Cistanche polisacharidai pagerina echinakozido absorbciją in vivo ir veikia žarnyno mikrobiotą

Susisiekite: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu ir kt

Abstraktus

Polisacharidai irfeniletanoidiniai glikozidaiišCistanche deserticolabuvo įrodyta, kad jie turi įvairios naudos sveikatai, tačiau šių dviejų rūšių junginių sąveikos poveikis in vivo nėra išsamiai žinomas. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti cistanche polisacharidų sinergetinį poveikį feniletanoido glikozidui ir polisacharidų poveikį žarnyno mikrobiotai. Sprague-Dawley žiurkės 20 dienų buvo šeriamos įvairių rūšių cistanche polisacharidais, paskutinę dieną visoms žiurkėms buvo suteiktasechinakozidasesant 100 mg/kg. Rezultatai buvo lyginami daugiausia pagal farmakokinetinių parametrų, žarnyno mikrobiotos sudėties ir trumpos grandinės riebalų rūgščių kiekio skirtumus. Rezultatai parodė, kad visi cistanche polisacharidai, įskaitant neapdorotus polisacharidus, yra didelės molekulinės masėssvorio polisacharidai, ir mažos molekulinės masės polisacharidai, gali reguliuoti žarnyno mikrobiotos įvairovę, padidinti naudingų bakterijų skaičių ir ypač padidinti Prevotella spp. taip pat pagerinti trumpos grandinės riebalų rūgščių gamybą ir echinakozido įsisavinimą. Ištyrus sinergetinį polisacharidų ir mažų molekulių poveikį, šie atradimai rodo, kad cistanche polisacharidai, ypač mažos molekulinės masės polisacharidai, galėtų būti naudojami kaip žarnyno mikrobiotos manipuliatorius sveikatai stiprinti.

Raktiniai žodžiai:CistanchedeserticolapolisacharidasEchinakozidasŽarnyno mikrobiota

Spustelėkite čia, jei norite gauti daugiau informacijos apie cistanche produktus

1. Įvadas

Pastaraisiais metais tapo aišku, kad polisacharidai moduliuoja žarnyno mikrobiotos sudėtį ir kad pokyčiai gali tarpininkauti daugeliui maistinių medžiagų įsisavinimo [1], sukurdami fiziologinę funkciją [2, 3]. Įrodyta, kad tradicinės kinų medicinos (TCM) polisacharidai yra idealūs žarnyno mikrobiotos reguliavimo kandidatai ir parodė prebiotinį poveikį. Virškinimo trakte polisacharidai ir kai kurių mažų molekulių junginių kontaktas neišvengiamai daro tam tikrą poveikį biologiniam aktyvumui [4]. Kaip viena iš pagrindinių aktyviųjų Panax ženšenio ingredientų, kurie buvo plačiai naudojami tūkstančius metų, polisacharidai buvo geri.tobulinimasviduježarnynomedžiagų apykaitąirabsorbcijaapieginsenozidaiin vivo [5]. Codonopsis pilosula polisacharidai parodė saponinų absorbcijos skatinamąjį poveikį pelėms, sergančioms dekstrano sulfato natrio sukeltu kolitu [6]. Nustatyta, kad Ganoderma lucidum polisacharidai, ypač didelės molekulinės masės frakcija, turiprebiotikasfunkcijasdaug riebalų turinčios dietos sukeltos žarnyno disbiozės pelių modeliuose [7]. Longano polisacharidai reguliuoja žarnyno mikrobiotą ir žarnyno metabolitus (padidina piruvato ir butanoato kiekį), kad sukurtų imunomoduliuojančią veiklą [8].

Cistanche deserticola, kaip tradicinė kinų medicina, buvo plačiai naudojama kaip maisto papildas Kinijoje. Farmakologiniai tyrimai parodė, kad jis eksponuojamasneuroprotekcinis, imunomoduliuojantis, hormoninisbalansavimas, anti-nuovargis, anti-uždegiminis, kepenų apsauga,anti-oksidacinis, anti-bakterinė, anti-virusinis, iranti-auglysefektai [9]. Cheminė analizė parodė, kad pagrindinės veikliosios medžiagos buvo feniletanoidiniai glikozidai ir polisacharidai. Echinakozidas, pagrindinis C. deserticola feniletanoidinis glikozidas, pasižymėjo plačiu farmakologiniu poveikiu, tačiau jo tinkamumas vaistams yra ribotas dėl prasto biologinio prieinamumo, greito ir intensyvaus metabolizmo in vivo. Tyrimai patvirtino, kad echinakozidą gali metabolizuoti žarnyno mikrobiota in vitro [10,11]. Tačiau įrodymai in vivo nebuvo ištirti. Kaip žinome, žarnyno mikrobiota vaidino svarbų vaidmenį tarpininkaujant augalinių vaistų metabolizuojančiam biologiniam aktyvumui. Todėl pagrindinis šio darbo tikslas buvo ištirti įtakącistanche polisacharidaižarnyno mikrobiotai ir poveikiui echinakozido metabolizmui.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Medžiagos ir chemikalai

Cistanche deserticola YC Ma buvo gautas iš Alashan, Vidinės Mongolijos Mandela smėlio pramonės plėtros Co., LTD, Kinija. Juos patvirtino profesorius Lijuanas Zhangas (Tianjino tradicinės kinų medicinos universitetas). Kupono pavyzdys buvo deponuotas mūsų laboratorijoje. Standartinė medžiaga, tokia kaip echinakozidas, akteozidas ir chlorogeninė rūgštis, buvo gauta iš Nacionalinio farmacijos ir biologinių produktų kontrolės instituto (Pekinas, Kinija). Kiekvieno standarto grynumas buvo didesnis arba lygus 98 proc. Chromatografijos klasės acetonitrilas ir metanolis buvo įsigyti iš Fisher Scientific (Pitts burgh, PA). Skruzdžių rūgštis buvo nupirkta iš Anaqua Chemical Supply Inc. (Wilmington, JAV). Kiti cheminiai reagentai buvo analitinės kokybės ir įsigyti iš Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Šanchajus, Kinija).

