Eteriniai aliejai, kurių sudėtyje yra citralio, kaip potencialūs tirozinazės inhibitoriai: biologiškai valdomas frakcionavimo metodas

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Santrauka:

Pernelyg didelė melanino gamyba sukelia rimtų dermatologinių ligų ir nedidelių estetinių problemų (pvz., strazdanų ir saulės lentigo). Tirozinazės reguliavimas yra plačiai paplitęs tokių sutrikimų gydymo būdas, o augalų ekstraktai dažnai pasirodė esantys vertingitirozinazėinhibitoriai. Citralis (neralo ir pelargonijų mišinys) yra svarbi kvapioji medžiaga, turinti antitirozinazės potencialą. Jo yra labai daug Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. ir Verbenaofficinalis L. eteriniuose aliejuose (EO). Tačiau buvo ištirtas tik L. cubeba EO. naudoti kaip potencialią odos balinimo priemonę. Šis darbas įvertina in vitrotirozinazėšių EO slopinamąjį aktyvumą ir tyrimus, naudojant į biologinį tyrimą orientuotą frakcionavimą, ar jų skirtinga cheminė sudėtis įtakoja bendrą EO slopinamąjį aktyvumą dėl galimos sinerginės, priedinės ir (arba) konkurencinės sąveikos tarp EO komponentų. C. schoenanthus EO ir M. officinalis EO slopinamasis aktyvumas, turint nedidelį (plius) citronelio kiekį, atitiko jų citralio kiekį. Kita vertus, L. cubeba ir V. officinalis EO slopinotirozinazėžymiai daugiau, nes juose buvo mirceno, kuris prisidėjo prie bendros EO veiklos. Panašūs stebėjimai buvo atlikti su M. officinalis EO, turinčiu daug (plius)-citronella, kuri padidino citralio aktyvumą.

Raktiniai žodžiai:tirozinazėslopinimas; eteriniai aliejai; citralinis

cistanche turi balinimo funkciją

Įvadas

Tirozinazėyra pagrindinis fermentas melanino pigmentų biosintezėje keliose bakterijose, grybuose, augaluose, gyvūnuose ir žmonėms. Žmonėms tirozinazė katalizuoja greitį ribojančius melanino biosintezės kelio etapus. Šiai biosintezei būdingos kelios fermentinės ir cheminės reakcijos, dėl kurių iš aminorūgšties L-tirozino susidaro melaninas, o tirozinazė katalizuoja jo hidroksilinimą į o-dopachinoną per mikofenolato ir difenolių veiklą. Nors melanogenezėje dalyvauja ir kiti fermentai, tik tirozinazės katalizuojamos reakcijos negali vykti spontaniškai, o likusieji etapai gali vykti be fermento aktyvumo esant fiziologiniam pH [1]. Dėl šios priežasties tirozinazės reguliavimas yra labai plačiai paplitęs būdas sumažinti melanino perteklių. tirozinazės inhibitorių, kaip odą balinančių medžiagų, naudojimas įrodė didelę klinikinę ir kosmetinę reikšmę [2].

ES rinkoje,tirozinazėinhibitorius, kurie naudojami kaip odą balinančios medžiagos, galima suskirstyti į dvi pagrindines kategorijas: uždraustus pagal ES kosmetikos reglamentą 1223/2009 (ty hidrochinonas ir monobenzileterio hidrochinonas) dėl jų sunkaus šalutinio poveikio, bet kurie vis dar naudojami hiperpigmentacijai gydyti pagal medicininę priežiūrą. priežiūra;ir tirozinazės inhibitoriai, kuriuos leidžiama naudoti kosmetikos gaminiuose (ty arbutinas, alavijas, kojo rūgštis) [2,3]. Tačiau šiai antrajai grupei vis dar būdingas potencialiai reikšmingas šalutinis poveikis; Klinikiniai kojic rūgšties tyrimai iš tiesų parodė eritemos, dilgčiojimo pojūčių ir kontaktinės egzemos atvejus. Panašiai Europos vartotojų saugos mokslinis komitetas išreiškė susirūpinimą dėl kosmetikos ingrediento arbutino naudojimo [2] dėl galimos glikozidinės jungties hidrolizės, išskiriančios hidrochinoną. Todėl hiperpigmentacijai gydyti reikia naujų molekulių šablonų ir (arba) bioaktyvių junginių mišinių.

Augalai buvo vertingi odą balinančių medžiagų šaltiniai, o trys iš penkių medicinoje ir kosmetiškai dažniausiai naudojamų medžiagų yra augalams būdingi metabolitai (ty hidrochinonas, -arbutinas, alavijas). Iki šiol fenoliniai junginiai iš esmės buvo tiriami kaip potencialūstirozinazėinhibitoriai, įskaitant flavonoidus (pvz., kvercetiną [4]), stilbenus (pvz., resveratrolį [1]), fenilpropanoidus (pvz., cinamaldehidą [5] ir eugenolį [6]) ir fenolio rūgštis (pvz., anizo rūgštį ir benzenkarboksirūgštis [7]). Susidomėjimas terpenoidais buvo žymiai mažesnis ir jie buvo palyginti nepakankamai ištirti kaip antitirozinazės agentai.

