Kombinuota Pangenomika ir transkriptomika atskleidžia pagrindinius ir perteklinius virulentiškumo procesus sparčiai besivystančiame grybeliniame augalų patogene
Dec 05, 2023
Abstraktus
Fonas
Sparčiai besivystančių patogenų genominių variacijų tyrimas potencialiai leidžia identifikuoti genus, palaikančius jų „pagrindinę biologiją“, esančius, veikiančius ir išreikštus visomis padermėmis arba „lanksčiąja biologija“, kuri skiriasi įvairiose padermėse. Lanksčią biologiją palaikantys genai gali būti laikomi „priedais“, o „pagrindinis“ genų rinkinys gali būti svarbus bendroms patogenų rūšies biologijos ypatybėms, įskaitant visų šeimininkų genotipų virulentiškumą. Kviečių patogeninis grybelis Zymoseptoria tritici yra viena iš sparčiausiai besivystančių grėsmių pasauliniam maisto saugumui ir buvo šio tyrimo pagrindinis dėmesys.
cistanche nauda vyrams - stiprina imuninę sistemą
Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus
【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Rezultatai
Sukūrėme 18 Europos lauko izoliatų pangenomą, iš kurių 12 infekcijos metu taip pat buvo atliktas RNAseq transkripcijos profiliavimas. Sujungę šiuos duomenis, mes prognozavome „pagrindinį“ genų rinkinį, apimantį 9807 sekas, kurios buvo (1) visuose izoliatuose, (2) neturinčios inaktyvuojančių polimorfizmų ir (3) išreikštos visuose izoliatuose. Taip pat buvo apibrėžtas didelis pagalbinis genomas, susidedantis iš 45% visų genų. Mes klasifikavome genetinį ir genominį polimorfizmą tiek chromosomų, tiek atskirų genų skalėse. Baltymai, reikalingi pagrindinėms funkcijoms, įskaitant virulentiškumą, turėjo mažesnį nei vidutinį pagrindinių genų sekos kintamumą. Tiek pagrindiniai, tiek pagalbiniai genomai užkodavo daug mažų, išskiriamų kandidatų efektorinių baltymų, kurie greičiausiai sąveikauja su augalų imunitetu. Virusinio vektoriaus sukeltas trumpalaikis augalo ekspresijos 88 kandidatai nesugebėjo nustatyti nė vieno, kuris sukėlė ligai būdingą lapų nekrozę. Tačiau nepatogeninio delecijos mutanto, neturinčio penkių pagrindinių genų, funkcinis papildymas parodė, kad visiškas virulentiškumas buvo atkurtas pakartotinai įvedus vieną geną, turintį mažiausią sekos polimorfizmą ir didžiausią ekspresiją.
Išvados
Šie duomenys patvirtina bendrą pangenomikos ir transkriptomikos naudojimą nustatant genus, kurie atspindi sparčiai besivystančių patogenų pagrindines ir galimai išnaudojamas silpnąsias vietas.
Raktažodžiai
Lapės uodegos mozaikos virusas, Septoria tritici, nekrotrofinis efektorius, esminiai genai, papildomos chromosomos, dothideomicetai,Chromosomų nestabilumas, Mycosphaerella spp
Fonas
Tvarią gyvūnų ir augalų infekcinių ligų kontrolę kelia iššūkis priežastinių mikroorganizmų evoliucijai [1, 2]. Sunkiausiai kontroliuojamos ligos yra tos, kurias sukelia sparčiausiai besivystančios rūšys, kurios gali greitai reaguoti į selektyvų spaudimą, įskaitant natūralų šeimininko imunitetą, nepalankias aplinkos sąlygas ir (arba) vaistus nuo infekcijų [1, 3]. Galimybę greitai vystytis mikrobiniams patogenams lemia keletas ypatybių, įskaitant, be kita ko,; (1) greitas gyvenimo ciklas ir (2) mechanizmai, skatinantys lytinį dauginimąsi [4]. Dėl pastarosios patogenų populiacijose gali atsirasti didelių nuolatinių genetinių variacijų, kurias galima išlaikyti ir sustiprinti esant išoriniam atrankiniam spaudimui. Nors tam tikri genai gali turėti natūralių genetinių sekos variacijų, skatinančių jų evoliuciją, kiti negali būti prarasti (arba inaktyvuoti dėl mutacijos), nepažeidžiant patogenų tinkamumo. Eukariotinių ir prokariotinių augalų patogenų atveju dėl šio genų polimorfizmų lygio skirtumo atsirado „dviejų greičių genomai“ [5], susidedantys iš kai kurių komponentų, kurie greitai vystosi ir, kaip manoma, reaguoja į išorinius veiksnius (šeimininko diapazoną ir imunitetą ir kt.), o lėčiau besivystančiame rinkinyje yra genų, atliekančių pagrindines namų ruošos ir kitas esmines funkcijas. Papildomos ir pagrindinės patogenų genomų dalys gali būti sujungtos į „pangenomą“, kuris turėtų būti beveik visas rūšies genų rinkinys [6]. Pangenomų šerdies ir pagalbinių dalių dydis skiriasi priklausomai nuo bakterijų, grybų ir oomicetų rūšių [7–13] ir gali parodyti, kad mikrobų populiacijos gali greitai vystytis iki selektyvaus slėgio. Galima įsivaizduoti, kad kuo didesnis papildomas pangenomas, palyginti su šerdimi, tuo šios populiacijos gali sparčiau vystytis. Ascomycete grybelis kviečių patogenas Zymoseptoria tritici yra Septoria tritici blotch (STB), pasauliniu mastu svarbios ligos, keliančios grėsmę maisto saugumui, sukėlėjas [14]. Patogenas taip pat ilgą laiką buvo laikomas pavyzdine populiacijos biologijos ir evoliucijos tyrimų sistema [15–18]. Taip yra todėl, kad Z. tritici pasižymi dideliu seksualinės rekombinacijos lygiu, kuris palaiko didelę nuolatinę genetinę įvairovę savo populiacijose ir leidžia greitai prisitaikyti tiek pasauliniu, tiek vietiniu mastu [17, 19–24]. Dėl to pagrindiniai kviečių genai, suteikiantys atsparumą Z. tritici, greitai įveikiami [25]. Be to, dauguma plačiai naudojamų komercinių fungicidų laikui bėgant praranda savo efektyvumą [3]. Šių dviejų veiksnių derinys kelia grėsmę pasaulinei kviečių gamybai, kurią reikia skubiai spręsti. Z. tritici taip pat neseniai pasirodė kaip naujas patogenų genomikos modelis su daugybe aukštos kokybės genomo nuorodų [26], be pangenomų, sukurtų iš daugybės atskirų izoliuotų genomų [27, 28]. Galbūt vienas įdomiausių Z. tritici genomo bruožų yra 13 pagrindinių chromosomų (1-13), randamų visuose izoliatuose, bet vėliau iki 8 mažesnių papildomų chromosomų (14-21), kurios rodo izoliatų buvimas / nebuvimas ir struktūrinis polimorfizmas [26, 29]. Laimei, vienas iš bendruomenės etaloninių izoliatų ir pirmasis, kuris buvo visiškai sekvenuotas, olandų lauko izoliatas IPO323, surinktas devintajame dešimtmetyje, turi 21 chromosomą, o tai yra didžiausias skaičius iki šiol. Todėl IPO323 yra puikus etalonas tiriant kitų izoliatų kitimą ir kaip pastoliai kuriant pangenomas.
cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą
Nelytinės Z. tritici infekcijos ciklas būdingas daugeliui giminingų augalų patogenų, turinčių įtakos daugeliui maistinių augalų [30]. Šie grybai, priklausantys Dothideomycetes būrio Mycosphaerellaceae šeimai, paprastai įsiskverbia į augalų audinius per stomas [30, 31]. Po to seka ilgo besimptomio augimo tarp augalų ląstelių laikotarpis, trunkantis mažiausiai 8 dienas, kuris staiga baigiasi nekroziniais lapų pažeidimais – situacija, kuri Z. tritici, atrodo, atsiranda dėl augalo „hiperaktyvavimo“ imunitetas [32–34]. Augalų ląstelių mirtis vėliau siejama su naujų sporuliacinių struktūrų, piknidijų, susidarymu substomatalinėse ertmėse ir vėlesniu naujai susidariusių piknidiosporų išspaudimu ir išplitimu purslų kritulių laikotarpiais. Įrodyta, kad kiti Dothideomycetes grybai sukelia augalų imuniteto hiperaktyvumą, nes išskiria baltymus „efektorius“, kurie atpažįstami jautriuose augaluose, todėl miršta ląstelės ir audiniai (nekrozė arba užprogramuota ląstelių mirtis). Šiems nekrotrofiniams grybams šis atsakas naudingas, o dalyvaujantys efektoriniai baltymai dabar vadinami nekrotrofiniais efektoriais [35, 36]. Nors yra keletas preliminarių įrodymų, kad Z. tritici taip pat gali panaudoti nekrotrofinius efektorius pereinant prie simptominio augimo [37], remdamasi lapų pažeidimais, ši hipotezė iki šiol nebuvo tvirtai patikrinta. Du vienas kitą neišskiriantys būdai apsaugoti būsimą kviečių gamybą nuo STB poveikio yra (1) padidinti natūralų augalų atsparumą ligoms ir (2) nustatyti naujus molekulinius taikinius, kurie galėtų būti panaudoti ligų kontrolei. Idealiu atveju tai leistų selektyviai kontroliuoti patogeną, tuo pačiu sumažinant kitus aplinkos ir ekologinius padarinius iki minimumo. Patogenų genomika ir ypač pangenomika suteikia galimybę išplėsti abi strategijas. Nors baltymuose, užkoduotuose priedo, greitai besivystančioje pangenomos dalyje gali būti daug genų, sąveikaujančių su augalų imunitetu (pvz., efektorių), pagrindiniame genome gali būti taikinių, kurie mutuoja ne taip lengvai dėl neigiamų tinkamumo (ir virulentiškumo) bausmių. Dėl šios priežasties žemės ūkio fungicidai paprastai yra skirti pagrindiniams procesams, kurie, kaip manoma, laikomi mažiau kintamais. Tačiau, kaip minėta anksčiau, net šie taikiniai gali tam tikru mastu išsivystyti, kad būtų išvengta cheminio slopinimo, kaip aprašyta daugeliui dabartinių fungicidų tikslinių baltymų [3, 14]. Dauguma iki šiol naudojamų fungicidų buvo nukreipti į gana siaurą molekulinių procesų rinkinį (pvz., sterolių biosintezę, kvėpavimą ir kt.) [3]. Galimai yra daug kitų tikslų, kurie galėtų būti naudojami selektyviai kontroliuoti grybelinius patogenus, kurie turėtų atsirasti derinant ir analizuojant kelis omikos duomenų rinkinius. Didelį atradimų potencialą pabrėžia tai, kad paprastai iki 40% visų genų, nustatytų patogeninių grybų (ir apskritai grybų) genomo sekose, vis dar nežinomos funkcijos. Tie, kurie yra ir galbūt yra išsaugoti pagrindiniame patogeninių grybų genome, gali būti ypač svarbūs.
Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >80 % genų, anotuotų kaip šerdis [10]. Tačiau kitos su augalais susijusių liepsnojančių grybų analizės numatė didesnius pagalbinius genų komponentus, įskaitant ~ 38% patogenų Claviceps purpurea [38] ir ~ 44% Pyrenophora tritici-repentis [39]. Ankstesniuose išsamiuose pan-genominiuose Z. tritici tyrimuose buvo naudojamos pasaulinės ir istorinės populiacijos, apimančios didelį izoliatų skaičių, kurios buvo sekvenuotos tiek fragmentuoto, tiek pilno genomo skalėje [27, 28]. Šie tyrimai nustatė didelį šios rūšies pagalbinių genų rinkinį (~ 40% visų genų). Be to, tai buvo koreliuojama su dideliu buvimu / nebuvimu ir chromosomų struktūriniais polimorfizmais, taip pat susijusiais su dinamiškais pasikartojančiais elementais (įskaitant perkeliamus elementus). Tolesnė analizė taip pat parodė, kad daugelis papildomų genų taip pat yra mažiau išreikšti (vidutiniškai) nei pagrindiniai genai. Šie tyrimai yra Z. tritici rūšies pangenomo struktūros „auksinis standartas“ ir iki šiol išsamiausias bet kurio siūlinio grybelio tyrimas. Tačiau šiai ir kitoms rūšims išlieka klausimas, kokiu mastu pangenomika gali būti naudojama nustatant pagrindinius virulentiškumo genus ir procesus. O pagrindinių genų rinkiniuose, ar visos populiacijos polimorfizmų, turinčių įtakos aminorūgščių pokyčiams, lygiai, taip pat genų ekspresijos lygiai, išduoda pagrindinių patogenų virulentiškumo genų tapatybę?
Šiame tyrime mes sujungėme genomo sekos nustatymo ir RNAseq pagrįstus transkriptominius metodus, kad gautume pangenomą iš naujausios Europos Z. tritici izoliatų kolekcijos. Mūsų pagrindinis tikslas buvo patikrinti, ar genai, esantys pagrindiniame genome, koduojančiame baltymus su mažu aminorūgščių polimorfizmu (ty koduojančiose sekose) tarp izoliatų, atlieka svarbias funkcijas, įskaitant pagrindinius vaidmenis pagrindinių kviečių infekcijos procesuose. Sutikdami su ankstesniais tyrimais [27, 28], parodome, kad Z. tritici turi itin didelį pagalbinį genomą (~ 45 % visų genų), patvirtinantį jo sparčiai besikeičiančią būklę. Be to, pateikiame biologinius duomenis, kurie aiškiai patvirtina abiejų omikos metodų kombinuoto naudojimo naudingumą nustatant naujus pagrindinius virulentiškumo genus. Ir atvirkščiai, didelio našumo virusų sukeltų funkcinių baltymų perteklinės ekspresijos ekranuose nepavyko nustatyti nė vieno kandidato į nekrotrofinius veiksnius, atsakingus už ligų pakitimų sukėlimą kviečių lapuose nei iš šerdies, nei iš papildomo pangenomo.
cistanche augalą stiprinanti imuninė sistema
Rezultatai
Europos Z. tritici kolekcijos virulentiškumo ekranai nustato panašiai agresyvias padermes iš geografiškai nesusijusių vietovių
Ištyrėme 43 Z. tritici izoliatus dėl virulentiškumo 21 plačiai jautrioje Europos duonos kviečių veislėje, kad gautume 2709 duomenų taškus (įskaitant tris pakartojimus). Išskirtinė informacija (kodas ir kilmės šalis) pateikta 1 papildomame faile: S1 lentelėje. Kiekviena sąveika buvo kiekybiškai įvertinta pagal šiuos parametrus: (1) inkubacinio laikotarpio trukmę, (2) laiką, per kurį buvo pasiekta visiška nekrozė (kai ji įvyko), ir (3) nelytinės sporuliacijos lygis (1A pav.). Remiantis tiek skaičiavimo, tiek regėjimo ligų įvertinimu (žr. metodus ir 2 papildomą failą: S1 pav.), visi izoliatai buvo sugrupuoti pagal jų virulentiškumo profilius išbandytame veislių skydelyje (1B pav.). Teigiamas kontrolinis izoliatas IPO323, kuris yra pasaulinė nuoroda [26] su visiškai sekvenuotu genomu, buvo mažiau agresyvus nei dauguma tirtų izoliatų prieš beveik visas veisles. Šis izoliatas buvo surinktas ~ 1984 m. ir nuo tada buvo laikomas saugykloje, retkarčiais perleidžiant per kviečių lapus; todėl šiuo metu neaišku, ar šis stebėjimas (bent iš dalies) galėjo atsirasti dėl mėginių laikymo laikui bėgant. Mes nustatėme septynis izoliatus, kurie negalėjo sukelti ligos simptomų nė vienoje iš kviečių veislių (1B pav.). Kadangi visi šie izoliatai kilę iš Ispanijos arba Italijos, kur dažniau auginami tetraploidiniai (kietieji / makaronai) kviečiai (Triticum durum L.), tikėtina, kad šie izoliatai buvo būdingi kietiesiems kviečiams [40, 41]. Svarbu tai, kad izoliatai, turintys panašų virulentiškumo profilį, nesusikaupė savo surinkimo vietoje, o izoliatai, kilę iš tolimų rytų iki Slovakijos iki vakarų iki Airijos, visi sugrupavosi (1B pav.). Šis stebėjimas puikiai sutampa su dideliu genetinės variacijos lygiu tarp izoliatų ir ankstesnių tyrimų, kurie parodė, kad tai vienodai didelė vieno kviečių lapų pažeidimo mastu, kaip ir kituose žemynuose [42]. Daugelis agresyvesnių izoliatų su skirtingais virulentiškumo profiliais vėliau buvo atrinkti genomo sekos nustatymui (1B pav. paryškinta „#“) ir RNAseq analizei (1B pav. paryškinta „+“).
1 pav. Europos izoliatų kolekcijos virulentiškumo vertinimas prieš įvairias heksaploidines (duonos) kviečių veisles. Tipiškas ligos progresavimo laikas, iliustruojantis ekrane įvertintus parametrus, įskaitant laiką, per kurį pasireiškė pirmieji matomi simptomai ir iki pilnos lapų nekrozės atsiradimo inokuliuotoje srityje. Paveikslėlyje parodytas kviečių veislės Riband užkrėtimas Z. tritici izoliatu IPO323. B Izoliatų virulentiškumo profilis, palyginti su veislių skydeliu, pagrįstas lapų nekrozės ir chlorozės lygiais. Matavimai buvo atlikti tiek vizualiai vertinant, tiek naudojant LemnaTec ir LemnaGrid vaizdų analizės programinę įrangą su panašiais galutiniais rezultatais. Izoliatai buvo reitinguojami ir suskirstyti į grupes pagal virulentiškumo duomenis. Z. tritici izoliatai, pažymėti #, buvo sekvenuoti, kad būtų sukurtas pangenomas. Izoliatai, pažymėti +, taip pat buvo analizuojami naudojant RNAseq transkriptomiką. Nustatyta, kad kviečių veislė Panorama (pažymėta X) yra vienodai ir visiškai jautri daugumai izoliatų ir buvo pasirinkta kaip lapų infekcijos RNAseq šeimininko genotipas. Atkreipkite dėmesį, kad septynių izoliatų išorinės grupės mažo virulentiškumo duomenys prieš visas veisles greičiausiai atsiranda dėl to, kad šie izoliatai buvo pritaikyti sukelti tetraploidinių kviečių (Durum arba Pasta) ligas. Visi duomenys reprezentuoja tris užkrėstus lapus, išanalizuotus / su jais sąveikaujančius iš dviejų biologinių pakartotinių eksperimentų (iš viso 6 lapai). C SplitsTree analizė, skirta genominiam sekvenavimui atrinktų izoliatų molekulinės filogenijos analizė. Izoliatų kilmės šalis nurodyta santrumpa (Pl=Lenkija; GB=Didžioji Britanija; Be=Belgija; Cz=Čekija; Ge {{8 }} Vokietija; Sw=Švedija; Fr=Prancūzija; Sl=Slovakija; Ir=Airija). Taip pat pateikiamas etaloninis izoliatas IPO323, surinktas ~ 1984 m. iš Nyderlandų (Ne).