Sprague-Dawley žiurkių patinus (200–220 g) tiekė Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Pekinas, Kinija, licencijos Nr. SCXK (Jing) 2014- 0004). Visi gyvūnai buvo veisiami ir laikomi SPF sąlygomis gyvūnų patalpoje. Eksperimentas buvo atliktas pagal gyvūnų priežiūros gaires, naudojant TJUTCM komitetą ir atitinkantį JAV nacionalinio sveikatos instituto paskelbtą laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą (NIH leidinio numeris 85–23, peržiūrėtas 1996 m. ). Po 1 savaitės aklimatizacijos laikotarpio žiurkės buvo atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes: kontrolinę grupę, bendro polisacharidų grupę, didelės molekulinės masės polisacharidų grupę ir mažos molekulinės masės polisacharidų grupę. Kiekvieną grupę sudarė 6 žiurkės, kurios buvo auginamos tame pačiame narve.

2.2. Cistanche polisacharidų preparatas

3.0 kg Cistanche deserticola YC Ma buvo išvalyta ir išdžiovinta 40 laipsnių temperatūroje orinėje džiovinimo krosnyje, tada susmulkinta iki rupių miltelių. Sausi rupūs milteliai buvo ekstrahuojami 85 procentų vandeniniu etanoliu (v/v) 60 laipsnių temperatūroje du kartus ir po 2 valandas kiekvieną kartą. Kietojo ir skysčio santykis buvo atitinkamai 1:12 ir 1:10. Vaistažolių liekanos dar du kartus ekstrahuotos 100 laipsnių vandeniu, ekstrahavimo laikas ir kietojo skysčio santykis su 85 procentų etanoliu buvo toks pat. Vandeninis tirpalas buvo sumaišytas ir sukoncentruotas sumažintame slėgyje, o po to nusodinamas 80 procentų etanolyje, stovint žemesnėje nei 4 laipsnių temperatūroje 24 valandas. Nuosėdos buvo išskirtos centrifuguojant 8000 aps./min., 10 minučių 4 laipsnių kampu, o po to liofilizuotos, kad gautų bendrą polisacharidus (ZT). Tada ZT buvo ištirpintas dejonizuotame vandenyje ir filtruojamas ant 100 kDa tuščiavidurio pluošto ultrafiltravimo membranos, buvo surinkti sulaikantys didelės molekulinės masės polisacharidai (HM). Persunktas filtratas buvo filtruojamas su 6 kDa ultrafiltravimo membrana. Gauti retenciniai filtrato vidutiniai molekuliniai polisacharidai (MM) ir prasiskverbę filtrato mažos molekulinės masės polisacharidai (LM).

2.3. Pirminis cistanche polisacharidų apibūdinimas

Polisacharidų kiekis buvo nustatytas sieros rūgšties fenolio metodu, naudojant gliukozę kaip standartą [12]. Bendras baltymų kiekis buvo nustatytas BCA metodu [13]. Monosacharidų sudėties analizė buvo atlikta naudojant HPLC (UltiMate 3000 sistema), turinčią SinoPak C18 kolonėlę (5 μm, 150 mm × 4,6 mm) ir diodų matricos detektorių (VWD-3000). Chromatografinis PMP (1-fenil-3- metil-5-pirazolono) prieškoloninis atskyrimas buvo atliktas naudojant 100 mM fosfatinį buferį ir acetonitrilą santykiu 82:18 (v/v). , proc.) kaip judrioji fazė, esant 1,0 ml/min srauto greičiui. Buvo įšvirkšta 10 μl kiekvieno mėginio ir buvo naudojamas 30 min. analizės laikas, aptikimas esant 245 nm. Duomenų surinkimas ir apdorojimas buvo atliktas naudojant „Chromeleon Software 7.1“ (Dionex, Sunnyvale, CA, JAV).

Molekulinė masė (Mw) buvo nustatyta naudojant didelio efektyvumo dydžio išskyrimo chromatografiją (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0 sistema), aprūpinta TSK geliu G3000 PWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japonija) ir TSK gelio GMPWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japonija) kolonėlė ir RefractoMax521 lūžio rodiklio detektorius (RID). Mėginiai buvo eliuuojami 0,1 mol/l Na2SO4 0,5 ml/min srauto greičiu. Kolonėlės temperatūra buvo palaikoma 35 laipsnių. Dekstranas kaip standartas ir standartinė kreivė buvo nubraižyta pagal eliuavimo laiką, pavaizduotą pagal molekulinės masės logaritmą.

