalo (0,1 mol/L), praskieskite jį 10 kartų su distiliuotu vandeniu, įdėkite jį į šaldytuvą ir laikykite jį iki 1 mėnesio.

② Eksperimento veikimo veiksmai
Paimkite fermento tirpalą ir 10 kartų praskieskite jį fiziologiniu druskos tirpalu ir veikkite pagal 5.2 lentelę. Gerai sumaišykite, spektrofotometro bangos ilgis yra 660Nm, o kolorimetrinės taurės šviesos kelias yra 10 mm. Nulis su distiliuotu vandeniu ir nuskaitykite kiekvieno vamzdžio absorbciją. Apskaičiuokite amilazės aktyvumą pagal pagrindinę skaičiavimo formulę 5.3.

 

Tab.5.2 Amilazės nustatymo veiksmai

 

(3) Lipazės aktyvumo nustatymas

Nustatymo metodas buvo atliktas pagal QB/T {{{0}}} [68]. 2% fermento bandymo tirpalas buvo paruoštas naudojant {0. 0 25 mol/L fosfato buferis (pH 7,5), fenolftaleinas buvo naudojamas kaip indikatorius, o riebalų rūgštys buvo titruojamos standartiniu natrio hidroksido tirpalu. Lipazės aktyvumas buvo apskaičiuotas atsižvelgiant į eksperimento suvartotų natrio hidroksido tūrį. Taisyklė yra tokia: esant 7,5 pH ir 40 laipsnių aplinkos temperatūrai, 1 ml skysto fermento tirpalo hidrolizuoja lipazę 1 min. Tada lipazės aktyvumas buvo apskaičiuotas pagal 5.4 formulę: fermento aktyvumas (u/ml)=(Ba) × C/0,05 × 50 × 1/15 × N {= 200/3 × (Ba) × C × N (5.4), kur: B yra nacionalinio hidroksido sunaudojimo, ml; A yra natrio hidroksido standartinio tirpalo tūris, sunaudotas tuščioje kontrolinėje grupėje, ML; C yra natrio hidroksido standartinio tirpalo koncentracija Mol/L; 0,05 yra natrio hidroksido standartinio tirpalo koncentracijos konvertavimo koeficientas; 50 yra riebalų rūgščių kiekis natrio hidroksido tirpale; 15 min yra reakcijos laikas; n yra skiedimo kartotinis.

(4) proteazės aktyvumo nustatymas

Žr. GB/T 23527-2009 [69] su nedideliais modifikacijomis.
① Standartinės kreivės paruošimas
Paimkite 1 ml tirozino standartinio tirpalo su skirtingomis masės koncentracijomis, kurios yra 0, 1 0, 20, 30, 40 ir 50 mg/l, ir įpilkite 5 ml 0,4 mol/L natrio karbonato tirpalo ir 1 ml Folino reagento tirpalo. Reaguokite 20 minučių 40 laipsnių temperatūroje. Baigę reakciją, pašalinkite reakcijos tirpalą ir išmatuokite tirpalo absorbcijos vertę, esant 680 nm bangos ilgiui, naudodami spektrofotometrą. Nubrėžkite tirozino standartinę kreivę su tirozino koncentracija kaip horizontalia ašimi ir absorbcijos verte kaip vertikalią ašį.

Naujos žolelės cistanche su stipria antioksidantine galia

② Proteazės aktyvumo nustatymas
Eksperimentinė grupė: Paimkite 1 ml kazeino tirpalo, kurio koncentracija yra 10 g/l, ir tolygiai sumaišykite su 1 ml mėginio tirpalo, kurį reikia išbandyti, ir reaguoti 10 min., Esant 40 laipsnių aplinkos temperatūrai; Filtruokite ir gaukite filtrą, kai stovite, paimkite 1 ml filtrato, 5 ml natrio karbonato tirpalo ir 1 ml Folirino reagento, tolygiai išmaišykite ir sureaguokite 20 min., Esant 40 laipsnių aplinkos temperatūrai; Naudokite spektrofotometrą, kad išmatuotumėte tirpalo absorbcijos vertę, esant 680Nm bangos ilgiui.
Tuščioji kontrolinė grupė: Imkitės 1 ml mėginio tirpalo, kurį reikia išbandyti, įpilkite trichloroacto rūgšties, visiškai reaguokite, kad inaktyvuotumėte proteazę, o kiti veikimo metodai yra tokie patys kaip eksperimentinė grupė.