Septyniolikos Europos izoliatų genomo seka ir filogenetinė analizė atskleidžia aukštą genetinės įvairovės lygį
We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >97% visais atvejais nurodė gerą visų izoliatų genų erdvės (koduojančių regionų) surinkimą. Visuose rinkiniuose trūko kelių BUSCO genų, o tai rodo, kad Z. tritici gali neturėti šių genų ortologų. Norėdami nustatyti genetinės variacijos, turinčios įtakos numatomiems koduojantiems regionams, kiekį, mes atlikome kiekvienos padermės SNPEf analizę, palyginti su pangenomu, sukurtu remiantis visu etaloninio izoliato IPO323 genomu (2 lentelė). Ši analizė parodė, kad kiekviena nauja padermė turėjo daugiau nei 160 000 SNP prieš gautą pangenomą. Tarp jų buvo daugiau nei 65 000, dėl kurių buvo galimas baltymų funkcijos praradimas (didelis efektas, kadrų poslinkis, paleidimo dingimas, priešlaikiniai sustabdymo kodonai) arba numatytų baltymų aminorūgščių pasikeitimas (vidutinis). Šie duomenys parodė genetinę įvairovę tarp Z. tritici izoliatų.
Buvo atlikta 17 naujai sekvenuotų padermių ir IPO323 suskaidytų medžių analizė, siekiant nustatyti, ar izoliatai, turintys panašių veislių infekcijos modelių, turėjo kokių nors filogenetinių ryšių ir ar tai buvo susiję su kilmės šalimi. Filogenezė buvo nustatyta naudojant šešių koduojančių ir nekoduojančių sekų sujungimą (žr. 3 metodus ir papildomą failą: duomenys S1). Medis (1C pav.) dar kartą iliustruoja, kad nebuvo aiškios sąsajos tarp virulentiškumo profilių ir mėginių ėmimo vietos sekvenuotiems izoliatams, o glaudžiai susiję virulentiškumo profiliai (palyginti su 1B pav.), kurie buvo nustatyti izoliatams, surinktiems iš skirtingų Europos šalių, kurie vis dėlto buvo filogenetiškai glaudžiai susiję.
Pangenome konstrukcija ir analizė numato 9807 "pagrindinius" ir 8083 "pagalbinius" genus
Be genomo sekų, mes pasirinkome 12 izoliatų RNAseq pagrindu veikiančiam transkripcijos profiliavimui (pažymėta + 1B pav.). Kiekvienas izoliatas buvo profiliuotas trimis egzemplioriais akseninio augimo metu YPD sultinyje ir taip pat dviejose nepriklausomose lapų infekcijos stadijose; 6 dienos po inokuliacijos (dpi), reiškianti vidurinę besimptomę fazę, ir 9 dpi, pereinamojoje ankstyvųjų simptomų vystymosi fazėje. Infekcijos tyrimams buvo naudojama visuotinai jautri kviečių veislė Panorama, kurią visi izoliatai galėjo visiškai užkrėsti neskiriama kinetika. Naudodami šiuos transkripto duomenis kartu su naujais genomo rinkiniais ir pradine IPO323 etalonine seka kaip pastolius, mes nustatėme Europos izoliatų pangenomą, apimantį sekas, esančias kituose izoliatuose, kurie nebuvo aptikti IPO323. Pangenomo konstravimo etapai ir mūsų kriterijai, pagal kuriuos genai skirstomi į "šerdį" arba "priedą", parodyti 2 pav. Svarbu tai, kad inaktyvavimo (didelis efektas, funkcijos praradimas-LoF) sekos polimorfizmas, buvimas ir nebuvimas. taip pat buvo paremti genų ekspresijos įrodymais. Taigi genas turėtų būti funkcine forma ir išreikštas visuose izoliatuose, kad būtų priskirtas „pagrindinei“ kategorijai. Mūsų bendras metodas (2 pav.) apibrėžė bendrą 17 890 genų pangenomą, įskaitant 2017 m., kurių nebuvo IPO323. Vėlesni filtravimo etapai 9807 buvo suskirstyti į pagrindinį genomą, o priedų rinkinyje buvo tik šiek tiek mažesnis skaičius, 8083. Pastarasis sudaro ~ 45% viso pangenomo, šiek tiek daugiau nei anksčiau aprašyta [28]. Nors šie skaičiai paprastai sutampa, pagalbinių genų įvertinimai yra labiau subjektyvūs dėl šališkumo dėl naudojamų metodų (Panseq ir kt.), todėl negalime manyti, kad papildoma būsima analizė gali nesumažinti pagalbinių genų skaičiaus naudojant, pavyzdžiui, ortologija pagrįstą. požiūriai. Visi pangenai buvo išanalizuoti dėl kelių savybių (sekrecijos, membranų asociacijos, lokalizacijos ir cisteino kiekio prognozės) ir numatomų funkcijų (BLAST, GO ir Interpro anotacijos). Pateikiama lentelė, kurioje pateikiama visa turima informacija apie visus genus (4 papildoma byla: S2 lentelė). Lentelėje taip pat rodomas santykinis vidutinis RNAseq gautas genų ekspresijos lygis, nustatytas visiems genams visuose 12 izoliatų trimis išbandytomis sąlygomis. Apskritai, lyginant ir su ankstesniais pangenominiais šio organizmo tyrimais [27, 28], aišku, kad Z. tritici turi vieną didžiausių iki šiol ištirtų pagalbinių genetinių grybų komponentų, o tai greičiausiai atspindi jo sparčiai besivystančią. gamta.
1 lentelė BUSCO naujų genomų analizė
2 lentelė SNP poveikio poveikio kiekvienam naujam genomui, palyginti su IPO323 etaloninių genų modeliais, santrauka
2 pav. Žingsnių, naudojamų generuojant „pagrindinį“ ir „papildomą“ genų skambučius ir numerius naujai sukurtam Europos Z. tritici pangenomui, santrauka. Skaičiai rodo genų, nustatytų kiekviename ruošimo etape, skaičių
Europos Z. tritici pangenomos variacijos struktūriniai ypatumai
Šio tyrimo tikslas buvo patikrinti hipotezę, kad pangenomika gali būti panaudota siekiant nustatyti svarbius naujus genus, būtinus gyvybei arba patogeninių organizmų virulentiškumui. Mes iškėlėme hipotezę, kad tai būtų genai, esantys ir veikiantys kiekvienoje patogeno padermėje ir išreikšti kiekvienoje patogeno padermėje. Be to, spėliojome, kad šie genai turės mažesnį didelio ir vidutinio poveikio SNP mutacijų, turinčių įtakos koduojančioms sekoms, lygius (mažiau polimorfines), ir kad jie gali susikaupti tam tikrų chromosomų regionuose.
Naudojome SNP variacijos duomenis (didelį, vidutinį ir modifikatorių – žr. 4 papildomą failą: S2 lentelę), taip pat vidutinius visų genų ekspresijos duomenis, kad ištirtume vidutinius kodavimo polimorfizmo ir ekspresijos lygius chromosomų pagrindu, naudojant 21 chromosomą. IPO323 kaip pastoliai. Modifikatoriai SNP reiškia nukleotidų pokyčius, kurie nekeičia aminorūgščių. 3A paveiksle parodyta, kad nebuvo jokio ypatingo mutacijų dažnio paklaidos, kai kumuliaciniai aukšti, vidutinio sunkumo ir modifikuojantys SNP buvo išreikšti kaip vidutinio baltymo ilgio visoje chromosomoje požymis. Tačiau, kai modifikatorių mutacijos, ty tos, kurios nesukelia aminorūgščių pasikeitimo, buvo praleistos, buvo aišku, kad mažiausiose 8 chromosomose yra genų su didesniu skaičiumi didelių ir vidutinių SNP mutacijų (3B pav.). Šis poveikis buvo dar labiau pabrėžtas, kai buvo analizuojami tik didelio poveikio SNP (3C pav.). Priešingai nei 1–13 pagrindinėse chromosomose (~ 20 %), iki 90 % genų, esančių aštuoniose mažiausiose 14–21 chromosomose, buvo paveiktas didelis poveikis, tikėtinas funkcijų praradimas bent vienoje mutacijoje. izoliuoti (3C pav.). Sukaupti visų 12 naujų izoliatų transkripcijos duomenys taip pat parodė santykinai žemą vidutinę 14–21 chromosomose esančių genų ekspresiją (3D pav.), kaip anksčiau buvo pastebėta IPO323 [32, 43, 44]. Apibendrinant, šie duomenys rodo aiškų genomo suskaidymą, kai mažiausiose aštuoniose papildomose chromosomose yra labai polimorfinės, papildomos ir paprastai prastai išreikštos sekos.
Palyginus visus pagrindinio arba pagalbinio genomo genus, paaiškėjo, kad ~ 60 % visų pastarojo genomo genų buvo rasta bent vienoje padermėje su didelio poveikio (funkcijos praradimo (LoF)) mutacija ir kad 47 % taip pat nebuvo bent viena padermė (4 papildoma byla: S2 lentelė). Panašiai kaip ir pagalbinių chromosomų analizė, atskiri pagalbiniai genai taip pat buvo labai prastai išreikšti tirtuose izoliatuose (4 papildomas failas: S2 lentelė) ir turėjo daug daugiau sekų su nežinomomis funkcijomis (apie 80 %). Šie stebėjimai gerai palyginami su ankstesniais pan genominiais tyrimais, atliktais pasaulinėse Z. tritici kolekcijose, surinktose dešimtmečių skirtumu [27, 28].
