Chimerinis žmogaus papilomos virusas-16 Į virusą panašios dalelės, kuriose yra P18I10 ir T20 peptidų iš ŽIV-1 apvalkalo, sukelia ŽPV16 ir ŽIV-1-specifinį humoralinį ir T ląstelių sukeltą imunitetą BALB/c pelėms

Santrauka:

Šiame tyrime ŽIV{0}} P18I10 CTL peptidas, gautas iš ŽIV-1 gp120 V3 kilpos, ir ŽIV-1 gp41 anti-susiliejimo peptidas T20 buvo įterpti į HPV16 L1 kapsidės baltymą. sukurti chimerinius ŽPV: ŽIV (L1:P18I10 ir L1:T20) VLP, naudojant žinduolių ląstelių ekspresijos sistemą. ŽPV: ŽIV VLP buvo išgryninti chromatografijos būdu. Mes parodėme, kad P18I10 arba T20 peptidų įterpimas į HPV16 L1 kapsidų baltymų DE kilpą neturėjo įtakos chimerinio ŽPV: ŽIV VLP stabilumui in vitro, savaiminiam surinkimui ir morfologijai. Svarbu tai, kad jis netrukdė nei ŽIV-1 antikūnų reaktyvumui, nukreiptam į nuoseklius ir konformacinius P18I10 ir T20 peptidus, esančius chimeriniame ŽPV: ŽIV VLP, nei HPV16 L1-specifinių antikūnų indukcijai in vivo. Pastebėjome, kad chimerinės L1:P18I10/L1:T20 VLP vakcinos gali sukelti ŽPV16-, bet silpną ŽIV-1-specifinį antikūnų atsaką ir sukelti ŽPV16- ir ŽIV-1-specifinį T- ląstelių atsakai BALB / c pelėms. Be to, tai gali būti potencialus stiprintuvas, padidinantis ŽIV specifinį ląstelių atsaką heterologinės imunizacijos metu po pradinio BCG.HIVA vakcina. Šis mokslinis darbas prisidėtų prie naujos chimerinės ŽPV: ŽIV VLP pagrindu sukurtos vakcinos platformos, skirtos kontroliuoti ŽPV16 ir ŽIV{42}} infekciją, kūrimo žingsnį, kurio skubiai reikia besivystančiose ir pramoninėse šalyse.

cistanche nauda vyrams - stiprina imuninę sistemą

Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus

【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Raktiniai žodžiai:

ŽIV-1; ŽPV16; vakcina; į virusus panašios dalelės; P18I10; T20 enfuvirtidas; BCG.HIVA; humoralinis imunitetas; T ląstelių sukeltas imunitetas

1. Įvadas

Žmogaus imunodeficito virusas-1 (ŽIV-1), sukeliantis įgytą imunodeficito sindromą (AIDS), buvo aptiktas devintojo dešimtmečio pradžioje ir nuo tada tapo pasauline epidemija [1]. Nors labai aktyvus antiretrovirusinis gydymas (HAART) kartu su profilaktika prieš ekspoziciją (PrEP) gali turėti realų poveikį ŽIV infekcijos kontrolei, vakcinacija vis dar yra esminis visuomenės naudos ir gydymo būdas. pasaulinės ŽIV{7}} epidemijos pabaigos [2]. Nepaisant daugiau nei tris dešimtmečius trukusių nuodugnių ŽIV{9}} tyrimų ir daugybės vakcinos klinikinių tyrimų, licencijuota ŽIV{10}} vakcina iki šiol vis dar nepasiekiama. Tailande atliktas RV144 tyrimas buvo pirmasis atvejis, atskleidęs nedidelį 31,2 % veiksmingumą nuo ŽIV{14}} infekcijos [3]. Dauguma kitų ŽIV -1 vakcinos kandidatų, kuriems buvo atlikti klinikiniai tyrimai, daugiausia buvo pagrįsti DNR, rekombinantiniais virusiniais vektoriais arba subvieneto baltymų modeliais [4,5]. Idealiu atveju veiksminga ŽIV{19}} vakcina gali sukelti įgimtą imuninį atsaką, neutralizuoti antikūnus, kad būtų išvengta virusinės infekcijos [6], taip pat citotoksinių T limfocitų (CTL) atsakų, kad būtų pašalintos užkrėstos ląstelės [7]. Tačiau norint sukelti kiekvieną atsaką, gali prireikti skirtingų vakcinų strategijų, todėl reikia atskirų, bet lygiagrečių plėtros pastangų. Imunogenų ir įvedimo vektorių parinkimas turės reikšmingos įtakos ŽIV -1 vakcinų funkcijai ir specifiškumui [8,9]. Dėl pasikartojančių nesėkmių taikant standartinius ŽIV -1 vakcinos kūrimo metodus buvo pripažinta tiekimo vektorių atrankos, pirminio sustiprinimo režimų ir imunogeno specifiškumo svarba tiek humoraliniam, tiek ląsteliniam atsakui. Jau žinoma daugiau nei 100 žmogaus papilomos viruso (ŽPV) tipų ir manoma, kad 16 ir 18 ŽPV genotipai sukelia maždaug 70 % gimdos kaklelio vėžio atvejų visame pasaulyje [10]. Į ŽPV L1 virusą panašios dalelės (VLP), klasifikuojamos kaip subvienetinių vakcinų tipas, daugiausia gali sukelti panašius L1- specifinius humoralinius atsakus į laukinio tipo virioną ir T ląstelių sukeliamus atsakus [11–13]. Šiuo metu rinkoje yra licencijuotos trys ŽPV profilaktinės vakcinos ir visos jos yra pagrįstos ŽPV L1 kapsidų baltymo VLP. Du iš jų – Gardasil (Merck, Rahway, NJ, JAV) ir Gardasil-9 (Merck) gaminami naudojant mielių (Saccharomyces cerevisiae) ekspresijos sistemą, o kita – Cervarix (GSK, Brentford, JK). Bakuloviruso ekspresijos vektoriaus/vabzdžių ląstelių (BEVS/IC) sistema [14]. Iki šiol optimalios HPV16 L1 baltymų gamybos sąlygos žinduolių ekspresijos sistemoje nebuvo nusistovėjusios. Taigi kombinuotos vakcinos, kuri apsaugotų nuo ŽPV ir ŽIV infekcijų, sukūrimas yra logiška pastanga kovojant su šiais dviem pagrindiniais pasaulio patogenais.

Ankstesniame apžvalgos dokumente apie virusinių dalelių (VLP) pagrįstų ŽIV -1 vakcinų projektavimo koncepcijas minėjome, kad be apvalkalo VLP, pvz., papilomos viruso VLP, gali atlikti funkcinį vaidmenį kaip pristatymo vektoriai. ŽIV-1 CTL arba neutralizuojančių antikūnų epitopai [15,16]. Ši hipotezė buvo patvirtinta keliuose chimeriniuose galvijų papilomos virusuose (BPV) L1 VLP, kuriuose yra P18I10 CTL epitopas iš gp120 ŽIV{12}} apvalkalo baltymo (Env) V3 kilpos ir 2F5 epitopas arba gp41 ŽIV{16}} Env MPER sritis. [17–22]. Žmogaus papilomos viruso tipo -16 (HPV16) L1 kapsidų baltymų struktūrinė ypatybė yra panaši į BPV ir gali savaime susiburti į vieno sluoksnio L1 VLP [23]. Penki iš HPV16 L1 baltymų sudaro pentamerą, o 72 pentamerai savaime susirenka į HPV16 VLP [24]. Tačiau vis dar nėra aiškių įrodymų, kad chimeriniai HPV16: ŽIV kapsidų baltymai gali būti stabilūs in vitro ir savaime susijungti į morfologiškai vientisus VLP. Kita vertus, buvo įrodyta, kad HPV16 L1 VLP yra labai imunogeniški ir gali sukelti antigenui specifinį T ir B ląstelių imuninį atsaką [11–13]. Dar reikia išsiaiškinti, ar ŽIV-1 epitopų atsiradimas per ŽPV: ŽIV VLP gali būti imunogeniški. Šiame tyrime siekėme sukurti chimerinę VLP pagrįstą ŽPV: ŽIV vakciną, naudodami žmogaus 293F ląsteles, nusistovėjusią žinduolių ląstelių ekspresijos sistemą. ŽPV 16 L1 baltymas veikė kaip struktūrinis vakcinos karkasas, o P18I10 ir T20 peptidai buvo atrinkti kaip ŽIV -1 imunogenai ir įterpti į HPV 16 L1 baltymo DE kilpą. Imunodominuojantis P18I10 CTL epitopas, susidedantis iš 10 aminorūgščių (311–320 liekanos: RGP GRAFVTI), yra gautas iš trečiojo ŽIV -1 apvalkalo glikoproteino gp120 kintamo domeno (V3). Nustatyta, kad P18I10 peptidas yra H-2Dd apribota MHC I klasės molekulė, sukelianti citotoksinį T limfocitų (CTL) atsaką [25,26]. T20 peptidas, žinomas kaip enfuvirtidas ir sukurtas kaip antiretrovirusinis multimerinis sulietas peptidas, susideda iš 36 aminorūgščių sekos (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF), imituojančios C-galo heptadės spiralės seką arti membranos.0 ŽIV -1 apvalkalo glikoproteino 41 (gp41) proksimalinė išorinė sritis (MPER) [27]. Šie du ŽIV-1 T (P18I10) ir B (T20) ląstelių epitopai buvo pasirinkti kaip chimerinio VLP pagrindu sukurto ŽPV: ŽIV vakcinos kūrimo platformos atspirties taškas ir koncepcijos eksperimento įrodymas.

Per pastarąjį dešimtmetį buvo išbandyta daug skirtingų VLP pagrindu sukurtų ŽIV -1 vakcinos pirminio padidinimo formatų [15]. Nors dauguma ankstesnių ŽIV-1 VLP [28] arba chimerinių BPV: ŽIV VLP [17–22] vakcinų strategijų buvo nukreiptos į imuninio atsako sukėlimą naudojant homologinį pirminio sustiprinimo režimą, du ankstesni tyrimai parodė, kad heterologinė imunizacija. susidedantis iš rekombinantiniųMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG), išreiškiantis ŽIV-1 Gag prime ir ŽIV-1 Gag VLP padidėjimas, gali padėti sustiprinti T ląstelių imunitetą [29, 30]. Mūsų tyrimo grupėje įrodėme, kad pradėjimas su rBCG, ekspresuojančiu ŽIVA imunogeną, ir sustiprinimas rekombinantiniu virusiniu vektoriumi MVA.HIVA buvo saugus ir sukėlė ŽIV-1-specifinį T-ląstelių imuninį atsaką BALB/c pelėms [31–33]. ŽIVA imunogenas, sukurtas dr. Tomas Hanke, sudarytas iš viso ilgio ŽIV-1 Gag baltymo, sujungto su keliais CTL epitopais, įskaitant P18I10 epitopus C gale [34]. Todėl siekėme įvertinti, ar BCG.HIVA gali sustiprinti T-ląstelių imuninį atsaką, kurį sukelia ŽIV: ŽPV (L1:P18I10) VLP BALB/c pelėms.

Šiame tyrime chimeriniai ŽPV: ŽIV (L1:P18I10 ir L1:T20) imunogenai buvo sukurti ir pagaminti naudojant 293F ekspresijos sistemą. Chimerinė L1: P18I10 ir L1: T20 baltymų ekspresija buvo patvirtinta imuniniu dažymu. ŽPV: ŽIV VLP vėliau buvo išgryninti 3-pakopinės chromatografijos metodu, įskaitant katijonų (CEC), dydžio išskyrimo (SEC) ir heparino afiniteto (H-AC) chromatografiją. Tada išgryninto ŽPV stabilumas in vitro, savaiminis surinkimas in vitro ir morfologija: ŽIV VLP buvo patvirtinti atitinkamai neredukuojančiu SDS-PAGE, molekulinės masės tyrimu ir perdavimo elektronų mikroskopija (TEM). Nuosekli ir konformaciniai P18I10 ir T20 peptidai, pateikti chimeriniame ŽPV: ŽIV VLP buvo toliau apibūdinti anti-ŽIV -1 gp120 V3 ir 2F5 monokloniniais antikūnais in vitro, naudojant Western blot ir netiesioginį ELISA tyrimą. Galiausiai, ŽPV imunogeniškumas: ŽIV VLP buvo įvertintas BALB/c pelių modelyje. Įrodėme, kad chimerinės L1:P18I10 ir L1:T20 VLP pagrįstos vakcinos gali sukelti ŽPV16- ir ŽIV-1-specifinius antikūnų atsakus, o chimeriniai L1:P18I10 VLP gali sukelti ŽPV16- ir ŽIV{ {37}}specifiniai T-ląstelių atsakai BALB/c pelėms. Kadangi imunogeninės ŽPV: ŽIV vakcinos kūrimas ir gamyba vis dar nepasiekiama, šis tyrimas pateikė pradinę strategiją, kuri gali būti verta remti pasaulines pastangas sukurti naujas chimerines VLP pagrindu sukurtas vakcinas, skirtas ŽPV ir ŽIV infekcijoms kontroliuoti.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. BCG.HIVA2auxo.int vakcinos padermės konstravimas

Rekombinantinis BCG, ekspresuojantis ŽIVA imunogeną, anksčiau buvo sukurtas naudojant E.coli-mycobacterial integracinį šaudyklinį vektorių p2auxo.int. E. coli/mikobakterijų vektoriaus, ekspresuojančio ŽIVA antigeną, konstrukcija buvo aprašyta anksčiau [31–33]. BCG.HIVA2auxo.int buvo atskiestas PBS-Tween20 iki 2 × 107 cfu/ml, apdorotas ultragarsu, kad suardytų bakterijų gumulėlius, ir inokuliuotas į užpakalinį maisto padą arba BALB/c peles (50 µL, 106 cfu/pelei).

