Cistanche Tubulosa chalcone sintazės klonavimas, funkcinis identifikavimas ir ekspresijos analizė

Anotacija: Tikslas Ištirti chalkono sintazės funkciją iš Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) ir CtCHS geno ekspresijos modelis baltose, raudonose ir violetinėse gėlėse.

Metodai CtCHS genas buvo klonuotas RT-PGR ir atlikta bioinformatinė analizė. PET-28a-CtCHS plazmidė buvo perkelta į Escherichia coli, kad sukeltų baltymų ekspresiją IPTG. CtCHS rekombinantinis baltymas buvo inkubuojamas su substratais p-kumaroil CoA ir malonilo CoA, o produktai buvo aptikti HPLC ir MS. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmidė buvo perkelta į Arabidopsis thaliana protoplastą, kad būtų galima stebėti CtCHS baltymo lokalizaciją tarpląstelėje. CtCHSgene raiškos modelis gėlėseC. tubulosasu trimis spalvomis buvo aptiktas qRT-PGR.

Rezultatai CtCHS genas buvo klonuotas. Atvirojo skaitymo rėmo (ORF) ilgis buvo 1173 bp, koduoja 390 aminorūgščių, o baltymo molekulinė masė buvo 42 8000. CtCHS buvo katalizinės liekanos Cys164, His303, Asn336, kurios buvo konservuotos chalkono sintazėje. CtCHSproteinas buvo ekspresuotas E. coli ir išgrynintas, kad gautų rekombinantinį baltymą. CtCHS baltymas gali katalizuoti p-kumaroilo CoA ir malonilo CoA, kad susidarytų naringenino chalkonas. CtCHS baltymas daugiausia buvo lokalizuotas citoplazmoje. CtCHS genas buvo labai išreikštas purpurinėse ir raudonose gėlėse, o santykinis ekspresijos lygis buvo atitinkamai 8, 44 ir 3, 21 karto didesnis nei baltųjų gėlių.

Išvada CtCHS genas buvo klonuotas iš gėlėsC. tubulosair baltymai buvo išreikšti. CtCHSproteinas turi chalkono sintazės funkciją, o CtCHS geno ekspresija yra didesnė tamsesnėse gėlėse, o tai rodo, kad CtCHSgenas gali reguliuoti C. tubulosa žiedų spalvą, o tai sudaro pagrindą tolesniems tyrimamsC. tubulosa žiedų spalvos reguliavimo mechanizmas.

Raktiniai žodžiai:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalkono sintazė; fermentų aktyvumo analizė; tarpląstelinė lokalizacija; išraiškos analizė

SPAUSKITE ČIA, kad gautumėte NATŪRALIŲ EKOLOGIŠKŲ CISTANČIŲ EKSTRAKTĄ, SU 30% ECHINAKOZO IR 12% AKTEOZIDU

„Wecistanche“ – didžiausio cistansų eksportuotojo Kinijoje – pagalbinė tarnyba:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp / Tel:+86 15292862950

Įsigykite daugiau specifikacijų:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Biosintetikaflavonoidų keliasprasideda fenilpropanoido keliu.Fenilalaninaspirmą kartą paverčiamas cinamono rūgštimifenilalanino amonializės veikimas(PAL), o cinamono rūgštis 4-hidroksilinama cinamono rūgštimi. Fermentas (cinamono rūgšties-4-hidroksilazė, C4H) ir 4-kumaratofermento A ligazė (4-kumaratofermento A ligazė, 4CL) katalizuoja reakciją, kad susidarytų 4-kumaroil-CoA [11 ]. Vieną 4-kumaroil-CoA molekulę ir tris malonil-CoA molekules katalizuoja chalkono sintazė (CHS), kad susidarytų naringenino chalkonas, turintis flavonoidų junginių. Pagrindinis chalkono izomerazės, flavanono{12}}hidroksilazės skeletas, dihidroflavonolio 4-reduktazė ir kt. gamina įvairius flavonoidus, tokius kaip izoflavonai, flavonoliai, antocianinai ir kt. [12]. Kaip pagrindinis fermentas flavonoidų biosintezės kelyje, CHS reguliuoja flavonoidų kiekį augaluose ir taip pat atlieka svarbų vaidmenį reguliuojant augalų žiedų spalvą [13]. Pavyzdžiui, Gentiana scabra Bunge CHS genų nutildymas po transkripcijos gali slopinti antocianinų biosintezę ir sukelti specifinį vainikinių skilčių balinimą [14]. CHS geno nutildymas Actinidia erianthaBenth. CHS sumažina antocianino kiekį žiedlapiuose ir daro žiedlapius raudonus. Žiedlapiai tampa šviesesni[15]. Todėl šiame tyrime CtCHS genas buvo klonuotas iš Cistanche tubulosa žiedų ir jame buvo atlikta bioinformatinė analizė, prokariotų ekspresija ir gryninimas, fermentų aktyvumo analizė, tarpląstelinės lokalizacijos analizė ir trijų spalvų gėlių ekspresijos analizė, siekiant ištirti CtCHS funkciją. baltymas ir CtCHS geno ekspresijos modelis buvo naudojami preliminariai ištirti ryšį tarp CtCHS ir Cistanche tubulosa gėlių spalvos, o tai padėjo pagrindą tiriant CtCHS reguliavimo mechanizmą.Cistanche tubulosa gėlių spalva.