2.4. Farmakokinetinis tyrimas

Kraujo mėginiai buvo paimti iš vidinio angos {{0}} val., 0.083 val., 0.167 val., 0.25 val. val., 0.5 val., 0.75 val., 1.0 val., 2.0 val., 3.{{20}} val., 4.{45}} val., 6.0 val., 8.0 val., 10 val., 12 val. ir 24 val. po echinakozido (100 mg/kg) vartojimo. Plazmos mėginiai buvo gauti centrifuguojant 10 minučių 7500 pm. Į 100 μL plazmos mėginio buvo įpilta 10 μL IS (chlorogeno rūgšties) tirpalo ir 500 μL metanolio. Tada mišinys maišomas 3 minutes ir centrifuguojamas 14, 000 aps./min. greičiu 10 min. Supernatantas surenkamas ir išdžiovinamas azote kambario temperatūroje. Vėliau likutis buvo ištirpintas 100 μl 50 procentų vandeninio metanolio, centrifuguojant 14, 000 aps./min. 10 min. Galiausiai 3 μL supernatanto buvo įšvirkšta į LC-MS/MS sistemą analizei. Mėginiai buvo analizuojami naudojant anksčiau pateiktą metodą. Mobiliąją fazę sudarė CH3CN (tirpiklis A) ir H2O (turintis 0,1 proc. HCOOH; tirpiklis B), naudojant tokį gradientą: 0–1 min., 10 proc. A; 1–8 min., 10–90 procentų A; 8–9 min., 90–10 procentų A; 9–11 min.: 10 procentų A. Mėginys buvo atskirtas ACQUITY HSS T3 kolonėlėje (1,8 μm, 100 mm × 2,1 mm id). Srauto greitis buvo 0,3 ml/min., o kolonėlės temperatūra nustatyta 35 °C. MS analizėje buvo naudojamas neigiamas jonizacijos režimas, kurio parametrai buvo optimizuoti: kapiliarinė įtampa, 2,5 kV; desolvatacijos temperatūra, 450 laipsnių. Azotas buvo naudojamas kaip desolvatavimo ir kūgio dujos, atitinkamai 900 l/h ir 150 l/h srauto greičiu. Taigi kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant MRM perėjimų m/z 785,29 → 623,26 echinakozidui, m/z 353,06 → 191,07 chlorogeno rūgščiai (IS), m/z 623,24 → 161,09 akteozidui. Echinakozido, IS ir akteozido kūgio įtampa buvo 100 V, 32 V ir 74 V; susidūrimo energija, 32 V, 14 V ir 30 V.

2.5. Trumposios grandinės riebalų rūgščių (SCFA) tyrimas

Sprague-Dawley žiurkių patinams 3 savaites buvo skiriama per burną ZT, HM ir LM. SCFA (acto rūgšties, propiono rūgšties, izosviesto rūgšties, sviesto rūgšties, izovalerio rūgšties, valerijono rūgšties ir heksano rūgšties) nustatymas dujų chromatografijos (GC) būdu buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau su keliais pakeitimais [14]. Trumpai tariant, 0,5 g išmatų mėginio buvo disperguota 2,5 ml Milli-Q vandens, maišoma 10 min. ir 7,5 ml 1 proc. HCl/etanolio tirpale, kuriame yra vidinių etalonų (sviesto rūgštis 24,0 ug). /mL ir 2- etilheksano rūgštis 1,32 ug/mL kaip vidiniai standartai). Mišiniai buvo homogenizuojami 5 min. ir centrifuguojami 14, 000 aps./min. greičiu 10 min 4 laipsnių temperatūroje. Penki mikrolitrai supernatanto buvo įpurkšti padalijimo režimu santykiu 30:1. Nešančiosios dujos buvo N2 (99,999 proc.) 1 ml/min. Papildomos dujos (N2) buvo 25 ml/min. H2 ir oro srautas buvo atitinkamai 30 ml/min ir 300 ml/min. Išmatų mėginiai buvo paimti 20-ąją šio tyrimo dieną ir nedelsiant laikomi –80 laipsnių temperatūroje.

2.6. Išmatų surinkimas, DNR ekstrahavimas ir 16S rRNR genų sekos nustatymas

Maždaug 200 mg šviežių išmatų mėginio buvo surinkta į 1,5 ml sterilų Eppendorf mėgintuvėlį iš kiekvienos žiurkės ir laikoma –80 laipsnių temperatūroje, kad vėliau būtų galima paruošti DNR. DNR buvo išskirta iš išmatų naudojant QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN). DNR kiekis buvo nustatytas naudojant NanoDrop spektrofotometrą (Thermo Electron Corporation); vientisumas ir dydis buvo patikrinti 1,0 procento agarozės gelio elektroforeze. Pagal koncentraciją DNR buvo atskiesta iki 1 ng/μL naudojant sterilų vandenį.

16S rRNR buvo amplifikuota naudojant specifinį pradmenį (V4: 515F-806R) su brūkšniniu kodu. Visos PGR reakcijos buvo atliktos naudojant Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). Sumaišykite vienodą tūrį 1 × įkrovimo buferio (sudėtyje yra SYB žalia) su PGR produktais ir aptikimui atlikite elektroforezę su 2 procentų agarozės geliu. Tolimesniems eksperimentams buvo pasirinktos ryškios pagrindinės juostos nuo 400 iki 450 bp. PGR produktai buvo sumaišyti pagal ES tankio santykius. Tada PGR produktų mišinys buvo išgrynintas Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Vokietija).

Sekvenavimo bibliotekos buvo sukurtos naudojant „TruSeq® DNA PCR Free Sample Preparation Kit“ (Illumina, JAV) pagal gamintojo rekomendacijas ir buvo pridėti indeksų kodai. Bibliotekos kokybė buvo įvertinta naudojant Qubit® 2.{1}} Fluorometrą (Thermo Scientific) ir Agilent Bioanalyzer 2100 sistemą. Biblioteka buvo suskirstyta į Illumina HiSeq 2500 platformą ir buvo sugeneruoti 250 bp porinio galo skaitymai.