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

2.2. Bakterijų kultūros ir transformacija

Glicino auksotrofinės E. coli padermės M151GlyA ląstelės (Invitrogen, Waltham, MA, JAV), kurias pateikė dr. Pau Ferrer, buvo kultivuojamos minimalioje M9-darinio terpėje (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/l; KH2PO4, 3 g/l; NaCl, {{10}},5 g/l; NH4Cl, 1 g/l, gliukozė, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0,1 mmol/L; tiaminas, 0},1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/l; AlCl3·6H2O, 0,13 mg/l; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/l; CoCl2·6H2O, 0,47 mg/l; CuSO4·H2O, 4,6 mg/l; H3BO3, 0.{101}}3 mg/l; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/l; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/L) , papildytas glicinu (70 µg/ml). E. coli M151Gly ląstelės buvo transformuotos p2auxo.HIVA plazmidėmis elektroporacijos būdu. Tam E. coli kultūros buvo auginamos iki 0,9 optinio tankio esant 600 nm ir transformuojamos naudojant Bio-Rad geno impulsinį elektroporatorių esant 2,5 kV, 25 µF ir 200 Ω. Transformuotos ląstelės vėliau buvo kultivuojamos M9-D agaro lėkštelėse (komponentai, kaip aprašyta anksčiau, pridėjus 1,5 % baktoagaro) nepridedant glicino atrankai arba naudojant gliciną kaip kontrolę. Lizino auksotrofinė BCG padermė BCG∆lys, kurią maloniai pateikė WR Jacobs Jr., BR Bloom ir T. Hsu, buvo transformuota p2auxo.HIVAint plazmidės DNR elektroporacijos būdu. Mikobakterijos buvo kultivuojamos Middlebrook 7H9 sultinio terpėje arba Middlebrook agaro 7H10 terpėje, papildytoje albumino-dekstrozės-katalaze (ADC; Difco), turinčioje 0,05% Tween 80. L-lizino monohidrochloridas (Sigma, Kawasaki, Japonija) ištirpinamas vandenyje ir naudojamas kaip priedas, kai galutinė koncentracija yra 40 µg/mL. Transformacijai BCG buvo kultivuojamas iki 1,5 optinio tankio esant 600 nm ir transformuojamas naudojant Bio-Rad geno impulsinį elektroporatorių esant 2,5 kV, 25 µF ir 1000 Ω. Tada transformantai buvo auginami ADC papildytoje Middlebrook agaro 7H10 terpėje, kurioje buvo 0, 05% Tween 80 be lizino papildymo.

2.3. Ląstelių linijos ir ląstelių kultūra

293F ląstelės (Tibco), gautos iš žmogaus embrioninio inkstų (HEK) 293 ląstelių, buvo kultivuojamos FreeStyle 293 ekspresijos terpėje (Tibco), papildytos 5 ml/l penicilino-streptomicino (Tibco), ir inkubuojamos 37 ◦C inkubatoriuje. sudrėkinta 5% CO2 atmosfera ant orbitinės kratytuvo platformos, besisukančios 125 aps./min.

2.4. L1:P18I10 ir L1:T20 baltymų gamyba naudojant 293F ekspresijos sistemą

Konstrukcijoje pCDNA3.1 buvo L1:P18I10 arba L1:T20 DNR koduojančios sekos, atitinkančios atitinkamai chimerinius L1:P18I10 ir L1:T20 baltymus. ŽIV-1 P18I10 CTL peptidas (RGPGRAFVTI) arba T20 peptidas (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) buvo įterptas į HPV16 L1 kapsidės baltymo DE kilpą. HPV16 L1 DE kilpos seka, koduojanti 130–136 aminorūgštis, buvo pakeista P18I10I10 arba T20 peptidu. L1:P18I10 arba L1:T20 DNR koduojančios sekos buvo modifikuotos Kozak seka, optimizuotos žmogaus kodonu, greta HindIII ir XbaI restrikcijos fermentų vietos ir klonuotos į pcDNA3.1(+) vektorių, naudojant GeneArt genų sintezės paslaugas ( Thermo Fisher, Waltham, MA, JAV). Rekombinantinė plazmidinė DNR (pDNR) buvo transformuota į E. coli DH5 kompetentingas ląsteles (Invitrogen) amplifikacijai ir ekstrahuota naudojant plazmidės Maxi rinkinius (QIAGEN, Hilden, Vokietija). 293F ląstelės buvo kultivuojamos su 30 ml FreeStyle 293 ekspresijos terpės 125 ml Erlenmeyerio kolboje (Corning, Niujorkas, NY, JAV) iki 1,0 × 106 / ml tankio ir laikinai transfekuotos L1:P18I10 arba L1:T20 pDNAs. polietileniminas, kurio MW yra 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences), esant optimizuotam DNR ir PEI santykiu 1:3 (m/m) ir DNR bei auginimo terpės santykiu 1:1 (m/v), pagal pagal gamintojo instrukcijas [35]. 293F ląstelės buvo surinktos praėjus 96 valandoms po transfekcijos. 293F ląstelės gali pasiekti susiliejantį 3,6 × 106 ląstelių / ml tankį, o jų gyvybingumas yra maždaug 50%.

2.5. Imunofluorescencinis dažymas

Ląstelės buvo permeabilizuotos ant stiklinio stiklelio 100% šaltu acetonu. Vėliau fiksuotos ląstelės buvo tiriamos anti-HPV16 L1 antikūnu CAMVIR-1 (Abcam, Kembridžas, JK) ir užfiksuotos anti-pelės IgG-FITC (Sigma). Imuniniu būdu dažyti ląstelių monosluoksniai buvo kruopščiai nuplauti PBS ir padengti tvirtinimo terpe su DAPI (Abcam). Imunofluorescenciniai vaizdai buvo tikrinami apverstu mikroskopu, padidinant 40 kartų. Transfekcijos efektyvumas buvo nustatytas pagal FITC (žalia) teigiamų ląstelių ir DAPI (mėlyna) dažytų ląstelių santykį.

2.6. ŽPV valymas: ŽIV (L1:P18I10 ir L1:T20) VLP

Iš viso 108 transfekuotos 293F ląstelės 125 ml Erlenmejerio kolboje (30 ml auginimo terpės/kolboje) buvo surinktos centrifuguojant 1500 aps./min. 5 minutes ir du kartus plaunamos PBS. Ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos lizės buferyje, sudarytame su 1% Triton X-100, proteazės inhibitoriumi (1:100) (Millipore) ir benzonaze ​​(25 V/mL) (Millipore). Ląstelių lizatai buvo nuskaidrinti 0,45 µm PVDF švirkšto filtru (Millipore). ŽPV: ŽIV (L1:P18I10 ir L1:T20) VLP mėginiai buvo nuosekliai gryninami naudojant katijonų mainus (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, JAV), dydžio išskyrimą (Capto Core 700, GE) ir afinitetą (HiTrap Heparin HP). , GE) chromatografija. Chromatografiniai protokolai buvo aprašyti ankstesniuose mūsų tyrimuose [36, 37] ir laikėsi gamintojo protokolo [38]. L1 baltymo signalas kiekviename gryninimo etape buvo apibūdintas Western blot analize ir patikrintas anti-HPV16 L1 antikūnu CAMVIR-1 [39].

2.7. Nemažinantis SDS-PUSLAPIS

HPV16 L1, L1:P18I10 ir L1:T20 VLP buvo sumaišyti su 2 × Laemmli mėginio buferiu (BIO-RAD), nesant 5 % (v/v) 2-merkaptoetanolio ({{11}). }ME) ir reagavo kambario temperatūroje (RT) 24 valandas. Mėginiai buvo atskirti 8–16% TGX be dėmių baltymų geliais (BIO-RAD). Tada geliai buvo perkelti į PVDF membranas. Membranos buvo tiriamos anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb praskiedimu 1:4000. Po to membranos buvo inkubuojamos su anti-pelės IgG peroksidazės konjugatu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV), praskiedus 1:4000. Signalas buvo sukurtas ir vizualizuotas chemiliuminescencijos būdu, naudojant Western Blot ECL substrato rinkinį (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV). Blotiniai vaizdai buvo gauti naudojant Odyssey Fc vaizdo gavimo sistemą.

2.8. Molekulinės masės analizė

HPV16 L1, L1:P18I10 ir L1:T20 VLP be 2-ME apdorojimo buvo išfiltruoti per 1000 kDa molekulinės masės ribinės vertės (MWCO) ultrafiltravimo prietaisus (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 ir L1:T20 VLP su 2-ME apdorojimu buvo praleisti per 100 kDa MWCO ultrafiltravimo įrenginius („Amicon“). Retentatai buvo atstatyti iki pradinio tūrio ir surinkti iš filtro įrenginio mėginio rezervuaro, o filtratai buvo surinkti centrifugos mėgintuvėlio apačioje. L1 signalas buvo matuojamas naudojant taškinį blotą, zonduotą anti-HPV16 L1 mAb ir aptiktas anti-pelės IgG-peroksidazės konjugatu (Sigma-Aldrich). Vaizdai buvo gauti naudojant Odyssey Fc vaizdo gavimo sistemą chemiliuminescenciniame kanale.

Cistanche tubulosa privalumai- stiprinti imuninę sistemą

2.9. Neigiamo dažymo ir perdavimo elektronų mikroskopija

Įkrovus anglimi dengtus varinius tinklelius (Sigma-Aldrich) ultravioletinėje šviesoje 5 minutes, komerciniai HPV16 L1 (Abcam), išgryninti L1:P18I10 ir L1:T20 VLP subalansuoti 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, 137 mM NaCl). ) buvo absorbuoti ant grotelių 1 minutę ir tris kartus nuplauti miliQ vandeniu. ŽPV: ŽIV VLP buvo neigiamai nudažyti 2% uranilo acetatu, esant pH 4,5 (Sigma-Aldrich), 1 minutę. Dažymo priemonių perteklius buvo pašalintas Whatman kokybiniu filtravimo popieriumi (Sigma-Aldrich). Tinkleliai buvo dedami į sausinimo kamerą mažiausiai 2 valandas prieš stebėjimą. Vaizdai buvo gauti naudojant perdavimo elektronų mikroskopą (Tecnai Spirit 120 kV) atitinkamai padidinus SA135K (100 nm) ir SA59000 (200 nm).

2.10. Natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforezė ir Western blot analizė

Lygiai (500 ng) HPV16 L1 baltymo (Abcam), išgryninto L1:P18I10 ir L1:T20 VLP buvo sumaišyti su 2 × Laemmli mėginio buferiu, kuriame yra 5% 2-ME, ir virinami 95 ◦C temperatūroje 5 min. . Mėginiai buvo atskirti 8–16% TGX be dėmių baltymų geliais ir po to perkelti į PVDF membraną (Millipore, Burlington, MA, JAV), naudojant pusiau sausą perkėlimo įrenginį (Bio-Rad). Membrana buvo užblokuota 5% nugriebtu pienu TBST. Tada membranos buvo tiriamos anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb, praskiedimu 1:4000, anti-ŽIV-1 gp120 V3 kilpos mAb (NIBSC, EVA3012), praskiedus 1: 40 ir ŽIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063), praskiedus atitinkamai 1:4000. Po to membranos buvo inkubuojamos su anti-pelės IgG peroksidazės konjugatu (Sigma-Aldrich), praskiedus 1:4000. Signalo kūrimui buvo naudojamas Vakarų ECL substrato rinkinys (BIO-RAD). Blotiniai vaizdai buvo gauti naudojant Odyssey Fc vaizdo gavimo sistemą chemiliuminescenciniame kanale.

2.11. Pelių imunizacija, serumų rinkimas ir splenocitų išskyrimas

Tai preliminarus koncepcijos įrodymo tyrimas, skirtas parodyti ŽPV imunogeniškumą: ŽIV VLP (L1:P18I10 ir L1:T20 VLP). Mūsų ŽPV dozė, vartojimo būdas ir pirminio padidinimo intervalas: ŽIV VLP nurodė ankstesnius tyrimus, kuriuose pelės buvo imunizuotos galvijų papilomos virusu (BPV): ŽIV VLP, skirtos antikūnų atsakams sukelti [20, 21]. Išgrynintas ŽPV: ŽIV VLP buvo emulsuoti vienodu tūriu (225 µg kiekvienai 0,5 ml dozei) aliuminio hidroksifosfato sulfato (Thermo Fisher), kad būtų užtikrinta panaši formulė kaip licencijuotos Gardasil -9 ŽPV vakcinos [40]. Visose pelių grupėse buvo vienodas lyčių pasiskirstymas (vienoje grupėje vyrų n=4 ir patelių n=4). A ir B grupėse BALB/c pelės buvo imunizuotos į raumenis (im) atitinkamai 10 µg L1:P18I10 arba L1:T20 VLP, laikantis homologinio pirminio padidinimo režimo. C grupėje pelėms buvo įšvirkšta 106 cfu BCG.HIVA2auxo.int į odą (id, prie maisto padėklo) ir į raumenis buvo sustiprinta 10 µg L1:P18I10 VLP. D grupėje teigiamos kontrolinės pelės buvo inokuliuotos Gardasil - 9 prime, po to Gardasil-9 į raumenis 10 µg HPV16 L1 VLP. E grupėje neigiamos kontrolės pelės buvo du kartus imunizuotos PBS buferiu. Pagrindinio pastiprinimo intervalas buvo 2 savaitės. Pelės buvo nužudytos 28 dieną. Kraujo mėginiai buvo paimti iš pelių širdžių. Serumai buvo paimti centrifuguojant ir laikomi –20 ◦C temperatūroje ELISA tyrimui. Pelių blužnies buvo pašalintos ir atskirai nuspaustos per ląstelių sietelį (Falcon) su 5 ml švirkšto guminiu stūmokliu. Pašalinus raudonuosius kraujo kūnelius ACK lizavimo buferiu (Lonza), splenocitai buvo nuplauti ir resuspenduoti limfocitų terpėje R10 (RPMI 1640, papildyta 10% veršelio vaisiaus serumu (FCS), penicilinu-streptomicinu, 20 mM HEPES ir 15 mM {{ 46}}ME) esant 2 × 107 ląstelių/ml koncentracijai.