1 Medžiagos ir instrumentai

1.1 Medžiagos

Cistanche tubulosa žiedai buvo surinkti iš Yutian apygardos, Hotano prefektūros, Sindziango 2018 m. gegužės mėn. Imant mėginius buvo vadovaujamasi atsitiktiniu principu ir buvo atrinktos geros fiziologinės būklės ir pastovaus augalo aukščio Cistanche tubulosa gėlės. Pekino universiteto farmacijos mokyklos profesorius Tu Pengfei paėmė tris Cistanche tubulosa štamus su trimis baltos, raudonos ir violetinės spalvos žiedais ir identifikavo juos kaip Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Jie buvo greitai užšaldyti skystame azote, o po to sauso ledo saugykloje gabenami į Pekiną. E. coli DH5 chemiškai kompetentingos ląstelės buvo įsigytos iš Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., o E. coli BL21 (DE3) chemiškai kompetentingos ląstelės buvo nupirktos iš Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektorius buvo pirktas iš Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA pirktas iš Sigma Company, 4-kumaroil-CoA, naringeninas - chalkonas buvo pirktas iš Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., o naringeninas buvo pirktas iš Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Prietaisai

Nanodrop 2000C spektrofotometras (Thermo Fisher Company, JAV); gradiento PGR instrumentas (Eppendorf Company, Vokietija); CFX 96 fluorescencinis kiekybinis PGR instrumentas, UVP gelio vaizdavimo įrenginys, gelio elektroforezės prietaisas, baltymų elektroforezės instrumentas (BioRad Company, JAV); EnSpire

Mikroplokštelių skaitytuvas („PerkinElmer Company“, JAV); pastovios temperatūros inkubatorius (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D didelės talpos visos temperatūros osciliatorius (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Vandens vonios pastovios temperatūros osciliatorius (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH itin švarus darbastalis (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); aukšto slėgio garų sterilizatorius („TOMY Company“, Japonija); Milli Q gryno vandens instrumentas (Millipore, JAV); LC-20Aukšto efektyvumo skysčių fazės chromatografas (Shimadzu Company, Japonija); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija (Thermo Fisher Company, JAV); FV1200 lazerinis konfokalinis mikroskopas (Olympus Company, Japonija).

2 Eksperimentiniai metodai

2.1 RNR ekstrahavimas ir cDNR sintezė.

Cistanche tubulosa gėlės buvo sumaltos skystame azote ir po to tiriamos RNR ekstrahavimo.

Bendra RNR buvo ekstrahuota naudojant rinkinį (Norgen, Cat 17200), RNR koncentracija ir kokybė buvo aptikta NanoDrop 2000C, o RNR mėginiai, kurių A260/A280 santykis yra nuo 1,8 iki 2,1, buvo atrinkti atvirkštinei transkripcijai, kad būtų sintetinama cDNR. M-MLV atvirkštinė transkriptazė (Promega, M170B) buvo naudojama kvalifikuotai bendrai RNR atvirkštiniam perrašymui į cDNR. Eksperimentinės operacijos buvo atliekamos pagal instrukcijas.

