FOXO reguliuoja antimikrobinių peptidų ekspresiją ir skatina krevečių antibakterinio imuniteto hemocitų fagocitozę
Aug 31, 2023
Abstraktus
Bestuburiai, norėdami atsispirti patogeninei infekcijai, remiasi įgimtu imunitetu, įskaitant humoralinį ir ląstelinį imunitetą. Ankstesni tyrimai parodė, kad šakutės dėžutės transkripcijos faktorius O (FOXO) dalyvauja žinduolių gleivinės imuniniame atsake ir bestuburių žarnyno humoraliniame imuniniame reguliavime. Tačiau ar FOXO dalyvauja reguliuojant bestuburių sisteminį ir ląstelinį imunitetą, lieka nežinoma. Šiame tyrime nustatėme krevečių (Marsupenaeus japonicus) FOXO ir nustatėme, kad normaliose krevetėse jis buvo išreikštas santykinai baziniu lygiu, tačiau krevetėse, kurioms užkrėtė Vibrio anguillarum, jis buvo žymiai padidintas. FOXO atliko svarbų vaidmenį palaikant hemolimfos ir žarnyno mikrobiotos homeostazę, skatindamas Relish, imunodeficito (IMD) transkripcijos faktoriaus, skirto antimikrobinių peptidų (AMP) ekspresijai krevetėse, ekspresiją. Taip pat nustatėme, kad patogeno infekcija suaktyvino FOXO ir sukėlė jo branduolinę translokaciją, sumažindama serino / treonino kinazės AKT aktyvumą. Branduolyje aktyvuotas FOXO tiesiogiai reguliavo tikslinių Amp ir Relish genų ekspresiją prieš bakterinę infekciją. Be to, buvo nustatyta, kad FOXO dalyvauja ląsteliniame imunitete, skatindamas hemocitų fagocitozę, padidindamas fagocitozės receptorių gaudyklės receptoriaus C (Src) ir dviejų mažų GTPazių Rab5 ir Rab7 ekspresiją, kurios yra susijusios su fagosomų judėjimu į lizosomą. citoplazmoje. Apibendrinant, mūsų rezultatai parodė, kad FOXO daro poveikį hemolimfos homeostazei ir žarnyno mikrobiotai, aktyvindamas IMD kelią normaliose krevetėse ir tiesiogiai ar netiesiogiai skatindamas AMP ekspresiją ir sustiprindamas hemocitų fagocitozę prieš patogenus bakterijomis užkrėstose krevetėse. Šis tyrimas atskleidė skirtingas FOXO funkcijas, susijusias su bestuburių gleivinės (vietiniu) ir sisteminiu antibakteriniu imunitetu.
cistanche papildo privalumai – kaip stiprinti imuninę sistemą
Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus
【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Įvadas
Forkhead box transkripcijos faktoriaus O šeimos baltymai (FOXO) dalyvauja įvairiuose kritiniuose organizmų biologiniuose procesuose, įskaitant ląstelių ciklo reguliavimą, pažeistos DNR atstatymą, priešvėžinį imunitetą ir gyvenimo trukmės reguliavimą [1,2]. Žinduoliai turi keturis skirtingus FOXO baltymus (FOXO1, FOXO3, FOXO4 ir FOXO6); tačiau bestuburiai turi tik vieną FOXO, kuris taip pat žinomas kaip Daf-16 Caenorhabditis elegans [3]. FOXO transkripcijos aktyvumą reguliuoja keletas potransliacinių modifikacijų, tokių kaip fosforilinimas, acetilinimas, metilinimas ir ubikvitinacija [4]. Šios modifikacijos turi įtakos FOXO branduolio perkėlimui arba išėjimui iš branduolio ir jo sąveikai su ko-represoriais ir koaktyvatoriais, kurie gali skatinti arba sumažinti FOXO aktyvumą ir tarpininkauti įvairioms jo biologinėms funkcijoms [5, 6]. Po aktyvacijos FOXO dalyvauja daugelyje fiziologinių funkcijų, reguliuodamas įvairių tikslinių genų transkripciją [7]. FOXO aktyvina įvairūs tarpląsteliniai dirgikliai, įskaitant augimo faktorius, citokinus ir hormonus [8]. Augimo signalai, pvz., insulinas arba į insuliną panašus augimo faktorius 1 (IGF{19}}), sąveikauja su insulino kelio receptoriais ir suaktyvina fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) signalus, todėl FOXO fosforilina. serino/treonino kinazė, proteinkinazė B (AKT) [9]. Fosforilintas FOXO perkeliamas iš branduolio į citozolį arba neleidžia jam perkelti iš citozolio į branduolį, kur jis tampa ubikvitinuotas, todėl jį skaido proteasoma [10]. Priešingai, nesant išorinių augimo signalų, PI3K-AKT signalizacijos kelias yra neaktyvus, o