2.12. Imunofermentinis tyrimas

HPV16 L1- ir ŽIV-1-specifinių antikūnų, jungiančių chimerinį ŽPV, tyrimas: ŽIV VLP konstrukcijos in vitro, 50 µL vienodos koncentracijos (200 ng/mL) rekombinantinio HPV16 L1 baltymo (Abcam, ab119880). ), išgryninti L1:P18I10 ir L1:T20 VLP 50 mM karbonato bikarbonato buferyje (pH=9.6) (Sigma) buvo 2-karto nuosekliai atskiesti ir padengti Maxisorb plokštelėmis (Nunc). Plokštelės buvo inkubuojamos 4 ◦ C temperatūroje per naktį. Plokštelės buvo blokuojamos blokuojančiu buferiu (5% nugriebto pieno TBST) 37 ◦C temperatūroje mažiausiai 2 valandas. Du kartus išplovus TBST, VLP dengtos plokštelės buvo inkubuojamos su anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb, praskiedimu 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) praskiedimu 1:8000 ir anti- ŽIV-1 gp120 V3 kilpos mAb (NIBSC, EVA3012), praskiedus atitinkamai 1:40 blokuojančiame buferyje, 37 ◦C temperatūroje 2 val. Tris kartus nuplovus TBST, plokštelės buvo inkubuojamos su rekombinantiniu baltymo G peroksidazės konjugatu (Thermo Scientific, Waltham, MA, JAV), praskiedus 1:4000 blokuojančiame buferyje 37 ◦C temperatūroje 1 valandą. TMB buvo naudojamas su fermentu susieto imunosorbento tyrimo (ELISA) signalui sukurti ir sustabdytas 50 µL 2M H2SO4. Kiekvieno šulinio optinis tankis (OD) buvo išmatuotas ir užregistruotas esant 450 nm bangos ilgiui, naudojant EL × 800 absorbcijos mikroplokštelių skaitytuvą.

Norint išmatuoti VLP sukeltus antikūnus BALB/c pelėms, mikrotitravimo plokštelės buvo padengtos 50 µl 2 µg/ml rekombinantinio HPV16 L1 baltymo (Abcam, ab119880), ŽIV-1 P18I10 peptido (NIBSC, ARP734). T20 peptidas (NIBSC, ARP984) atitinkamai su 50 mM karbonato-bikarbonato buferiu (pH=9,6). Plokštelės buvo inkubuojamos 4 ◦ C temperatūroje per naktį. Plokštelės buvo blokuojamos blokuojančiu buferiu (5% nugriebto pieno TBST) 37 ◦C temperatūroje mažiausiai 2 valandas. Tuo pačiu metu serumai, surinkti iš grupės AE imunizuotų pelių, buvo atskiesti 5% nugriebtu pienu TBST santykiu 1:50. Du kartus nuplovus TBST, plokštelės buvo inkubuojamos su atskiestu serumu 37 ◦ C temperatūroje 2 valandas. Tris kartus nuplovus TBST, plokštelės buvo pridėtos rekombinantinio baltymo G HRP konjugato, praskiedus 1:4000 blokuojančiame buferyje, ir inkubuojamos 37 ◦ C temperatūroje 1 valandą. TMB buvo naudojamas ELISA signalui sukurti ir sustabdytas 50 µL 2M H2SO4. Kiekvieno šulinio OD buvo matuojamas esant 450 nm bangos ilgiui, naudojant EL × 800 absorbcijos mikroplokštelių skaitytuvą (Biotek).

2.13. IFN-ELISpot tyrimas

Su fermentu susietas imuninės absorbentinės dėmės (ELISpot) tyrimas buvo atliktas naudojant komercinį pelių IFN-ELISpot rinkinį (Mabtech, Nacka Strand, Švedija), pagal gamintojo instrukcijas. ELISpot plokštelės (MSISP4510, 96-šulinėlių plokštelės su polivinilideno difluorido membranomis, Millipore, Middlesex County, MA, JAV) buvo apdorotos 70 % EtOH ir padengtos išgrynintu anti-pelės interferono (IFN-) gaudymo monokloniniu antikūnu, praskiestu fosfatiniu buferiniu fiziologiniu tirpalu (PBS) iki galutinės koncentracijos 5 µg/mL 4 ◦C temperatūroje per naktį. Tada į kiekvieną šulinėlį buvo pridėta 2, 5 × 105 šviežių splenocitų. Vėliau A ir B grupių ląstelės buvo stimuliuojamos atitinkamai 2 µg/mL HPV16 L1 VLP ir ŽIV -1 P18I10 peptidais. Visi mėginiai ir kontroliniai mėginiai buvo dedami į du kartus. ELISpot tyrimai buvo inkubuojami 16 valandų 37 ◦C temperatūroje, 5 % CO2. Vėliau plokštelės buvo plaunamos 5 kartus PBS, 2 valandas inkubuojamos su biotiniluotu anti-IFN-monokloniniu antikūnu (mAb), praskiestu PBS 2% vaisiaus veršelio serume (FCS), iki galutinės koncentracijos 2 µg/ml, plaunamos 5 kartus. PBS ir inkubuojamas su streptavidino-šarminės fosfatazės konjugatu PBS 2% FCS. Tada plokštelės 5 kartus plaunamos PBS ir inkubuojamos su 100 µl 5-bromo-4-chlor-3-indolilfosfato (BCIP)/nitro mėlynojo tetrazolio (NBT) substrato tirpalo (Sigma-Aldrich). , Sent Luisas, MO, JAV). Po 5–10 minučių plokštelės buvo nuplaunamos vandeniu iš čiaupo, išdžiovinamos, o susidariusios dėmės suskaičiuotos naudojant ELISPOT skaitytuvą (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Vokietija). Kiekvieno gyvūno fono atsakų vidurkis buvo atimtas atskirai iš visų šulinėlių, kad būtų galima palyginti IFN dėmę formuojančias ląsteles (SFC) / 106 tarp grupių. Norint apibrėžti teigiamus atsakus, slenkstis buvo apibrėžtas kaip bent penki dėmės vienoje duobutėje ir atsakai, viršijantys vidutinį dėmių skaičių neigiamos kontrolės šulinėliuose, pridėjus tris standartinius neigiamų kontrolinių duobučių nuokrypius.

2.14. Statistinė analizė

Visa statistinė analizė buvo atlikta naudojant Prism 6 GraphPad programinę įrangą (CA, JAV). Naudojome duomenis iš eksperimentų, atliktų naudojant 5 skirtingas ELISA plokštelės dangos koncentracijas (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) rekombinantinio HPV16 L1 baltymo (Abcam, ab119880) ir ŽPV: ŽIV VLP. Mes surinkome duomenis iš 2 grupių (HPV16 L1 ir ŽPV: ŽIV VLP) ir surinkome tris kiekvienos dangos koncentracijos pakartojimus. Diagrama „Prism“ parodė duomenis kaip sklaidos diagramą, rodančią dangos koncentraciją (ng/mL) X ašyje ir OD450 Y ašyje. Kadangi iškėlėme hipotezę, kad mūsų in vitro ELISA duomenys yra susiję tiesiniu būdu, atlikome tiesinės regresijos analizę ir palyginome dviejų linijų nuolydžius, kad patvirtintume duomenų rinkinį-1 ir duomenų rinkinį-2 (antikūnas). reaktyvumas tarp ŽPV16 L1 ir ŽPV: ŽIV VLP) skiriasi savo veiksmais. Kartu su geriausiai tinkančia linija pasirinkome 95 % pasikliovimo intervalus. Prizmė automatiškai uždengia tiesinę regresijos liniją abiejuose mūsų duomenų rinkiniuose ir nubrėžė punktyrinę liniją, atspindinčią 95% pasikliautinuosius intervalus. Linijinės regresijos analizės metu programinė įranga apskaičiavo tik vidutinę mūsų duomenų rinkinio Y vertę, kuri parodė tinkamumo gerumą. Be to, Prism pateikė mums komentarą, todėl galime daryti išvadą, kad skirtumai tarp dviejų šlaitų yra itin reikšmingi.

Turėjome 5 rinkinius (ELISA) ir 4 rinkinius (ELISPOT) duomenų, surinktų iš pelių imunizacijos eksperimentų. Šių duomenų rinkinių kiekvienoje grupėje buvo vienodas skaičius (vyrų n=4 ir moterų n=4). Kaip teigiamą kontrolinę grupę naudojome imunizuotas Gardasil{4} peles, o kaip neigiamą kontrolinę grupę – imunizuotas PBS. Mūsų suplanuotų eksperimentų duomenys neatitiko arba nesusieti. Mes atlikome vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), kad išsiaiškintume, ar šie vidurkiai skiriasi. Pirmiausia patikrinome, ar mūsų duomenys atitinka Gauso normalųjį pasiskirstymą. Mes nustatėme, kad kai kurios ELISA tyrimo duomenų grupės neatitiko Gauso normalaus pasiskirstymo testo. Todėl atlikome neparametrinę šių duomenų statistinę analizę. Priešingai, visos duomenų grupės ELISPOT tyrime praėjo Gauso normalaus pasiskirstymo testą. Taigi atlikome šių duomenų parametrinę statistinę analizę. Reikšmingumo slenkstis ir pasikliovimo lygis buvo nustatyti į 0,05 (atitinka 95 % pasikliautinąjį intervalą). p reikšmė, bendrai rodanti tikimybę, kad tarp grupių yra skirtumų. Kadangi mūsų pagrindinis rūpestis dėl šio eksperimento yra mūsų grupių skirtumai, daugkartiniai palyginimai Prism davė mums visų grupių palyginimo su visomis kitomis grupėmis rezultatą.

2.15. Etikos pareiškimai

Šešių – aštuonių savaičių BALB/c pelės buvo įsigytos iš Envigo (Inotiv Company, Čikaga, IL, JAV) ir patvirtintos vietos valdžios institucijų (Generalitat de Catalunya, projekto numeris 11157) ir Universitat Autònoma de Barcelona etikos komiteto. Eksperimentai su gyvūnais griežtai atitiko Generalitat de Catalunya teisės aktus dėl gyvūnų gerovės. Visus eksperimentus patvirtino vietinis tyrimų etikos komitetas (procedūra 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Rezultatai

3.1. L1:P18I10 ir L1:T20 imunogenų projektavimas ir ŽPV įvertinimas: ŽIV baltymų ekspresija naudojant 293F ekspresijos sistemą

P18I10 peptidas iš ŽIV-1 Env trečiojo kintamo domeno (V3) kilpos ir T20 peptidas iš ŽIV-1 Env membranos proksimalinės išorinės srities (MPER) buvo įterptas į HPV16 L1 DE kilpos baltymą, kad būtų sukurtas chimerinis L1. :P18I10 ir L1:T20 imunogenai. Chimerinės L1:P18I10 ir L1:T20 DNR koduojančios sekos buvo klonuotos į pcDNA3.1 (+) plazmidės DNR ekspresijos vektorių trumpalaikei transfekcijai 293F ląstelėse (1A pav.). HPV16 L1, chimerinių L1:P18I10 ir L1:T20 kapsidų baltymų monomerų struktūros buvo preliminariai prognozuojamos naudojant SWISS modelio serverį (1B pav.). HPV16 pagrindinis kapsidės baltymas L1 (7cn2.1.R) buvo pasirinktas kaip struktūrinis šablonas HPV16 L1, L1:P18I10 ir L1:T20 kapsidės baltymo homologijos modeliavimui. Palyginti su surišto P18I10 peptido konformacija ankstesniame tyrime [41], mūsų chimerinio L1:P18I10 baltymo P18I10 peptido pagrindinės grandinės kryptis nuo N iki C galo eina iš dešinės į kairę (1B pav., vidurinė ir viršutinė plokštė). ir eksponuojamos P18I10 šoninės grandinės gali sąveikauti su T ląstelių receptoriais (1B pav., vidurinė ir apatinė plokštės). Palyginti su ŽIV-1 sintezės inhibitoriaus peptido struktūra ankstesniame apžvalginiame dokumente [42], į HPV16 L1 kapsido baltymą įterptas T20 peptidas pateikiamas kaip į spiralę panašus darinys (1B paveikslas, dešinysis ir viršutinis skydeliai). ), o atviras T20 šonines grandines gali atpažinti B ląstelių receptoriai (1B paveikslas, dešinysis ir apatinis skydeliai). Kadangi HPV16 L1 kapsidų baltymai gali homogeniškai susiburti į T=7 ikosaedrinę dalelę su 72 pentameriniais kapsomerais [43], didelio tankio P18I10 arba T20 peptidų rodymas išoriniame chimerinio ŽPV paviršiuje: ŽIV VLPs gali būti stipriai imunostimuliuojantis. sukelti epitopui specifinį imuninį atsaką.

1 pav. L1:P18I10 ir L1:T20 imunogeno projektavimas ir chimerinio ŽPV: ŽIV VLP konstravimas naudojant 293F ekspresijos sistemą. (A) Chimerinės L1:P18I10 ir L1:T20 DNR koduojančios sekos buvo klonuotos atitinkamai į pcDNA3.{13}} ekspresijos vektorius trumpalaikei transfekcijai 293F ląstelėse. (B) HPV16 L1 ir chimerinio ŽPV monomerų struktūrų numatymas: ŽIV kapsidų baltymai, naudojant SWISS modelio serverį. HPV16 pagrindinis kapsidės baltymas L1 (7cn2.1.R) buvo pasirinktas kaip struktūrinis šablonas HPV16 L1 (kairysis skydelis), L1:P18I10 (vidurinis skydelis) ir L1:T20 (dešinysis skydelis) kapsidės baltymo homologijos modeliavimui. Antriniai struktūriniai HPV16 L1 kapsidės baltymo elementai yra pažymėti raidėmis h1–h5, žyminčiomis 5 -spirales. HPV16 L1 kapsido baltymo kilpos tarp sruogų yra pažymėtos BC, CD, DE, EF, FG ir HI. Antriniai struktūriniai ŽIV-1 P18I10 ir T20 peptidų L1 elementai pažymėti rodyklėmis (viršutiniame skydelyje). P18I10 ir T20 peptidų dalis, išsikišusi virš HPV16 L1 kapsido baltymo paviršiaus, pažymėta rodyklėmis (apatinė plokštė). (C) L1 baltymo dažymas imunofluorescenciniu būdu 293F ląstelėse. Šie pDNA.L1:P18I10 (kairėje), pDNA.L1:T20 (viduryje) ir pDNA.be įterpimo (dešinėje) buvo transfekuoti į 293F ląsteles. Transfekuotos ląstelės buvo tiriamos anti-HPV16 L1 mAb ir aptiktos anti-pelės IgG-FITC (žaliuoju kanalu). Ląstelių branduoliai buvo nudažyti DAPI (mėlynuoju kanalu). Imunofluorescenciniai vaizdai buvo sujungti naudojant „Adobe Photoshop“.

