Santrauka:Buvo pranešta, kad Vitis amurensis šaknys gali balinti odą, įvertinus melanogenezę ir tirozinazę slopinančią veiklą. Šiame tyrime V. amurensis šaknys buvo panaudotos norint greitai atrinkti balinančius ingredientus, naudojant LC-Q-TOF-MS kartu su tirozinazės slopinimo tyrimu, ir optimizuoti ekstrahavimo procesą, kad būtų galima naudoti kaip odą balinančią funkcinę medžiagą pagal atsako paviršiaus metodiką. Rezultatai parodė, kad V. amurensis šaknys rodė tirozinazę slopinantį poveikį dviem stilbeno oligomerais, ε-vinifera (1) ir vitaminu B (2), kaip prognozavo LC-Q-TOF-MS kartu su biologiniu tyrimu. Optimalios ekstrahavimo sąlygos (metanolio koncentracija 66 proc., tirpiklio tūris 140 ml ir ekstrahavimo laikas 100 min.) odos balinamiesiems ingredientams buvo nustatytos su 6,20 proc. išeiga, o tirozinazę slopinantis aktyvumas buvo 87,27 proc. Ryšys tarp kiekvieno veiksnio ir atitinkamo atsako buvo patvirtintas Pearsono koreliacijos analize. Tirpiklio tūris parodė aiškų tiesinį ryšį su išeiga, o metanolio koncentracija turėjo stiprų tiesinį ryšį su 1 ir 2 junginių tirozinazės slopinamuoju aktyvumu, taip pat jų deriniu. Apskritai buvo įrodyta, kad LC-Q-TOF-MS kartu su biologiniu tyrimu gali veiksmingai rasti naujų aktyvių sudedamųjų dalių, taip pat žinomų veikliųjų sudedamųjų dalių; Vitaminai gali būti pasiūlyti kaip nauja natūrali balinimo priemonė.

Remiantis atitinkamais tyrimais,cistancheyra įprasta žolė, žinoma kaip „stebuklingas augalas, prailginantis gyvenimą“. Jo pagrindinis komponentas yracistanozidas, kuris turi įvairų poveikį, pvzantioksidantas, priešuždegiminis, irimuninės funkcijos skatinimas. Mechanizmas tarp cistanche irodos balinimasslypi antioksidaciniame cistanche veikimeglikozidai. Melaninas žmogaus odoje susidaro oksiduojantis tirozinui, kurį katalizuojatirozinazė, o oksidacijos reakcijai reikalingas deguonies dalyvavimas, todėl laisvieji radikalai organizme tampa svarbiu veiksniu, turinčiu įtakos melanino gamybai. Cistanche yracistanozidas, kuris yra antioksidantas ir gali sumažinti laisvųjų radikalų susidarymą organizme, taip slopindamas melanino gamybą.

Spustelėkite „Cistanche“ parduota šalia manęs

Daugiau informacijos:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Raktiniai žodžiai:Vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS, sujungtas su tirozinazės slopinimo tyrimu; atsako paviršiaus metodika; Pearsono koreliacija

1. Įvadas

Melaninas yra atsakingas už žinduolių odos ir plaukų spalvą ir apsaugo odą nuo ultravioletinių spindulių, tačiau per didelė melanino gamyba ir melanino kaupimasis odoje sukelia hiperpigmentacinius odos sutrikimus, tokius kaip strazdanos, melasma, amžiaus dėmės, efelidai ir senatviniai lentiginiai. Tirozinazė, žinoma kaip vario turintis oksidazės fermentas, atlieka lemiamą vaidmenį melanino biosintezėje. Fermentas katalizuoja dvi iš eilės vykstančias oksidacijos reakcijas: pirmasis žingsnis – L-tirozino hidroksilinimas į 3,4-dihidroksi-L-fenilalaniną (L-DOPA), o antrasis etapas – L-DOPA oksidacija iki dopachinonas. Dopachinonas yra labai reaktyvi medžiaga, kuri gali spontaniškai polimerizuotis, kad susidarytų melaninas [1–3]. Taigi tirozinazės inhibitoriai gali būti naudojami kaip su hiperpigmentacija susijusių odos sutrikimų gydymas ir kaip odą balinančios medžiagos.

Vitis amurensis – laukinių vynuogių rūšis, daugiausia paplitusi Azijoje (Korėjoje, Kinijoje ir Japonijoje). Visiškai prinokę vaisiai vartojami žali, juose yra daug maistinių medžiagų, tokių kaip sacharozė, gliukozė, baltymai ir vitaminai, todėl jie naudojami kaip vyno, sulčių, drebučių ir uogienės medžiaga. Be to, jo lapai naudojami salotose [4]. Jo šaknys ir stiebai buvo naudojami kaip tradicinė medicina vėžiui, neuralginiam skausmui ir pilvo skausmui gydyti [5,6]. Jo šaknis sudaro stilbenai (pagrindinė sudedamoji dalis), procianidinai, flflavonoidai, triterpenoidai ir kiti fenoliniai junginiai. Iki šiol šaknies cheminė sudėtis buvo pakankamai išsamiai ištirta. Visų pirma buvo pranešta apie įvairius stilbeno oligomerus, įskaitant resveratrolį, amurenziną A, vitaminą A, (plius)-ε-vinifera, amurenzinus C-M, ampelopsiną A, D ir ampelopsiną E [6]. Šaknies metanolinis ekstraktas turi anti-melanogeninį poveikį prieš melanocitus stimuliuojančio hormono sukeltą melanogenezę B16F10 ląstelėse ir 3,4-dihidroksifenilalanino (L-DOPA) oksidaciją per grybų tirozinazę [7]. Be to, V. amurensis ekstraktai ir jų aktyvūs junginiai turi antioksidacinį, priešuždegiminį, neuroprotekcinį ir priešnavikinį poveikį [7–10].