Taip pat atlikome genų buvimo ir nebuvimo variacijos (PAV) analizę visiems genams, numatytiems etaloniniame izoliate IPO323, kitiems 17 sekvenuotų izoliatų. Šie buvimo / nebuvimo duomenys buvo pavaizduoti kiekvieno geno pozicijoje kiekvienoje iš 21 chromosomos, esančios IPO323. 3E ir F paveiksluose rodomi reprezentatyvių pagrindinių chromosomų (1 ir 7) duomenys, o 3G ir H pav. rodomi reprezentatyvių papildomų chromosomų (13 ir 14) duomenys. Likusių chromosomų duomenys pateikti 2 papildomame faile: S2 pav. Ši analizė nustatė daug IPO323 esančių genų, kurių trūksta daugelyje iš naujo sudarytų izoliatų, ir aiškiai parodo skirtumą tarp bendro geno buvimo / nebuvimo tarp IPO323 "pagrindinių" chromosomų (kurios yra kiekvienoje Z. tritici padermėje). palyginti su 8 mažiausiomis „pagalbinėmis“ chromosomomis. Duomenys taip pat pabrėžia regioną 7 chromosomoje, tarp 1,7 Mb ir 2,5 Mb, kuris rodo aukštą genų nebuvimo dažnį naujuose izoliatuose (3F pav.). Įdomu tai, kad šis regionas tiksliai atitinka genomo vietą, kurioje anksčiau buvo nustatyta minimali arba visai nebuvo geno ekspresija IPO323 auginant kultūrą arba bet kurios augalų infekcijos fazės metu [32, 43]. Šis regionas taip pat atitinka chromosomų deleciją, kuri buvo pastebėta Jemeno izoliate ankstesniame pangenomo tyrime [28]. Kartu šie duomenys patvirtina mintį, kad Z. tritici yra greitai besivystantis organizmas, kurio populiacijoje yra didelė genetinė ir genominė įvairovė.
Baltymų lokalizacijos prognozės atskleidžia genus pagalbiniame pangenome, kurie gali veikti prisitaikydami prie besikeičiančios aplinkos
„WolfPsort“ baltymų lokalizacijos prognozės buvo vykdomos visiems pangenomos koduotiems baltymams. Tada mes apskaičiavome santykinį baltymų procentą, kuris, kaip prognozuojama, lokalizuosis kiekviename tarpląsteliniame regione, kaip bendro baltymų skaičiaus šerdies arba pagalbinio pangenomo požymį (4 pav.). Pagrindiniame genome buvo praturtintos kelios lokalizacijos kategorijos, įskaitant „citoplazmą“, „tarpląstelinę“ ir „plazmos membraną“, iš kurių pastaroji turi daug pagrindinių transportavimo funkcijų (4 pav.). Atvirkščiai, vietos „branduolys“ ir „mitochondrijos“ buvo susijusios su didesniu genų procentu priedo genome (4 pav.). Papildomas genomas buvo praturtintas tam tikrais cinko surišimo domenais, kurie gali užtikrinti transkripcijos lankstumą. Apie šios kategorijos praturtėjimą taip pat buvo pranešta ankstesniame pangenomo tyrime, kuriame pabrėžiama, kad mūsų bendras dujotiekis davė palyginamus rezultatus [27, 28]. „Mitochondrijų“ sodrinimas yra įdomus, nes egzistuoja pseudogenai ir bona fide mitochondrijų baltymų paralogai, kurie yra nukreipti priešgrybelinės chemijos būdu. Vienas aiškus papildomos pangenomos pavyzdys yra sukcinato dehidrogenazės subvieneto C (SDHC3) paralogas, kuris, kaip įrodyta, tarpininkauja nuolatiniam atsparumui SDHI (sukcinato dehidrogenazės inhibitorių) fungicidų poklasiui Z. tritici [45]. Mes nustatėme visas šio geno sekas tik trijuose iš septyniolikos sekvenuotų izoliatų, o aukštą genų ekspresijos lygį nustatėme tik viename iš 12 vėliau tirtų RNAseq (5B pav.). Nepaisant to, ankstesniame tyrime ir dabartinėje mūsų analizėje pabrėžiama, kad priedų genome iš tiesų yra svarbių funkcijų, tačiau jos tikriausiai yra svarbesnės prisitaikant prie besikeičiančios aplinkos nei pagrindiniam gyvenimo būdui.
3 pav. Pangenomo struktūrinės ypatybės ir polimorfizmai buvimo / nebuvimo 21 etaloninio izoliato IPO323 chromosomoje. Bendras kumuliatyvių SNP mutacijų, suteikiančių modifikavimo, vidutinio (M) ir didelio (H-funkcijos praradimo-LoF) poveikio pokyčius, išreiškiamas kaip vidutinio baltymo ilgio (aa) ypatybė vienoje chromosomoje. B Bendras kumuliacinių SNP mutacijų, suteikiančių vidutinio ir didelio poveikio pokyčius, skaičius, išreikštas kaip vidutinio baltymo ilgio vienoje chromosomoje požymis. C Bendras kumuliatyvių SNP mutacijų, suteikiančių didelį poveikį, skaičius, išreikštas kaip vidutinio baltymo ilgio vienoje chromosomoje ypatybė. D Vidutinė visų genų, esančių kiekvienoje iš 21 chromosomos, ekspresija visuose izoliatuose. E Genų buvimas ir nebuvimas (PaV) polimorfizmas, numatytas IPO323 izoliato 1-ojoje pagrindinėje chromosomoje 17-oje naujai sekvenuotų izoliatų. F PaV 7 pagrindinės chromosomos genams. G PaV 15 pagalbinės chromosomos genams. G–F PaV 15 pagalbinės chromosomos genams. Duomenys išryškina didelius regioninius skirtumus ir aiškiai atskiria bendrų sekos polimorfizmų lygius ir buvimo/ nebuvimas matomas pagrindinėse ir papildomose chromosomose
4 pav. Numatoma pagrindinių ir pagalbinių genų koduojamų baltymų lokalizacija. Procentinių prognozuojamų baltymų lokalizacijų, nustatytų „WolfPsort“, santrauka nurodytoms kategorijoms, palyginti su bendru baltymų kiekiu, esančiu šerdyje ir pagalbiniame pangenome
Papildomo genomo efektoriniai baltymai pasižymi didesniu ekspresijos skirtumu tarp padermių nei šerdyje
Daugiau nei aštuoni procentai pagrindinio genomo genų koduoja numanomus išskiriamus baltymus, o tai yra didesnis skaičius nei pagalbinio genomo (~ 5%). Tačiau pagalbinio genomo, koduojančio išskiriamą baltymą, genai dažniau turėjo nežinomą funkciją, neturėjo atpažįstamų domenų ar katalizinių regionų. Šie nežinomos funkcijos baltymai sudarė ~ 75% visos papildomos sekrecijos, palyginti su 42% pagrindinės sekrecijos. Daugelis kandidatų (o kai kuriais atvejais patvirtintų) efektorių, esančių pagrindiniame genome, buvo išreikšti panašiais modeliais ir panašiais lygiais visuose dvylikoje izoliatų, kuriuos analizavo RNASeq. Pavyzdžiui, trys LysM (lizino) domeno turintys efektoriai 3LysM, 1LysM ir xLysM buvo išreikšti labai panašiu lygiu ir identiškais modeliais kiekviena paderme (5C-E pav.). Te 3LysM efektorius išlieka vienintelis pagrindinis išskiriamas Z. tritici virulentiškumo determinantas, kur šis baltymas slopina chitino sukeltą augalų imunitetą ankstyvos infekcijos metu [46, 47]. Tačiau žinoma, kad visi trys LysM efektoriai šiuo tikslu dirba kartu [48]. Taigi pažymėtina, kad šių genų ekspresijos skirtumai tarp izoliatų buvo labai maži, o tai dar kartą patvirtina pasiūlymus, kad šis gynybos slopinimas yra pagrindinė infekcijos dalis. Priešingai, kandidatų efektoriai rasti priedų genomo rodomas tiek buvimo ir nebuvimo variacijos ir labai kintama išraiška tarp izoliatų (5 pav. F-H). Pavyzdžiui, AvrStb6, pirmasis avirulentiškumo efektorius, nustatytas Z. tritici [49, 50], pasižymi dideliu ekspresijos skirtumu (5F pav.), nepaisant to, kad jis yra visuose izoliatuose. Šį sekos kintamąjį, mažą, išskiriamą baltymą, atpažįsta kviečių veislės, turinčios į receptorių panašios kinazės Stb6 funkcinius alelius [25, 51]. Šis atpažinimas suteikia atsparumą ligoms prieš visus izoliatus, kuriuose yra tam tikras šio efektoriaus alelis. Tere buvo reikšmingas AvrStb6 ekspresijos pokytis tarp izoliatų ir mes nustatėme vieną izoliatą (Zt118), kuriame nepavyko aptikti jokios ekspresijos nė vienoje iš trijų išbandytų sąlygų. Dėl šios priežasties mūsų prognozavimo vamzdyne AvrStb6 buvo priskirtas priedų genomui. Daugelis kitų kandidatų, šiuo metu nežinomų funkcijų efektorių, parodė reikšmingą buvimą / nebuvimą ir (arba) išraiškos pokyčius pagalbiniame genome (5G ir H pav.).