Kadangi infekcijos metu HPV16 L1 baltymo C galinė seka tarpininkauja ląstelių branduolio importo mechanizmams [44], ankstesniuose tyrimuose buvo nustatyti HPV16 L1 baltymo branduolio lokalizacijos signalai (NLS) [45]. CAMVIR-1 monokloninis antikūnas buvo pasirinktas taip, kad atpažintų HPV16 L1 epitopą (GFGAMDF, 230–236 aa) [39], o fluoresceino pagrindu pagamintas FITC dažiklis buvo naudojamas kaip reporteris L1:P18I10 ir L1 ekspresijai stebėti: T20 baltymai. Imunofluo atvaizdai aiškiai parodė, kad HPV16 L1 (žalia spalva) daugiausia buvo lokalizuota 293F ląstelių branduoliuose (mėlyna spalva). Kontrolinėmis plazmidėmis perskirtose 293F ląstelėse (pcDNA3.1 plazmidė be intarpo) L1 signalo nepastebėta (1C pav.). Rezultatai rodo, kad tiek chimeriniai L1:P18I10, tiek L1:T20 kapsidų baltymai gali būti ekspresuojami naudojant polietilenimino (PEI) sukeltą transfekciją ir atpažinti HPV16 L1 CAMVIR-1 monokloniniu antikūnu.

3.2. L1:P18I10 ir L1:T20 VLP valymas naudojant chromatografinius metodus

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa ir heterologinė apatinė juosta<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

2 pav. L1:P18I10 ir L1:T20 VLP gryninimas ir apibūdinimas. (A) L1:P18I10 ir L1:T20 VLP gryninimo chromatografija schema. (B, C) L1:P18I10 ir L1:T20 VLP mėginių iš kiekvieno gryninimo etapo Western blot analizė. L1 signalas kiekviename gryninimo etape buvo apibūdintas Western blot analize, tiriant anti-HPV16 L1 mAb. Rodyklė rodo ~ 56 kDa L1: P18I10 ir ~ 58 kDa L1: T20 baltymų molekulinę masę. 1 juosta: nuskaidrintas ląstelių lizatas (CCL); 2 juosta: pratekėjimas (FT) iš katijonų mainų chromatografijos (CEC) mėginio įkrovimo; 3 juosta: CEC eliuatas; 4 juosta: FT iš CEC 2M NaCl regeneravimo pakopos; 5 juosta: dydžio išskyrimo chromatografija (SEC) FT-1; 6 juosta: SEC FT-2; 7 juosta: FT iš heparino afininės chromatografijos (H-AC) mėginio įkėlimo; 8 juosta: H-AC eliuatas; 9 juosta: FT iš H-AC 2M NaCl regeneracijos pakopos; 10 juosta: 10-lankstinė diafiltracija.

3.3. L1:P18I10 ir L1:T20 VLP stabilumas in vitro ir savaiminis surinkimas

Siekdami patvirtinti, kad išgryninti ŽPV: ŽIV VLP in vitro stabiliai buvo panašūs į HPV16 L1 VLP, atlikome neredukuojantį SDS-PAGE, kad įvertintume ŽPV: ŽIV kapsidės baltymų disulfidinį kryžminį ryšį (3A pav.). Yra žinoma, kad pH, jonų stiprumas, temperatūra [52] ir redokso aplinka koreliuoja su HPV16 L1 kapsidų baltymų disulfidinėmis jungtimis [53]. HPV L1 VLP yra linkę savarankiškai surinkti esant žemam pH ir dideliam jonų stiprumui. Norint maksimaliai išardyti VLP, paprastai reikia gana ilgą laiką veikti didelės koncentracijos redukuojančiu agentu, pvz., 5 % 2-merkaptoetanolio (2-ME) [54]. Nesant redukuojančių agentų 2-ME, tik nedidelė HPV-16 L1, L1:P18I10 ir L1:T20 baltymų dalis migravo į monomerus, kurių tariama molekulinė masė (MW) yra 55 kDa. . Maždaug 70% L1 baltymų buvo disulfidiniai sujungti į didesnius dimerus arba pentamerus, kurių numatomas MW buvo 110 kDa ir 280 kDa (3A pav., 2, 4 ir 6 juostos). Priešingai, beveik visi HPV-16 L1, L1:P18I10 ir L1:T20 baltymai išardymo buferyje pasirodė kaip monomerinės struktūros neredukuojančiame SDS-PAGE (3A pav., 3, 5 ir 7 juostos). Šie rezultatai parodė, kad išgrynintų L1:P18I10 ir L1:T20 VLP stabilumas in vitro parodė panašius disulfidų kryžminimo modelius kaip ir HPV16 L1 VLP esant tokioms pačioms pH, jonų stiprumui ir šiluminėms sąlygoms. Atrodo, kad išgryninti VLP suskaidomi iki pentamerių, trimerių ir dimerų lygio po ilgalaikio didelio redukuojančių medžiagų koncentracijos poveikio. Šie duomenys atitinka ankstesnius tyrimus [53,54] Tačiau ŽPV: ŽIV VLP išardymas dar toli gražu nebuvo baigtas (monomerai).

3 pav. L1:P18I10 ir L1:T20 VLP stabilumas in vitro. (A) L1:P18I10 ir L1:T20 VLP disulfidinis kryžminis ryšys neredukuojančiame SDS-PAGE. HPV16 L1 VLP, išgryninti L1:P18I10 ir L1:T20 VLP buvo sumaišyti su Laemmli mėginio buferiu atitinkamai be 2-merkaptoetanolio (2-ME) arba jame buvo, ir analizuojami neredukuojant. SDS-PUSLAPIS. L1 monomero (55 kDa), L1 dimero (110 kDa) ir L1 pentamero (280 kDa) padėtis pažymėta rodykle. 1 juosta: baltymo molekulinės masės žymuo; 2 juosta: HPV16 L1 VLP; 3 juosta: HPV16 L1 VLP, apdorotas 2-ME; 4 juosta: L1:P18I10 VLP; 5 juosta: L1:P18I10 VLP apdorota 2-ME; 6 juosta: L1:T20 VLP; 7 juosta: L1:T20 VLP apdorota 2-ME. (B) L1:P18I10 ir L1:T20 VLP molekulinės masės analizė. Surinkti VLP, neapdoroti 2-ME (2, 4 ir 6 juostos), buvo išfiltruoti per 1000 kDa molekulinės masės ribinės vertės (MWCO) diafiltravimo įrenginius (viršutinis skydelis). Išardyti VLP, apdoroti 2-ME (3, 5 ir 7 juostos), buvo filtruojami per 100 kDa MWCO išcentrinio filtro įtaisus (apatinis skydelis). Retentatai (R) buvo surinkti iš filtravimo įrenginio mėginių rezervuarų, o filtratai (F) buvo surinkti centrifugos mėgintuvėlių apačioje. L1 baltymo signalas buvo aptiktas naudojant taškinį blotą, zonduotą anti-HPV16 L1 mAb.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) ir buvo išsaugoti retentatuose. Šis modelis sutapo su duomenimis, kurie buvo pastebėti atliekant neredukuojančią SDS-PAGE. Nors visos VLP grupės, apdorotos 2-ME, buvo parodytos monomerinėje juostoje (~ 55 kDa) neredukuojančiame SDS-PAGE (3A pav., 3, 5 ir 7 juostos). Tačiau atitinkamos sumažintos VLP nebuvo išfiltruotos per 100 kDa ultrafiltravimo membranas (3B pav., apatinis skydelis). Šie rezultatai leido manyti, kad chimerinis ŽPV: ŽIV baltymai galėjo savaime susiburti į didesnes daleles, tačiau norint maksimaliai išardyti VLP į monomerus, reikėjo ne tik sumažinti disulfidines jungtis, bet ir kitus denatūruojančius veiksnius, tokius kaip pH ar joninė jėga.

3.4. L1:P18I10 ir L1:T20 VLP morfologinis apibūdinimas

Perdavimo elektronų mikroskopija (TEM) buvo naudojama HPV16 L1 ir ŽPV: ŽIV VLP morfologinei konformacijai ištirti. ŽIV -1 P18I10 ir T20 peptidai buvo atitinkamai įterpti į HPV16 L1 baltymo DE kilpas. Šie komerciniai HPV16 L1 ir chimeriniai ŽPV: ŽIV kapsidų baltymai gali spontaniškai savarankiškai surinkti in vitro į vientisus VLP, kurių skersmuo yra maždaug 50–60 nm (4A–C paveikslas, dešinysis skydelis). Palyginti su ankstesniuose tyrimuose paskelbtomis HPV16 L1 VLP elektroninėmis mikrografijomis [55,56], HPV16 L1, L1:P18I10 ir L1:T20 VLP ikosaedrinė struktūra čia buvo mažiau kontrastinga ir neaiški. Tai galima priskirti neigiamam dėmių reagentui, kurį naudojome šiame tyrime. Neseniai atliktame tyrime, paskelbtame ankstesniame tyrime [37] ir kitame šiuo metu vykstančiame kolegų peržiūros dokumente (duomenys nerodomi), gavome gerą elektroninių mikrografijų kokybę ir skiriamąją gebą, kai iš mielių ir bakulovirusų gauti L1: P18I10 VLP (ta pati chimerinė). konstrukcija) buvo subalansuoti PBS ir neigiamai nudažyti fosfotungsto rūgštimi (PTA). Kadangi šiame tyrime naudojome skirtingas VLP gamybos ir gryninimo sistemas, iš žinduolių ląstelių L1: P18I10 ir L1: T20 VLP buvo subalansuoti Tris-HCl ir neigiamai nudažyti uranilo acetatu. Nors elektronų mikrografijas galima patobulinti, vis tiek galėjome pastebėti aiškų modelį, kad dauguma HPV16 L1, L1: P18I10 ir L1: T20 kapsidų baltymų TEM ekrane gali savarankiškai surinkti į morfologinius VLP (4A–C pav., kairysis skydelis). ). Iš esmės HPV VLP yra apsaugoti nuo agregacijos esant dideliam druskos kiekiui [57]. Kai kurios aptinkamos HPV16 L1 ir ŽPV agregacijos: ŽIV VLPs mažai druskos turinčiame Tris-HCl buferyje buvo matomos esant mažesniam padidinimui (4A–C pav., kairiajame skydelyje). Iš šių rezultatų padarėme išvadą, kad dalinės L1 DE kilpos sekos modifikavimas įterpiant ŽIV-1 P18I10 arba T20 peptidus neturėjo reikšmingos įtakos ŽPV morfologijai: ŽIV VLP.

4 pav. L1:P18I10 ir L1:T20 VLP elektroninės mikrografijos. (A) ŽPV16 VLP morfologija. (B) L1:P18I10 VLP morfologija. (C) L1:T20 VLP morfologija. Išgryninti VLP buvo absorbuoti ant UV įkrautų anglimi dengtų varinių tinklelių ir neigiamai nudažyti 2% uranilo acetatu. Vaizdai buvo gauti naudojant transmisijos elektronų mikroskopiją. Juosta atitinkamai reiškia 200 nm, kai padidinimas yra 59, 000 (kairysis skydelis) ir 100 nm, kai padidinimas 135K (dešinysis skydeliai).

3.5. ŽPV-16 ir ŽIV-1 epitopų pateikimas ir reaktyvumas 

Siekiant patvirtinti, kad nuoseklūs ŽIV -1 P18I10 arba 2F5 epitopai buvo pateikti chromatografijos būdu išgrynintuose L1:P18I10 arba L1:T20 VLP, buvo atlikta Western blot analizė ir netiesioginė ELISA naudojant epitopui specifinius mAb. Mes pasirinkome gerai žinomą monokloninį antikūną (mAb), pavadintą CAMVIR-1, kad atpažintume labai konservuotą HPV16 L1 baltymo epitopą (GFGAMDF, aa 230–236) [39,58]. Anksčiau paskelbtas mAb, nukreiptas į ŽIV-1 gp120 V3 kilpos epitopą (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322), buvo pasirinktas aptikti nuoseklius P18I10 epitopus (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. Kita vertus, T20 peptido apibūdinimui buvo pasirinktas platus neutralizuojantis antikūnas (bnAb), atpažįstantis ŽIV-1 gp41 2F5 epitopą (ELDKWA) prieš daugybę laboratorinių ŽIV-1 padermių [ 60,61]. Western blot tyrimas, atliktas naudojant HPV16 L1 mAb, parodė 55, 56 ir 58 kDa juostas, atitinkančias atitinkamai HPV16 L1, L1:P18I10 ir L1:T20 baltymus (5A, B paveikslai, kairėje). L1:P18I10 baltymo molekulinė masė (MW) buvo panaši į HPV16 L1 baltymą (5A pav., kairėje). Juosta, atitinkanti L1:T20 baltymą, buvo pastebėta šiek tiek didesnė už HPV16 L1 baltymą, kaip prognozuota iš papildomos aminorūgščių sekos (5B pav., kairėje). Maždaug 56 ir 58 kDa juostos, atitinkančios L1:P18I10 ir L1:T20 baltymą, buvo aptiktos Western blot tyrime, zonduojant atitinkamai anti-ŽIV-1 gp120 V3 ir 2F5 mAb (5A pav., B, dešinėje). ). Manėme, kad anti-2F5-dažyto L1:T20 baltymo molekulinė masė (MW) buvo teisinga ir atitiko numatomą 58 kDa (5B pav., dešinėje). Tačiau anti-ŽIV-1 gp120 V3-dažyto L1:P18I10 baltymo MW yra šiek tiek mažesnis (5A pav., dešinėje). Tai gali būti siejama su nevienalyte chimerinių L1: P18I10 baltymų struktūra. Kadangi denatūruojant SDS-PAGE, nuosekli epitopo konformacija gali būti prarasta. Todėl toliau atlikome netiesioginį ELISA, kad parodytume konformacinį P18I10 peptidą, tinkamai pateiktą mūsų chimeriniuose L1: P18I10 VLP (5E pav.). Kita vertus, mūsų naudojamas antikūnas prieš ŽIV{100}} gp120 V3 kilpą atpažino visą ŽIV{103}} V3 kilpą, o ne P18I10 epitopą. Todėl bendras anti-V3 signalas buvo mažesnis (5A, B pav., dešinės plokštės). Nepaisant to, šie rezultatai parodė, kad nuoseklūs ŽIV-1 P18I10 ir T20 peptidai yra pateikti ŽPV: ŽIV VLP.