LC-MS kartu su biologiniu tyrimu gali tuo pačiu metu patvirtinti natūralių produktų komponentų cheminį profilį ir biologinį aktyvumą, nereikalaujant ekstrahavimo ir izoliacijos. Todėl pastaruoju metu jis buvo naudojamas efektyviai ir greitai nustatyti biologiškai aktyvius junginius natūraliuose produktuose [11–13].

Optimizavimas – tai procesas, leidžiantis pasiekti maksimalų eksperimentinių sistemų ar produktų efektyvumą. Atsako paviršiaus metodologija (RSM), daugiamatė analizė, eksperimentų projektavimas naudojant matematinius ir statistinius metodus, pagrįstus empiriniais modeliais, ir eksperimentinio plano bei rezultatų koreliacijos išraiška kaip polinominė funkcija – tai keletas metodų, užtikrinančių idealias optimizavimo sąlygas su maksimaliu efektyvumu. RSM yra tikslus ir efektyvus optimizavimo metodas, plačiai naudojamas įvairiose srityse, įskaitant maisto perdirbimą, chemiją, biologiją ir žemės ūkį [14–16]. Per pastaruosius dešimtmečius išaugo susidomėjimas vaistais, kosmetika ir funkciniais maisto produktais, kurių sudėtyje yra natūralių produktų; todėl tiek akademinėje bendruomenėje, tiek pramonėje atliekami moksliniai tyrimai, kuriais siekiama sukurti tokius produktus [17,18]. Pirmasis šių tyrimų žingsnis yra biologiškai aktyvios sudedamosios dalies ekstrahavimas iš natūralių produktų. Šiuo metu, kadangi daug veiksnių, tokių kaip ekstrahavimo laikas, temperatūra, skysčio ir kietos medžiagos santykis bei tirpiklio tūris, paveikė ekstrahuotas sudedamąsias dalis, reikia optimizuoti biologiškai aktyvias sudedamąsias dalis maksimaliai.

Mūsų žiniomis, retai buvo pranešta apie tirozinazę slopinančias sudedamąsias dalis ir V. amurensis šaknų ekstraktų optimizavimą [5,19]. Todėl šiuo tyrimu buvo siekiama greitai gauti tirozinazės inhibitorių iš V. amurensis šaknų, naudojant LC-Q-TOF-MS kartu su tirozinazės slopinimo tyrimu, ir optimizuoti ekstrahavimo sąlygas, siekiant išplėsti V. amurensis šaknų, kaip odos balinimo medžiagos, panaudojimą. pateikė RSM.

2. Rezultatai ir aptarimas

2.1. LC-QTOF MS, sujungta su tirozinazės slopinimo tyrimu, naudojant V. amurensis šaknų ekstraktą

V. amurensis šaknies 80 procentų MeOH ekstraktas parodė reikšmingą tirozinazę slopinantį aktyvumą (80,7 ± 0,8 proc. esant 50 µg/ml, S1 lentelė). Norint identifikuoti tirozinazę slopinančius junginius V. amurensis šaknyje be izoliacijos, buvo atliktas LC-QTOF-MS, sujungtas su tirozinazę slopinančiu tyrimu. Cheminis V. amurensis šaknų ekstrakto profilis buvo gautas per pirmąjį bandymą (S1 pav.), o biologiškai aktyvūs junginiai buvo identifikuoti naudojant tirozinazę slopinančių frakcijų, surinktų kas 30 s nuo antrojo bandymo, tyrimą (1 pav.). Numatyta, kad masės chromatogramoje buvo dvi smailės nuo 19 iki 22 min., turinčios reikšmingą tirozinazę slopinantį aktyvumą, o jų struktūros buvo nustatytos kaip stilbeno dimeras (1) ir stilbeno tetrameras (2), naudojant cheminį profiliavimą (1 lentelė).

2.2. V. amurensis šaknies tirozinazę slopinančių sudedamųjų dalių identifikavimas

Pirma, iš EtOAc frakcijos buvo išskirtos dvi sudedamosios dalys, kurios, kaip tikimasi, slopina tirozinazę, ir buvo įvertintas jų biologinis aktyvumas. Išskirtų 1 ir 2 junginių struktūros buvo identifikuotos kaip ε-vinifera (1) [20,21] ir vitaminas B (-vinifera, 2) [21–23], naudojant 1H-BMR, 13C-BMR ir ESI-MS (2 pav., S2 ir S3 paveikslai ir S2 lentelė). Tirozinazės slopinimo tyrime 1, 2 junginių ir kojinės rūgšties IC50 vertės buvo atitinkamai 3,51, 10,74 ir 27,09 µM. Abu junginiai parodė didesnį tirozinazę slopinantį poveikį nei teigiama kontrolė, kojinė rūgštis, kuri yra žinoma odos balinimo sudedamoji dalis (1 lentelė ir S4 paveikslas). Ankstesniuose tyrimuose buvo pranešta, kad ε-vinifera (1) slopina tirozinazę [23]; tačiau vitaminas B (2) pirmą kartą buvo nustatytas mūsų tyrime.