5 pav. Genų raiškos kitimas šerdies ir pagalbiniame pangenome ir trumpalaikės viruso ekspresijos sistemos sukūrimas, naudojamas nekrotrofiniams efektorių ekranams. Duomenų interpretavimo raktas parodytas paveikslėliuose. B Sukcinato dehidrogenazės subvieneto C paralogo, esančio pagalbiniame genome, buvimas / nebuvimas ir genų ekspresijos kitimas. C-E ZtLysM efectors, 3LysM, 1LysM ir xLysM raiškos profiliai, visi yra pagrindiniame pangenome. F Avirulentiškumo efektoriaus AvrStb6 raiškos profilis. Jokios išraiškos nebuvimas izoliate 118 priskiria efektorių į papildomą pangenomą. G ir H yra papildomų kandidatų efektorių pavyzdžiai pagalbiniame pangenome.
Funkciniai ekranai nepateikia nekrotrofinio efektoriaus aktyvumo įrodymų nei pagrindiniame, nei pagalbiniame pangenome
Kviečių (ir kitų javų ir ne javų kultūrų) virusinės vektoriaus sąlygotos trumpalaikės baltymų ekspresijos sistemą panaudojome Foxtail Mosaic virusą (FoMV), kad atliktume vidutinio ir didelio našumo kandidatų Z. tritici efectors atranką. iš pangenomos. Mes specialiai siekėme patikrinti, ar kuri nors iš jų gali sukelti nekrozę nedidelėje kviečių veislių grupėje, o tai gali reikšti, kad jos veikia pereinant prie ligos simptomų kaip „nekrotrofinių efektorių“ [36, 52]. Šiam tyrimui atlikome keletą anksčiau paskelbtos sistemos modifikacijų [53]. Norėdami paskatinti ekstraląstelinį baltymų sekreciją kviečiuose, naudojome su kviečių patogeneze susijusio baltymo 1 (TaPR1) signalo peptido seką, kodoną optimizuotą į Arabidopsis thaliana, kuri vėliau genų sintezės būdu buvo sujungta kadre su kiekviena kandidato grybelio efektoriaus seka (1 pav.). 5I). TaPR1 signalinio peptido veiksmingumas išskirti funkcinius Z. tritici ekstraląstelinius baltymus buvo nustatytas pagal jo gebėjimą sukelti tabako lapų nekrozę, kai jis yra priešais Z. tritici nekrozę ir etileną indukuojantį baltymą (ZtNLP), kuris yra tik funkcinis. kai taikinys ekstraląstelinei sekrecijai (5 pav. Jl) [54]. Tada patvirtinome, kad vektorius gali vienodai gerai išreikšti baltymus įvairiose kviečių veislėse, vizualizuodamas vietinę ir sisteminę žalio fluorescencinio baltymo (GFP) ekspresiją skirtingų kviečių veislių lapuose (2 papildomas failas: S3 pav.). Galiausiai išbandėme gerai apibūdinto nekrotrofinio efektoriaus SnToxA, kilusio iš giminingo kviečių patogeno Parastagonospora nodorum, gebėjimą sukelti nekrozę genotipų, turinčių Tsn1 jautrumo geną, kviečių lapuose [55]. Kaip ir tikėtasi, FoMV sukelta per didelė SnToxA ekspresija su TaPR1 signaliniu peptidu sukėlė nekrozę tik toms kviečių veislėms, turinčioms Tsn1 (cv Halberd 5K pav.), o veislėms, kurioms šio jautrumo geno nėra (cv. Riband5K), simptomų nepastebėta. ). Šie duomenys patvirtino, kad viruso vektoriaus sukeltos per didelės ekspresijos sistema buvo tinkama didesnio masto kandidatų Z. tritici efektorių atrankai, siekiant nustatyti bet kurį, turintį nekrotrofinį efektorių aktyvumą. Iš viso buvo atrinkti 88 kandidatai, kurie buvo patikrinti pagal penkias kviečių veisles (5 papildoma byla: S3 lentelė). Tai apėmė 66 baltymus, esančius pagrindiniame pangenome, ir 22 iš priedo. Atrinkti genai (5 papildomas failas: S3 lentelė) buvo nuo pagrindinių genų, neturinčių specifinių padermių polimorfizmų (monomorfinių) ir turinčių didelę augalų ekspresiją, iki genų, esančių pagalbiniame genome, pasižyminčiais buvimu / nebuvimu ir (arba) reikšmingu ekspresijos polimorfizmu. Visuose eksperimentuose buvo vykdomos lygiagrečios ToxA vs cv Halberd ir cv Riband techninės kontrolės, kurios visada davė laukiamus rezultatus. Priešingai, nė vienas iš 88 tirtų Z. tritici per daug ekspresuotų baltymų nesukėlė jokios lapų nekrozės jokiai kviečių veislei. Apibendrinant galima pasakyti, kad šie rezultatai nepateikė jokių nekrotrofinių efektorių įrodymų, todėl nė vienas iš išbandytų kandidatų nepalaiko perėjimą prie nekrotrofinio augimo infekcijos metu.
cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą
Pagrindiniai genai, koduojantys baltymus su parodytomis arba numatomomis esminėmis gyvybei ar pagrindinėmis virulentiškumo funkcijomis, turi mažesnį bendrą aminorūgščių polimorfizmo lygį
Atlikome literatūros paiešką, siekdami identifikuoti visus Z. tritici genus, kuriems buvo taikomas funkcinis apibūdinimas – virulentiškumas arba esminiai genai, datuojami iki 2018 m. Taip buvo sudarytas 28 baltymų sekų sąrašas (6 papildomas failas: S4 lentelė). Panašiai mes nustatėme 26 baltymų, kurie taip pat buvo funkciškai apibūdinti, sąrašą, tačiau buvo įrodyta, kad jie nevaidina pagrindinio vaidmens virulentiškumui arba yra būtini (6 papildomas failas: S4 lentelė). Tada ištyrėme šių genų kaupiamųjų perteklinių didelių ir vidutinių mutacijų lygius ir išreiškėme jų reikšmes kaip kiekvieno baltymo ilgio požymį, o tada nustatėme vidutines rinkinio vertes. 6 paveiksle pabrėžta, kad paskelbti genai, darantys įtaką virulentiškumui, turėjo statistiškai reikšmingai mažesnį mutacijų (polimorfizmo) dažnį (p{8}}.007) nei tie, kurie, kaip įrodyta, yra funkciškai pertekliniai.
Tyrimų, kuriais siekiama nustatyti gyvybiškai svarbius (esminius) genus siūliniuose grybuose (išskyrus mieles), yra nedaug, ir iki šiol esminių genų duomenų bazėje (DEG) yra tik vienas atstovas, kilęs iš oportunistinio žmogaus patogeno Aspergillus fumigatus. [56–58]. Mes nustatėme visų 28 genų Z. tritici ortologą, eksperimentiškai įrodytą, kad jie yra būtini A. fumigatus gyvybei, ir vėl apskaičiavome santykinį kiekvieno mutacijų dažnį, palyginti su sekos ilgiu (7 papildoma byla S5 lentelė). Dar kartą nustatėme aiškų statistiškai reikšmingą didelių ir vidutinių SNP mutacijų dažnio sumažėjimą (p{7}}.0148) šiuose esminiuose kandidatuose genuose, tada pastebėjome, kad genai nėra būtini nei virulentiškumui, nei gyvybei ( 6 pav.). Priešingai, reikšmingo skirtumo (p=0.2128) tarp eksperimentiškai patvirtintų virulentiškumo genų ir numatytų esminių genų mutacijų dažnio nebuvo (6 pav.). Šie duomenys kartu patvirtina koncepciją, kad aminorūgščių polimorfizmų lygis populiacijose gali būti naudojamas nuspėti santykinę genų svarbą pagrindiniam organizmo gyvenimo būdui.
6 pav. Eksperimentiškai patvirtinto patogeniškumo ir (arba) nuspėjamų esminių gyvybei genų pagrindinių genų rinkinių analizė atskleidžia mažesnį mutacijų dažnį nei neesminiuose genuose. Vidutinis didelis ir vidutinis (H/M) mutacijų dažnis, išreikštas kaip baltymų ilgio (aa) ypatybė genų sąrašams, koduojantiems baltymus, kurie buvo; 1- eksperimentiškai nustatyta, kad grybelio virulentiškumo srityje nevaidina jokio (arba labai nežymaus) vaidmens; 2-eksperimentiškai pasiryžusi atlikti svarbų vaidmenį virulentiškumo ir; 3-numatoma, kad per ortologiją koduos numanomus gyvybiškai svarbius genus baltymams, eksperimentiškai apibūdintiems Aspergillus fumigatus. Žvaigždutės (*) simbolis rodo statistiškai reikšmingą mutacijų dažnių skirtumą tarp nurodytų genų rinkinių. Genų sąrašai ir susiję polimorfizmo duomenys pateikti 6 papildomame faile: S4 lentelėje
Kombinuoto nuspėjimo metodo naudą siekiant atskleisti patogeno silpnumą palaiko genetinės komplementacijos tyrimai su penkių „pagrindinių“ genų delecijos mutantu.