Citralis yra vienas iš riboto tirtų terpenoidinių darinių, turinčių antitirozinazės savybių, skaičiaus. Tai dviejų izomerų, cis- ir trans-3, 7-dimetil-2, 6-oktadienalų (ty neralinio ir pelargoninio), mišinys, kurie, kaip įrodyta, blokuoja grybų fermentinis aktyvumas in vitrotirozinazė[8]. Be savo svarbos kaip kvapus ingredientas gėrimuose, maisto produktuose ir kosmetikoje, citralis parodė daug žadantį biologinį poveikį in vitro, įskaitant priešgrybelinį, antibakterinį, antioksidacinį ir priešuždegiminį poveikį [9–11]. Be to, naujausi tyrimai parodė. pabrėžė, kad citralis turi potencialią terapinę reikšmę kaip lygiųjų raumenų atpalaiduojantis ir vietinis anestetikas, nes skatina trachėjos, gimdos ir aortos lygiųjų raumenų atsipalaidavimą ir slopina nervų jaudrumą gyvūnų modeliuose [12–15].

Citralis gaunamas iš kelių botaninių rūšių eterinių aliejų (EO), įskaitant Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. ir Verbena officinalis L. Geriausi autoriai. žiniomis, dėl jo buvo ištirtas tik L. cubeba EOtirozinazėslopinantis aktyvumas [16]. Todėl šiuo tyrimu siekiama įvertinti C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis ir V.officinalis EO tirozinazę slopinamąjį aktyvumą, naudojant in vitro kolorimetrinį tyrimą, siekiant įvertinti, ar skirtingos cheminės sudėties daro įtaką bendram EO slopinamajam aktyvumui. galimos sinerginės, priedinės ir (arba) konkurencinės sąveikos tarp jų komponentų. Šiame tyrime naudojamas abioanalizuojamas frakcionavimo metodas, siekiant visapusiškai įvertinti EO sudedamąsias dalis ir jų enantiomerus, kai jie yra chiraliniai, kurie prisideda prie EO slopinimo aktyvumo prieš grybų tirozinazės šaltinį, o tai yra gera pavyzdinė preliminaraus atrankos sistema.tirozinazėinhibitoriai [17].

2. Rezultatai ir aptarimas

2.1. Tiriamo eterinio aliejaus cheminė sudėtis ir citralių kiekis

Bandydami visapusiškai apibūdinti visus galimus EO komponentus, kurie prisideda prie svarstomo biologinio aktyvumo, ištirtus EO išanalizavo GC, aptikus tiek FID, tiek MS. Buvo nustatytas visų aptiktų junginių normalizuotas santykinis procentinis gausumas (apskaičiuotas iš absoliučių plotų, normalizuotų pagal vidinį standartą C13, naudojant atsako koeficientus [18, 19]) ir panaudotas EO kompozicijoms palyginti. 1 paveiksle pateiktas tirtų EO, analizuotų įprastine stulpeliu, GC-MS profilis. 1 lentelėje pateikiami kiekvieno tirto EO junginiai, kurių normalizuotas procentas buvo didesnis nei 0, 1, o visos EO cheminės sudėties pateikiamos papildomose medžiagose (S1–S5 lentelės).

Visuose tirtuose EO yra daug nervinių (cis{{0}}, 7-dimetil-2, 6-oktadienalinių) ir geranijų (trans-3,{ {5}}dimetil-2,6-oktadienalis), kurie yra gausiausi junginiai. Visuose tirtuose EO vidaus ir pelargonijų santykis buvo labai panašus ir atitiko 0,74 ± 0,05. C. schoenanthus ir L. cubeba EO rodo didžiausią nervų ir pelargonijų kiekį, kuris vidutiniškai sudaro 60 procentų visos jų EO sudėties ir yra 1.{14}}kartą didesnis nei V. officinalis EO ir trys M. officinalis EO (ty 1, 2 ir 3 mėginiai). Papildomi deguonies prisotinti junginiai, būdingi visiems EO, yra 6-metil-5-hepten-1-one, linalolis ir citronelalis. Pastarasis M. officinalis EO 1 yra žymiai gausesnis nei kituose tirtuose EO, įskaitant M. officinalis EO2 ir 3.

Angliavandenilių frakcijos gausa skirtinguose EO labai skiriasi.M. officinalis EO 1 sudėtyje yra tik trans- -kariofileno ir -humuleno kaip seskviterpeno angliavandeniliai, kurie sudaro atitinkamai 2,7 proc. ir 0,13 proc. viso EO. C.schoenanthus EO yra šiek tiek turtingesnė angliavandenilių frakcija nei M. officinalis EO 1 (ty 7.0 proc.), turintis abu monoterpenus (ty kamfeną, cis{{1{{20 }}}}ocimenas, limonenas, -pinenas, trans- -ocimenas, -tujenas) ir seskviterpenai (ty trans- -kariofilenas, -kadinenas, δ-kadinenas, germakrenas D, -elemenas) sumos. L. cubeba ir V.officinalis EO angliavandenilių frakcija sudaro 20 procentus viso EO, o limonenas yra gausiausias junginys (ty atitinkamai 15,0 ir 10,9 proc.), po to seka -pinenas, pinenas. , sabinenas, trans- -kariofilenas, -mircenas, kamfenas ir kopenas. Galiausiai M.officinalis EO 2 ir 3 pasižymi didžiausiu angliavandenilių frakcijų kiekiu (atitinkamai 38,8 proc. ir 31,8 proc. bendro EO). Abiejuose mėginiuose angliavandenilių frakcijoje daugiausia yra seskviterpenų, būtent trans- -kariofileno (atitinkamai 27,8 proc. ir 20,0 proc.) ir -humuleno (3,0 proc. ir 2,6 proc.), ir sumažintos monoterpeno frakcijos, kuriai daugiausia būdingas limonenas ( atitinkamai 4,2 ir 3,2 procento).