nefosforilintas FOXO persikelia į branduolį, skatindamas tikslinio geno transkripciją [11]. FOXO taip pat dalyvauja antibakteriniame ir antivirusiniame bestuburių įgimtame imuniniame atsake [12,13]. Lėtinis FOXO aktyvinimas senstančiame Drosophila žarnyne slopina peptidoglikano atpažinimo baltymo SC2 (neigiamo imunodeficito (IMD) kelio reguliatoriaus) ekspresiją ir pažeidžia žarnyno imuninę homeostazę [14]. FOXO tiesiogiai reguliuoja antimikrobinių peptidų (AMP) genus neužkrėstų Drosophila epitelio audiniuose, reaguodamas į bado stresą, kuris nepriklauso nuo patogenų reaguojančių įgimto imuniteto būdų [15]. Tačiau patogeno infekcija taip pat gali paskatinti enterocitą FOXO patekti į branduolį iš citoplazmos tiesiai į Drosophila žarnas [12]. Nuo FOXO priklausomas AMP reguliavimas taip pat vyksta žinduolių epitelio audiniuose, o tai rodo, kad tai evoliuciškai išsaugota gyvūnams [16]. Keletas tyrimų parodė, kad FOXO aktyvina patogenai arba citokinų stimuliacija, kai atsiranda gleivinės imuninis atsakas [17]. Jų perkėlimą į branduolį ir prisijungimą prie tikslinių genų promotorių skatina mitogeno aktyvuoto baltymo (MAP) kinazės kelias ir slopina PI3K/AKT kelias. FOXO tiksliniai genai apima priešuždegimines signalines molekules, adhezijos molekules ir chemokino receptorius [17]. Lieka neaišku, ar FOXO dalyvauja sisteminiame imuniniame atsake prieš patogenus. AMP ekspresijos prieš patogenus skatinimas yra svarbus bestuburių humoralinio įgimto imuniteto mechanizmas [18]. Drosophila įgimtame imunitete Toll ir IMD keliai yra susiję su AMP ekspresijos reguliavimu, o AMP vaidina svarbų vaidmenį pašalinant invazinius patogenus [19–21]. Panašiai kaip ir vabzdžių imunitetas, vėžiagyvių AMP ekspresijos reguliavime dalyvauja Toll, IMD ir Janus kinazės (JAK)/signalų keitiklis ir transkripcijos (STAT) takų aktyvatorius [22,23]. Reikia išsiaiškinti, ar FOXO gali reguliuoti AMP ekspresiją nepriklausomai nuo Toll, IMD ir JAK / STAT kelių prieš vėžiagyvių patogenų infekciją. Be humoralinio imuniteto, bestuburiai taip pat remiasi ląsteliniu imunitetu, kad atliktų įgimtas imuniteto funkcijas nuo patogeninės infekcijos. Hemocitų sukelta fagocitozė yra vienas iš svarbių ląstelių imuniteto nuo patogeninės infekcijos mechanizmų [24]. Ankstesni tyrimai parodė, kad FOXO{50}}tarpininkaujama autofagija yra būtina natūralių žudikų (NK) ląstelių vystymuisi [25]. Be to, FOXO dalyvauja skatinant neutrofilų bakterinę fagocitozę [26]. Nors vėžiagyviuose nėra specializuotų imuninių ląstelių, tokių kaip NK ląstelės ar neutrofilai, krevečių hemocitai gali sukurti sisteminį įgimtą imunitetą nuo patogeninių bakterijų infekcijos per fagocitozę [27]. Tačiau neaišku, ar FOXO dalyvauja krevečių hemocitų patogeninėje fagocitozėje. Krevečių akvakultūra yra viena iš sparčiausiai augančių gyvulinių baltymų gamybos pramonės šakų pasaulyje ir labai prisidėjo tenkinant visame pasaulyje išaugusį gyvūninių baltymų poreikį. Šiuo metu pasaulinė krevečių produkcija sudaro apie 4,88 mln. tonų, o jų vertė – apie 39 mlrd. USD [28]. Tačiau kartu auginant daug gyvūnų, gyvūnai patiria didelį stresą, o tai palengvina patogenų, įskaitant bakterijas ir virusus, dauginimąsi ir klinikines ligas, dėl kurių pramonė patiria didelių ekonominių nuostolių [29]. Krevečių imuninių mechanizmų tyrimai galėtų suteikti naujų ligų prevencijos ir kontrolės strategijų [30]. Šiame tyrime nustatėme FOXO kurumos krevetėse (Marsupenaeus japonicus). Po numušimo Foxo ekspresijos ir po Vibrio anguillarum iššūkio nustatėme, kad bakterijų pašalinimo gebėjimas ir krevečių išgyvenamumas žymiai sumažėjo. Tolesnis tyrimas parodė, kad FOXO tiesiogiai arba netiesiogiai skatino AMP ekspresiją ir sustiprino krevečių bakterijų fagocitozę. Buvo išanalizuoti galimi FOXO poveikio prieš patogenų infekciją krevetėse mechanizmai.
cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą
Rezultatai
FOXO išreiškiamas baziniu lygiu neužkrėstose krevetėse ir yra padidintas krevetėse, užkrėstose V. anguillarum
Iš M. japonicus hemocitų transkripto sekos mes gavome viso ilgio Foxo cDNR seką (GenBank prisijungimo numeris: MW080526). Domenų palyginimas parodė, kad numatomas FOXO baltymas turi Forkhead (FH) domeną, kuris yra panašus į Homosapiens FOXO, įskaitant FOXO1, FOXO3, FOXO4 ir FOXO6, ir turi panašų AKT fosforilinimą (S1A pav.). Filogenetinės analizės rezultatai parodė, kad FOXO buvo suskirstyti į dvi grupes, įskaitant stuburinius ir bestuburius FOXO, o krevetės FOXO buvo susitelkusios į bestuburių filogenetinio medžio šaką (S1B pav.). Panašiai kaip ir žmogaus FOXO [31], krevetės FOXO turi ekstraląstelinio reguliuojamo kinazės (ERK) fosforilinimo modifikavimo vietas ir CREB Binding Protein (CBP) acetilinimo modifikavimo vietas, tačiau neturi sir tuin 1 (SIRT1) deacetilinimo modifikavimo vietų ir c-JUN N-galo. kinazės (JNK) fosforilinimo modifikacijos vietos (S2 pav.). Polikloniniai antikūnai, atpažįstantys krevečių FOXO, buvo paruošti naudojant FOXO rekombinantinį FH domeną, išreikštą Escherichia coli (1A pav.). FOXO pasiskirstymo audiniuose analizė mRNR ir baltymų lygiuose parodė, kad jis buvo išreikštas visuose tirtuose audiniuose (1B pav.). FOXO ekspresijos trukmė krevečių, užkrėstų V. anguillarum, hemocituose ir žarnyne, buvo analizuojama naudojant qPCR ir Western blot metodą. Rezultatai parodė, kad FOXO buvo sureguliuotas hemocituose ir žarnyne mRNR lygiu (1C ir 1D pav.) ir baltymų lygiu (1E ir 1F pav.). Šie rezultatai rodo, kad FOXO yra susijęs su atsaku į V. anguillarum infekciją, ir paskatino mus ištirti FOXO funkciją krevečių imunitete.