Z. tritici gali perduoti genetikos tyrimus, pagrįstus atsitiktine T-DNR integracija per Agrobacterium-medijuojamą grybelinę transformaciją (AMT). Mūsų ankstesniame darbe buvo sukurtas vienas Z. tritici T-DNR mutantas, kuris negalėjo sukelti visos užkrėstų kviečių lapų ligos (7A pav.). Šis mutantas, vadinamas 23-21 (23-ias transformacijos raundas ir 21-oji surinkta kolonija), galėjo normaliai augti kaip laukinis tipas maistinių medžiagų turinčioje agaro terpėje (YPD), tačiau jam nepavyko išplėsti panašaus grybelio hifų kiekio, kai buvo auginamas ant maistinių medžiagų neturinti terpė, įskaitant vandens agarą (7A pav.). Mes panaudojome viso genomo Illumina pakartotinę 23-21 seką, kad atskleistume galimai priežastinio T-DNR įterpimo vietą. Ši analizė atskleidė vieną T-DNR integraciją tarp 899878 ir 912699 pozicijų 8 chromosomoje, sukėlusią penkių numatytų kodavimo sekų ištrynimą / sutrikimą (7B pav.). SNP ir indelio analizė neatskleidė jokių papildomų nepažymėtų mutacijų 23-21 padermėje, palyginti su laukinio tipo IPO323 genomo seka. 23-21 T-DNR delecija veiksmingai pašalino penkis genus, kurie visi yra pagrindiniame genome, ir su šiomis funkcinėmis (Interpro) prognozėmis; genas 1=Citochromas P450; genas 2=S-adenozilmetionino metiltransferazė; genas 3=Cinkas (2) C6 tipo DNR surišantis baltymas; genas 4=Nukleoziddifosfato kinazė (NDK) ir genas 5=glikozilo hidrolazė 31 (7B pav.). Mes ištyrėme santykinį didelių ir vidutinių mutacijų skaičių kiekviename baltyme kaip baltymo ilgio ypatybę, o tai atskleidė, kad baltymas 4 (NDK) turėjo daug mažiau mutacijų, turinčių įtakos aminorūgščių sekos pokyčiams, nei kitos keturios analizuotos sekos izoliuotame rinkinyje (1 pav.). 7C ir 2 papildoma byla: S4 pav.). Tada ištyrėme vidutinę santykinę visų penkių genų ekspresiją visuose išbandytuose izoliatuose. Jis taip pat atskleidė, kad 4 genas (koduojantis NDK) buvo žymiai stipresnis nei visi kiti kandidatai (7D pav. ir 2 papildomas failas: S5 pav.). Taigi mes iškėlėme hipotezę, kad mažiausiai polimorfinio ir daugiausiai išreikšto geno, 4 geno, NDK, praradimas buvo atsakingas už virulentiškumo praradimą ir su tuo susijusį defektą plečiant hifas. Norėdami tai patikrinti, kiekvieną iš penkių kandidatų genų atskirai transformavome atgal į 23-21 Z. tritici mutantinę padermę, kurią varo savas endogeninis promotorius. Iš kiekvieno buvo gauti keli transformantai ir pakartotinai ištirti dėl kviečių lapų virulentiškumo ir gebėjimo išplėsti siūlinius hifus ant vandens agaro. Tai parodė, kad pakartotinai įvedus vien tik NDK geną (4 geną), buvo visiškai atkurtas virulentiškumas ir hifų augimas iki laukinio tipo lygių (7E pav. ir 2 papildomas failas: S6 pav.). Kiekvieno iš kitų keturių kandidatų pakartotinis įvedimas nesukėlė jokių fenotipo pokyčių nuo pradinės mutantinės padermės 23-21 (7E pav.). Siekiant užtikrinti, kad visi pakartotinai įvesti genai būtų išreikšti atitinkamoje komplementuotoje padermėje, kiekvienam transformantui ir pradiniam 23-21 mutantui buvo atlikta RT-PGR. Tai patvirtino numatomą kiekvieno transkripto trūkumą 23-21 mutante ir parodė teisingą kiekvieno tikslinio geno ekspresiją papildytuose izoliatuose (7F pav.). Tus, pakartotinai įvedus vieną geną su mažiausiais populiacijos lygio polimorfizmais iš penkių kandidatų ir aukščiausia santykine ekspresija, atkūrė defektinius šio kviečių patogeno fenotipus. Šis eksperimentinis stebėjimas patvirtina pangenomikos ir transkriptomikos derinimo naudą numatant genus, kurie gali būti svarbūs pagrindinėms funkcinės gyvybės savybėms.
7 pav. Funkcinės komplementacijos tyrimai su penkių genų ištrynimo nepatogeniniu Z. tritici mutantu palaiko kombinuotą pangenomų mutacijų greičio ir ekspresijos lygio analizės naudojimą kaip svarbių pagrindinių gyvenimo būdo genų prognozes. A Z. tritici atsitiktinio T-DNR įterpimo mutanto "23-21" augimo ir infekcijos charakteristikos. Padermė normaliai auga ant turtingo maistinių medžiagų agaro, tačiau blogai auga siūlinis agaras, o kviečių lapų ligas sukeliantis aktyvumas yra labai pažeistas. Mastelio juostos reiškia 1 cm. B Padermės 23-21 viso genomo sekos nustatymas atskleidžia T-DNR sukeltą 13 kb genomo srities ištrynimą, sutrikdant arba ištrinant penkis numatytus genus iš pagrindinio pangenomo. C rodo kiekvieno geno (pažymėto 1-5) vidutinius didelės ir vidutinės mutacijos įvykius iš pangenomo, palyginti su koduoto baltymo ilgiu (aa)
Diskusija
Kombinuota pangenomika ir transkriptomika gali būti naudojama kaip ginklas prieš greitai besivystančius patogenus
Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>40% visų genų) priedinis genomas nei šios rūšys. Kodėl ir kaip Z. tritici ir galimai kiti augalų patogeniniai grybai išlaiko tokį didelį pagalbinį komponentą, neaišku. Pavyzdžiui, mažiausios aštuonios chromosomos, nustatytos IPO323, neturi jokio aiškaus didelio poveikio virulentiškumui ar kitiems procesams, o tik vienas tyrimas šiuo metu rodo, kad 14, 16, 18, 19 ir 21 chromosomos vaidina subtilų virulentiškumo vaidmenį pasirinktos kviečių veislės [59]. Nepaisant to, populiacijose išlieka šių mažų chromosomų deriniai. Buvo pasiūlyta, kad jie numato rekombinacijos įvykius, kurie gali būti pagrindas grybelio gebėjimui greitai vystytis, kad prisitaikytų prie aplinkos įtempių, kartu su dideliu perkeliamų elementų aktyvumu [60–62]. Panašų atvejį galima ginčyti ir dėl didelio priedinio genomo. Tai patvirtina dviejų šiame tyrime nurodytų papildomų genomo komponentų – SDH subvieneto C paralogas ir AvrStb6 – funkcinė svarba, kurie abu vaidina pagrindinį vaidmenį sąveikaujant su kintamaisiais išorinės aplinkos elementais (fungicidų naudojimas ir derančios veislės). atitinkamai atsparumo ligoms genai) [25, 45]. Buvo aprašyti ir kiti biologiniai procesai, kurie taip pat gali būti prarasti atskiruose Z. tritici izoliatuose be aiškių tinkamumo defektų, įskaitant melanizacijos (pigmentacijos) kontrolę [63]. Mūsų tyrimas parodė, kad papildomas, greitai besivystantis Z. tritici genomas gali būti panaudotas prieš jį, kai dėmesys sutelkiamas į tai, ko negalima prarasti arba turi ribotą polimorfizmą. Šiuo tyrimu buvo siekiama tai padaryti, atsižvelgiant į pagrindinius genus, kurie yra ne tik esantys ir veikiantys visuose izoliatuose, bet ir išreikšti visuose izoliatuose. Mes taip pat laikėmės požiūrio, bandydami reitinguoti genų rinkinius pagrindiniame genome, remdamiesi aminorūgščių sekos kintamumo lygiais. Žinoma, yra keletas įspėjimų, susijusių su mūsų naudojamais metodais, ypač dėl to, kad perteklinių (identiško tipo ir padėties) mutacijų negalima lengvai atskirti nuo panašaus skaičiaus mutacijų, kurios gali atsirasti unikaliose kiekvieno izoliato vietose (neperteklinės mutacijos). Taigi mūsų metodas netinka greitai besivystantiems genams reitinguoti. Nepaisant to, šis metodas leidžia lengvai identifikuoti genus, kurių kintamumas nėra arba mažas, remiantis mažu polimorfizmų, turinčių įtakos aminorūgščių pokyčiams, dažniu. Šis metodas parodė, kad eksperimentiškai patikrinti ir numatyti esminiai gyvybei genai arba virulentiškumo genai turėjo žymiai mažiau tokio tipo polimorfizmo tarp izoliatų nei tie, kurių funkcijos šiems procesams būtinos. Galiausiai išplėtėme šį metodą, kad nustatytų naują nukleozidų difosfatkinazės (NDK) virulentiškumo funkciją, kuri parodė mažiausią visų genų variaciją 5-geno T-DNR delecijoje. Remdamiesi šiomis išvadomis, siūlome, kad pangenomikoje nustatytų pagrindinių genų polimorfizmo lygiai galėtų būti naudojami nustatant svarbias koduotų baltymų funkcijas ir taip suteikiant pirmenybę genams funkcinei analizei, siekiant nustatyti naujus pasėlių apsaugos ir potencialiai gyvūnų sveikatos tikslus.
Kylantis silpnumas Z. tritici ir susijusių patogenų infekcijų biologijoje?