Apskritai rezultatai, koreliuojantys su prognozuojamais LC-MS duomenimis, kartu su tirozinazės slopinimo tyrimu ir vitaminu B (2), rodo potencialą kaip naujas tirozinazės inhibitorius. Be to, buvo atlikti molekulinio prijungimo tyrimai, siekiant patvirtinti dviejų stilbeno oligomerų reikšmingą tirozinazę slopinantį aktyvumą. Kaip parodyta 1 lentelėje, 1 ir 2 junginiai parodė didesnį prijungimo balą nei teigiama kontrolė, kojo rūgštis, atitinkanti mūsų eksperimentinius duomenis. Tačiau junginių prijungimo rezultatai prieštaravo mūsų eksperimentiniams rezultatams. 1 ir 2 junginių sąveikos būdai aprašyti 3 paveiksle. 1 junginys sudarė 4 vandenilinius ryšius, 2 hidrofobines sąveikas ir 1 pilonų porų sąveiką, o 2 junginys sudarė 11 vandenilio jungčių, 7 hidrofobines sąveikas, 1 van der Waals sąveiką. , ir 3 pi-vienos poros sąveikos. Dėl to buvo patvirtinta, kad junginiai gali būti įterpti į tikslinio baltymo aktyviąją vietą ir prisijungti prie katalizinių aminorūgščių liekanų, kurios gali slopinti tirozinazės aktyvumą. Be to, pranešama, kad ε-vinifera (1) yra konkurencinis inhibitorius, kuris jungiasi prie tos pačios vietos, kurioje L-DOPA jungiasi su tirozinaze [23]. Pastebėta, kad vitaminas B (2) jungiasi prie tos pačios vietos kaip ε-vinifera (1), o tai patvirtino, kad vitaminas B (2) yra naujas konkurencinis inhibitorius.

2.3. V. amurensis šaknų ekstrahavimo optimizavimas naudojant RSM

Norint panaudoti V. amurensis šaknis kaip odą balinančią funkcinę medžiagą, optimalios ekstrahavimo sąlygos buvo sukurtos pagal Box-Behnken dizainą (BBD), kad būtų maksimaliai padidintas ekstrahavimo išeiga ir tirozinazę slopinantis aktyvumas. Nepriklausomų atsakų, tokių kaip ekstrahavimo išeiga, tirozinazę slopinantis aktyvumas, 1 junginio kiekis, 2 junginio kiekis ir 1 bei 2 junginių sumos kiekis, poveikis trims nepriklausomiems kintamiesiems (ekstrahavimo laikas, MeOH/vandens koncentracija ir tirpiklio tūris), buvo išmatuoti (2 lentelė). Kintamųjų diapazonas buvo nustatytas kaip ekstrahavimo laikas (40, 70 ir 100 min.), MeOH koncentracija (40, 70 ir 100 proc.) ir tirpiklio tūris ( 35, 87,5 ir 140 ml), remiantis preliminariu vieno faktoriaus eksperimentu (duomenys nerodomi). Suplanuotų eksperimentų metu gautos reikšmės buvo išreikštos kaip kintamųjų koreliacijų polinomai, naudojant regresinę analizę (S4–S13 lentelės ir S5 pav.). Atliekant individualų kiekvienos reakcijos optimizavimą (3 lentelė), tikimasi, kad išeiga sudarys 6,21 proc. ekstrahuojant 100.00 min., MeOH 64,78 proc , 140.{{42} } ml. Tirozinazę slopinantis aktyvumas (procentais) buvo ekstrahuotas 65,22 min., MeOH 100.00 proc., 140.00 ml sąlygomis, ir prognozuojama, kad jo vertė bus 90,37 proc. Numatyta, kad 1 junginio kiekis per 65,74 min., MeOH 100.00 proc., 35,00 ml buvo 37,45 µg/mg, o 2 junginio kiekis po 70,00 min., MeOH 70,00 proc. ir 92,24 ml buvo prognozuojama kaip 86,77 µg/mg. Be to, bendras 1 ir 2 junginių kiekis turėtų būti didžiausias 108,10 µg/mg, kai ekstrahuojamas 75,20 min., MeOH 100,00 proc. ir 35,00 ml. Eksperimentai, pagrįsti optimizuotomis sąlygomis, davė 6,19 ± 0,36 proc., tirozinazę slopinantis aktyvumas 91,72 ± 3,48 proc., 1 junginio kiekis 36,54 ± 1,78 µg/mg, 2 junginio kiekis 85,74 ± 16,57 µg ir {8 µg/m. }.10 ± 19,11 µg/mg, o individualūs atsakymai kiekvienam kintamajam skyrėsi 5 procentais ar mažiau nuo teoriškai numatytų verčių. Siekiant maksimaliai padidinti ekstrahavimo išeigą ir tirozinazės slopinamąjį aktyvumą, buvo atliktas kelių atsako optimizavimas (3 lentelė). Optimizuotos sąlygos buvo tokios: ekstrahavimo laikas, 100 min.; MeOH koncentracija, 66,38 proc ; ir tirpiklio tūris – 140 ml. Taikant šias sąlygas, nustatyta, kad išeiga yra 5,95 ± 1,13 proc., o tirozinazę slopinantis aktyvumas buvo 85,93 ± 1,57 proc.; šios reikšmės buvo panašios į prognozuotas reikšmes – atitinkamai 6,20 ir 87,25 proc. Be to, koreliacija tarp kiekvieno kintamojo ir atitinkamo atsako buvo analizuojama naudojant Pearsono koreliaciją (4 lentelė). Ekstrahavimo išeiga parodė aiškų tiesinį ryšį tarp ekstrahavimo laiko ir MeOH koncentracijos ir neigiamą tiesinį ryšį su 1 junginio kiekiu. Be to, tirozinazę slopinantis aktyvumas parodė stiprų tiesinį ryšį tarp 2 junginio kiekio ir sumos kiekio. 1 ir 2 junginių, ir aiškus tiesinis ryšys su 1 junginiu. Todėl V. amurensis šaknies tirozinazę slopinantis aktyvumas buvo proporcingas tiek 1, tiek 2 junginiams, tačiau buvo stipresnis tiesinis ryšys su 2 junginio kiekiu nei 1 junginio.