2.7. Bioinformatinė analizė

Brūkšninio kodo ir pradmenų sekos nutraukimas, sekos surinkimas ir duomenų filtravimas pagal QIIME (V 1.7.0). Sekos, kurių panašumas didesnis arba lygus 97 procentams, buvo priskirtos tiems patiems OTU. OTU yra pažymėti kaip SILVA etiketės. Alfa įvairovės indeksai, įvertinantys žarnyno mikrobų bendruomenės turtingumą (AKF ir Chao1 metrika) ir bendruomenės įvairovę (Šanono ir Simpsono metrika), buvo apskaičiuoti naudojant Qiime (1.9.1 versija). Beta įvairovės analizė buvo naudojama mikrobų bendruomenių struktūriniams skirtumams tirti naudojant UniFrac atstumą. Visų grupių skirtumai buvo patikrinti Tukey testu ir Wilcox testu. Pagrindinių koordinačių analizė (PCoA) buvo taikoma siekiant paaiškinti keturių grupių sudėties skirtumus naudojant R paketus. Linijinės diskriminacinės analizės efekto dydžio (LEfSe) metodas yra specialiai sukurtas biologinių žymenų atradimo ir paaiškinimo sekos duomenims. Ir linijinė diskriminacinė analizė (LDA) buvo naudojama norint apskaičiuoti kiekvieno skirtingai žarnyno mikrobų poveikį ir charakteristikas, susijusias su kiekviena žiurkių grupe. Koreliacinė analizė atlikta naudojant R paketus gcorrplot (1.1.463 versija).

SCFA duomenys buvo analizuojami naudojant SPSS 22 ANOVA.0.

3. Rezultatai ir diskusija

3.1. Cistanche polisacharidų paruošimas ir cheminė analizė

Cistanches Herba Kinijoje naudojama ir kaip maistas, ir kaip vaistas. Iš jo išskirti polisacharidai sulaukė didelio dėmesio dėl savo reikšmingos veiklos. Šiame tyrime keturios cistanche polisacharidų dalys (ZT, HM, MM ir LM) buvo gautos vandens ekstrahavimo, alkoholio nusodinimo ir ultrafiltravimo metodu. Keturių polisacharidų dalių cheminė sudėtis parodyta 1 lentelėje.

Bendras cukraus kiekis mėginiuose, naudojant standartinę gliukozės kreivę. Rezultatas parodė, kad HM ir LM derlius buvo didesnis nei MM. Polisacharidai pasižymėjo įvairiomis farmakologinėmis savybėmis, ypač imuniniu aktyvumu. Tyrimai parodė, kad monosacharidų kiekis ir tipas, molekulinė masė, pakaitų grupės tipas vaidina svarbų vaidmenį polisacharidų veikloje [15]. Skirtingos cistanche polisacharidų monosacharidų sudėties dalys buvo panašios, o pagrindiniai monosacharidai buvo manozė (Man), galakturono rūgštis (GalUA), gliukozė (Glc), galaktozė (Gal) ir arabinozė (Ara).

Tačiau keturių dalių turinys skyrėsi. Gliukozė ir arabinozė buvo pagrindiniai ZT ir HM komponentai, o gliukozė buvo pagrindinis LM cukraus vienetas, be to, šiose frakcijose taip pat buvo aptikta mažai ramnozės ir gliukurono rūgšties (GlcUA).

Mėginių santykinės molekulinės masės buvo tiriamos naudojant didelio efektyvumo dydžio išskyrimo chromatografiją (HPSEC). Pagal standartinę dekstranų kreivę ir sulaikymo laiką stulpeliuose, pagrindinės didžiausios ZT molekulinės masės buvo 1,68 × 106 Da ir 1,70 × 104 Da, HM buvo 1,54 × 106, 2,06 × 105 ir Nustatyta, kad 4,81 × 104 MM ir LM yra atitinkamai 1,09 × 104 ir 2,05 × 104. Jų derlingumas buvo nurodytas 1 lentelėje, o MM derlius buvo mažas ir nepakako eksperimentui su gyvūnais. Ankstesni tyrimai parodė nuo struktūros priklausomą cistanche polisacharidų poveikį įvairiems biologiniams aktyvumams [16]. Vis dar reikalingi tolesni eksperimentai, ypač gryninimas. Struktūrinio aktyvumo tyrimui turėtų būti taikoma smulkioji struktūrinė analizė