5 pav. ŽPV-16 ir ŽIV-1 epitopų pateikimas. (A, B) Chimerinių L1:P18I10 ir L1:T20 VLP nuoseklus epitopų aptikimas. Išgryninti L1:P18I10 ir L1:T20 VLP buvo analizuojami Western blot metodu, naudojant anti-HPV16 L1, anti-ŽIV-1 gp120 V3 ir 2F5 mAb. HPV16 L1 VLP buvo naudojami kaip kontrolė. L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) ir L1:T20 (58 kDa) baltymų molekulinė masė pažymėta rodykle. 1 juosta: baltymo molekulinės masės žymuo; 2 juosta: HPV16 L1 baltymas; 3 juosta: L1:P18I10 baltymas; 4 juosta: L1:T20 baltymas. (C, D) HPV16 L1 mAb prisijungimas prie chimerinių L1:P18I10 ir L1:T20 VLP. (E) Anti-ŽIV-1 gp120 V3 mAb prisijungimas prie chimerinių L1:P18I10 VLP. (F) ŽIV-1 2F5 mAb prisijungimas prie chimerinių L1:T20 VLP. Netiesioginių ELISA tyrimų linijinė diagrama buvo atlikta siekiant aptikti rekombinantinių HPV16 L1, L1:P18I10 ir L1:T20 VLP konformacinius epitopus, prijungtus atitinkamai prie anti-L1, anti-ŽIV-1 gp120 V3 arba 2F5 mAb. Duomenys reprezentuoja tris nepriklausomus eksperimentus. Buvo atliktas paprastas tiesinės regresijos testas, siekiant palyginti išgrynintų L1:P18I10 ir L1:T20 VLP linijų skirtumą su standartine komercinių L1 VLP kreive; ns: nereikšminga; ** p < 0,01.

Be to, norėdami nustatyti, ar ŽPV{{{{50}}}} konformaciniai epitopai yra ant ŽPV: ŽIV VLP gali būti identifikuojami pagal gp120 V3 ir 2F5 neutralizuojančius antikūnus in vitro, atlikome netiesioginį ELISA tyrimą, kad patikrintume. epitopų surišimo specifiškumas ir reaktyvumas. Kaip parodyta 5C paveiksle, D, HPV16 L1, L1:P18I10 ir L1:T20 VLP atpažino anti-L1 mAb. Mes atlikome tiesinės regresijos analizę, kad palygintume kiekvienos praskiedimo linijos nuolydį. Rezultatai atskleidė, kad L1: P18I10 arba L1: T20 VLP L1 epitopų surišimo specifiškumas nesiskyrė nuo HPV16 L1 VLP. Be to, anti-ŽIV-1 gp120 V3 mAb galėjo surišti L1:P18I10 VLP, bet ne HPV16 L1 VLP (5E pav.). Be to, 2F5 mAb gali atpažinti L1:T20 VLP, bet ne HPV16 L1 VLP (5F pav.). Atlikus tiesinės regresijos analizę, gp120 V3 epitopų surišimo specifiškumo skirtumas tarp L1:P18I10 ir HPV16 L1 buvo itin reikšmingas (p < 0,01%). L1:T20 VLP surišimo su epitopu specifiškumas 2F5 reikšmingai skyrėsi nuo HPV16 L1 VLP (p < 0,01%). Šis modelis atskleidė, kad hidrofobiniai ląstelių lipidai nebuvo būtini norint prijungti 2F{62}}neutralizuojančius antikūnus prie ŽPV: ŽIV VLP in vitro. Nors anti-ŽIV-1 gp120 V3 ir 2F5 neutralizuojančių antikūnų prieš ŽPV: ŽIV VLP reaktyvumas yra palyginti nedidelis, anti-ŽIV-1 gp120 V3 ir 2F5 mAb prisijungimas prie ŽPV: ŽIV VLP buvo reikšmingas. specifinis epitopui.

3.6. L1:P18I10 ir L1:T20 VLP imunogeniškumas po BALB/c pelių imunizacijos

Įvertinome ŽPV16- ir ŽIV-1-specifinius imuninius atsakus po BALB/c pelių imunizacijos L1:P18I10 ir L1:T20 VLP. Imunizacijos grafikas parodytas 6A paveiksle. Kadangi VLP sukeltas imunogeniškumas po vartojimo per gleivinę paprastai buvo silpnesnis nei sisteminio vartojimo, pelės buvo imunizuotos į raumenis šeštadaliu Gardasil{10}} HPV16 L1 dozės [22,62]. Aliuminio hidroksifosfato sulfato adjuvantas, skirtas chimerinio ŽPV dozei (10 µg/100 µL): ŽIV VLPs buvo pritaikytas tokiai pačiai koncentracijai (1 mg/1 ml) kaip ir Gardasil{19}}. Siekiant įvertinti lyčių skirtumus tarp vakcinacijos rezultatų, buvo palygintas antikūnų atsakas tarp pelių patinų (n=4) ir patelių (n=4). L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP ir Gardasil-9 grupėje pelių patelių anti-HPV16 L1 antikūnų atsakas buvo vidutiniškai didesnis nei pelių patinų (6B pav.). 2 iš 4 (50%) L1:P18I10 VLP imunizuotų patelių, 3 iš 4 (75%) L1:T20 VLP imunizuotų patelių ir visos (100%) Gardasil imunizuotos pelių patelės sukėlė didesnį anti-L1 antikūnų titrą nei pelių patinai. Anti-L1 atsakas, kurį sukėlė pelių patelės Gardasil{51}} grupėje, buvo žymiai didesnis nei pelių patinų (p=0.0041) (6B pav.). Labai mažas anti-L1 antikūnų atsakų lygis buvo aptiktas BCG.HIVA pradėjimo ir L1:P18I10 VLP sustiprinimo grupėje. Šis modelis atitinka ankstesnes išvadas, apibūdinančias, kad BCG daugiausia sukelia T ląstelių atsaką, o ne IgG gamybą [63].

6 pav. Humoralinio imuninio atsako sukėlimas L1:P18I10 ir L1:T20 VLP BALB/c pelėms. Imunizacijos grafikas pavaizduotas (A) Visose pelių grupėse buvo vienodas lyčių pasiskirstymas (patinas n=4 ir patelė n=4). A ir B grupės: homologinė pirminė imunizacija su 10 µg L1:P18I10 arba L1:T20 VLP į raumenis (im); C grupė: pradinis 106 cfu rBCG.HIVA intraderminiu būdu (id) ir 10 µg L1:P18I10 VLP im. D grupė: homologinė pirminė vakcinacija su Gardasil -9, kurioje yra 10 µg HPV16 L1 VLP im; E grupė: imunizacija du kartus su PBS buferiu. Pagrindinio pastiprinimo intervalas buvo 2 savaitės. Šio tyrimo galutinis taškas buvo 28 dieną. ELISA tyrimui serumai buvo surinkti ir praskiesti 1:50 titru. (B) ŽPV L1-specifinis IgG pelių patinai ir patelės. (C–E) Epitopui specifinis IgG, sukeltas L1:P18I10 ir L1:T20 VLP. ELISA buvo atlikta siekiant išanalizuoti anti-L1, anti-P18I10 ir anti-T20 IgG, sukeltas BALB/c pelių po skirtingų pirminio padidinimo derinių, kaip aprašyta aukščiau. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± SD Vienpusis ANOVA (neparametrinis) testas buvo atliktas, siekiant palyginti skirtumus tarp grupių. OD: optinis tankis. Ns nėra reikšmingas; ** p < 0,01

Įvertinome, ar pelės, imunizuotos L1:P18110 ir L1:T20 VLP, gali sukelti ŽPV -16 L1-specifinius ir ŽIV-1 epitopui specifinius antikūnus BALB/c pelėse. VLP sukelti IgG antikūnai pelių serumuose buvo išmatuoti ELISA metodu, padengtu atitinkamai rekombinantiniu HPV16 L1 baltymu, P18I10 arba T20 peptidais. Statistinis L1-specifinio IgG skirtumas, kai serumo titras yra 1:50, buvo aptiktas Gardasil-9 grupėje, palyginti su PBS kontroline grupe (p=0.0039). Anti-L1 atsakai tarp Gardasil-9, L1:P18I10 ir L1:T20 VLP imunizuotų pelių buvo panašūs ir reikšmingai nesiskyrė (6C pav.). BCG.HIVA2auxo.int prime ir L1:P18I10 VLP boost pelės sukėlė labai žemą anti-L1 IgG lygį. Šie rezultatai rodo, kad ŽPV: ŽIV VLP imunizuotos pelės gamino tokį patį anti-L1 IgG lygį kaip ir Gardasil {39}}imunizuotos pelės (6C pav.). Nors atrodo, kad L1:P18I10 VLP grupė turi didesnį P18I10 epitopui specifinio IgG lygį nei kitos imunizacijos grupės, šie skirtumai nebuvo statistiškai reikšmingi (6D pav.). Kai kuriose L1:P18I10 VLP imunizuotose pelėse (4 iš 8, 50 %) buvo pastebėti daugiau anti-P18I10 surišančių antikūnų, palyginti su Gardasil -9-imunizuotomis pelėmis. Arba T testo analizė atskleidė, kad skirtumas tarp L1:P18I10 VLP ir Gardasil{63}} grupės buvo reikšmingas (p=0.005) (duomenys nerodomi). L1:T20 VLP grupėje buvo nustatytas žymiai didesnis antikūnų atsakas prieš T20 peptidą, palyginti su Gardasil-9 grupe (p=0,0083). Kaip ir tikėtasi, anti-T20 titrai nebuvo aptinkami naudojant Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP ir BCG.HIVA pirminius kartu su L1:P18I10 VLP padidinimo grupėmis (6E pav.). T20 peptidui specifinio antikūno titras buvo palyginti mažas. Tikėtina, kad taip yra dėl: (1) T20 yra subdominuojantis peptidas; (2) norint sukelti MPER arba 2F5 neutralizuojančius antikūnus, reikia peptidų ir lipidų konjugatų (6E pav.). Apskritai mūsų rezultatai parodė, kad L1:P18I10 ir L1:T20 VLP pelėms gali sukelti ŽPV16-, bet silpną ŽIV-1-specifinį antikūnų atsaką.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Norėdami įvertinti ŽPV ir ŽIV specifinį T-ląstelių imuninį atsaką pelėms, laikėmės imunizacijos grafiko, parodyto 7A paveiksle. Be to, heterologinis BCG.HIVA2auxo.int pradinis ir L1:P18I10 VLP sustiprinimas buvo lyginamas su homologiniu L1:P18I10 VLP pradiniu ir stiprinančiu imunizavimu, siekiant įvertinti specifinių ŽPV16 ir ŽIV-1 T-ląstelių imuninių atsakų dažnį. Nebuvo jokių skirtumų tarp Gardasil{14}} ir PBS grupių dėl IFN sekrecijos po splenocitų stimuliacijos HPV16 L1 VLP. L1- specifinės IFN sekrecijos skirtumai L1:P18I10 VLP ir Gardasil{23}} grupėse taip pat nebuvo reikšmingi. Darėme išvadą, kad silpna L1-specifinė IFN sekrecija gali būti siejama su maža HPV16 L1 VLP koncentracija (2 µg/mL), naudojama kaip stimulas. BCG.HIVA2auxo.int prime ir L1:P18I10 VLP boost grupė sukėlė didesnį IFN išskiriančių splenocitų dažnį ir buvo pastebėti reikšmingi IFN sekrecijos skirtumai, palyginti su pelėmis, paskiepytomis Gardasil-9 grupe (p {{36) }}.0103). 3 iš 8 pelių (~38 %) sukėlė didžiausią L1- specifinį IFN atsaką (7B pav.). Remiantis ankstesniais tyrimais, tai gali būti siejama su nespecifiniu BCG adjuvantiškumu [64–66]. Akivaizdus pradinis poveikis, net ir naudojant laukinio tipo BCG, atitinka rBCG darinių gebėjimą veikti kaip stiprūs adjuvantai vėlesniems stiprinantiems vakcinoms [64, 65]. Kalbant apie ŽIV-1-specifinius T-ląstelių atsakus, didžiausias bendras IFN dėmę formuojančių ląstelių (SFC)/106 splenocitų dydis buvo pastebėtas pelėms, kurios buvo paruoštos BCG.HIVA2auxo.int, palyginti su pelėmis, vartojusiomis Gardasil{54} } vakcinos arba L1:P18I10 VLP. Pelės, paskiepytos BCG.HIVA ir sustiprintos L1:P18I10 VLP, sukėlė žymiai didesnę IFN sekreciją, palyginti su pelėmis, paskiepytomis L1:P18I10 VLP homologiniu pirminiu padidinimu (p=0.0268). Be to, pelių, paskiepytų L1:P18I10 VLP, IFN sekrecija buvo žymiai didesnė, palyginti su pelėmis, kurios buvo skiepytos Gardasil-9 vakcinomis (p=0.0157) (7C pav.). Kaip ir tikėtasi, Gardasil-9 ir PBS grupėse IFN sekrecija nebuvo aptikta. Šie rezultatai parodė, kad (1) L1:P18I10 VLP sukėlė ŽIV-1-specifinį T-ląstelių imuninį atsaką; (2) L1:P18I10 VLP sukėlė ŽPV specifinį T-ląstelių imuninį atsaką ir (3) BCG.HIVA2auxo.int gali sustiprinti ŽIV -1-specifinius T-ląstelių imuninius atsakus, kuriuos sukelia L1:P18I10 VLP.