3. Medžiagos ir metodai

3.1. Bendrosios eksperimentinės procedūros

Vidutinio slėgio skysčių chromatografija (MPLC) buvo atlikta naudojant Biotage Isolera (Biotage AB, Upsala, Švedija). Vienoje sistemoje yra didelio efektyvumo greitosios chromatografijos (HPFC) siurblys, kintamasis dviejų bangų ilgio detektorius ir kolektorius. BMR spektrai buvo gauti naudojant Bruker SPECTROSPIN 300 MHz spektrometrą (Bruker Corporation, Billerica, MA, JAV). Metanolis-d4, BMR tirpiklis, buvo nupirktas iš Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Chromatografinės klasės acetonitrilas (ACN), vanduo ir metanolis (MeOH) buvo įsigyti iš ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (Seulas, Korėjos Respublika). L-tirozinas, grybų tirozinazė, kojinė rūgštis ir skruzdžių rūgštis buvo įsigytos iš Sigma–Aldrich Co (St. Louis, MO, JAV).

3.2. Augalinė medžiaga

V. amurensis šaknis buvo gauta iš Gyeongbuk, Korėjos, taip pat pirkta iš Omniherb (Daegu, Korėjos Respublika). Juos nustatė dr. prof. Ki Yong Lee iš Korėjos universiteto Farmacijos koledžo. Kupono pavyzdys (KUP-HD071) buvo deponuotas Korėjos universiteto Farmacijos koledžo Farmakognozijos laboratorijoje.

3.3. LC-Q-TOF masės spektrometrija

LC buvo atlikta naudojant Agilent 1260 seriją (Agilent, Santa Clara, CA, JAV), kurią sudaro dvejetainis siurblys, internetinis degazatorius, automatinis mėginių ėmiklis, termostatu valdomas kolonėlės skyrius ir fotodiodų matricos detektorius. Chromatografinis atskyrimas buvo atliktas naudojant Shiseido CapCell PAK C18 kolonėlę (5 µm, 4,6 mm, ID × 15{8}} nm). Mobiliąją fazę sudarė vanduo (tirpiklis A) ir ACN (tirpiklis B), kurių abiejuose buvo 0,1 proc. skruzdžių rūgšties. Gradiento sąlygos buvo tokios: 0–5 min., 10 proc. B, 5–30 min. ir tiesiškai didinti B nuo 10 iki 90 proc. Bendras greitis buvo nustatytas į 0,6 ml/min.; 5 µL ir 20 µL mėginių buvo sušvirkšta atitinkamai LC-Q-TOF-MS analizei ir LC-Q-TOF-MS, kartu su tirozinazės slopinimo tyrimu. Masių spektrometrija buvo atlikta naudojant Agilent 6530 Q-TOF masės spektrometrą (Agilent, Santa Clara, CA, JAV) su elektropurškimo jonizacijos (ESI) sąsaja neigiamu režimu. Masės diapazono nuo m/z 50–1000 duomenys buvo renkami centroido režimu. Masės parametrai buvo tokie: kapiliarinė įtampa, 4000 V; purkštuvo slėgis, 40 psi; fragmento įtampa, 175 V; skimerio įtampa, 65 V; džiovinimo dujų temperatūra, 325 ◦C; bendras džiovinimo dujų greitis, 12,0 L/min; susidūrimo energija 10, 20, 30 ir 40 eV. Gavimo parametrų koregavimas ir duomenų apdorojimas buvo atliktas naudojant LC-MS/MS Data Acquisition naudojant 6530 serijos Q-TOF (versija B.05.00) (MassHunter Workstation programinė įranga, Agilent, Santa Clara, CA, JAV).