3.2. Farmakokinetikos tyrimas

Echinakozido farmakokinetika buvo ištirta naudojant itin efektyvią skysčių chromatografiją trigubo kvadrupolio masės spektrometrija (UPLC ir Xevo TQ-S) išgėrus echinakozido. Vidutinės echinakozido koncentracijos plazmoje ir laiko profiliai parodyti 1 pav. Pagal vaistų ir statistikos programinę įrangą (DAS, 2 versija.0), echinakozido farmakokinetika atitinka vieno skyriaus modelį, o kitą ZT, HM ir LM grupių parametrai buvo apibendrinti 2 lentelėje, įskaitant laiką iki maksimalios koncentracijos (Tmax), maksimalios koncentracijos (Cmax), plotą po koncentracijos ir laiko kreive (AUC) ir vidutinę buvimo trukmę (MTR). ). Farmakokinetikos tyrimas parodė, kad vidutinė echinakozido Cmax ZT, HM ir LM grupėse buvo 646,4 ng/ml, 732.{13}} ng/ml ir 898,4 ng/mL, kurie buvo 1,6, 1,8 ir 2,2 kartų, palyginti su kontroline grupe (406,8 ng/ml). Iš anksto apdorojant polisacharidais, echinakozido AUC(0-24 h) padidėjo atitinkamai 6,6 proc., 36,7 proc. ir 63,6 proc. ZT, HM ir LM grupėse, palyginti su kontroline grupe, kuri įrodė, kad polisacharidai parodė mažos molekulės absorbciją skatinanti veikla. Šie rezultatai buvo gana panašūs į tai, kad chitooligosacharidai pagerino Fructus Forsythia ekstrakte esančių feniletanoidinių glikozidų biologinį prieinamumą [17], o Polygonum multiflorum polisacharidai pagerino 2, 3, 5, 4′-tetrahidroksi- 2-bene biofarmacines savybes. O- -D-gliukozidas normalioms Sprague-Dawley žiurkėms [18]. Žarnyno mikrobiotoje yra įvairių su vaistais metabolizuojamų susijusių fermentų, o mikrobiomų mechanizmai, formuojantys vaistų farmakokinetiką ir farmakodinamiką, vis dar nežinomi [19]. Polisacharidai gali maitinti žarnyno mikrobiotą, didindami imuninę sistemą, absorbuodami maistines medžiagas ir mažindami patogenų augimą [20, 21]. Nors literatūroje rašoma, kad cistanche polisacharidai gali padidinti echinakozido metabolitų (tokių kaip akteozidas) kiekį in vitro, mes nenustatėme, kad kartu egzistuojantys polisacharidai būtų naudingi echinakozido pavertimui akteozidu in vivo [10,11].

3.3. SCFA kiekis žiurkių išmatose

Žarnyno mikrobiota fermentavo polisacharidus, gaminančius įvairius bioaktyvius polimerus ir metabolitus, tokius kaip SCFA [3]. Kaip pagrindiniai polisacharidų metabolitai, SCFA buvo analizuojami išmatose. Buvo pranešta, kad SCFA, įskaitant acto rūgštį, propiono rūgštį ir butiratą, turi teigiamą poveikį gliukozės, cholesterolio ir lipidų metabolizmui. Acetatas yra pagrindinis storosios žarnos SCFA ir svarbus cholesterolio sintezės substratas, propionatas yra gliukoneogenezės substratas kepenyse, o butiratas yra pageidaujamas kolonocitų energijos substratas ir turi priešuždegiminį poveikį žarnyne [22, 23].

Mūsų rezultatai parodė, kad acetatas buvo pagrindiniai SCFA, susidarantys išmatose visose grupėse, po to - butiratas ir propionatas, o valerato ir šakotųjų SCFA (izosviesto rūgšties ir izovalerio rūgšties) koncentracija buvo mažesnė. Nustatyta, kad acetatas padidina fermentų aktyvumą kepenų audinyje, todėl geriau kontroliuojamas cukraus kiekis kraujyje [24]. 20-ą dieną (2 pav.) LM grupėje buvo žymiai didesnis acetato kiekis (pb 0,05), propionato dalis buvo linkusi mažėti, o butirato dalis – didėti, nors išmatose pokytis buvo nežymus, lyginant su kontroline grupe.

Tačiau HM grupėje butirato dalis buvo žymiai mažesnė nei kontrolinėje grupėje (pb 0.05). Bendras SCFA kiekis tarp LM ir HM buvo priešingas, palyginti su kontroline grupe, ir tik LM grupė turėjo reikšmingą skirtumą.

Daugelis veiksnių turi įtakos SCFA kiekiui išmatose, įskaitant žarnyno mikrobiotos sudėtį ir kiekį, mitybos šaltinį ir laiką, per kurį maistas patenka per virškinamąjį traktą [22]. Besikaupę tyrimai rodo, kad polisacharidų struktūra, įskaitant monosacharidų likučių sudėtį, polimerizacijos laipsnį, gali turėti įtakos fermentacijos savybėms ir SCFA gamybai [25]. Iš mūsų rezultatų galime daryti išvadą, kad cistanche polisacharidai moduliuoja SCFA gamybą, o skirtingos struktūros polisacharidai turi skirtingą poveikį.

3.4. Cistanche polisacharidai sukėlė esminius žarnyno mikrobiotos sudėties ir įvairovės pokyčius

Išmatų mėginių (n=4) bakterinė sudėtis buvo ištirta naudojant Illumina didelio našumo sekos nustatymo metodą. Biblioteka buvo suskirstyta į Illumina HiSeq2500 platformą ir buvo sukurti 250 bp porinio galo skaitymai. Jie buvo apdoroti taksonominiam identifikavimui ir įvairovės analizei. Retėjimo kreivės (3a pav.) parodė, kad kiekvieno mėginio bakterijų rūšių gausa išsilygino, kai mėginių ėmimo gylis padidėjo, o tai rodo, kad sekos nustatymo pastangos buvo pakankamos ir kad buvo užfiksuota visa mėginio įvairovė. Šenono kreivė (3b pav.) parodė, kad unikalių bakterijų rūšių skaičius didėjo didėjant identifikuotų sekų skaičiui. Šenono kreivių prisotinimas reiškia, kad sekos nustatymo duomenų pakako, kad apimtų visas bakterijų rūšis.