Šis tyrimas taip pat suteikė papildomų konkrečių įžvalgų apie šio svarbaus kviečių patogeno infekcijos biologiją. Pirma, nebuvo gauta jokių įrodymų, patvirtinančių, kad 88 išskiriami baltymai, atrinkti iš pagrindinio ir pagalbinio genomo, turi pagrindinį nekrotrofinį efektorių aktyvumą. Negalime atmesti galimybės, kad nepasirinkome tinkamų baltymų arba kad keli efektoriai gali dirbti kartu, kad paskatintų augalų ląstelių mirtį (taip pat siūlo panašūs ekspresijos profiliai). Jei taip yra, tai skirtųsi nuo aiškios atskirų nekrotrofinių efektorių svarbos susijusiems kviečius užkrečiantiems grybams, ypač Parastagonospora nodorum ir Pyrenophora rūšims [35]. Taip pat gali būti, kad ekspresijos lygiai, kuriuos gauname iš trumpalaikės FoMV sistemos, yra mažesni nei reikalingi efektoriams, kurių atpažinimas yra mažiau ryškus nei SnToxA. Nepaisant to, čia pateikti duomenys nepatvirtina minties, kad perėjimas prie simptominio augimo ir augalų ląstelių žūties yra susijęs su pagrindinių (pavienių) nekrotrofinių Z. tritici efectors atpažinimu. Todėl gali būti, kad masinė šių baltymų gamyba simptomų pradžioje gali padėti apsaugoti grybelių hifus nuo akivaizdaus ląstelių mirties ir augalų atsako hiperaktyvacijos. Atsižvelgiant į tai, buvo įrodyta, kad iš šio ir kitų grybų išskiriami efektoriai gali slopinti augalinės kilmės proteazes, chitinazes ir kitus ląstelių sieneles atakuojančius fermentus, kuriuos patys sukelia augalų gynybos reakcijos metu [46, 48, 64, 65 ]. Visai neseniai taip pat buvo įrodyta, kad grybelių efektoriai manipuliuoja ir pertvarko mikro ir mikrobiomas [66, 67].
cistanche nauda vyrams - stiprina imuninę sistemą
Tačiau svarbu nustatyti pagrindinį NDK virulentiškumo vaidmenį. Šie baltymai buvo priskirti daugeliui skirtingų prokariotinių ir eukariotinių organizmų funkcijų. Yra viena ataskaita, kurioje nurodomas augalų imuniteto moduliavimo vaidmuo [68], o kitos rūšies (A. fumigatus) atveju buvo įrodyta, kad ji yra gyvybiškai svarbi [69]. Tačiau pagrindinė ir konservuota šių baltymų funkcija yra fosforilinti nukleozidų difosfatus, paprastai naudojant ATP kaip substratą, kad būtų galima generuoti kitus nukleozidų trifosfatus (NTP), reikalingus įvairiems ląstelių procesams skatinti [70, 71]. Tai ypač svarbu, kai riboti ištekliai apsunkina tam tikrų NTP generavimą kitomis priemonėmis. Tus, NDK yra pagrindinis gelbėjimo būdas, skirtas NTP regeneracijai, greičiausiai, kai yra riboti tarpląsteliniai ištekliai. Svarbūs vaidmenys keletui kitų gelbėjimo būdų, ypač biosintezės būdų, neseniai išryškėjo atlikus kitus Z. tritici genų funkcijos tyrimus. Pavyzdžiui, lizino biosintezė yra būtina infekcijai ir hifų augimui esant skurdžiam maistinėms medžiagoms [72], kaip ir purino biosintezė [73]. Šios funkcijos yra nereikalingos augimui visose terpėse. Ankstesni transkripto duomenys apie labai ankstyvą lapų paviršiaus kolonizacijos stadiją parodė, kad grybelis yra aplinkoje, kurioje trūksta maistinių medžiagų, ir jis priklauso nuo tarpląstelinių atsargų panaudojimo [33]. Kartu su ankstesniais funkciniais tyrimais ir pagrindiniu NDK vaidmeniu akivaizdu, kad Z. tritici yra labai pažeidžiamas pagrindinių biosintezės ir gelbėjimo takų slopinimo, kai ant lapo paviršiaus ankstyvos kolonizacijos metu, ir, galbūt, sukelia augalų ląstelių mirtis po 7–10 dienų. Taigi, nauji pasėlių apsaugos produktai ar strategijos galėtų būti nukreiptos į šių procesų slopinimą, o tai gali būti Z. tritici ir potencialiai daugelio kitų susijusių grybų, turinčių panašius infekcijos būdus, silpnumas.
Išvados
Šis tyrimas suteikia pradinę paramą bendram pangenomikos ir transkriptomikos naudojimui, siekiant apibrėžti genus, kurie atspindi sparčiai besivystančių patogenų pagrindines ir potencialiai išnaudojamas silpnąsias vietas. Tačiau iš esmės šie metodai gali būti naudojami genų prioritetų nustatymui bet kurioje biologinėje sistemoje, kurioje yra keli genomai ir transkriptai. Tikimės, kad šie metodai galėtų paskatinti pagrindinių biologinių procesų atradimą daugelyje įvairių biologinių sistemų.
Nuorodos
1. Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. Pasaulyje atsirandantis atsparumas priešgrybeliniams vaistams kelia iššūkį žmonių sveikatai ir maisto saugumui. Mokslas. 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.
2. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL ir kt. Kylančios grybelinės grėsmės gyvūnų, augalų ir ekosistemų sveikatai. Gamta. 2012;484. https://doi.org/10.1038/nature10947.
3. Lucas JA, Hawkins NJ, Fraaije BA. Atsparumo fungicidams raida. Adv Appl Microbiol. 2015;90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.
4. Heitman J. Lytinis dauginimasis ir mikrobų patogenų evoliucija. Curr Biol. 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.
5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. Dviejų greičių gijinių patogenų genomai: valsas su augalais. Curr Opin Genet Dev. 2015;35:57–65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.
6. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL ir kt. Daugelio patogeninių Streptococcus aga-lactiae izoliatų genomo analizė: pasekmės mikrobų „pan-genomui“. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.
7. Lefébure T, Stanhope MJ. Strep-coccus šerdies ir pan-genomo evoliucija: teigiama atranka, rekombinacija ir genomo sudėtis. Genome Biol. 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.
8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF ir kt. Lyginamoji rizobiją formuojančių sojų pupelių genomika rodo, kad adaptacijose yra daug specifinių genų įdarbinimo. Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.
9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP ir kt. Panparastagonospora lyginamoji genomo analizė-efektoriaus numatymas ir genomo evoliucija. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/ gbe/evy192.
10. McCarthy CGP, Fitzpatrick DA. Modelinių grybų rūšių pan-genominė analizė. Mikrob. Genomika. 2019 m.;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.
11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y ir kt. Pan-genomo analizė, siekiant nustatyti pagrindinius ir esminius Brucella spp. Mol geno genomika. 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.
12. Barber AE, Sae-Ong T, Kang K, Seelbinder B, Li J, Walther G ir kt. Aspergillus-lus fumigatus pan-genominė analizė nustato genetinius variantus, susijusius su žmogaus infekcija. Nat Microbiol. 2021 m.;6. https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.
13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R ir kt. Viso genomo sekos nustatymas atskleidžia natūralią Phytophthora sojae variaciją ir adaptacinę evoliuciją. Priekinė mikrobiolė. 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.
14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: pagrindinė grėsmė kviečių gamybai, integruoti kontrolės metodai. Grybelinė Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.
15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. Imigracijos ir seksualinio dauginimosi matavimas Mycosphaerella graminicola lauko populiacijose. Fitopatologija. 1998;88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.
16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. Poravimosi tipo alelių pasiskirstymas kviečių patogene Mycosphaerella graminicola erdvinėmis skalėmis nuo pažeidimų iki žemynų. Grybelinė Genet Biol. 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.
17. Stukenbrock EH, Banke S, Java-Nikkhah M, McDonald BA. Grybelinio kviečių patogeno Mycosphaerella graminicola kilmė ir prijaukinimas simpatriniu būdu. Mol Biol Evol. 2007;24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.
18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. Mycosphaere-lla graminicola populiacijos struktūra: nuo pažeidimų iki žemynų. Fitopatologija. 2002;92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.
19. Croll D, McDonald BA. Genetinis vietinio prisitaikymo prie patogeninių grybų pagrindas žemės ūkio ekosistemose. Mol Ecol. 2017;26. https://doi.org/ 10.1111/mec.13870.
20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. Rekombinacijos taškų įtaka grybelinio augalo patogeno genomo evoliucijai. Genetika. 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.
21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. Virulentiškumo ir dauginimosi pokyčių palaikymas žemės ūkio augalų patogenų populiacijose. Evol Appl. 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.
22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. Tarprūšiniai genų mainai įveda didelį pasėlių patogeno genetinį kintamumą. Genome Biol Evol. 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.
23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. Grybelinio kviečių patogeno šeimininko specializacija išsivystė dėl plataus chromosomų pertvarkymo. ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.
24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. Mejozė sukelia platų kopijų skaičiaus kitimą ir iškreiptą kviečių patogeno Zymoseptoria tritici papildomos chromosomos paveldėjimą. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.
25. Stephens C, Ölmez F, Blyth H, McDonald M, Bansal A, Burcu Turgay E ir kt. Neseniai pastebimi avirulentiškumo geno AvrStb6 genetinės įvairovės pokyčiai pasaulinėse kviečių patogeno Zymoseptoria tritici populiacijose. Mol augalų patolis. 2021 m. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.
26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Crane CF, Hane JK ir kt. Išbaigtas grybelinio kviečių patogeno Mycosphaerella graminicola genomas atskleidžia dozavimo struktūrą, chromosomų plastiškumą ir slaptą patogenezę. PLoS Genet. 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.
27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. 19-Išskirkite etaloninės kokybės pasaulinį pangenomą grybinių kviečių patogenui Zymoseptoria tritici. BMC Biol. 2020;18. https://doi.org/10.1186/ s12915-020-0744-3.