FOXO dalyvauja reguliuojant sveikų krevečių hemolimfos ir žarnyno mikrofloros homeostazę
Norint ištirti FOXO funkciją krevečių hemolimfoje ir žarnyno mikrofloros homeostazėje, buvo atliktas RNR trukdis ir ištirtas bakterijų kiekis. Rezultatai parodė, kad Foxo ekspresija žymiai sumažėjo Foxo-RNAi krevetėse (2A ir 2B pav.). Netikslinis Foxo RNAi poveikis taip pat buvo analizuojamas nustatant kitų Fox šeimos genų (įskaitant Foxk2 ir Foxn3) ekspresiją. Rezultatai parodė, kad Foxo numušimas nesumažino Foxk2 ar Foxn3 ekspresijos lygių (S3A – S3C pav.). Naudodami Western blot ir fluorescencinius imunocitocheminius tyrimus, toliau stebėjome FOXO tarpląstelinį pasiskirstymą krevečių, užkrėstų bakterijomis, žarnyne ir hemocituose po Foxo nutildymo. Rezultatai parodė, kad, palyginti su dsGfp grupe, Foxo-RNAi krevečių FOXO lygis branduolyje žymiai sumažėjo, net jei krevetės buvo užkrėstos V. anguillarum (S3D-S4E' pav.). Visi aukščiau pateikti rezultatai rodo, kad mūsų Foxo RNAi tyrimas gali konkrečiai nutildyti Foxo hemocituose ir žarnyne (įskaitant citoplazmą ir branduolį). Toliau išanalizavome bakterijų kiekį hemolimfoje ir žarnyne po Foxo numušimo krevetėse normaliomis sąlygomis (be bakterijų poveikio). Rezultatai parodė, kad bakterijų skaičius hemolimfoje ir žarnyne žymiai padidėjo po to, kai Foxo ekspresija buvo sėkmingai numušta (2C ir 2D pav.). Toliau išanalizavome Foxo-RNAi krevečių išgyvenamumą be bakterijų poveikio, o rezultatai parodė, kad Foxo-knockdown krevečių išgyvenamumas žymiai sumažėjo, palyginti su kontroline (2E pav.). Norėdami toliau patikrinti šiuos rezultatus, išanalizavome Foxo-RNAi krevečių, gydytų antibiotikais, išgyvenamumą ir rezultatai parodė, kad, palyginti su dsGfp grupe, krevečių be gemalų išgyvenamumas reikšmingai nesumažėjo (2F pav.). Visi rezultatai rodo, kad FOXO vaidina svarbų vaidmenį krevečių in vivo mikrobiotos (įskaitant hemolimfą ir enterinę mikrobiotą) homeostazėje normaliomis sąlygomis.
cistanche papildo privalumai - padidina imunitetą
FOXO dalyvauja hemolimfos ir žarnyno mikrofloros homeostazės reguliavime, skatindamas sveikų krevečių pasimėgavimą ir Amp raišką.
Ankstesni tyrimai rodo, kad sveikose krevetėse cirkuliuojančioje hemolimfoje yra mažas, bet stabilus bakterijų skaičius ir didelis, nors ir pastovus, kiekis bakterijų virškinimo trakte ir imuninės sistemos efektoriai, tokie kaip antimikrobiniai peptidai (AMP), reguliuojami branduolinio faktoriaus kappa B (NF). -κB) kelias ir reaktyviosios deguonies rūšys (ROS), reguliuojamos dvigubos oksidazės (DUOX) keliu, atlieka esminį vaidmenį homeostazės hemolimfoje ir žarnyno mikrobiotoje [32–34]. Norėdami ištirti FOXO dalyvavimo hemolimfos ir žarnyno mikrofloros homeostazės reguliavime normaliomis sąlygomis mechanizmą, pirmiausia nustatėme tarpląstelinį FOXO pasiskirstymą hemocituose ir žarnyne normaliomis sąlygomis. Rezultatai parodė silpną FOXO signalą krevečių hemocitų ir žarnyno ląstelių branduoliuose normaliomis sąlygomis (3A ir 3B pav.), o tai rodo, kad įprastomis sąlygomis krevetėse esanti in vivo mikrobiota buvo aktyvuota šiek tiek FOXO. AMP ekspresiją reguliuoja IMD kelias Drosophila žarnyne [35]. Todėl manėme, kad transkripcijos faktorius Relish gali būti tikslinis FOXO genas. Mes aptikome Relish, IMD kelio transkripcijos faktoriaus, mRNR ekspresiją krevečių hemocituose ir žarnyne po Foxo numušimo. Rezultatai parodė, kad Foxo-knockdown krevetėse Relish ekspresija žymiai sumažėjo (3C ir 3D pav.), o panašūs rezultatai buvo gauti baltymų lygiu (3E ir 3E pav.). Rezultatai rodo, kad FOXO gali skatinti Relish raišką ir suaktyvinti IMD kelią. Norint patvirtinti, kad FOXO dalyvauja hemo limfos ir virškinimo trakto homeostazėje per IMD signalizaciją, buvo gautos krevetės be gemalų (3F pav.) ir aptikta RELISH aktyvacija bei AMP ekspresija. Palyginti su kontroline grupe, FOXO ir RELISH kiekis žarnyno ląstelių ir hemocitų branduoliuose žymiai sumažėjo (3G ir 3H pav.). Tuo tarpu AMP, įskaitant crustinus (CrusI-2 iki 5) ir antilipopolisacharidinius faktorius (Alf A1, B1, C1, D1 ir E1), kuriuos galimai reguliuoja FOXO ir (arba) RELISH, ekspresija buvo patikrinta gemalu. be krevečių, o rezultatai parodė, kad CrusI-3, Alf-B1 ir Alf-C1 ekspresija žymiai sumažėjo krevečių hemocituose ir žarnyne (3I ir 3J pav.). Atsižvelgiant į tai, kad Alf-B1 ir Alf C1 ekspresiją reguliavo IMD kelias [36], šie rezultatai rodo, kad FOXO dalyvauja reguliuojant hemolimfos ir virškinimo trakto homeostazę normaliomis sąlygomis per IMD kelią, kad skatintų raišką. AMP.