Alfa įvairovės analizė naudojama įvairovei imtyje matuoti. Chao1, ACE, Shannon ir Simpson įvairovės indeksai buvo apskaičiuoti Tukey testu, kad apibūdintų alfa įvairovę. AKF ir Chao 1 indeksais pagrįsta įvairovės analizė atskleidė žarnyno mikrobiotos turtingumą OTU lygmeniu. AKF ir Chao 1 indeksai buvo žymiai mažesni LM grupės išmatų mėginiuose, palyginti su kontroline grupe (pb 0.05) (4a, b pav.), o tai reiškia, kad sumažėjo žarnyno mikrobiotos rūšių gausa. maitinant LM. Šenono ir Simpsono indeksais pagrįsta įvairovės analizė atskleidė žarnyno mikrobiotos bendruomenės įvairovę. Gydant cistanche polisacharidais, palyginti su kontroline grupe, akivaizdžių Shannon ir Simpson įvairovės indeksų pokyčių nebuvo.

Cistanche polisacharidai sukėlė didelius taksonų pokyčius. Be to, keturiose grupėse N98 procentai OTU buvo susiję su phyla Bacteroidetes, Firmicutes ir Proteobacteria. Daugiausia vyravo Bacteroidetes, sudarančios 55.09 proc., 57,89 proc., 52,72 proc. ir 69.{{20}}4 procentus išmatų mikrobiotos kontrolinės grupės, ZT, HM ir Atitinkamai LM grupės, po jų seka Firmicutes, sudarančios atitinkamai 41,39 proc., 38.{26}}3 proc. , 42,15 proc. ir 28,15 proc. (5a, b pav.). Palyginti su kontroline grupe, buvo įrodyta, kad ZT grupė turėjo silpną poveikį santykiniam pagrindinių filų gausumui, išskyrus tai, kad mažas aktinobakterijų gausumas buvo žymiai padidėjęs (MetaStat, pb 0, 05). HM grupėje proteobakterijų skaičius buvo žymiai padidėjęs (pb 0,01). Tai parodė, kad HM Cistanche polisacharidas gali paskatinti proteobakterijų praturtėjimą, kad paveiktų medžiagų apykaitą žiurkėse. LM grupėje Bacteroidetes, kurių pagrindiniai sukėlėjai buvo Prevotellaceae ir Prevotellaceae_UCG-001, gausa žymiai padidėjo (pb 0,05), o Firmicutes, įskaitant Peptococcaceae, gausa žymiai sumažėjo.01 pp. . Prevotella ir Bacteroides nariai anksčiau buvo apibūdinti kaip maistinių skaidulų skaidytojai [26], gaminantys galutinius metabolinius produktus, tokius kaip sukcinatas ir acetatas [27]. Tokie radiniai patvirtino ankstesnius tyrimus, rodančius, kad kai kurios Prevotella spp. gali skaidyti sudėtingus augalų polisacharidus. Ankstesnėse ataskaitose taip pat buvo parodyta, kad du dominuojantys bakterijų skyriai, padidėjęs phyla Firmicutes / Bacteroidetes santykis, yra susiję su nutukimu [28]. Mažesnis pirmųjų ir didesnis antrųjų gausumas LM grupėje rodo, kad LM gali padėti atsikratyti svarų.

Iš 72 aptiktų šeimų taksonai top10 buvo išskirti ir išanalizuoti (5c, d pav.). Lachnospiraceae ir Ruminococcaceae yra dvi iš gausiausių žinduolių žarnyno aplinkoje randamų šeimų ir buvo siejamos su žarnyno sveikatos palaikymu [29]. Šiame tyrime šeimos Bacteroidales_S24-7_grupė (39,11 ± 6,04 proc., 36,88 ± 4,44 proc., 28,37 ± 4,01 proc., 35,81 ± 7,91 proc.), Prevotellaceae (10,3,5 ± 5,6 proc. Procentas, 19,65 ± 8,97 proc., 21,05 ± 8,39 proc.), Lachnospiraceae (18,21 ± 5,20 proc., 15,09 ± 3,29 proc., 12,13 ± 7,14 proc., 13,12 ± 6,82 proc.) Ir Ruminococaceae (9,64 ± 0,88 proc., 10,44 ± 2,45 proc. kiekvienoje grupėje dominavo ± 4,70 proc., 8,19 ± 1,72 proc. Buvo pranešta, kad S24-7 šeima turi daug angliavandenius skaidančių fermentų [30]. Prevotellaceae polisacharidų grupėje augo, o Lachnospiraceae – mažėjimo tendencija, palyginti su kontroline grupe [31]. Daryta prielaida, kad Bacteroidales_S24-7_grupėje ir Lachnospiraceae nėra atitinkamų cistanche polisacharidų aktyvių fermentų arba angliavandenius surišančių bakterijų modulių polisachariduose. Buvo pranešta apie Prevotella gentis, susijusias su polisacharidų panaudojimo lokusais ir angliavandenių aktyviais fermentais [32]. Norint rasti ryšį tarp bakterijų ir SCFA, buvo pritaikyta Spearman koreliacijos analizė. Kai kurios gentys, tokios kaip Bacteroides, Prevotella ir Lactobacillus žarnyno mikrobiotoje, atlieka svarbų vaidmenį hidrolizuojant polisacharidus į SCFA [33]. Mūsų rezultatai taip pat parodė, kad Bacteroidaceae koreliuoja teigiamai ir dominuojanti mikrobiota gamino daugiau butirato [34], o Prevotellaceae koreliavo teigiamai, o dominuojanti mikrobiota gamino daugiau acetato. Lactobacilaceae ir Ruminococcaceae dominuojanti mikrobiota gamino daugiau propionato (6 pav.).