Apskaičiuokite proteazės aktyvumą pagal 5.5 formulę:
Proteazės aktyvumas (u/ml)=Ak × 4/10 (5.5) Kur: A yra fermento tirpalo absorbcija eksperimentinėje grupėje; K yra tirozino kiekis, kai absorbcija yra lygi 1; 4 yra bendras reakcijos tirpalo tūris, ML; 10 yra reakcijos laikas, min.

(5) Celilazės aktyvumo nustatymas [70]

Celilazės aktyvumą fermentuose paprastai išreiškiamas gliukozės kiekis, išsiskiriantis tam tikru fermento tirpalo kiekiu per laiką. Filminio popieriaus metodo naudojimo celilazės aktyvumui principas yra tas, kad celilazė gali suskaidyti celiuliozę filtravimo popieriuje, kad susidarytų antriniai metabolitai, tokie kaip gliukozė, o gliukozė gali reaguoti su 3, 5- dinitrosalicilo rūgštimi, kad sudarytų geltoną kompleksą. Šios reakcijos spalva yra gana ryški, o tai gali gerai nustatyti gliukozės kiekį ir kitus pagamintus cukraus kiekį.

 

①3, 5- dinitrosalicilo rūgšties kolorimetrinis agentas
Tiksliai sverkite 1 0 G iš 3, 5- dinitrosalicilo rūgšties su {{3 {3}} laipsniu, ištirpinkite jį distiliuotu vandeniu Fenolio ir 0,5 g bevandenio natrio sulfito, nuolat maišykite pridėjimo proceso metu, kol jis visiškai ištirps, sustabdykite šildymą tolygiai maišant, vėsinkite iki kambario temperatūros, perkelkite visus į 1000 ml tūrinę kolbą, praskiestą ant žymės su distiliuotu vandeniu, vienos savaitės kambario temperatūroje, filtruokite, filtruokite, supernatantą ir laikykite rudąjį gėrimo buteliuką.②enziminė hidrolizė
Tiksliai pipetė {{0}}, 0. 5, 1. Po 5 minučių pastovios temperatūros vandens vonios 40 laipsnių, pridėkite 6 chromatografijos filtravimo popieriaus gabalus, kurių plotas yra atitinkamai 1 × 1cm2, ir nedelsdami pradėkite laiką, kad reakcijos laikas būtų tikslus iki 60 minučių. Nedelsdami perkelkite į virimo vandens vonią, kad reakcija būtų 10 minučių, o celilazė praranda savo aktyvumą.

 

 

③ Spalvos reakcija
Paimkite fermento mėginio tirpalą, įpilkite 3 ml 3, 5- dinitrozalicilo rūgšties kolorimetrinį agentą, paruoštą ① ①, kaitinkite virimo vandens vonioje 15 minučių, išimkite, vėsinkite iki kambario temperatūros, pridėkite 10 ml distiliuoto vandens.
④ Gliukozės standartinės kreivės brėžinys
Paruoškite standartinį gliukozės tirpalą, kurio koncentracija yra 1mg/ml, ir naudokite distiliuotą vandenį, kad gliukozės standartinis tirpalas pagamintų su 0, 0. 2, 0. 4, 0. 3ML 3, 5- dinitrosalicilo rūgšties kolorimetrinis agentas, paruoštas ① spalvų vystymosi reakcijai atlikti. Nubraižykite standartinę kreivę su gliukozės koncentracija kaip horizontalia ašimi ir absorbcija kaip vertikalia ašimi.
⑤ Kalkulavimas
Naudokite absorbcijos vertę A po spalvų vystymosi su fermento tirpalu, tada apskaičiuokite gliukozės išsiskyrimo kiekį M pagal gliukozės standartinę kreivę ir apskaičiuokite pagal 5.6 formulę:
Celilazės aktyvumas (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) Kur: m yra gliukozės išsiskyrimo kiekis, ug; t yra fermentinės hidrolizės laikas, min; M yra fermento kiekis reakcijoje, UG/ml.