7 pav. ŽPV16 ir ŽIV-1 specifinių T ląstelių atsakų indukcija chimeriniais L1:P8I10 VLP ir BCG.HIVA BALB/c pelėse. Imunizacijos grafikas pavaizduotas (A). Visos pelių grupės pasiskirstė vienodai pagal lytį (patinas n=4 ir patelė n=4). A grupė: homologinė pirminė imunizacija su 10 µg L1:P18I10 VLP į raumenis (im); B grupė: pradinis 106 cfu rBCG.HIVA intraderminiu būdu (id) ir 10 µg L1:P18I10 VLP im. C grupė: homologinė pirminė vakcinacija su Gardasil -9, kurioje yra 10 µg HPV16 L1 VLP im; D grupė: imunizacija du kartus su PBS buferiu. Pagrindinio pastiprinimo intervalas buvo 2 savaitės. Šio tyrimo galutinis taškas buvo 28 diena. IFN-ELISpot tyrimui buvo išskirti splenocitai. T-ląstelių imuninis atsakas į ŽPV16 ir ŽIV-1 buvo įvertintas ex vivo naudojant IFN-ELISpot po splenocitų stimuliacijos HPV16 L1 VLP ir P18I10 peptidu. (B, C) HPV16 L1- ir ŽIV-1 P8I10-specifiniai T-ląstelių atsakai, kuriuos sukelia L1:P8I10 VLP ir BCG.HIVA pradas kartu su L1:P18I10 VLP pastiprinimu. Duomenys pateikiami kaip mediana ± SD. Buvo atliktas vienpusis ANOVA testas, siekiant palyginti skirtumus tarp grupių. Ns nėra reikšmingas; * p < 0,05.

4. Discussion

Tiek ŽPV16, tiek ŽIV-1 yra lytiniu keliu plintančios ligos ir šiuo metu yra daugelio vakcinų tyrimų objektas. Nors ŽPV profilaktinės vakcinos buvo komercializuojamos, o ŽIV{2}} perdavimas buvo labai kontroliuojamas antiretrovirusiniu gydymu (ART) ir PrEP, veiksminga, saugi ir prieinama chimerinė ŽPV: ŽIV vakcina nuo abiejų virusų yra skubiai reikalinga. Šiame tyrime (1) parodėme, kad 293F ekspresijos sistema ir chromatografinis gryninimo metodas gali būti įmanomi būdai gaminti ir išvalyti chimerinius L1:P18I10 ir L1:T20 VLP; (2) patvirtinome, kad P18I10 arba T20 peptidų įterpimas į HPV16 L1 kapsidų baltymų DE kilpą neturėjo įtakos chimerinio ŽPV stabilumui, savaiminiam susijungimui ir morfologijai in vitro: ŽIV VLP; (3) nuoseklūs ir konformaciniai P18I10 arba T20 peptidai, veikiami chimerinio ŽPV DE kilpų: ŽIV VLP galima aptikti anti-ŽIV-1 gp120 V3 ir 2F5 neutralizuojančiais antikūnais in vitro; (4) Chimeriniai L1:P18I10 ir L1:T20 VLP BALB/c pelėms gali sukelti ŽPV, bet silpnus ŽIV{34}}specifinius surišančius antikūnus. Be to, ŽIV-1 P18I10 arba T20 peptidų įterpimas į HPV16 L1 baltymą neturėjo įtakos HPV16 L1-specifinio antikūno indukcijai in vivo; (5) L1:P18I10 VLP gali sukelti tiek HPV16, tiek ŽIV{48}}specifinius T-ląstelių atsakus; (6) BCG.HIVA pradinis ir L1:P18I10 VLP padidinimas sukėlė didžiausią IFN gaminančių splenocitų skaičių, palyginti su L1:P18I10 VLP homologiniu pirminiu BALB/c pelių stimuliavimu. Šios išvados patvirtino tolesnį ŽIV vakcinų, pagrįstų rBCG ir chimeriniu ŽPV: ŽIV VLP, kūrimą. Apskritai, šis tyrimas pateikia pradinę strategiją, kuri gali būti verta paremti pasaulines pastangas sukurti naujas chimerines VLP pagrindu sukurtas vakcinas, skirtas ŽPV ir ŽIV infekcijoms kontroliuoti.

Šiame tyrime L1:P18I10 ir L1:T20 VLP gali sukelti tokį patį anti-HPV16 L1 surišančių antikūnų kiekį kaip ir HPV Gardasil{8}} vakcina. Tačiau L1:P18I10 ir L1:T20 VLP sukelia tik mažus P18I10 ir T20 epitopams specifinius ŽIV surišančių antikūnų atsakus. Iškėlėme hipotezę, kad tai gali būti dėl to, kad ELISA tyrimo plokštelės buvo padengtos atitinkamai rekombinantiniu HPV16 L1 baltymu, ŽIV-1 P18I10 peptidu ir ŽIV-1 T20 peptidu. Pelių anti-L1 antikūnai, kuriuos sukelia mūsų L1:P18I10 ir L1:T20 VLP, gali būti nukreipti į kelis jungiančius L1 baltymo epitopus. Priešingai, pelių anti-ŽIV-1 antikūnai, kuriuos sukelia mūsų L1:P18I10 ir L1:T20 VLP, yra nukreipti tik į vieną ŽIV peptidą (P18I10 arba T20) ant ŽPV: ŽIV VLP. Todėl bendros didžiausios anti-ŽIV -1 jungiančių antikūnų OD450 vertės buvo daug mažesnės nei anti-HPV16 L1 antikūnų.

Priežastis, kodėl pasirinkome HPV16 L1 kapsidės baltymo DE kilpą kaip preliminarų ŽIV -1 imunogeno įterpimo sritį, buvo susijusi su ankstesniu tyrimu, kurio metu pelės buvo imunizuotos galvijų papilomos virusu (BPV): ŽIV VLP, skirtos antikūnų atsakams sukelti [20]. Yra žinoma, kad epitopai, esantys ŽPV L1 pagrindinių kapsidų baltymų paviršiuje esančiose DE ir FG kilpose, daugiausia prisideda prie vakcinos sukeltų kryžminių neutralizuojančių antikūnų [67]. Be to, ankstesni tyrimai parodė, kad ŽIV-1 MPER įterpimas į BPV L1 DE kilpą gali sukelti iš dalies neutralizuojančius antikūnus, kurie specifiškai atpažįsta natūralią MPER konformaciją ŽIV-1 Env [20]. Tačiau nėra duomenų, ar rekombinantinis BPV L1:MPER VLP turi įtakos imunogeniškumui ir neutralizavimui prieš BPV po ŽIV-1 MPER įterpimo į BPV L1 baltymą. Savo tyrime, naudojant HPV16 L1 VLP kaip ŽIV antigeno pristatymo vektorių, pastebėjome, kad ŽIV-1 peptido įterpimas nepakeitė ŽPV L1 struktūros ir kad chimerinis ŽPV: ŽIV baltymai vis dar gali sudaryti VLP. Be to, įgyvendinome imunoblokavimo koncepciją, kad parodytume panašų imuninį atsaką tarp ŽPV: ŽIV VLP kandidato (mūsų) ir patvirtintos VLP pagrįstos ŽPV vakcinos (licencijuota Gardasil{21}}). Mūsų duomenys atskleidė, kad ŽIV-1 P18I10 arba T20 peptido įterpimas į chimerinį ŽPV: ŽIV VLP gali sukelti panašų HPV16 L1-specifinių surišančių antikūnų titrą, palyginti su HPV Gardasil{28}} vakcina. Tipui specifiniai anti-HPV16 L1 surišantys antikūnai, pastebėti naudojant licencijuotą HPV Gardasil-9 VLP vakciną, palyginti su chimerinėmis HPV Gardasil-9 VLP vakcinos versijomis, atitiko mūsų duomenis.

Optimalaus ŽIV-1 svetimo antigeno, įtraukto į HPV16 L1 VLP, ilgis ir vieta bei gauto chimerinio ŽPV stabilumas in vitro: prieš pelių imunizavimą reikia patikrinti ŽIV VLP. Mūsų dabartinis tyrimas parodė, kad P18I10 arba T20 peptidų įterpimas į HPV16 L1 baltymą neturėjo įtakos chimerinio ŽPV stabilumui, savaiminiam surinkimui ir morfologijai in vitro: ŽIV VLP. Šie rezultatai sutapo su ankstesniais tyrimais, rodančiais, kad ŽIV-1 MPER domeno įterpimas į BPV L1 DE kilpos seką neturėjo įtakos BPV L1 kapsidų baltymo gebėjimui savarankiškai susijungti į VLP [20]. Iš esmės epitopai, esantys paviršiuje veikiamose ŽPV L1 kapsidų baltymų DE ir FG kilpose, daugiausia prisideda prie L1-specifinių kryžminių neutralizuojančių antikūnų susidarymo [67]. Čia parodėme, kad ŽIV-1 P18I10 arba T20 peptidų įterpimas į HPV16 L1 DE kilpą neturėjo įtakos L1-specifinių antikūnų indukcijai chimeriniu ŽPV: ŽIV VLP po pelių imunizacijos. Be to, ŽIV-1 P18I10 arba T20 epitopai ant chimerinio ŽPV HPV16 DE kilpų: ŽIV VLP buvo aptikti in vitro ir buvo imunogeniški in vivo. HPV16 L1 VLP sudaro potencialų pagrindą dominančio ŽIV-1 epitopo paviršiuje. Šiame tyrime atlikome netiesioginį ELISA, kad parodytume konformacinį P18I10 ir T20 peptidą, esantį mūsų chimerinio ŽPV: ŽIV VLP paviršiuje. Ateityje imuninė-elektroninė mikroskopija taip pat galėtų būti papildomas būdas parodyti P18I10 arba T20 antigeno struktūrinę lokalizaciją ir organizavimą ŽPV: ŽIV VLP.

Savarankiškas surinkimas yra tipiškas HPV16 L1 VLP stabilumo in vitro indeksas. Yra žinoma, kad pH, jonų stiprumas, temperatūra [52] ir redokso aplinka koreliuoja su HPV16 L1 kapsidų baltymų disulfidinėmis jungtimis [53]. Ankstesni papilomos viruso VLP darbai parodė disulfidinių jungčių svarbą L1 pagrindinių kapsidų savaiminiam surinkimui [68, 69]. Disulfido susidarymas rodo didesnį L1 kapsidės baltymo cisteino kiekį atitinkamoje geometrijoje [53]. Šie disulfidiniai kryžminiai ryšiai sujungia 175 ir 428 liekanas (ŽPV16), kurios stabilizuoja ŽPV virionus ir VLP [70]. Šiame tyrime išanalizavome tarpmolekulinius disulfidų kryžminius ryšius kaip netiesioginius įrodymus, įrodančius, kad mūsų L1: P18I10 ir L1: T20 kapsidų baltymai yra linkę savarankiškai surinkti in vitro. 3A paveiksle parodėme, kad išgryninti L1:P18I10 ir L1:T20 VLP turi panašius tarpmolekulinius disulfidinius kryžminius ryšius kaip ir HPV16 L1 VLP esant tokioms pat pH, jonų stiprumo ir šiluminėms sąlygoms. 3B paveiksle mes taip pat parodėme, kad išgryninti L1:P18I10 ir L1:T20 baltymai galėjo savarankiškai susijungti į didesnes daleles (didesnes nei L1 pentameris, MW 280 kDa) in vitro. Todėl kartu su morfologiniu savaiminio susikaupimo VLP modeliu (nors ikosaedrinė struktūra nebuvo gana gera), pastebėtu 4 paveiksle, padarėme išvadą, kad mūsų išgrynintas chimerinis ŽPV: ŽIV VLP yra stabilūs in vitro. Be VLP stabilumo, reikia atsižvelgti į daugelį kitų svarbių veiksnių, galinčių turėti įtakos chimerinio ŽPV imunogeniškumui: ŽIV VLP, pvz., imunogeno įterpimo vieta tarp skirtingų VLP kilpų [71], dozė, pirminio sustiprinimo intervalai ir vartojimo būdas [22]. ir kt.