28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. Kviečių patogeno Zymoseptoria tritici Pangenome analizė atskleidžia labai plastiško eukarioto genomo struktūrinį pagrindą. BMC Biol. 2018;16. https://doi.org/10.1186/ s12915-017-0457-4.
29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A ir kt. Mejozė skatina nepaprastą genomo plastiškumą haploidinio grybelio augalų patogene Mycosphaerella graminicola. PLoS One. 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.
30. Steinberg G. Zymoseptoria tritici ląstelių biologija: patogeninių ląstelių organizavimas ir kviečių infekcija. Grybelinė Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.
31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. Mycosphaerella graminicola patogenezės kviečiuose histologija. Fitopatologija. 1996 m.;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.
32. Rudd JJ, Kanyuka K, Hassani-Pak K, Derbyshire M, Andongabo A, Devon-Shire J ir kt. Kviečių Zymoseptoria tritici infekcijos ciklo transkripto ir metabolitų profiliavimas atskleidžia dvifazę sąveiką su augalų imunitetu, apimančiu skirtingą patogeno chromosomų indėlį ir hemibiotrofinio gyvenimo būdo apibrėžimo pokyčius. Augalų fiziol. 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.
33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM ir kt. Mycosphaerella graminicola transkripcijos pritaikymas prie jos jautraus kviečių šeimininko užprogramuotos ląstelių mirties (PCD). Mol augalų ir mikrobų sąveika. 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.
34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. Kviečių mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės TaMPK3 ir TaMPK6 yra skirtingai reguliuojamos keliais lygiais suderinamos ligos sąveikos su Mycosphaerella graminicola metu. Augalų fiziol. 2008;147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.
35. Friesen TL, Faris JD. Efektoriaus ir taikinio sąveikos apibūdinimas nekrotrofinėse patosistemose atskleidžia šeimininko manipuliavimo tendencijas ir skirtumus. Annu Rev Phytopathol. 2021;59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.
36. Friesen TL, Faris JD, Solomon PS, Oliver RP. Šeimininkui būdingi toksinai: nekrotrofinio patogeniškumo veiksniai. Ląstelių mikrobiolas. 2008;10. https://doi.org/10. 1111/j.{6}}.2008.01153.x.
37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari A ir kt. FPLC ir skysčių chromatografijos masės spektrometrija identifikuoja nekrozę sukeliančius baltymus iš grybelinių kviečių patogeno Zymoseptoria tritici kultūros filtratų. Grybelinė Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.
38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. Didelis pagalbinis genomas ir aukšti rekombinacijos rodikliai gali turėti įtakos grybelinio augalų patogeno Claviceps purpurea pasauliniam pasiskirstymui ir plačiam šeimininkų diapazonui. PLoS One. 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
39. Moolhuijzen PM, Žr. PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN ir kt. Pasaulinis kviečių grybelio patogeno Pyrenophora triticirepentis pangenomas ir efector baltymų struktūrinės homologijos prognozė. Mikrob. Genomika. 2022 m.;8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. Genetinė virulentiškumo ir atsparumo variacija kviečių-Mycosphaerella graminicola kelio sistemoje II. Patogeno izoliatų ir šeimininkų veislių sąveikos analizė. Fitopatologija. 1996 m.;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.
41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R, Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. Genetic variation for virulent and rezistent in the wheat Mycosphaerella graminicola pathosystem I. Sąveika tarp patogenų izoliatų ir šeimininkų veislių. Fitopatologija. 1996 m.;86. https://doi.org/ 10.1094/Phyto-86-200.
42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. Kviečių patogeno Mycosphaerella graminicola pasaulinė genetinė struktūra pasižymi didele branduolių įvairove, maža mitochondrijų įvairove, reguliaria rekombinacija ir genų srautu. Grybelinė Genet Biol. 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.
43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala M, Carteris D, Courbot M, Rudd JJ ir kt. Lyginamosios Zymoseptoria tritici padermių transkriptominės analizės rodo sudėtingus gyvenimo būdo pokyčius ir specifinį transkripcijos profilių kintamumą. Mol. Augalų patolis. 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.
44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. Kviečių patogeno Zymoseptoria tritici ekspresijos profiliavimas atskleidžia genominius transkripcijos modelius ir šeimininkui būdingas reguliavimo programas. Genome Biol Evol. 2014 m.;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.
45. Steinhauer D, Salat M, Frey R, Mosbach A, Luksch T, Balmer D ir kt. Nepakeičiamas sukcinato dehidrogenazės C subvieneto paralogas tarpininkauja nuolatiniam atsparumui SDHI fungicidų poklasiui Zymoseptoria tritici. PLoS Patogas. 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.
46. Marshall R, Kombrink A, Motteram J, Loza-Reyes E, Lucas J, Hammond Kosack KE ir kt. Dviejų augalų LysM efector homologų iš grybelio Mycosphaerella graminicola analizė atskleidžia naujas funkcines savybes ir skirtingą indėlį į kviečių virulentiškumą. Augalų fiziol. 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola sąrašo efector-mediated stealth patogenezė pakerta atpažinimą per cerk1 ir cebip homologus kviečiuose. Mol augalų ir mikrobų sąveika. 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
48. Tian H, MacKenzie CI, Rodriguez-Moreno L, van den Berg GCM, Chen H, Rudd JJ ir kt. Trys Zymoseptoria tritici LysM efektoriai bendrai nuginkluoja chitino sukeltą augalų imunitetą. Mol augalų patolis. 2021;22. https:// doi.org/10.1104/pp.111.176347.
49. Zhong Z, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala M ir kt. Nedidelis išskiriamas Zymoseptoria tritici baltymas yra atsakingas už kviečių veislių, turinčių Stb6 atsparumo geną, avirulentiškumą. Naujasis Phytol. 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari A, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F ir kt. Stresas ir lytinis dauginimasis turi įtakos šilumos patogeno efektoriaus AvrStb6 ir strobilurino atsparumo dinamikai. Natas Genetas. 2018;50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W ir kt. Kviečių receptorių kinazės tipo baltymas Stb6 kontroliuoja genų-genų atsparumą grybelio patogenui Zymoseptoria tritici. Natas Genetas. 2018;50. https://doi.org/ 10.1038/s41588-018-0051-x.
52. Tan KC, Oliveris RP, Solomon PS, Mofat CS. Baltyminiai nekrotrofiniai veiksniai grybelių virulentiškumui. Funct Plant Biol. 2010;37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.
53. Bouton C, King RC, Chen H, Azhakanandam K, Bieri S, Hammond-Kosack KE ir kt. Lapės uodegos mozaikos virusas: virusinis vektorius baltymų ekspresijai grūduose. Augalų fiziol. 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.
54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürnberger T ir kt. MgNLP, vienintelio NPP1 domeno turinčio baltymo, iš grybelinio kviečių lapų patogeno mycosphaerella graminicola, molekulinis apibūdinimas ir funkcinė analizė. Mol augalų ir mikrobų sąveika. 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
55. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S ir kt. Unikalus į atsparumą kviečių ligoms panašus genas reguliuoja efektoriaus sukeltą jautrumą nekrotrofiniams patogenams. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. Numatyti esminiai genai, skirti nustatyti galimus Aspergillus fumigatus narkotikų taikinius. Comput Biol Chem. 2014;50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.
57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. Esminių Aspergillus nidulans genų identifikavimas ir analizė naudojant heterokaryon gelbėjimo techniką. Nat Protoc. 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.
58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton A ir kt. Esminis genų identifikavimas ir vaistų tikslinio prioriteto nustatymas Aspergillus fumigatus. PLoS Patogas. 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.
59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. Išankstinis genetikos metodas atskleidžia nuo šeimininko genotipo priklausomą papildomų chromosomų svarbą grybelinių kviečių patogene Zymoseptoria tritici. MBio. 2017;8. https://doi. org/10.1128/mBio.{6}}.
60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. Streso valdoma perkeliamo elemento de-represijos dinamika ir virulentiškumo raida grybelio patogene. Mol Biol Evol. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.
61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. Nepaprastas genomo nestabilumas ir plačiai paplitę chromosomų pertvarkymai vegetatyvinio augimo metu. Genetika. 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.
62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. Aprangą sudaro priedai: papildomos chromosomos ir kitos nepakeičiamos DNR sritys augalų patogeniniuose grybuose. Mol augalų ir mikrobų sąveika. 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
63. Krishnan P, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D ir kt. Perkeliami elementų įterpimai formuoja genų reguliavimą ir melanino gamybą kviečių grybeliniame patogene. BMC Biol. 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodriguez-Moreno L, Valkenburg DJ, Saleem Batcha R, Wawra S ir kt. Išskirtas LysM efector apsaugo grybelių hifus per nuo chitino priklausomą homodimero polimerizaciją. PLoS Patogas. 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.
65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. Kviečių PR-1 baltymai yra nukreipti į nekrotrofinius patogeno efektorinius baltymus. Augalas J. 2016;88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.
66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. Senovinis antimikrobinis baltymas, kurį kartu pasirinko grybelinis augalų patogenas, skirtas manipuliuoti planta mikobiomu. Proc Natl Acad Sci US A. 2021;118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.
67. Snelders NC, Rovenich H, Petti GC, Rocafort M, van den Berg GCM, Vorholt JA ir kt. Dirvožemyje plintančių grybelinių augalų patogenų manipuliavimas mikrobiomu naudojant efektorinius baltymus. Nat augalai. 2020 m.. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.
68. Rocha RO, Wilson RA. Magnaporthe oryzae nukleozido difosfato kinazė reikalinga metabolinei homeostazei ir redokso sąlygojamam šeimininko įgimtam imuniteto slopinimui. Mol Microbiol. 2020;114. https://doi.org/ 10.1111/mmi.14580