Beta įvairovės analizė buvo naudojama tiriant žarnyno mikrobiotos struktūrinius pokyčius mėginiuose, naudojant UniFrac atstumo metriką. Unifrac atstumų skirtumai buvo analizuojami Tukey ir Wilcox testu (7 pav.). Naudodami nesvertinę uniFrac analizę, nustatėme, kad LM pašarų pelės susitelkusios nuo kitų grupių. Kontrolinėms, ZT, HM ir LM grupėms buvo nustatytas akivaizdus klasterizacijos modelis.

Šių mikrobų gausa buvo skirtingai moduliuojama gydant polisacharidais. Norint nustatyti specifinius kiekvienos grupės bakterijų taksonus, kontrolinės, ZT, HM ir LM grupių mikrobiotos sudėtis buvo palyginta linijinės diskriminacinės analizės efekto dydžio (LEfSe) metodu. Linijinė diskriminacinė analizė (LDA) naudojama kiekvienos skirtingai gausios ypatybės poveikio dydžiui apskaičiuoti. LDA balų slenkstis yra didesnis nei 4 buvo sąrašas, o tai rodo didesnį santykinį bendruomenės gausą atitinkamoje grupėje nei kitose grupėse. Naudodami šį metodą nustatėme, kad 19 OTU visose grupėse buvo reikšmingai skirtingi, būtent 6 OTU kontrolinėje grupėje buvo didesni, tik 1 OTU ZT grupėje buvo didesnis, 1 0 OTU HM grupėje buvo didesnis. ir 2 OTUS LM grupėje buvo didesni nei kitose grupėse (8 pav.). G_Prevotellaceae_ UCG_001 gausa LM reikšmingai padidėjo (8,47 ± 1,9 proc. LM, 0.40 ± {{21 }}.09 procentai valdymo grupėje, pb 0,01). Rezultatas atitiko ataskaitą, kad Porphyra haitanensis ir Ulva prolifera polisacharidai akivaizdžiai gali skatinti Prevotellaceae UGC-001 (pb 0,05) ir Rikenellaceae RC9 (pb 0,01) [35].

4. Išvados

Akivaizdu, kad yra ryšys tarp TCM cheminių sudedamųjų dalių, žarnyno mikrobiotos ir tam tikrų metabolitų, atsirandančių dėl žarnyno mikrobų. Mūsų dabartinės išvados suteikė metodą, kaip tirti echinakozidų metabolizmo sinergijas su įvairių rūšių polisacharidais, remiantis žarnyno mikrobiota. Žarnyno mikrobiota gali metabolizuoti TCM, o TCM gali paveikti žarnyno mikrobiotos augimą. Viena vertus, po geriamojo polisacharidų vartojimo į žarnyną, įvairios žarnyno mikrobiotos koduoja metabolinius fermentus, vaidinančius svarbų vaidmenį skaidant polisacharidus ir gaminant bioaktyvius metabolitus. Kita vertus, polisacharidų indėlis daro tam tikrą poveikį žarnyno mikroaplinkos pusiausvyrai procese. Palyginus su polisacharidais arba be jų, mes nustatėme, kad polisacharidai, nors ir tiesiogiai virškinami šeimininko, potencialiai veikė kaip prebiotikai, o tai lemia palankius žarnyno mikrobiotos pokyčius, skatindami probiotikų augimą. Cistanche polisacharidai reguliavo žarnyno mikrobiotos įvairovę, padidino naudingų bakterijų skaičių, o ypač mažos molekulinės masės polisacharidai padidino Prevotella spp. Be to, patobulinta žarnyno mikrobiota padidino echinakozido absorbciją Cistanche deserticola. Tačiau priežastis nėra visiškai aiški, gali būti dėl bendro žarnyno mikrobiotos, SCFA ir imuniteto defektų, todėl reikia atlikti tolesnius ligos modelio tyrimus. Sunku įrodyti prebiotikų poveikį sveikiems gyvūnų modeliams, kurių mikrobiotos bendruomenė yra stabili ir atspari. Cistanche deserticola polisacharidai gali būti sukurti kaip probiotiniai produktai, reguliuojantys žarnyno mikrobiotą, ir ateityje gali būti naudojami sinergetiniam mažų molekulių metabolizmui. Šie duomenys padės mums sukurti intervencijas, kurios neleistų pažeidžiamoms žmonių grupėms pagerinti savo sveikatą.

Konkuruojančių interesų deklaracija

Autoriai pareiškia, kad dėl šio straipsnio publikavimo nėra interesų konflikto.

Padėkos

Autoriai dėkoja Nacionaliniam Kinijos gamtos mokslų fondui (grantos Nr. 81830112 ir 81904058)