2.2 CtCHS geno klonavimas

Remiantis mūsų tyrimų grupės Cistanche tubulosa gėlių transkripto duomenimis [16], buvo atrinktas CtCHS su visu atviru skaitymo rėmeliu, o SnapGene programinė įranga buvo naudojama specifiniams pradmenims pagal genų seką sukurti (1 lentelė). PGR amplifikacija buvo atlikta naudojant Cistanche tubulosa gėlių cDNR kaip šabloną. Amplifikacijos sistema buvo 2 × Phanta Max Buffer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, prieš srovę ir pasroviui esantys pradmenys (10 μmol/L) po 2 μL, cDNR 2 μL, Phanta Max Super Fidelity DNA μL polimerazė, 1 ddH2O 17 μL. Reakcijos sąlygos buvo: išankstinis denatūravimas 95 laipsnių temperatūroje 3 min.; 25 denatūravimo ciklai 95 laipsnių temperatūroje 15 s, atkaitinimo 55 laipsnių temperatūroje 15 s ir pratęsimo 72 laipsnių temperatūroje 1 min.; reakcijos pratęsimas 72 laipsnių temperatūroje 5 min. PGR produktas buvo aptiktas 1% agarozės gelio elektroforeze, o DNR gryninimo rinkinys (Novizan, Cat DC301-01) buvo naudojamas geliui atgauti, o tada išgauta DNR buvo išgryninta greitojo klonavimo rinkiniu (Novizan, Cat. C601-01). DNR fragmentas buvo susietas su pCE2TA/Blunt-Zero vektoriumi, transformuotas į Escherichia coli DH5 kompetentingas ląsteles ir po kultivavimo per naktį 37 laipsnių temperatūroje buvo atrinktos vieno klono padermės ir išsiųstos į bendrovę sekvenavimui.

1 lentelė Pradmenų sekos

2.3 Bioinformatinė analizė

Naudokite ProtParam internetinę programinę įrangą baltymų fizinėms ir cheminėms savybėms analizuoti; naudoti Prot Scale internetinį įrankį baltymų hidrofiliškumui/hidrofobiškumui analizuoti; naudoti internetinį įrankį SOPMA baltymų antrinei struktūrai numatyti; naudoti internetinę analizės programinę įrangą SWISS-MODEL, kad prognozuotų tretinę baltymų struktūrą; naudoti internetinę programinę įrangą TMHMM Nuspėti transmembraninę baltymo struktūrą; naudoti DNAMAN programinę įrangą, kad palygintumėte CtCHS homologiją su kitų rūšių CHS aminorūgščių sekomis; naudokite MEGA-X programinę įrangą filogenetiniam medžiui konstruoti, naudojant kaimynų sujungimą (NJ) ir Puasono korekciją. Evoliucinis atstumas apskaičiuojamas naudojant Bootstrap metodą, o Bootstrap pakartojimų skaičius yra 1000 kartų.

2.4 CtCHS prokariotų ekspresija ir gryninimas

Sukurkite pradmenis su restrikcijos vietomis BamHⅠ ir XhoⅠ, remiantis CtCHS seka, ir PGR amplifikuoja atitinkamus tikslinius fragmentus. pET-28a vektorius ir tikslinis fragmentas buvo virškinami naudojant endonukleazes BamHI ir Klonuotas kamienas sekvenuojamas, o plazmidė ekstrahuojama nustačius teisingą seką. PET-28a-CtCHS plazmidė, patikrinta nustatant seką, buvo perkelta į Escherichia coli BL21 (DE3) kompetentingas ląsteles. Žr. Ding Ning ir kt. metodą. [17] su izopropilu

-D-tiogalaktopiranozidas (IPTG) buvo naudojamas baltymų ekspresijai sukelti žemoje temperatūroje ir buvo išgrynintas per Ni2+ afininės chromatografijos kolonėlę (Cytiva, Cat 17531901). Baltymai buvo sukoncentruoti centrifuguojant ultrafiltravimo mėgintuvėlyje (Millipore, 30 000) ir iš jo pašalinta druska. Laikyti 20 mmol/L KPB buferyje (pH 8,0, kuriame yra 1 mmol/LEDTA) ir laikyti –80 laipsnių šaldytuve ilgalaikiam saugojimui.

2.5 CtCHS fermento aktyvumo analizė

CtCHS fermentų reakcijos sistema: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroil-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantinis baltymų 20 μL, in Po 12 valandų reakcijos 37 laipsnių vandens vonioje, mišinys tris kartus ekstrahuotas 800 μL etilo acetatu, išdžiovintas azoto srautu ir ištirpintas 100 μL metanolio. Produktui aptikti naudokite didelio efektyvumo skysčių chromatografiją. Sąlygos yra Ultimate LP-C18 kolonėlė (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), kolonėlės temperatūra 30 laipsnių, mėginio tūris 10 μL ir vanduo (A) ir acetonitrilas (B) kaip srautas. Fazė, eliuavimo gradientas: 0–10

min, 30% B; 10–20 min., 30–60 % B; 20-25 min., 60%~70% B; 25-30 min., 70%~80% B; 30–35 min., 80–100 % B; 35-40 min., 100 % B; 40-46 min., 100 %-30% B. Tūrinis srautas yra 1 ml/min., o aptikimas atliekamas esant 290 nm bangos ilgiui.