Buvo ištirti trys L. cubeba, V. officinalis ir C. schoenanthus Eos mėginiai, pagaminti skirtingais metais, taip pat trys skirtingų gamintojų M. officinalis EO mėginiai. C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis ir V. officinalis GC-MS analizės neatskleidė reikšmingų kokybinių ir kiekybinių skirtumų tarp trijų skirtingų gamybos metų mėginių cheminės sudėties. Tai gali būti siejama su optimaliomis laikymo sąlygomis, ty gintaro stiklo inde 4 ◦C temperatūroje tamsoje su nežymia erdve. Kita vertus, GC-MS analizė parodė reikšmingus citronelio ir trans{{4} }}kariofilenas trijuose tirtuose M. officinalis EO. M. officinalis EO 1, 2 ir 3 citronella atitinkamai siekė 19,6 proc., 0,26 proc. ir 0,31 proc. Priešingai, kaip aprašyta anksčiau, trans- -kariofileno M. officinalis EO 2 ir 3 yra daug daugiau nei M. officinalis EO 1. Šie rezultatai atitinka Seidler-Lozykawska ir kt. kurie pabrėžė reikšmingus citralio, citronelio ir trans{19}}kariofileno kiekio skirtumus EO, gautuose iš 22 atrinktų M. officinalis genotipų, kilusių iš Europos botanikos sodų [20].

Tikrasis kiekybinis įvertinimas buvo atliktas išoriniu standartiniu kalibravimu, siekiant tiksliai įvertinti potencialių biologiškai aktyvių specializuotų junginių (ty neralinių, pelargonijų, limonenų, mirceno ir citronelalio) gausą. 2 ir 3 lentelėse pateikiami diagnostiniai jonai (m/z), naudojami SIM- Tiriamų žymenų junginių MS kiekybinis nustatymas kartu su kalibravimo diapazonu, kalibravimo kreivės lygtimi, koreliacijos reikšmėmis ir kiekvienos analitės regresijos standartine paklaida bei kiekybiniais rezultatais.

2.2. Tirtų eterinių aliejų in vitro slopinamasis aktyvumas prieš grybų tirozinazę

Kaip aprašyta anksčiau, C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba ir V.officinalis EO turi didelį citralio kiekį, kuriam būdingas nekonkurencinis slopinantis aktyvumas prieš grybelinį tirozinazės šaltinį [8,16,21] . Šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti in vitrotirozinazėšių EO slopinamąjį aktyvumą, siekiant ištirti, ar jų slopinamasis aktyvumas gali būti priskirtas tik jų citralio kiekiui, ar yra kitų biologiškai aktyvių junginių, turinčių įtakos EO slopinamajam poveikiui.

GrybastirozinazėČia buvo priimtas dėl didelės homologijos su humantirozinaze, santykinai mažos kainos ir lengvo prieinamumo, todėl jis yra geras pavyzdinė sistema preliminariai tirozinazės inhibitorių atrankai [17]. In vitro tikslumastirozinazėslopinimo testas buvo įvertintas pagal pakartojamumą (penkis kartus per tą pačią dieną atliekant fermentinio slopinimo testą) ir vidutinį tikslumą (fermentinio slopinimo testą kartojant penkis kartus kas keturias savaites per šešių mėnesių laikotarpį). 4 lentelėje pateiktas variacijos koeficientas (CV) slopinimo testams, atliktiems su kojo rūgštimi, kuri buvo naudojama kaip teigiama kontrolė, ir su L. cubeba EO. Rezultatai buvo patenkinami, nes CV niekada neviršijo 7 procentų pakartojamumo ir 10 procentų vidutinio tikslumo. 4 lentelėje pateiktas slopinimo testų, atliktų su kojinės rūgšties, naudotos kaip teigiamos kontrolės, ir su L. cubeba EO variacijos koeficientas. Panašios tikslumo vertės buvo gautos visiems išbandytam EO.

Citralio koncentracijos ir atsako kreivė buvo tiriama brėžiant pastebėtą slopinamąjį aktyvumą kaip jo koncentracijos reakcijos mišinyje funkciją. Visi EO buvo išbandyti esant 166,7 µg/mL koncentracijai, kuri, nepaisant EO, suteikė citralinę koncentraciją koncentracijos ir atsako kreivės tiesiškumo diapazone (y=0.3956x plius 1.8094,R{{7} }.9951, regresijos paklaida: 2,08448, tiesiškumo diapazonas: 6,7–166,7 µg/mL) ir nesukėlė tirpumo problemų reakcijos mišinyje.