P18I10 peptidai, gauti iš ŽIV-1 gp120 V3 kilpos, yra pateikiami ŽIV infekuotose ląstelėse per pagrindinio histokompatibilumo komplekso (MHC-I) I klasės molekules [26]. CD8+, citotoksiniai T limfocitai (CTL), gali atpažinti MHC-I apribotus P18I10 antigenus ir išskirti įvairius citokinus, tokius kaip IFN, kad pašalintų ŽIV infekuotas ląsteles [72–75]. Rekombinantinė virusinė arba plazmidinė DNR yra geras vakcinos nešiklis, galintis ekspresuoti P18I10 peptidus ląstelėse-šeimininkėse ir sukelti specifinius P18I 10- ląstelių atsakus per MHC-I kelią [76–79]. Pavyzdžiui, kombinuoto DNR pradinio ir modifikuoto Ankaros vakcinijos viruso (MVA) pastiprinimo režimo pakako IFN ir CTL atsakams prieš P18I10 epitopą sukelti [79]. Priešingai, egzogeniniai P18I10 peptidai nėra efektyviai pristatomi CD8+ T-ląstelėms MHC-I keliu [80,81] ir reikalauja atitinkamų adjuvantų [82–85] arba antigeno nešėjų, pvz. VLP. Pavyzdžiui, sintetinių P18I10 peptidų, papildytų adjuvantais, imunogeniškumas buvo nedidelis, nes nebuvo T pagalbininkų determinantų [82–85]. Anksčiau buvo pranešta, kad ŽIV-1 Gag VLP [86], hepatito B paviršiaus antigeno (HBsAg) VLP [87], parvoviruso VP2 VLP [88] ir papilomos viruso L1 VLP [17–19] gali veikti kaip MHC-I apriboto CTL epitopo pateikimo in vivo pristatymo vektoriai. Nors VLP sukeltų MHC-I apribotų T-ląstelių atsakų mechanizmas vis dar neaiškus, VLP dalelių struktūra gali būti naudinga makrofagų arba dendritinių ląstelių endocitiniam įsisavinimui, taip patekdama į citozolį ir vėliau į tipišką MHC-I kelią [89, 90]. Be to, buvo pastebėta, kad MHC-I apribotas P18I10 determinantas sukelia CD4+ pagalbinių T-ląstelių atsaką per MHC-II kelią [91,92]. Hibridiniai BPV1 L1 VLP gali būti naudojami kaip antigeniniai epitopų nešėjai, siekiant sukelti terapinį virusui specifinį CTL atsaką per MHC-I ir MHC-II kelius [17, 19], o tai yra perspektyvi vakcinos dizaino strategija virusinei infekcijai kontroliuoti. Kai kurie ankstyvieji tyrimai taip pat parodė BPV L1 VLP, ekspresuojančius ŽIV -1 gp120 V3 kilpos sukeltų gleivinės paviršių HPV16 E7 epitopą arba P18I10 epitopą, taip pat sisteminį VLP epitopui specifinį humoralinį ir T ląstelių imunitetą [18]. Remiantis ankstesniais tyrimais, mes preliminariai įrodėme, kad mūsų chimerinis ŽPV: ŽIV (L1: P18I10) VLP gali sukelti ŽIV specifinį T-ląstelių imuninį atsaką BALB/c pelėms po splenocitų stimuliacijos P18I10 peptidu. Be to, BCG.HIVA pradėjimas sustiprino ŽIV -1-specifinį T-ląstelių imuninį atsaką pelėms. Tačiau daugiafunkciniams T-ląstelių imuniniams atsakams, kuriuos sukelia L1: P18I10 VLP, reikės tolesnių imunologinių tyrimų.

Platesnis CD{0}} T-ląstelių atsakas prieš kelis konservuotus CTL epitopus yra naudingas siekiant įveikti ŽIV-1 genetinę įvairovę ir pabėgti [7,93–100]. Racionalus ŽIV-1 T-ląstelių imunogenų, tokių kaip ŽIVA, dizainas turėtų turėti galimybę reaguoti į kelis CTL epitopus [34]. ŽIV-1 ŽIVA imunogenas, sukurtas dr. Tomas Hanke, sudarytas iš viso ilgio ŽIV-1 Gag baltymo, sujungto su keliais CTL epitopais, įskaitant P18I10 epitopus C gale [34]. DNR, MVA ir rBCG buvo parinktos kaip ŽIVA imunogeno tiekimo priemonės ir sukėlė didelio CTL epitopui specifinio ląstelių atsako dydį ir platumą, naudojant heterologinius pirminio padidinimo režimus pelių ir nežmoginių primatų (NHP) modeliuose [34, 101]. Ankstesni mūsų tyrimai parodė, kad BCG.HIVA pradas kartu su MVA.HIVA padidino BALB/c pelėms specifines IFN gaminančias CD{23}} T-ląsteles [31–33,102]. Įdomu tai, kad VLP gali būti potencialus stiprintuvas, padidinantis ŽIV specifinį ląstelių atsaką heterologinėje imunizacijoje rBCG [29, 30] arba DNR vakcinomis [103, 104]. Pavyzdžiui, rBCG, ekspresuojantis ŽIV-1 Gag baltymas, gali veiksmingai suaktyvinti T-ląstelių imuninę sistemą, kad NHP modeliuose sustiprintų Gag VLP [29, 30]. Dabartiniame tyrime parodėme, kad BCG.HIVA pradėjimas gali sustiprinti T-ląstelių imuninį atsaką, kurį sukelia ŽPV: ŽIV (L1:P18I10) VLP. Toliau tirsime polifunkcinių CD4+, CD{8+ ir atminties T-ląstelių atsakų, sugeneruotų šio rBCG pirminio ir VLP padidinimo režimo, mastą.

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Šiuo metu mūsų tyrimų grupė daugiausia dėmesio skiria perspektyvių rBCG kūrimui: ŽIV vakcinos, ekspresuojančios naujus ŽIV{0}} T-ląstelių imunogenus, tokius kaip tHIVconsvX ir HIVACAT (HTI) T ląstelių imunogenas, siekiant pagerinti ŽIV-1 varianto atitikimas ir T-ląstelių atsako plotis. 2-osios kartos HIVconsvX imunogenai buvo sukurti iš naujo apibrėžiant M grupės konservuotus regionus ir naudojant dvivalentės mozaikos dizainą, siekiant maksimaliai padidinti potencialių 9-mer T-ląstelių epitopų atitiktį vakcinoje su visuotiniais variantais [64]. HTI imunogenas buvo sukurtas taip, kad apimtų T-ląstelių taikinius, prieš kuriuos T-ląstelių atsakas daugiausia stebimas ŽIV{12}}infekuotiems asmenims, turintiems mažą ŽIV{13}} virusų kiekį [65, 66]. Kadangi buvo įrodyta, kad papilomos VLP yra daugybinių CTL epitopų nešiotojai [17], siekėme sukurti chimerinius HPV16 L1 VLP, turinčius kelis konservuotus ŽIV{19}} CTL epitopus, kartu su rBCG, ekspresuojančiais ThivconsvX arba HTI T-ląstelių imunogenus, kad sukeltų platesnius CTL imuninis atsakas prieš ŽIV-1. Didelis ŽIV-1 CTL epitopo, pateikto chimeriniame ŽPV, tankis ir daugybė kopijų: ŽIV VLP gali pagerinti antigeno tiekimą į imuninę sistemą ir sukelti didesnį CTL atsakų dažnį. Priešingai, rekombinantinis BCG dažniau generuos mažesnį CTL atsakų dažnį dėl lėtos replikacijos in vivo. Kadangi BCG turi ryškią įtaką T ląstelių diferenciacijai, o tai reiškia, kad BCG gali sukelti CD8+ T ląstelių atmintį, dalyvaujant CD4+ T pagalbinėms ląstelėms [105], ši imunogeninė savybė. Dėl to BCG gali būti tinkamas kaip pradinis agentas heterologiniuose pirminio padidinimo režimuose. Taigi, tikėjomės, kad mūsų ŽPV: ŽIV VLP gali būti daug žadantis stiprintuvas, padidinantis ŽIV-1 CTL atsaką, kai pradedama naudoti rekombinantiniu BCG, ekspresuojančiu naują ŽIV-1 T-ląstelių imunogeną. .

T20 peptide yra labai konservuotas linijinis epitopas 2F5 (ELDKWA). Buvo pranešta, kad 2F5 antikūnai, surinkti iš ilgai užsikrėtusių ŽIV pacientų, turi iš esmės neutralizuojantį veiksmingumą [106, 107]. Manoma, kad gp41 MPER yra silpnai imunogeniškas, galbūt susijęs su jo vieta netoli ląstelių ir viruso fosfolipidų dvisluoksnio [108]. Naudojant DNR vektorius, pateikiančius MPER lipidinėje aplinkoje, naudinga sukelti gp{11}}specifinius nAb [109–111]. Pavyzdžiui, buvo įrodyta, kad ŽIV-1 T20-koduojančios DNR vakcinos, sukurtos dr. Britta Wahren, sukelia kryžminio bloko neutralizuojančių antikūnų (nAb) atsaką [109]. Priešingai, daugelis ankstyvų bandymų sukelti nAb, nukreiptus į gp41, naudojant peptidinės ar subvienetinės vakcinos strategijas, buvo nesėkmingi [112–116]. Neseniai kai kurie tyrimai parodė, kad BPV L1 VLP, ekspresuojantys 2F5 epitopą arba MPER ŽIV-1 gp41 sukeltų 2F5-specifinių antikūnų pelėse, lėmė kryžminio bloko neutralizavimą [20, 21]. Panašus imunogeniškumo modelis buvo nustatytas, kai hepatito B paviršiaus antigenas (HBsAg) buvo sujungtas su ŽIV-1 2F5 epitopu arba MPER [59, 117–119]. Čia parodėme, kad ŽIV-1 T20 ir P18I10 peptidų pateikimas mūsų chimeriniame HPV16 L1 VLP gali sukelti antikūnų atsaką prieš ŽIV-1 ir ŽPV16. Neutralizuojantys epitopai, stabilizuoti ant konformacinio karkaso, pvz., ŽIV -1 funkciniai šuoliai arba VLP, galėtų būti pagrindinis B ląstelių imunogeno projektavimo srautas, siekiant sukurti plačius neutralizuojančius antikūnus (bnAb) [93]. Tačiau dauguma naujų bnAb epitopų (apie 90 %) yra nenutrūkstantys ir sudaryti regionai, sujungti į 3-matmenų konfigūracijas [120]. Nors nepertraukiamų epitopų atsiradimą ant baltymų karkaso galima numatyti skaičiavimo modeliavimo būdu [121], šie bnAb epitopai gali būti įterpti į neapgaubtą HPV16 L1 baltymų karkasą. Priešingai, mažumoje ŽIV -1 B ląstelių imunogenų, tokių kaip ŽIV-1 gp41 MPER (2F5) arba gp120 V3 kilpa (P18IIB), yra linijinių neutralizuojančių epitopų ir jie gali būti tinkami ŽPV: ŽIV baltymų stuburas. Todėl pasirinkome linijinį 2F5 neutralizuojantį epitopą, kuris yra įtrauktas į išplėstinį ŽIV-1 MPER T20 peptidą, atsižvelgiant į palankią struktūrą -spiralės susidarymui [122]. T20 peptidai gali būti sulieti ir stabilizuoti ant L1 kapsidų karkasų, kad būtų sukeltos neutralizuojančios antikūnų reakcijos, jei būtų galima pateikti natūralią 2F5 epitopo konfigūraciją. Šiame tyrime mes nustatėme, kad 2F5 nAb buvo prijungti prie chimerinių ŽPV: ŽIV (L1:T20) VLP in vitro. Be to, L1:T20 VLP taip pat gali sukelti T20-specifinius surišimo antikūnus BALB/c pelėse. Daugėja įrodymų, kad ŽIV-1 sintezę slopinantys (T20) peptido sukelti antikūnai turi panašias savybes kaip anti-ŽIV -1 suliejimo peptidas Enfuvirtidas, jungiantis hidrofobinę transmembraninę T20 liekaną, esančią gp41 MPER. ŽIV-1 susiliejimas ir prisideda prie virusų kontrolės [109,123,124]. Remiantis mūsų ankstesnėmis apžvalgomis, racionalus chimerinių VLP pagrindu pagamintų vakcinų dizainas, siekiant sukelti ŽPV ir ŽIV specifinius neutralizuojančius antikūnus ir CTL atsakus, visada turėtų būti vertinamas imunogeno atrankos, antigeno tiekimo vektorių ir pirminio padidinimo režimų požiūriu. Apibendrinant, šis tyrimas parodė alternatyvią žinduolių ląstelių ekspresijos platformą ir keičiamo dydžio chromatografinį gryninimo metodą, skirtą chimeriniam ŽPV: ŽIV VLP sukurti. Manome, kad mūsų nauji valymo metodai padės išgauti antigeninį ŽPV: ŽIV VLP iš žinduolių ląstelių, siekiant sumažinti laiką, sąnaudas ir darbo jėgas, kartu padidinant pramoninės gamybos pajėgumus. Be to, parodėme, kad HPV16 L1 VLP gali veikti kaip pristatymo platforma pernešti ŽIV-1 peptidinį antigeną, nes P18I10 arba T20 peptidų įterpimas į HPV16 L1 kapsidų baltymų DE kilpą neturėjo įtakos chimerinio ŽPV stabilumui in vitro, savaiminiam susijungimui ir morfologijai: ŽIV VLP ir padarė. netrukdyti specifinių HPV16 L{107}antikūnų indukcijai in vivo. Kita vertus, chimerinis ŽPV: ŽIV VLP gali sukelti HPV16 ir ŽIV specifinį B ir T ląstelių imuninį atsaką prieš abu virusus. Šioje ataskaitoje buvo nagrinėjama galimybė sukurti ŽIV{111}} vakcinas, pagrįstas rekombinantiniais BCG, ekspresuojančiais ŽIV-1 imunogenus, ir ŽPV: ŽIV VLP, kurios gali būti naudojamos vaikų imunizacijai nuo ŽIV{113}}. Kadangi veiksmingos chimerinės vakcinos nuo ŽPV16 ir ŽIV sukūrimas{115}} vis dar yra iššūkis, šis darbas prisideda prie naujos chimerinės ŽPV kūrimo: ŽIV VLP pagrįstos vakcinos platformos, skirtos ŽPV16 ir ŽIV kontroliuoti{118 }} infekcija, kurios skubiai reikia besivystančiose ir pramoninėse šalyse.

Nuorodos

1. UNAIDS pasaulinė ŽIV ir AIDS statistika-2018 Faktų lapas. 2019. Prieiga per internetą: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (prieiga 2020 m. birželio 15 d.).