Tolesniam aptikimui buvo naudojamas UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Skystos fazės sąlygos buvo Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolonėlė (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonėlės temperatūra 40 laipsniai, naringeninas- chalkono ir naringenino kontrolė. Produkto įkrovimo tūris yra 4 μL, o fermento reakcijos produkto įkrovimo tūris yra 7 μL. Vanduo (A)-acetonitrilas (B) naudojamas kaip judanti fazė. Eliuavimo gradientas yra: nuo 0 iki 5 min., 30 % B; 5–15 min., 30 %-60% B; 15-20 min., 60 %-100% B; 20-25 min., 100 % B; 25-31 min., 100%-30% B. Tūrinis srautas yra 0,3 ml/min. Masių spektrometrijos sąlygos yra elektropurškimo jonų šaltinis, azotas kaip nešančiosios dujos, apvalkalo dujų slėgis 3,5 MPa, pagalbinių dujų slėgis 1,0 MPa, purškimo slėgis 3500 V, kapiliarų temperatūra 350 laipsnių, pagalbinių dujų šildymo temperatūra 200 laipsnių, teigiamų ir neigiamų jonų režimai, skenavimas jonų diapazonas m/z yra 100-1500, visa MS skiriamoji geba yra 35 000, dd-MS2 skiriamoji geba yra 17 500, (N)

CE/pakopinis nce nustatytas į 35, 60.

2.3 Bioinformatinė analizė

Naudokite ProtParam internetinę programinę įrangą baltymų fizinėms ir cheminėms savybėms analizuoti; naudoti Prot Scale internetinį įrankį baltymų hidrofiliškumui/hidrofobiškumui analizuoti; naudoti internetinį įrankį SOPMA baltymų antrinei struktūrai numatyti; naudoti internetinę analizės programinę įrangą SWISS-MODEL, kad prognozuotų tretinę baltymų struktūrą; naudoti internetinę programinę įrangą TMHMM Nuspėti transmembraninę baltymo struktūrą; naudoti DNAMAN programinę įrangą, kad palygintumėte CtCHS homologiją su kitų rūšių CHS aminorūgščių sekomis; naudokite MEGA-X programinę įrangą filogenetiniam medžiui konstruoti, naudojant kaimynų sujungimą (NJ) ir Puasono korekciją. Evoliucinis atstumas apskaičiuojamas naudojant Bootstrap metodą, o Bootstrap pakartojimų skaičius yra 1000 kartų.

2.4 CtCHS prokariotų ekspresija ir gryninimas

Sukurkite pradmenis su restrikcijos vietomis BamHⅠ ir XhoⅠ, remiantis CtCHS seka, ir PGR amplifikuoja atitinkamus tikslinius fragmentus. pET-28a vektorius ir tikslinis fragmentas buvo virškinami naudojant endonukleazes BamHI ir Klonuotas kamienas sekvenuojamas, o plazmidė ekstrahuojama nustačius teisingą seką. PET-28a-CtCHS plazmidė, patikrinta nustatant seką, buvo perkelta į Escherichia coli BL21 (DE3) kompetentingas ląsteles. Žr. Ding Ning ir kt. metodą. [17] su izopropilu

-D-tiogalaktopiranozidas (IPTG) buvo naudojamas baltymų ekspresijai sukelti žemoje temperatūroje ir buvo išgrynintas per Ni2+ afininės chromatografijos kolonėlę (Cytiva, Cat 17531901). Baltymai buvo sukoncentruoti centrifuguojant ultrafiltravimo mėgintuvėlyje (Millipore, 30 000) ir iš jo pašalinta druska. Laikyti 20 mmol/L KPB buferyje (pH 8,0, kuriame yra 1 mmol/LEDTA) ir laikyti –80 laipsnių šaldytuve ilgalaikiam saugojimui.