2 paveiksle pateiktame langelyje parodytas procentastirozinazėslopinimas kiekvienam EO. L. cubeba, V. officinalis ir C. schoenanthus EO rezultatai, pateikti 2 paveiksle, atitinka 2020 EO grybų tirozinazę slopinamąjį aktyvumą, nes dispersijos analizė neparodė statistiškai reikšmingų skirtumų tarp skirtingų EO gamybos metų (p > 0,05). Kalbant apie L. cubeba ir C. schoenanthus EO, šie rezultatai gerai sutampa su rezultatais, gautais atliekant kiekybines GCMS analizes, kurios atskleidė beveik identišką citralio kiekį skirtingų gamybos metų EO. 2020 m. V. officinalis EO partijoje yra šiek tiek didesnis citralio kiekis nei 2019 ir 2018 m. partijose. Tačiau pagal citralio koncentracijos ir atsako kreivę 2020 m. partijos citralio perteklius nėra pakankamas, kad būtų galima nustatyti statistiškai reikšmingai didesnį fermentinio slopinimo procentą, atsižvelgiant į atsitiktinį atvejį. su matavimais susijusi klaida. Norėdami gauti daugiau informacijos, žr. S1 paveikslą papildomoje medžiagoje. Kita vertus, dispersijos analizė (ANOVA), po kurios buvo atliktas Tukey-Kramer post-hoctestas, parodė, kad trys išbandyti M. officinalis EO, kuriuos pateikė skirtingi gamintojai, slopino grybą.tirozinazėskirtingu mastu, kuris bus išsamiau aprašytas tolesnėse pastraipose. Didžiausias slopinamasis aktyvumas buvo pastebėtas L.cubeba, M. officinalis 1 ir V. officinalis EO, kurie slopino 59 ± 6 proc., 55 ± 7 proc. ir 52 ± 6 proc.tirozinazėaktyvumas, atitinkamai, kai tiriama esant 166,7 µg/ml koncentracijai. Statistiškai reikšmingas (p < 0.05)="" mažesnis="" aktyvumas="" buvo="" pastebėtas="" c.="" schoenanthus="" ir="" m.officinalis="" 2="" ir="" 3="" eo,="" kurių="" fermentus="" slopinantis="" aktyvumas="" buvo="" 42="" ±="" 5="" proc.,="" 40="" ±="" 5="" proc.="" ir="" 38="" ±="" 6="" proc.="" proc.,="" atitinkamai.="" 5="" lentelėje="" pateikta="" inhibitorių="" koncentracija,="" kuri="" perpus="" sumažino="" fermento="" aktyvumą="" nurodytomis="" eksperimentinėmis="" sąlygomis="" (ic50)="" kiekvienam="" tiriamam="" inhibitoriui="" (ty="" eo,="" atskiri="" junginiai="" ir="" kojo="" rūgštis).="" visi="" eo="" veiksmingai="" slopino="" grybų="" tirozinazę="" ir="" rodė="" slopinamąjį="" aktyvumą,="" kuris="" buvo="" vidutiniškai="" 100-kartų="" mažesnis="" nei="" kojicacido,="" kuri="" buvo="" naudojama="" kaip="" teigiama="">

2.3. Papildomų bioaktyvių komponentų, be citralio, identifikavimas pagal biologinį tyrimą vadovaujamą frakciją. 3 paveiksle pateiktoje histogramoje eksperimentiškai išmatuotų fermentinių slopinimo procentas palyginamas su vertėmis, kurių būtų galima tikėtis, jei neralinis ir pelargoninis (laikomas suma, ty citraliu) būtų tik aktyvūs junginiai tirtuose EO. Šios vertės buvo išmatuotos interpoliuojant iš citralio koncentracijos ir atsako kreivės. Kaip galima pastebėti, C. schoenanthus, M. officinalis 2 ir M. officinalis 3 slopino aktyvumą, kuris atitiko jų citralio kiekį, o L. cubeba, M. officinalis 1 ir V. officinalis EO slopino grybų augimą. tirozinazės padidėjimas didesnis nei tikėtasi. Siekiant nustatyti papildomus junginius, kurie prisideda prie citralio aktyvumo, buvo priimtas biologinis metodas. L. cubeba, M. officinalis 1 ir V. officinalis EO deguonies ir angliavandenilių frakcijos buvo išskirtos greitosios chromatografijos būdu ir atskirai ištirtos dėl jų grybų.tirozinazėslopinanti veikla. Fitoheminės frakcijos buvo išbandytos dėl grybų tirozinazės slopinimo. Frakcijų fitoheminės frakcijos buvo tiriamos esant tokiai pačiai koncentracijai kaip ir jų koncentracija, kai buvo tiriama 166,7 µg/mL atitinkamo EO (žr. 3.2 skirsnio skyrių „Medžiagos ir metodai“). ir -mirceno frakcionuotų EO deguonies ir angliavandenilių frakcijose.