3.4. LC-Q-TOF-MS, sujungtas su tirozinazės slopinimo tyrimu

LC-Q-TOF-MS, sujungtas su tirozinazės slopinimo tyrimu, buvo atliktas naudojant ankstesniame tyrime nustatytą metodą [24]. Trumpai tariant, tyrimas buvo atliktas dviem važiavimais. Pirmajame bandyme cheminis mėginio profilis buvo gautas naudojant LC-Q-TOF-MS. Kitame bandyme eliuatas, praėjęs per LC sistemą nurodytomis LC-Q-TOF sąlygomis, buvo surinktas į 96-šulinėlių plokšteles kas 30 s. Surinktų frakcijų tirozinazę slopinantis aktyvumas buvo įvertintas naudojant tirozinazės slopinimo testą.

3.5. Tirozinazę slopinančių junginių išskyrimas iš V. amurensis šaknies

Norint išskirti tirozinazę slopinančius junginius, identifikuotus naudojant LC-Q-TOF-MS kartu su tirozinazės slopinimo tyrimu, V. amurensis šaknis (301 kg) buvo ekstrahuota tris kartus su 80 proc. MeOH 60 min. kambario temperatūroje naudojant ultragarsą. Ekstrahuotas tirpiklis filtruojamas ir sukoncentruotas, kad gautų neapdorotą ekstraktą (215,7 g), kuris buvo suspenduotas vandenyje ir paeiliui paskirstytas naudojant n-heksaną, etilo acetatą (EtOAc) ir n-BuOH. EtOAc frakcija (25,85 g) buvo chromatografuojama silikagelio kolonėlėje, naudojant n-heksaną: EtOAc gradiento sąlygomis (20:1 → 0:1), kad gautųsi septynios frakcijos (E1-E7). Frakcija E4 buvo atskirta naudojant MPLC ir 100 g SNAP KP-Sil, silikagelio kasetę ir dichlormetaną: MeOH gradiento sąlygomis (97:3 → 0:100), kad gautų septynias subfrakcijas (E4-1 iki E4-7). . 2 junginys (417,0 mg) buvo gautas iš E4-5. Subfrakcija E4–4 buvo pakartotinai chromatografuota naudojant MPLC, naudojant SNAP 25 g Ultra, silikagelio kasetę ir chloroformą:MeOH:H2O gradiento sąlygomis (50:4:1 → 15:4:1), kad gautųsi septynios frakcijos ( E4–4–1 iki E4–4–7). 1 junginys (396,0 mg) buvo gautas iš E4–4–5, kuris buvo pastebėtas kaip viena dėmė plonasluoksnės chromatografijos (TLC) plokštelėje.

3.6. Tirozinazės slopinimo tyrimas

Tirozinazę slopinantis aktyvumas buvo įvertintas naudojant anksčiau aprašytą metodą su nedideliais pakeitimais [25]. Du mikrolitrai mėginio ir 50 µL 0,1 U/µL grybų tirozinazės buvo apdoroti 96-šulinėlių plokštelėse ir inkubuojami 37 ◦C temperatūroje. Po 15 min. buvo pridėta 50 µL 1 mM L-tirozino ir 15 min. reaguojama 37 ◦C temperatūroje. Susidariusio dopachromo kiekis buvo išmatuotas esant 495 nm, naudojant Spectra Max 19{{20}} mikroplokštelių skaitytuvą (Molecular Devices, San Chosė, CA, JAV). Tirozinazę slopinantis aktyvumas buvo apskaičiuotas naudojant šią lygtį: tirozinazės slopinimas (procentais )=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, kur S yra mėginio, tirozinazės ir L absorbcija. -tirozinas; S0 yra mėginio ir L-tirozino absorbcija; C yra tirozinazės ir L-tirozino absorbcija, o C0 yra L-tirozino absorbcija. Kojic rūgštis, žinomas tirozinazės inhibitorius, buvo naudojama kaip teigiama kontrolė. IC50 reikšmės buvo apskaičiuotos naudojant GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, JAV).

3.7. Molekulinio prijungimo tyrimai

Molekulinis prijungimas buvo atliktas naudojant SYBYL-X 2.1.1 programinę įrangą (Tripos Ltd., St. Louis, MO, JAV) su kristalinėmis struktūromis PPO3, tirozinazės iš Agaricus bisporus (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W). Visos tikslinio baltymo vandens molekulės buvo pašalintos, o ligandų paruošimas buvo atliktas pagal „sanitize“ paruošimo protokolą SYBYL-X 2.1.1. Baltymų ligando afinitetas buvo apskaičiuotas Tripos jėgos lauku ir išreikštas bendrais balais. Pritvirtinta ligando poza iš baltymo-ligando komplekso buvo vizualizuota Discovery Studio 2017 R2 Client programoje (Biovia Co., San Diego, CA, JAV).