2. Baeten, JM PrEP dėl ŽIV: A laipsnio įrodymai, bet laukiama poveikio. Nat. Kunigas Urolis. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]

3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Čiu, J.; Paris, R.; Premsri, N.; Namvatas, C.; De Souza, M.; Adamsas, E.; ir kt. Vakcinacija ALVAC ir AIDSVAX, siekiant išvengti ŽIV{2}} infekcijos Tailande. N. Engl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]

4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Pagrindinės mokslinės kliūtys kuriant ŽIV vakciną: istorinė perspektyva ir ateities kryptys. Priekyje. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]

5. Robinson, HL ŽIV/AIDS vakcinos: 2018. Klin. Pharmacol. Ten. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]

6. Wang, Q.; Zhang, L. Plačiai neutralizuojantys antikūnus ir vakcinos nuo ŽIV{1}} infekciją dizainas. Priekyje. Med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]

7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T ląstelės ŽIV kontrolei, gydymui ir prevencijai. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. Pollard, AJ; Bijker, EM Vakcinologijos vadovas: nuo pagrindinių principų iki naujų pokyčių. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]

9. Shapiro, SZ Pamokos bendriesiems vakcinologijos tyrimams iš bandymų sukurti ŽIV vakciną. Vakcina 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]

10. Ahmedas, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Žmogaus papilomos viruso 16 ir 18 potipių paplitimas tarp Jemeno pacientų, sergančių gimdos kaklelio vėžiu. Azijos Ramusis vandenynas J. Vėžys Ankst. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]

11. Olcese, VA; Chen, Y.; Šlėgelis, R.; Yuan, H. HPV16 L1 kilpos domenų apibūdinimas formuojant tipui būdingą konformacinį epitopą. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]

12. Dupuy, C.; Buzoni-Vartai, D.; Touzė, A.; Le Cann, P.; Butas, D.; Coursaget, P. Ląstelių sukeltas imunitetas, kurį pelėms sukėlė į ŽPV 16 L1 virusą panašios dalelės. Mikrob. Patogas. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]

13. Šileris, J.; Lowy, D. Paaiškinimai dėl didelio ŽPV profilaktinių vakcinų stiprumo. Vakcina 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]

14. Markowitz, LE; Schiller, JT Žmogaus papilomos viruso vakcinos. J. Užkrėsti. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Į virusus panašių dalelių pagrindu sukurtų ŽIV-1 vakcinų projektavimo koncepcijos. Priekyje. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Chimerinių virusų tipo dalelių pagrindu sukurtų vakcinų nuo žmogaus papilomos viruso ir ŽIV kūrimas: išmoktos pamokos. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]

17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH į papilomos virusą panašios dalelės, skirtos daugybei citotoksinių T ląstelių epitopų pristatyti. Virologija 2000, 273, 374–382. [CrossRef]

18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazeris, IH; Zhou, J. Gleivinės imunizacija į papilomos virusą panašiomis dalelėmis pelėms sukelia sisteminį ir gleivinį imunitetą. Virology 1998, 252, 39–45. [CrossRef]

19. Pengas, S.; Frazeris, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Į papilomos virusą panašios dalelės gali pristatyti apibrėžtus CTL epitopus į MHC I klasės kelią. Virologija 1998, 240, 147–157. [CrossRef]

20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Ietis, GT; Qiao, L. Į galvijų papilomos virusą panašios dalelės, turinčios konservuotus epitopus iš membranos proksimalinės išorinės ŽIV-1 gp41 sukeltų gleivinės ir sisteminių antikūnų. Vakcina 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]

21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Ietis, GT; Qiao, L. Gleivinių ir sisteminių neutralizuojančių antikūnų prieš 1 tipo žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV-1) sukėlimas per burną imunizuojant galvijų papilomos viruso-ŽIV-1 gp41 chimerinio viruso tipo dalelėmis. J. Virolis. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]

22. Xiao, SL; Wen, JL; Kongas, Naujoji Zelandija; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Chimerinio BPV1 VLP vartojimo būdas lemia sukeltų imuninių atsakų pobūdį. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]

23. Kirnbaueris, R.; Taubas, JANET; Greenstone, HEATHER; Rodenas, RICHARDAS; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Efektyvus žmogaus papilomos viruso 16 tipo LI ir L1-L2 savaiminis susijungimas į į virusą panašias daleles. J. Virolis. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]

24. Zhao, Q.; Poteris, CS; Carragher, B.; Landeris, G.; Sworenas, J.; Taunas, V.; Abraomas, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Į virusus panašių dalelių GARDASIL® apibūdinimas naudojant kriotransmisijos elektronų mikroskopiją. Hum. Vakcinos Imunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. Achoras, A.; Lehammedis, S.; Pikaras, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Vileris, A.; Beiksas, F.; Burny, A.; Zagury, D. Citotoksiniai T limfocitai, specifiniai ŽIV-1 gp160 antigenui ir sintetiniam P18IIIB peptidui imunizuoto asmens HLA-A11-. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1994, 10, 19–25. [CrossRef]

26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. TCR ir peptidų/MHC sąveikos molekulinė analizė naudojant P18-I10- išvestus peptidus su vienu D-aminorūgšties pakaitalu. Biofizė. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]

27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. ŽIV N-trimerio pokišenės identifikavimas ir apibūdinimas-1 Gp41: Įtaka viruso patekimui ir narkotikų taikiniui. Pagalbinės priemonės 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]

28. Petersas, BS; Cheingsong-Popov, R.; Callow, D.; Foksalas, R.; Patou, G.; Hodžkinas, K.; Weber, JN Bandomasis II fazės ŽIV p17/p24:VLP (p24-VLP) saugumo ir imunogeniškumo tyrimas su besimptomiais ŽIV seropozityviais tiriamaisiais. J. Užkrėsti. 1997, 35, 231–235. [CrossRef]

29. Chege, GK; Mėsainiai, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; ir kt. Tvirtas imunitetas auksotrofinei Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost ŽIV vakcinos kandidatui, naudojant nežmoginių primatų modelį. J. Virolis. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]

30. Chege, GK; Tomas, R.; Shephard, EG; Meyersas, A.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; Pilka, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL Pirminis imunizacijos režimas, naudojant rekombinantines BCG ir Pr55gag virusą panašias daleles, pagrįstas ŽIV 1 tipo C potipiu, sėkmingai sukelia babuinams būdingą Gag atsaką. Vakcina 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]

31. Juozapas, J.; Saubi, N.; Aš, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatelis, JM; Hanke, T. Naujagimių pelių vakcinacija BCG.HIVA222 + MVA.HIVA sustiprina specifinį ŽIV-1- imuninį atsaką: amžiaus ir imunizacijos būdų įtaka. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]

32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatelis, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Naujos mikobakterinės vakcinos projektavimas vaikų ŽIV-TB vakcinai, vektorizuotai BCG lizino auksotrofu. Mol. Ten. Metodai Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]

33. Mahantas, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Gitartas, N.; Gatelis, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Ikiklinikinis BCG.HIVA2auxo.int, turinčio integruotą ekspresijos vektorių, kūrimas ŽIV-TB vaikų vakcinai. Stabilumo ir specifinio ŽIV-1 T ląstelių imuniteto stiprinimas. Hum. Vakcinos Imunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

35. Hankė, T.; McMichael, AJ. Eksperimentinės ŽIV{1}} vakcinos projektavimas ir konstravimas metų-2000 klinikiniam tyrimui Kenijoje. Nat. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]

35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Aukšto lygio ir didelio našumo rekombinantinių baltymų gamyba trumpalaikiu suspensijoje augančių žmogaus 293-EBNA1 ląstelių transfekcija. Nucleic Acids Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. Kimas, HJ; Kimas, SY; Limas, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Vienpakopis chromatografinis žmogaus papilomos viruso 16 tipo L1 baltymo iš Saccharomyces cerevisiae gryninimas. Protein Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Chimerinio ŽPV-ŽIV baltymo L1P18 ekspresija pichia pastoris; į virusą panašių dalelių valymas ir apibūdinimas. Pharmaceutics, 2021, 13, 1967. [CrossRef]

38. GE. CaptoTM Core 700 ir Capto Q ImpRes naudojimas valant į žmogaus papilomos virusą panašias daleles. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1–4.

39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smithas, GL; Higinsas, G.; Stanley, M.; Minsonas, AC Monokloninio antikūno prieš 16 tipo žmogaus papilomos virusą gamyba ir apibūdinimas naudojant rekombinantinį vakcinijos virusą. J. Clin. Pathol. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]

40. Merck Canada Inc. Gaminio monografija Gardasil®. Prod. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.

41. Achoras, A.; Persson, K.; Harisas, RA; Sundbäck, J.; Sentman, CL; Lindqvistas, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. H-2D(d) I klasės MHC kristalinė struktūra, sudaryta komplekse su ŽIV-1- gautu peptidu P18-110, esant 2,4 Å skyrai: pasekmės T ląstelėms ir NK ląstelėms pripažinimas. Imunitetas 1998, 9, 199–208. [CrossRef]

42. Pang, W.; Tomas, SC; Zheng, YT Dabartiniai peptidų ŽIV tipo{1}} sintezės inhibitoriai. Antivirus. Chem. Chemother. 2009, 20. [CrossRef]

43. Čenas, XS; Garcea, RL; Goldbergas, I.; Kazini, G.; Harrison, SC Mažų į virusą panašių dalelių struktūra, surinkta iš žmogaus papilomos viruso L1 baltymo 16. Mol. Cell 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]

44. Diena, PM; Weisberg, AS; Thompson, CD; Hughesas, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Žmogaus papilomos virusas 16 kapsidų tarpininkauja branduolio patekimui infekcijos metu. J. Virolis. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]

45. Zhou, J.; Durų juosta, J.; saulė, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Žmogaus papilomos viruso 16 tipo L1 baltymo branduolinio lokalizacijos signalo identifikavimas. Virologija 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Vlps, A.; Middelbergas, APJ; Lua, LHL Viruso tipo dalelių biologinis apdorojimas: iššūkiai ir galimybės. Pharm. Bioprocesas. 2013, 1, 407–409.

47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Teigiamai įkrautos žmogaus papilomos viruso 16 tipo kapsidės baltymų sekos yra pakankamos, kad tarpininkuotų genų perkėlimui į tikslines ląsteles per heparano sulfato receptorių. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]

48. Sasagawa, T.; Pushko, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasseras Hajibagheri, MA; Finčas, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. 6 ir 16 tipo žmogaus papilomos virusų į virusus panašių dalelių sintezė ir surinkimas skilimo mielėse Schizosaccharomyces pombe. Virusologija 1995, 206, 126–135. [CrossRef]

49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzeris, L.; Müller, M. Į žmogaus papilomos viruso 16 tipo virusą panašių dalelių gamyba transgeniniuose augaluose. J. Virolis. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]

50. Zahin, M.; Jonas, J.; Khanal, S.; Lukštas, A.; Masonas, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Milleris, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Didelė HPV16 L1 baltymų ir VLP gamyba iš tabako lapų. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]

51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Vila, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perezas-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Žmogaus papilomos viruso 16 tipo L1 viruso tipo dalelių gamyba rekombinantinėmis Lactobacillus casei ląstelėmis. Appl. Aplinka. Microbiol. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]

52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Andersonas, C.; Hamas, M.; Aukštasis, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; ir kt. Gardasil® terminio stabilumo įvertinimas. Hum. Vakcina. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. Kiekybinis žmogaus papilomos viruso 16 į virusą panašių dalelių surinkimo in vitro aprašymas. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]

54. McCarthy, parlamento narys; Balta, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA Žmogaus papilomos viruso 11 tipo viruso tipo dalelių kiekybinis išardymas ir surinkimas in vitro. J. Virolis. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]

55. Kirnbaueris, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Papilomos viruso L1 pagrindinis kapsidų baltymas savaime susirenka į virusus panašias daleles, kurios yra labai imunogeniškos. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]

56. Patelis, MC; Patkaras, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Imunogeninio žmogaus papilomos viruso-16 iš pagrindinių kapsidės baltymų gautų į virusą panašių dalelių gamyba. Indijos J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.

57. Ši, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B.; Greimas, TL; Wang, N.; Volkin, DB Į žmogaus papilomos virusą panašių dalelių stabilizavimas nejoninėmis paviršinio aktyvumo medžiagomis. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]

58. Carteris, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Žmogaus papilomos viruso tipo 16-specifinio epitopo identifikavimas pagrindinio kapsidės baltymo L1 C gnybtoje. J. Virolis. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]

59. Von Brunn, A.; Gamintojas, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardtas, F.; Schdelt, F. Pagrindinis ŽIV-I neutralizuojantis domenas yra labai imunogeniškas, kai jis yra išreikštas hepatito B šerdies dalelių paviršiuje. Vaccine 1993, 11, 817–824. [CrossRef]

60. Dennisonas, SM; Anasti, K.; Scearce, RM; Sutherland, L.; Parksas, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; ir kt. Neneutralizuojantys ŽIV-1 gp41 apvalkalo II grupės žmogaus monokloniniai antikūnai rodo polireaktyvumą jungiantis prie fosfolipidų ir baltymų autoantigenų. J. Virolis. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]

61. Tkola, A.; Kusteris, H.; Rusertas, P.; Joosas, B.; Fišeris, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Huberis, M.; Rehr, M.; Oksenijus, A.; ir kt. ŽIV -1 atkryčio uždelsimas nutraukus antiretrovirusinį gydymą dėl pasyvaus žmogaus neutralizuojančių antikūnų perdavimo. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]

62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Andersonas, C.; Hamas, M.; Brownas, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Lowe, R.; ir kt. Koreliacija tarp pelių stiprumo ir in vitro santykinio žmogaus papilomos viruso 16 tipo viruso tipo dalelių ir Gardasil vakcinos mėginių stiprumo. Hum. Vakcina. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

64. Kilpeläinenas, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Rekombinantinės Mycobacterium bovis BCG pagrįstos ŽIV vakcinos kūrimo pažanga ir iššūkiai: išmoktos pamokos. „Expert Rev. Vaccines“, 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]