Kalbant apie L. cubeba ir V. officinalis EO, tiek deguonies, tiek angliavandenilių frakcijos slopino grybų tirozinazę, nors ir skirtingu mastu. Deguonies prisotintų frakcijų aktyvumas (atitinkamai 53 ± 3 procentai ir 44 ± 5) sudaro didžiąją dalį EO anti-tirozinazėpotencialą ir atitiko atitinkamą citralio kiekį, o tai rodo, kad junginiai, prisidedantys prie citralio aktyvumo, priklauso angliavandenilių frakcijoms. L. cubeba ir V. officinalis EO angliavandenilių frakcijos yra gana panašios cheminės sudėties. limoneno (atitinkamai 68,4 ir 50,3 proc.), trans- -kariofileno (atitinkamai 120 ir 7,8 proc.), pineno (atitinkamai 1,7 ir 7,5 proc.), -pineno (atitinkamai 2,5 ir 12,9 proc.), sabineno (atitinkamai 2,7 ir 3,8) ir -mirceno (atitinkamai 2,0 ir 2,4 proc.) yra daugiausia junginių abiejose frakcijose ir jų yra gana panašiais kiekiais, išskyrus -pinenas ir -pinenas, kurie vyrauja V. officinalis EO angliavandenilių frakcijoje.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 proc. abiejų EO), limoneno (atitinkamai 97 ir 94 proc. L. cubeba ir V. officinalis EO) ir sabineno (87 proc. abiejuose EO), o -pineno ((-)- enantiomerų perteklius buvo skirtingas. enantiomeras: 38 proc. L. cubebaEO ir 73 proc. V. officinalis EO) ir -pineno ((-)-enantiomeras: 67 proc. L. cubeba EO ir 88 proc. V. officinalis EO). Abiejuose EO (-)-limonenas sudaro daugiau nei 50 procentų visos frakcijos. Tačiau, nors ankstesniuose tyrimuose buvo pranešta apie grybų tirozinazės slopinamąjį poveikį dėl didelio jos gausumo [22, 23], (-)-limonenas čia neparodė tirozinazę slopinančio aktyvumo. Panašūs rezultatai gauti naudojant (plius)-limoneną, raceminį mišinį ir junginius (-)-trans- -kariofileną, (±)- -pineną ir (±)- -pineną . Sabinene nebuvo išbandyta, nes jau buvo įrodyta, kad jame yra nereikšmingas grybastirozinazėslopinantis poveikis [8]. Sutinkant su ankstesniais duomenimis [8], mircenas sumažino grybų tirozinazės aktyvumą. Išbandžius 166,7 µg/mL L. cubeba ir V. officinalis EO koncentraciją, mirceno aktyvumas užpildė spragą tarp numatomo EO slopinamojo poveikio, jei citralis buvo vienintelis aktyvus junginys ir eksperimentinių rezultatų. Priešingai nei pastebėjo Matsuura ir kt. [8], -mircenas pasirodė esąs stipresnis grybų tirozinazės inhibitorius nei citralis, nes jo IC50 buvo beveik kelis kartus mažesnis (13,3 µg/mL, palyginti su 121,8 µg/ml). Šis skirtumas gali būti siejamas su skirtingais naudojamais substratais; Matsuura ir kt. tyrė tik grybų tirozinazės difenolazės aktyvumą, nes kaip substratą jie naudojo L-DOPA, o šiame tyrime buvo naudojamas L-tirozinas. Dabartinės išvados rodo, kad mircenas gali veiksmingiau slopinti grybų tirozinazės monofenolazės aktyvumą nei difenolazės.

M. officinalis EO 1 turi nedidelę angliavandenilio frakciją, kuri sudaro mažiau nei 3 procentus visos, ir neturi tirozinazę slopinančio aktyvumo. Tačiau M. officinalisEO 1 deguonimi prisotinta frakcija grybų tirozinazę slopino labiau, nei būtų galima tikėtis iš jos citralio kiekio (3 pav.). Šioje frakcijoje, be nervų ir pelargonijų, yra daug citroneliolių, o chiralinė analizė atskleidė aukštą citronelalio enantiomerinį grynumą (pliuso) enantiomero (98,3 proc.) naudai. Nepriklausomai tiriant, esant 166,7 µg/ml koncentracijai, (plius)-citronellalis nežymiai slopino fungirozinazę, nors jos aktyvumas žymiai padidėjo, kai buvo tiriamas kartu su citraliu. Šie rezultatai gali paaiškinti pastebėtus grybų procentų skirtumustirozinazėslopinimas įvairiuose M. officinalis EO. M.officinalis EO 2 ir 3 turi labai mažą citronelių kiekį, todėl gali būti, kad jų slopinamasis aktyvumas yra žymiai mažesnis nei M. officinalis EO 1.

3. Medžiagos ir metodai

3.1. Reagentai

Dimetilsulfoksidas (DMSO), grybų tirozinazė iš Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tirozinas, kojinė rūgštis, citralas, citronellalis, -mircenas, (plius)-limonenas, (-)-limonenas, (±)-limonenas, ( ±)- ir pinenas buvo įsigyti iš Merck Life Science Srl (Milanas, Italija). Litsea cubeba, Verbena officinalis ir Cymbopogon schoenanthus EO tiekė Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Italija). Buvo išbandytos trys skirtingų metų partijos (ty 2020, 2019, 2018 m.). Buvo ištirti trys Melissa officinalis EO pavyzdžiai; vieną pateikė Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), vieną - ErboristeriaMagentina Srl, o paskutinis buvo pirktas iš vietinės parduotuvės ir buvo iš SpecchiasolS.rl (Bussolengo, Italija). Tekste autoriai nurodo skirtingus Melissaofficinalis EO atitinkamai kaip M. officinalis EO 1, 2 ir 3. Pateikti EO buvo gauti taikant Europos farmakopėjoje aprašytas procedūras [24]. Melissa officinalis ir Verbena officinalis EO buvo gautos atitinkamai iš lapų ir augalų antžeminių dalių hidrodistiliacijos būdu; panašiai, Litsea cubeba ir Cymbopogon schoenanthus EO buvo gauti atitinkamai distiliuojant šviežius vaisius ir šviežias oro dalis. Kiekvienas EO buvo individualiai išanalizuotas GC-MS, kai tik jį įsigijo / pateikė atitinkamas gamintojas, kiekvienais saugojimo metais ir prieš pat jo fungirozinazę slopinančio aktyvumo tyrimą.