3.8. Eksperimentinis planavimas ir statistinė analizė

Naudojant BBD su trimis kintamaisiais ir trimis lygiais (MINITAB 14.12 leidimas.{2}} Statistinė programinė įranga) buvo sukurta optimizuota sudedamųjų dalių, turinčių didžiausią tirozinazę slopinantį aktyvumą, ekstrahavimo iš V. amurensis šaknies sąlyga. Remiantis preliminariais vieno faktoriaus eksperimento rezultatais, buvo pasirinkti nepriklausomi kintamieji, įskaitant ekstrahavimo laiką (X1), MeOH ir vandens koncentraciją (X2), skysčio tūrį (X3) ir jų kintamųjų diapazoną (S3 lentelė). RSM kintamieji buvo koduojami naudojant tris lygius –1, 0 ir 1. Iš viso buvo sukurta 15 eksperimentų, įskaitant 3 pakartojimus dizaino centre (2 lentelė). Kaip nepriklausomi atsakai, buvo išmatuotas derlius (procentai), tirozinazę slopinantis aktyvumas (procentai), junginio (1) kiekis (µg/mg) ir junginio (2) kiekis (µg/mg). Tirozinazę slopinantis ekstrakto aktyvumas buvo įvertintas esant 50 µg/mL koncentracijai. Kiekvienas atsakas išreiškiamas naudojant šią antros eilės daugianario lygtį:

kur R reiškia atsaką; 1, 2 ir 3 yra tiesiniai koeficientai; 12, 23 ir 13 yra trijų kintamųjų sąveikos koeficientai; ir 11, 22 ir 33 yra kvadratiniai koeficientai.
Be to, buvo atlikta Pearsono koreliacinė analizė, siekiant nustatyti tiesinį ryšį tarp kiekvieno kintamojo ir atsako. Pirsono koreliacijos koeficientas turi tvirtą tiesinį ryšį tarp {{0}}.7 ir 1.0, aiškų tiesinį ryšį tarp 0.3 ir 0.7, silpnas tiesinis ryšys tarp {{10}.1 ir 0.3 ir nėra arba nereikšmingas tiesinis ryšys tarp 0.0 ir 0,1. Teigiama ir neigiama koreliacija išreiškiama priklausomai nuo to, ar Pirsono koreliacijos koeficientas yra teigiamas ar neigiamas.

3.9. Tirozinazę slopinančių junginių 1 ir 2 kiekybinė analizė

Kiekvieno 1 ir 2 junginio kiekis ekstraktuose, gautuose naudojant suplanuotas 15 eksperimentinių sąlygų, buvo matuojamas naudojant kalibravimo kreives (2 lentelė). 1 ir 2 junginių kalibravimo kreivės buvo nustatytos naudojant plotą po UV chromatogramos kreive (330 nm, gauta atitinkamai esant 0,1–1000 µg/mL ir 7,81–1000 µg/mL koncentracijoms). LC buvo atlikta naudojant Waters 2695 LC sistemą (Waters, Santa Clara, CA, JAV) tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir LC sistemoje, aprašytoje Medžiagos ir metodai, LC-Q-TOF masės spektrometrija.

4. Išvados

V. amurensis šaknų ε-viniferinas (1) ir vitaminas B (2) buvo apibūdinti kaip odą balinančios sudedamosios dalys, naudojant LC-Q-TOF-MS kartu su tirozinazės slopinimo tyrimu. Visų pirma, šiame tyrime vitaminas B (2) pirmą kartą buvo nustatytas kaip tirozinazę slopinantis junginys, o ε-vinifera (1) ir vitaminas B (2) parodė didesnį tirozinazę slopinantį poveikį nei teigiama kontrolė, kojo rūgštis. Optimizavimo sąlygos su maksimaliu tirozinazės slopinamuoju poveikiu ir V. amurensis šaknų derliumi nustatytos naudojant ekstrahavimo laiką (100 min.), MeOH koncentraciją (66,38 proc.) ir skysčio tūrį (140 ml). Rezultatas parodė gerą atitikimą tarp eksperimentinių ir numatomų verčių. Todėl LC-Q-TOF-MS kartu su biologiniu tyrimu įrodė, kad gali veiksmingai rasti naujų aktyvių sudedamųjų dalių, taip pat žinomų aktyvių sudedamųjų dalių, vitamino B (2), kurį galima pasiūlyti kaip naują natūralų balinimo agentą.