Nuorodos
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Potencialūs prebiotikai ir jų perdavimo mechanizmai: naujausi metodai, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, žarnyno mikrobiota, šeimininko sveikata ir polisacharidai, Biotechnol. Adv. 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, Kritinis polisacharidų vaidmuo žarnyno mikrobų ekologijoje ir fiziologijoje, Annu. Rev. Microbiol. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, Trijų skirtingos molekulinės masės polisacharidų ir flavonoidų iš kukurūzų šilko (Maydis stigma), Carbohyd jungimosi charakteristikų tyrimai. Polym. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, žarnyno mikrobiota - dalyvauja mechanizmai, didinantys sisteminį ginsenozidų poveikį kartu su ženšenio nuovire esančiais polisacharidais, Sci. Rep. 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Codonopsis pilosula saponinų absorbcija kartu su polisacharidais palengvina žarnyno mikrobų disbiozę su natrio dekstranu. - sukeltas kolitas pavyzdinėms pelėms, Biomed. Res. Tarpt. 2018 (2018), 1781036 (18 psl.).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum sumažina pelių nutukimą, moduliuodama žarnyno mikrobiotos sudėtį, Nat. Komun. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, Žarnyno mikrobiota dalyvauja longano polisacharido, Mol, imunomoduliacinėje veikloje. Nutr. Food Res. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, „Dykumos ženšenis“: apžvalga, Am. J. Chinas. Med. 40 (6) (2012) 1123–1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, Echinakozido metabolitų, kuriuos gamina žmogaus žarnyno bakterijos naudojant itin efektyvų skystį, identifikavimas
chromatografija–kvadrupolio skrydžio laiko masės spektrometrija, J. Agr. Food Chem. 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Cistanches Herba vandens ekstrakto metabolizmas žmogaus virškinimo trakte in vitro: metabolizmo profilio išaiškinimas, pagrįstas išsamiu metabolitų identifikavimu skrandžio sultyse, žarnyno sultyse, žmogaus žarnyne. bakterijos ir žarnyno mikrosoma, J. Agric. Food Chem. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Kolorimetrinis cukrų ir susijusių medžiagų nustatymo metodas, Anal. Chem. 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Naujoji gleivinės imunizacija polisacharido-baltymo konjugatais, įstrigtais alginato mikrosferose, J. Control. 53 leidimas (1–3) (1998) 215–224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Jautrus ir supaprastintas antibiotikų įtakos dinaminiams ir įvairiapusiams išmatų trumpųjų pokyčių aptikimas. -grandinės riebalų rūgštys, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, Molekulinė polisacharidų modifikacija ir gaunamas biologinis aktyvumas , Kompr. Maistas kun. Sci. F. 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: jo chemijos, farmakologijos ir farmakokinetikos savybių apžvalga, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Chitooligosacharidų poveikis
Fructus Forsythia ekstrakte esančių feniletanoidinių glikozidų absorbcija žarnyne, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, Ophiopogon japonicus polisacharidų įtaka 2,3,5,4′-tetrahidroksi-stilbenui-2- Z. Fu ir kt. / International Journal of Biological Macromolecules 149 (2020) 732–740 739 O- -d-gliukozidas apie biofarmacines savybes in vitro ir farmakokinetiką in vivo, Int. J. Biol. Macromol. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Tikslioji medicina yra mikroskopinė: mikrobiomo kūrimas siekiant pagerinti vaistų rezultatus, Cell Host Microbe 26 (1) (2019), 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Prebiotikų paieška, novatoriški vertinimo metodai ir jų taikymas sveikatai: apžvalga, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimeris, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, Tarptautinė mokslinė probiotikų asociacija ir prebiotikų (ISAPP) konsensuso pareiškimas dėl prebiotikų apibrėžimo ir taikymo srities, Nat. Kunigas Gastro. Hepat. 14 (8) (2017) 491–502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Storosios žarnos sveikata: fermentacija ir trumpos grandinės riebalų rūgštys, J. Clin. Gastroenterolis. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] SI Cook, JH Sellin, apžvalgos straipsnis: trumpos grandinės riebalų rūgštys sveikatai ir ligoms, Aliment. Pharm. Ten. 12 (6) (1998) 499–507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Nutukimo ir gliukozės tolerancijos gerinimas acetatu sergant 2 tipo diabetu Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty (OLETF) žiurkės, Biosci. Biotechnol. Biochem. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, In vitro fermentability of xylooligosacharids and Xylo-polysacharide fractions with different molecular weights by human fecal bakterijos, Carbohyd. Polym. 179 (2018) 50–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Prevotella ir Bacteroides dominuojančių žarnyno mikrobiotų skaidulų panaudojimo pajėgumai skiriasi, Sci. Rep. 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii yra ankstesnis heterotipinis Bacteroides chinchilla sinonimas ir turi pirmenybę, Int. J. Syst. Evol. Mikrofonas 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, Su nutukimu susijęs žarnyno mikrobiomas, turintis didesnį energijos surinkimo pajėgumą, Nature 444 (7122) (2006) 1027–1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Ryšys tarp žarnyno mikrobiomo ir metabolinių hormonų ankstyvojo nėštumo metu antsvorio turinčioms ir nutukusioms moterims, Diabetas 65 (8) (2016 m.) 2214 –2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, Genominis apibūdinimas nekultūringos Bacteroidales šeimos S24-7, gyvenančios homeoterminių gyvūnų žarnyne, Microbiome. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Naudingas butiratą gaminančių Lachnospiraceae poveikis streso sukeltam padidėjusiam visceraliniam jautrumui žiurkėse, J. Gastro. Hepatol. 34 (8) (2019) 1368–1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, Įvairūs ir platūs augalų polisacharidų skaidymo prieskrandyje ir užpakalinėje žarnoje aparatai. Prevotella rūšys: jų paplitimo veiksnys? Syst. Appl. Microbiol. 42 (2) (2019) 107–116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, Angliavandenių vaidmuo kiaulių žarnyno sveikatai, Anim. Maitinti. Sci. Tech. 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A. Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, Understanding the prebiotic potencial of different dietary fibers using in vitro nepertraukiamos suaugusiųjų fermentacijos modelį (PolyFermS), Sci. Rep. 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Dviejų jūros dumblių polisacharidų poveikis pelių žarnyno mikrobiotai, įvertintas Illumina PE250 sekvenavimu, Int. J. Biol. Macromol. 112 (2018) 796–802.