3.2. In vitro tirozinazės slopinimo tyrimas

ThetirozinazėEO ir izoliuotų junginių slopinamieji aktyvumai buvo tiriami in vitro naudojant kolorimetrinį rodmenį pagrįstą fermentų tyrimą, optimizuotą Zengh ir kt. [25], su nedideliais pakeitimais. EO tirozinazę slopinantis aktyvumas, taip pat jų atitinkamos angliavandenilių ir deguonies frakcijos bei gryni junginiai buvo tiriami in vitro, naudojant kolorimetrinį rodmenį pagrįstą fermentų tyrimą, kurį optimizavo Zengh ir kt. [25], su nedideliais pakeitimais: tyrimas buvo atliktas kambario temperatūroje irtirozinazėslopinimas buvo matuojamas atsižvelgiant į kontrolę ir mėginio absorbciją po 6 minučių inkubacijos, o ne po 20 minučių, kad veiktų tiesine fermentinės reakcijos dalimi, kuri suteikia tikslesnius slopinimo rezultatus [26, 27]. Šiam tyrimui buvo atrinktas Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach grybų tirozinas. L-tirozinas buvo naudojamas kaip substratas, o tai reiškia, kad bendras tirozinazę slopinantis aktyvumas buvo tiriamas neskiriant tirozinazės monofenolazės ir difenolazės aktyvumo. Fotometriniai matavimai esant 475 nm buvo atlikti su Thermo spectronic Genesys6, o kojinė rūgštis buvo naudojama kaip teigiamas kontrolinis inhibitorius. Tirtų potencialių inhibitorių (EO, EO išskirtų frakcijų, EO atskirų junginių ir kojicacido) tirpalai buvo paruošti DMSO. 7 lentelėje pateikiamos kiekvieno tiriamo potencialaus inhibitoriaus ištirtos koncentracijos. Grybastirozinazė200 U/mL (27,9 µg/mL) tirpalas buvo paruoštas natrio fosfato buferyje (pH 6,8), o 9 ml alikvotinės dalys buvo laikomos –18 ◦C temperatūroje ir atšildytos prieš pat eksperimentus. Tirozino tirpalas 0,1 mg/mL buvo paruoštas natrio fosfato buferyje (pH 6,8) ir atnaujinamas kasdien. Reakcijos mišinio komponentai buvo sudėti į buteliuką tokia tvarka: 1 ml grybų tirozinazės tirpalo 200 U/mL; 1 ml natrio fosfato buferinio tirpalo; 10 µL EO/vieno junginio/kojinės rūgšties tirpalo; ir galiausiai 1 ml tirozino tirpalo 0,1 mg/ml. Galutinis DMSO procentas reakcijos mišinyje buvo 0,3 procento. Tyrimas buvo atliktas sandariame 4 ml buteliuke, kad būtų išvengta bet kokių EO komponentų praradimo į aplinką ir kad būtų sumažintas jų išsiskyrimas į viršutinę erdvę virš reakcijos mišinio. Reakcijos mišinys buvo inkubuojamas termostatinėje vandens vonioje 25 °C temperatūroje 6 min. Vėliau buvo užregistruota absorbcija esant 475 nm, nes šis bangos ilgis leidžia identifikuoti dopachromą. Absorbcija, atitinkanti 100 procentų tirozinazės aktyvumo, buvo išmatuota pakeitus EO / atskirą junginį / kojinės rūgšties tirpalą 10 µL gryno DMSO. Tušti tirpalai buvo paruošti taip: 2 mL natrio fosfato buferinio tirpalo, 10 µL EO / atskiro junginio. /kojinės rūgšties/DMSO tirpalo ir 1 ml tirozino tirpalo 0,1 mg/ml. Tirozinazės slopinimo procentas buvo matuojamas pagal žemiau pateiktą lygtį: procentas slopinimas=∆A (kontrolė) − ∆A (mėginys) / ∆A (kontrolė) × 100, ∆A (kontrolė) arba (mėginys) {{ 33}} A475 (Control) arba (Sample) − A475 (Valdymo tuščia) arba (Sample Blank).

3.3. Flash kolonėlės chromatografija

EO frakcionavimas buvo atliktas naudojant Sepachrom (Rho, Milanas, Italija) greitąją kolonėlės chromatografijos sistemą PuriFlash450, aprūpintą UV ir ELSD detektoriais. Frakcionuoto EO kiekis: 900,0 mg. Stacionari fazė: sferinės silikagelio dalelės, 50 µm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) buvo iš Sepachrom; judrioji fazė: petroeteris (A) ir etilo acetatas (B); srautas 25 ml/min. Linijinis gradiento eliuavimas buvo priimtas nuo 100 procentų A iki 80 procentų A ir 20 procentų B per 20 min.