Papildomos medžiagos: S1 pav.: MS chromatograma neigiamos jonizacijos režimu (A); V. amurensis šaknų ekstraktų UV chromatograma esant 280 nm (B), S2 paveikslas: 1 junginio 1H ir 13C BMR spektrai (300 ir 75 MHz, CD3OD), S3 paveikslas: junginio 1H ir 13C BMR spektrai 2 (300 ir 75 MHz, CD3OD), S4 pav. Sigmoidinė diagrama ir teigiamos kontrolės IC50, 1 ir 2 junginiai, S5 paveikslas: atsako paviršiaus ir kontūro diagramos, rodančios ekstrahavimo parametrų poveikį (X1: ekstrahavimo laikas, min.; X2: MeOH koncentracija, procentai; X3: tirpiklio tūris, ml). (A) derlius; (B) tirozinazę slopinantis aktyvumas; (C) junginys 1; (D) junginys 2; (E) 1 ir 2 junginių suma, S1 lentelė. V. amurensis šaknų ekstraktų tirozinazę slopinantis aktyvumas, S2 lentelė: 1 ir 2 junginių 1H ir 13C BMR duomenys CD3OD (δ ppm), S3 lentelė. Nepriklausomi kintamieji ir lygiai atsako paviršiaus metodikai, S4 lentelė. Derliaus koeficientas, S5 lentelė: derliaus dispersijos analizė, S6 lentelė: apskaičiuotas tirozinazę slopinančio aktyvumo regresijos koeficientas, S7 lentelė: tirozinazę slopinančio aktyvumo dispersijos analizė, S8 lentelė: apskaičiuotas 1 junginio regresijos koeficientas, S9 lentelė. 1 junginio dispersija, S10 lentelė: 2 junginio apskaičiuotas regresijos koeficientas, S11 lentelė. 2 junginio dispersijos analizė, S12 lentelė: 1 ir 2 junginių sumos apskaičiuotas regresijos koeficientas, S13 lentelė: 1 ir 2 junginių sumos dispersijos analizė.
Autoriaus indėlis: Konceptualizavimas, KYL; metodika, K.-EO, HS ir KYL; programinė įranga, K.-EO ir HS; patvirtinimas, HS; formalioji analizė, K.-EO ir HS; tyrimas, K.-EO, HS, MKL ir KYL; duomenų tvarkymas, K.-EO, HS, BP ir KYL; raštu- originalaus projekto rengimas, K.-EO ir HS; rašymas – peržiūra ir redagavimas, HS, MKL, BP ir KYL; priežiūra, MKL, BP ir KYL Visi autoriai perskaitė ir sutiko su publikuota rankraščio versija.
Finansavimas: Šį tyrimą rėmė Nacionalinio Korėjos tyrimų fondo dotacija, finansuojama Korėjos vyriausybės (NRF-2017R1A2B4003403 ir NRF-2019R1A6A1A03031807) ir Korėjos sveikatos technologijų mokslinių tyrimų ir plėtros projekto dotacija per Korėjos sveikatos pramonės plėtrą. institutas (KHIDI), finansuojamas Korėjos Respublikos sveikatos ir gerovės ministerijos (HF20C0038).
Duomenų prieinamumo pareiškimas: Šiame tyrime pateikti duomenys pateikiami papildomoje medžiagoje.
Interesų konfliktai:Autoriai pareiškia, kad nėra interesų konflikto.
Mėginio prieinamumas: Nepasiekiamas

Nuorodos

1. Ranjbar, S.; Shahvaranas, PS; Edraki, N.; Khoshneviszadeh, M.; Darroudi, M.; Sarrafifi, Y.; Hamzehloueian, M.; Khoshneviszadeh, M. 1, 2, 3-su triazolu susieti 5-benzilideno (tio) barbitūratai kaip nauji tirozinazės inhibitoriai ir laisvųjų radikalų gaudytojai. Arch. Pharm. 2020, 353, 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. Chang, T.-S.; Ding, H.-Y.; Linas, H.-C. 6, 7, 40 -trihidroksiizoflavono nustatymas kaip stiprus tirozinazės inhibitorius. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005, 69, 1999–2001. [CrossRef] [PubMed]

3. Miyazawa, M.; Oshima, T.; Koshio, K.; Itsuzaki, Y.; Anzai, J. Tirozinazės inhibitorius iš juodųjų ryžių sėlenų. J. Agrič. Food Chem. 2003, 51, 6953–6956. [CrossRef]

4. Chen, Q.; Diao, L.; Daina, H.; Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: Chemijos ir farmakologijos apžvalga. Fitomedicina 2018, 49, 111–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin, K.-S.; O, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Betulino rūgštis, išskirta iš Vitis amurensis šaknies, slopina 3-izobutil-1- metilksantino sukeltą melanogenezę, reguliuodama MEK/ERK ir PI3K/Akt kelius B16F10 ląstelėse. Food Chem. Toksikolis. 2014, 68, 38–43. [CrossRef]

6. Kimas, H.; Thuong, PT; Ngoc, TM; Lee, I.; Pakabintas, ND; Bae, K. Vitis amurensis lapų ir stiebų oligostilbenų antioksidacinis ir lipoksigenazę slopinantis aktyvumas. J. Ethnopharmacol. 2009, 125, 304–309. [CrossRef]

7. Jin, K.-S.; O, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis Ruprecht šaknis slopino melanocitus stimuliuojančio hormono sukeltą melanogenezę B16F10 ląstelėse. Nutr. Res. Praktika. 2014, 8, 509–515. [CrossRef]

8. Jang, MH; Piao, XL; Kim, HY; Cho, EJ; Baek, SH; Kvonas, SW; Park, JH Resveratrolio oligomerai iš Vitis amurensis susilpnina amiloido sukeltą oksidacinį stresą PC12 ląstelėse. Biol. Pharm. Bull. 2007, 30, 1130–1134. [CrossRef]

9. Lee, E.-O.; Lee, H.-J.; Hwang, H.-S.; Ahn, K.-S.; Chae, C.; Kangas, K.-S.; Lu, J.; Kim, S.-H. Stipriai slopina Lewiso plaučių vėžio augimą heksanoliu A nuo Vitis amurensis šaknų per apoptotinę ir antiangiogeninę veiklą. Kancerogenas 2006, 27, 2059–2069. [CrossRef]

10. Bakas, M.-J.; Truongas, VL; Kang, H.-S.; Jun, M.; Jeong, W.-S. Laukinių vynuogių (Vitis amurensis) sėklų procianidinų priešuždegiminis poveikis LPS sukeltose RAW 264.7 ląstelėse. Oksidas. Med. Ląstelė. Longevas. 2013 m., 2013 m. [CrossRef]