1 pav. FOXO buvo padidintas krevetėse, užkrėstose V. anguillarum. (A) FOXO FH domeno rekombinantinė ekspresija E. coli ir Western blot, siekiant nustatyti FOXO, naudojant polikloninius antikūnus prieš FOXO, paruoštus triušiams. 1 juosta, bendri E. coli baltymai su Foxo-pGEX4T-1. 2 juosta, bendri bakterijų baltymai po IPTG indukcijos. 3 juosta, išgrynintas rekombinantinis FOXO. 4 juosta, FOXO neapdorotų krevečių žarnyne buvo aptiktas naudojant Western blot metodą. M, baltymų molekulinės masės žymenys. (B) Foxo pasiskirstymas audiniuose mRNR (viršutinis skydelis) ir baltymų (apatinis skydelis) lygiais buvo aptiktas atitinkamai RT-PGR ir Western blot metodu. ACTB yra -actin santrumpa. (C, D) Foxo mRNR ekspresijos modeliai hemocituose (C) ir žarnyne (D) buvo išanalizuoti naudojant qPCR, naudojant -aktino ir Ef{11}}, kaip endogeninių kontrolinių genų, geometrinį vidutinį ekspresiją. (E, F) FOXO baltymų ekspresijos modeliai hemocituose (E) ir žarnyne (F) buvo nustatyti Western blot metodu. Trijų pakartojimų statistinės analizės rezultatai buvo parodyti apatinėse plokštėse. Western blot juostos buvo skaitmenizuotos naudojant ImageJ programinę įrangą, nuskaitant juostas iš trijų nepriklausomų pakartojimų. Santykiniai FOXO / -aktino ekspresijos lygiai buvo išreikšti kaip vidurkis ± SD, o kontrolinių krevečių vertė buvo nustatyta kaip viena. Klaidų juostos paveikslėlyje rodo SD (trys pakartojimai).
FOXO aktyvuojamas krevetėse veikiant V. anguillarum provokacijai ir dalyvauja patogenų pašalinime iš hemolimfos ir žarnyno
Pranešama, kad FOXO gali būti aktyvuotas stimuliuojant bakterinę ar citokiną ir yra perkeliamas į branduolį, kad reguliuotų tam tikrų tikslinių genų ekspresiją žinduoliuose [17]. Norint nustatyti, ar FOXO buvo suaktyvintas krevetėse, užkrėstose bakterijų, FOXO pasiskirstymas krevečių žarnyne buvo ištirtas naudojant Western blot metodą. Rezultatai parodė, kad FOXO kiekis žarnyno ląstelių citoplazmoje palaipsniui mažėjo nuo 2 iki 4 valandų po V. anguillarum užkrėtimo (4A pav.). Priešingai, FOXO kiekis žarnyno ląstelių branduolyje žymiai padidėjo po užsikrėtimo V. anguillarum (4B pav.). Norint išanalizuoti FOXO vaidmenį sisteminiame imunitete, fluorescencinis imunocitocheminis tyrimas buvo naudojamas FOXO branduolinei translokacijai krevečių hemocituose stebėti praėjus 2 valandoms po V. metinės larum stimuliacijos. Mes nustatėme, kad bakterijų sukelta FOXO perkėlimas į branduolį žymiai padidėjo, tačiau PBS užkrėstose krevetėse akivaizdžių pokyčių nebuvo (4C ir 4C pav.). Norėdami ištirti, ar branduolyje perkeltas FOXO yra susijęs su patogeno klirensu, išanalizavome bakterijų kiekį Foxo-knockdown krevečių hemolimfoje ir žarnyne praėjus 6 valandoms po bakterijų užkrėtimo. Mes nustatėme, kad po Foxo numušimo bakterijų kiekis hemolimfoje ir žarnyne žymiai padidėjo, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (4D pav.). Be to, Foxo-knockdown krevečių, užkrėstų V. anguillarum, išgyvenamumas žymiai sumažėjo, palyginti su kontroliniu (4E pav.). Šie rezultatai parodė, kad FOXO buvo aktyvuotas enterinėse ląstelėse ir hemocituose, ir rodo, kad FOXO dalyvauja vietiniame ir sisteminiame imuniniame atsake prieš bakterinę infekciją.