2.5 CtCHS fermento aktyvumo analizė

CtCHS fermentų reakcijos sistema: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroil-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantinis baltymų 20 μL, in Po 12 valandų reakcijos 37 laipsnių vandens vonioje, mišinys tris kartus ekstrahuotas 800 μL etilo acetatu, išdžiovintas azoto srautu ir ištirpintas 100 μL metanolio. Produktui aptikti naudokite didelio efektyvumo skysčių chromatografiją. Sąlygos yra Ultimate LP-C18 kolonėlė (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), kolonėlės temperatūra 30 laipsnių, mėginio tūris 10 μL ir vanduo (A) ir acetonitrilas (B) kaip srautas. Fazė, eliuavimo gradientas: 0–10

min, 30% B; 10–20 min., 30–60 % B; 20-25 min., 60%~70% B; 25-30 min., 70%~80% B; 30–35 min., 80–100 % B; 35-40 min., 100 % B; 40-46 min., 100 %-30% B. Tūrinis srautas yra 1 ml/min., o aptikimas atliekamas esant 290 nm bangos ilgiui.

Tolesniam aptikimui buvo naudojamas UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Skystos fazės sąlygos buvo Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolonėlė (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonėlės temperatūra 40 laipsniai, naringeninas- chalkono ir naringenino kontrolė. Produkto įkrovimo tūris yra 4 μL, o fermento reakcijos produkto įkrovimo tūris yra 7 μL. Vanduo (A)-acetonitrilas (B) naudojamas kaip judanti fazė. Eliuavimo gradientas yra: nuo 0 iki 5 min., 30 % B; 5–15 min., 30 %-60% B; 15-20 min., 60 %-100% B; 20-25 min., 100 % B; 25-31 min., 100%-30% B. Tūrinis srautas yra 0,3 ml/min. Masių spektrometrijos sąlygos yra elektropurškimo jonų šaltinis, azotas kaip nešančiosios dujos, apvalkalo dujų slėgis 3,5 MPa, pagalbinių dujų slėgis 1,0 MPa, purškimo slėgis 3500 V, kapiliarų temperatūra 350 laipsnių, pagalbinių dujų šildymo temperatūra 200 laipsnių, teigiamų ir neigiamų jonų režimai, skenavimas jonų diapazonas m/z yra 100-1500, visa MS skiriamoji geba yra 35 000, dd-MS2 skiriamoji geba yra 17 500, (N)

CE/pakopinis nce nustatytas į 35, 60.

2.6 CtCHS baltymo lokalizacija tarpląstelėje

Remiantis CtCHS seka ir besiūlio klonavimo principu, buvo sukurti pradmenys su fermentų pjovimo vietomis Kpn Ⅰ ir BamH Ⅰ, o atitinkami tiksliniai fragmentai buvo amplifikuoti PGR. pCAMBIA1300-35S-GFP plazmidė buvo suardyta restrikcijos endonukleazėmis Kpn Ⅰ ir BamH Ⅰ, o tikslinis fragmentas ir vektorius buvo sujungti per besiūlį klonavimo rinkinį (Novizan, Cat C115-01), o tada perkelta. į E. coli DH5 kompetentingas ląsteles. , atrinkti atskirų klonų padermes sekvenavimui ir iš atitinkamų padermių išgauti plazmides. Plazmidės pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ir pCAMBIA 1300-35S-GFP buvo transformuotos į Arabidopsis thaliana protoplastus naudojant PEG4000 ir kultivuojamos esant silpnam apšvietimui 8–10 valandų. CtCHS baltymo subląstelinė lokalizacija buvo stebima lazeriniu konfokaliniu mikroskopu.

2.7 CtCHS išraiškos modelio analizė

Realaus laiko fluorescenciniai kiekybiniai pradmenys buvo sukurti naudojant DNAMAN pagal CtCHS seką, o F-box kaip vidinį etaloninį geną. Pradmenų sekos parodytos 1 lentelėje. Santykinė CtCHS ekspresija skirtingų spalvų Cistanche tubulosa žieduose buvo nustatyta realiu laiku fluorescencine kiekybine PGR. Naudokite „TransStart Green qPCR SuperMix“ (viso aukso, AQ101-02), kad išmatuotų fluorescencinių dažų SYBRGreen metodu. Reakcijos sistema: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, prieš srovę ir pasroviui esantys pradmenys (10 μmol/L) 0.2 μL, cDNR šablonas 0,5 μL, buvo naudojamas 4,1 μL vandens be nukleotidazės reakcijai naudojant dviejų pakopų metodą. Reakcijos procedūra buvo pagrįsta Dong Xianjuan ir kt. metodu. [18]. Kiekviename mėginyje buvo 3 biologiniai pakartojimai ir eksperimentas buvo pakartotas tris kartus. Eksperimentiniai duomenys buvo analizuojami naudojant Excel, santykinė CtCHS išraiška apskaičiuota naudojant 2−ΔΔCt metodą, o GraphPadPrism 8 naudota reikšmingumo analizei ir histogramoms braižyti.