11. Šinas, H.; Chung, H.; Parkas, B.; Lee, KY Antioksidacinių Polygonum aviculare sudedamųjų dalių identifikavimas naudojant LC-MS kartu su DPPH tyrimu. Nat. Prod. Sci. 2016, 22, 64–69. [CrossRef]

12. Parkas, S.; Shin, H.; Parkas, Y.; Choi, I.; Parkas, B.; Lee, KY Catalpa ovata NO gamybą slopinančių sudedamųjų dalių apibūdinimas naudojant LC-MS kartu su ląstelių tyrimu. Bioorg. Chem. 2018, 80, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

13. Ingkaninanas, K.; De Best, C.; Van Der Heijden, R.; Hofte, A.; Karabatakas, B.; Irth, H.; Tjadenas, U.; Van der Greefas, J.; Verpoorte, R. Didelio efektyvumo skysčių chromatografija su prijungtu UV, masių spektrometriniu ir biocheminiu aptikimu acetilcholinesterazės inhibitorių iš natūralių produktų identifikavimui. J. Chromatogr. 2000, 872, 61–73. [CrossRef]

14. Bezerra, MA; Santelli, RE; Oliveira, EP; Villaras, LS; Escaleira, LA Atsako paviršiaus metodika (RSM) kaip analitinės chemijos optimizavimo įrankis. Talanta 2008, 76, 965–977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak, A.; Chojnacka, K.; Podstawczyk, D.; Dawiec, A.; Pokomeda, K. Atsako paviršiaus metodologijos ir dirbtinio neuroninio tinklo metodų taikymas modeliuojant ir optimizuojant biosorbcijos procesą. Bioresursas. Techn. 2014, 160, 150–160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo, PW; Brereton, RG Eksperimentinis dizainas I. Atranka. Tendencijų analitikas. Chem. 1996, 15, 26–31. [CrossRef]

17. Wang, Y.; Zhao, L.; Zhang, R.; Yang, X.; Saulė, Y.; Ši, L.; Xue, P. Ekstrahavimo ultragarsu optimizavimas taikant atsako paviršiaus metodiką, antioksidacinį pajėgumą ir antocianinų iš raudonųjų ryžių sėlenų aktyvumą, slopinantį tirozinazę. Maisto Sci. Nutr. 2020, 8, 921–932. [CrossRef]

18. Veremfo, A.; Adulley, F.; Adarkwah-Yiadom, M. Fenolinių junginių ekstrahavimo mikrobangėmis ir avokado (Persea americana Mill.) sėklų antioksidacinio aktyvumo vienu metu optimizavimas naudojant atsako paviršiaus metodiką. J. Anal. Methods Chem. 2020, 2020, 7541927. [CrossRef]

19. Ko, J.; Choi, J.; Bae, SK; Kim, J.; Yoon, KD Penkių oligostilbenų atskyrimas nuo V itis amurensis naudojant aukšto efektyvumo priešsrovinės chromatografijos gradientą. J. Sep. Sci. 2013, 36, 3860–3865. [CrossRef]

20. Wang, K.-T.; Chen, L.-G.; Tseng, S.-H.; Huang, J.-S.; Hsieh, M.-S.; Wang, C.-C. Resveratrolio ir oligostilbenų priešuždegiminis poveikis nuo Vitis thunbergii var. Taiwaniana nuo lipopolisacharidų sukelto artrito. J. Agrič. Food Chem. 2011, 59, 3649–3656. [CrossRef]

21. Hu, J.; Linas, T.; Xu, J.; Dingas, R.; Wang, G.; Shen, R.; Zhang, Y.-W.; Chen, H. Polifenoliai, išskirti iš Vitis thunbergii var. Taivanija reguliuoja su APP susijusį kelią. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2016, 26, 505–511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oshima, Y.; Kamijou, A.; Ohizumi, Y.; Niwa, M.; Ito, J.; Hisamichi, K.; Takeshita, M. Novel oligostilbenes from Vitis coignetiae. Tetrahedron 1995, 51, 11979–11986. [CrossRef]

23. Anna Malinowska, M.; Billet, K.; Drouet, S.; Munsch, T.; Unlubayir, M.; Tungmunnithum, D.; Giglioli-Guivarc'h, N.; Hano, C.; Lanoue, A. Vynuogių cukranendrių ekstraktai kaip daugiafunkcinis jauninantis kosmetikos ingredientas: Sirtuino aktyvumo, tirozinazės slopinimo ir biologinio prieinamumo potencialo įvertinimas. Molecules 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Yang, HH; O, K.-E.; Jo, YH; Ahn, JH; Liu, Q.; Turkas, A.; Jang, JY; Hwang, BY; Lee, KY; Lee, MK Tirozinazę slopinančių sudedamųjų dalių apibūdinimas iš oro Humulus japonicus dalių naudojant LC-MS/MS susietą internetinį tyrimą. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu, K.; Kim, C.; Jo, YH; Kimas, SB; Hwang, BY; Lee, MK Resveratrolio darinių, kaip melanogenezės inhibitorių, sintezė ir biologinis įvertinimas. Molekulės 2015, 20, 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

Daugiau informacijos: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501