3.4. Analizės sąlygos

EO tirpalai ir jų atitinkamos frakcijos buvo paruošti cikloheksane, kurio koncentracija 50 mg/ml, ir analizuojami GC-MS. Citralis, citronelalis, -mircenas ir limonenas buvo kiekybiškai įvertinti kiekviename EO ir atitinkamose izoliuotose frakcijose, naudojant išorinį standartinį kalibravimo metodą. Tinkami kalibravimo lygiai buvo paruošti incikloheksanu ir analizuojami GC-MS. Tridekanas (C13) 1.0 mg/mL buvo naudojamas kaip vidinis standartas analitės signalams normalizuoti. 2 lentelėje apibendrinamas kiekvieno kiekybiškai įvertinto junginio koncentracijos diapazonas.

GC-MS analizės buvo atliekamos naudojant Gerstel MPS-2 universalų mėginių ėmimo įrenginį (Mülheim an der Ruhr, Vokietija), įdiegtą Agilent 6890 N GC, sujungtą su 5975 MSD ir aprūpinta ChemStation E versija. 02.02.1431 duomenų apdorojimo sistema („AgilentTechnologies“, Santa Klara, CA, JAV). GC sąlygos: injektoriaus temperatūra: 250 ◦C; įpurškimo režimas: padalintas; santykis: 1/20; nešančiosios dujos: helis; pastovus srautas: 1 ml/min.; kolonėlės: Mega5 (95 proc. polidimetilsiloksano, 5 proc. fenilo) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, ilgis 25 m, iš MEGA (Legnano, Italija). Temperatūros programa: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C(5 min). MSD sąlygos: MS veikia EI režimu (70 eV); nuskaitymo diapazonas: nuo 35 iki 350 amu; išlikimo laikas 40 ms; jonų šaltinio temperatūra: 230 ◦C; kvadrupolio temperatūra: 150 ◦C; perdavimo linijos temperatūra: 280 ◦C. EO žymenys buvo identifikuoti lyginant jų tiesinio sulaikymo indeksus (IT), apskaičiuotus su C9-C25 angliavandenilių mišiniu, ir jų masės spektrus su autentiškų mėginių arba iš komerciškai prieinamų masių spektrinių bibliotekų (Adams, 2007). EO chiralinės analizės buvo atliktos taikant tas pačias analizės sąlygas 2,3-di-O-metil-6-Ot-butildimetilsilil- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 µm, nuolatinė srovė 0,25 mm, ilgis 25 m nuo MEGA. Temperatūros programos: 40 ◦C(1 min.)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min.).

GC-FID analizės buvo atliktos tuo pačiu prietaisu. GC sąlygos: injektoriaus temperatūra: 250 ◦C; įpurškimo režimas: padalintas; santykis: 1/20; nešančiosios dujos: vandenilis; srauto greitis: 1 ml/min. Temperatūros programos: 40 ◦C (1 min.)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min.).

4. Išvados

Šio tyrimo tikslas buvo (1) visapusiškai ištirti in vitro grybątirozinazėCymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis ir Verbena officinalis EO slopinamąjį aktyvumą ir 2) nustatyti, ar jų biologinis aktyvumas priklauso tik nuo citralių kiekio, ar yra papildomų bioaktyvių monoterpenų, kurie prisideda prie tiriamo biologinio aktyvumo naudojant biologinio tyrimo vadovaujamas frakcionavimo metodas. Šis tyrimas nustatė, kad L. cubeba ir V. officinalis EO, nepaisant nedidelio jo kiekio, -mircenas prisideda prie EO slopinimo, ir buvo įrodyta, kad jis turi didesnę citralo slopinimo galią. Antrasis pagrindinis atradimas buvo (plius) citronelių turintis citralinis grybastirozinazėslopinančią galią, potencialiai per sinergistinę sąveiką, nes ji pati neveikė. Pastaroji išvada paaiškino, kodėl M. officinalis EO, kuriuose yra nežymus (plius) citronelės kiekis, slopinamasis aktyvumas atitiko citralio kiekį, o priešingai galioja M. officinalis EO, kuriame yra gana didelis (plius) citronelės kiekis. nors vis dar reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant tiksliai apibrėžti sąveikos, atsirandančios tarp mirceno ir citralio bei tarp citronelio ir citralio, tipą ir įvertinti šių EO ir atskirų junginių slopinamąjį poveikį žmogui.tirozinazė, šio tyrimo rezultatai gali padėti racionaliai sukurti EO arba praturtintų EO mišinius, kurie pagerintų jų biologinį efektyvumą ir padidintų jų, kaip adjuvantų, potencialą gydant hiperpigmentaciją.

Nuorodos

1. Pillaiyar, T.; Manickam, M.; Namasivayam, V. Odos balinimo priemonės: tirozinazės inhibitorių medicininės chemijos perspektyva.J. Fermentas. Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]

2. Desmedtas, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogiers, V.; Grosberis, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Odos balinimo priemonių apžvalga su įžvalga apie nelegalią kosmetikos rinką Europoje. J. Eur. Akad. Dermatolis. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedtas, B.; Van Hoeckas, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Įtariamos nelegalios odą balinančios kosmetikos apibūdinimas. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]

4. Kubo, I.; Ikuyo, KH Šafrano žiedų flavonoliai: tirozinazę slopinantis aktyvumas ir slopinimo mechanizmas. J. Agrič. Food Chem.1999, 47, 4121–4125. [CrossRef]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Ši, Y.; Chou, S.-TT Cinnamomum cassia eterinio aliejaus cheminė sudėtis ir tirozinazę slopinantis aktyvumas. Botas. Stud. 2013, 54, 2–8. [CrossRef]

6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; García-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. Tirozinazės onorto-pakeistų fenolių veikimas: galimas poveikis rudumui ir melanogenezei. J. Agrič. Food Chem. 2012, 60, 6447–6453. [CrossRef]

7. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Tirozinazės inhibitoriai iš kmynų. J. Agrič. Food Chem. 1998, 46, 5338–5341. [CrossRef]

8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Citrusinių eterinių aliejų tirozinazę slopinantis aktyvumas. J. Agrič. Food Chem. 2006,54, 2309–2313. [CrossRef]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. Spuogų kontrolei naudojamų eterinių aliejų biologinis aktyvumas in vitro. Tarpt. J. Aromateris. 2006, 16, 43–49. [CrossRef]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Biologinės citralio savybės ir galimas jo apsauginis poveikis nuo citotoksiškumo, kurį sukelia aspirinas IEC-6 ląstelėse. Biomed. Pharmacother. 2017, 87, 653–660. [CrossRef]

11. Lee, HJ; Jeong, HS; Kim, didžėjus; Ne, YH; Juk, DY; Hong, JT Citralio slopinamasis poveikis NO gamybai slopinant iNOS ekspresiją ir NF-κB aktyvaciją RAW264.7 ląstelėse. Arch. Pharm. Res. 2008, 31, 342–349. [CrossRef]

12. Carvalho, PMM; Macêdo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopfas, MR; Menezes, IRA; Barbosa, R. Lippia alba (Mill.) NE Brown eterinio aliejaus ir pagrindinių jo sudedamųjų dalių, citralio ir limoneno, poveikis žiurkių trachėjos lygiajam raumeniui. Biotechnol. Rep. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Kosta, RHSd; Monteiro, Á.B.; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopfas, MR; Barbosa, R. Lippia alba eterinio aliejaus ir pagrindinių jo sudedamųjų dalių, citralio ir limoneno, tokolitinis aktyvumas izoliuotoje žiurkių gimdoje. Chem. Biol. Bendrauti. 2019, 297, 155–159. [CrossRef]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, TVS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopfas, MR; Menezesas, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Lippia alba eterinio aliejaus ir jo pagrindinės sudedamosios dalies, citralio, vazorelaksuojantis poveikis izoliuotos žiurkės aortos kontraktilumui. Biomed. Pharmacother. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. Sousa, DG; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopfas, MR; Menezesas, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Lippia alba eterinis aliejus ir pagrindinė jo sudedamoji dalis citralio blokuoja žiurkės sėdmenų nervų jaudrumą. Braz. J. Med. Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Galimas kosmetinis eterinio aliejaus, išgautų iš Litsea cubeba vaisių iš Kinijos, panaudojimas. J. Essentas. Oil Res. 2013, 25, 112–119. [CrossRef]

17. Zolghadri, S.; Bahramis, A.; Hassanas Khanas, MT; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Išsami tirozinazės inhibitorių apžvalga. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Kosta, R.; Rubiolo, P. Kiekybinė eterinių aliejų analizė: sudėtinga užduotis. Skonis Fragr. J. 2008, 23, 382–391. [CrossRef]

19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Eteriniai aliejai ir lakiosios medžiagos: mėginių paruošimas ir analizė. Apžvalga.Skonio kvapas. J. 2010, 25, 282–290. [CrossRef]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianovskis, J.; Król, D. Šių atrinktų melisų (Melissa officinalis L.) genotipų morfologinių ir cheminių požymių kintamumo įvertinimas. Ind. Crops Prod. 2013, 49, 515–520. [CrossRef]

21. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Alyvuogių aliejaus aromatinių junginių tirozinazę slopinantis aktyvumas. J. Agrič. Food Chem. 1999, 47, 4574–4578.[CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D.; Arčiulis, M.; Arena, MP; Benvenuti, S.; Gallone, A. Įvairių eterinių aliejų cheminė sudėtis ir anti-melanogeninis potencialas. Skonis Fragr. J. 2016, 31, 255–261. [CrossRef]

23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Citrinų eterinio aliejaus slopinamasis poveikis grybų tirozinazės aktyvumui in vitro. Mod. FoodSci. Techn. 2015, 31, 97–105. [CrossRef]

24. Europos Taryba. Europos farmakopėja, 10-asis leidimas; Europos Taryba: Strasburgas, Prancūzija, 2020 m.; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Wang, M. Cudrania tricuspidata šakelėse esančių tirozinazės inhibitorių apibūdinimas ir jų struktūros ir aktyvumo santykių tyrimas. Fitoterapija 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. Williams, KP; Scott, JE Fermentų tyrimo dizainas didelio našumo atrankai. Atliekant didelio našumo atranką. Molekulinės biologijos metodai (metodai ir protokolai); Janzen, WP, Paul, B., red.; Humana Press: Clifton, NJ, JAV, 2009 m.; 565 tomas, p. 107–126.

27. Bruksas, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smithas, MC; Weidner, JR HTS fermentinių tyrimų pagrindai. Tyrimo vadove; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., red.; Eli Lilly & Company ir Nacionalinis vertimo mokslų tobulinimo centras: Bethesda, MD, JAV, 2004 m.