2 pav. FOXO dalyvauja žarnyno (vietiniame) ir sisteminiame antibakteriniame imuniniame atsake. (A, B) Foxo-RNAi efektyvumas krevečių hemocituose (A) ir žarnyne (B), nustatytas naudojant qPCR (A) ir Western blotting (B). qPCR datos analizė naudojant -aktino ir Ef-1 geometrinę išraišką kaip endogeninius kontrolinius genus. Klaidų juostos rodo SD. (C) Foxo-knockdown krevečių hemolimfinių bakterijų aptikimas naudojant kietą LB kultūrą (trys pakartojimai); dsGfp injekcija buvo naudojama kaip kontrolė. Skiedimo santykis buvo 1:10. (D). Bakterijų skaičius hemolimfoje ir žarnyne Foxo knockdown krevetėse ir dsGfp injekcinėse krevetėse be bakterijų poveikio. (E). Foxo-RNAi krevečių išgyvenamumas be bakterijų. dsGfp injekcija buvo naudojama kaip kontrolė. (F). Foxo-RNAi krevečių, gydytų antibiotikais, išgyvenamumas. dsGfp injekcija buvo naudojama kaip kontrolė. Įprasta: laukinio tipo krevetės negydomos antibiotikais.
3 pav. Bazinis FOXO kiekis persikelia į hemocitų ir žarnyno ląstelių branduolius, skatina Relish ekspresiją ir vėliau aktyvuoja IMD kelią, kad normaliomis sąlygomis reguliuotų hemolimfos ir žarnyno mikrobiotos homeostazę. (A) Imunocitochemija buvo naudojama FOXO tarpląsteliniam pasiskirstymui normalių krevečių hemocituose nustatyti. Mastelio juosta=20 μm. Cy: citoplazma; Nu: Branduolys. (B) Western blot buvo naudojamas FOXO pasiskirstymui tarpląsteliniame normalių krevečių ir V. anguillarum užkrėstų krevečių žarnyno ląstelėse nustatyti. (C) Relish ekspresija mRNR lygiu buvo aptikta krevečių hemocituose po Foxo numušimo qPCR, naudojant geometrinį -aktino ir Ef-1 ekspresijos vidurkį kaip endogeninius kontrolinius genus. (D) Relish ekspresija mRNR lygiu krevečių žarnyne po Foxo numušimo buvo aptikta qPCR, naudojant geometrinį vidutinį -aktino ir Ef-1 ekspresiją kaip endogeninius kontrolinius genus. (E) RELISH lygis buvo aptiktas naudojant Western bloting krevetėse po Foxo numušimo. (E') Trys skydelio E kopijos buvo skaitmenintos naudojant „ImageJ“ programinę įrangą. (F) Krevečių hemolimfos ir žarnyno bakterijų apkrova praėjus 24 valandoms po gydymo antibiotikais. (G) FOXO branduolyje buvo aptiktas naudojant Western blot krevečių hemocituose ir žarnyne praėjus 24 valandoms po gydymo antibiotikais. (H) RELISH branduolyje buvo aptiktas naudojant Western blot krevečių hemocituose ir žarnyne praėjus 24 valandoms po gydymo antibiotikais. (I, J) Amps ekspresija krevečių be gemalų hemocituose (I) ir žarnyne (J) buvo nustatyta qPCR, naudojant -aktiną ir Ef-1 kaip vidinius etaloninius genus. Įprastos krevetės (H2O injekcija) buvo naudojamos kaip kontrolė.
Ankstesni tyrimai parodė, kad FOXO transkripcijos aktyvumą reguliuoja fosforilinimo modifikacija, o serino / treonino kinazė AKT reguliuoja Forkhead transkripcijos faktorių aktyvumą fosforilindama juos ir slopindama jų neaiškią translokaciją [9, 37]. Norėdami ištirti, ar AKT turi įtakos FOXO padidėjimui branduolyje po patogeninių bakterijų infekcijos, pirmiausia nustatėme FOXO kiekį citoplazmoje ir branduolyje Western blot metodu po krevečių Akt numušimo. Rezultatai parodė, kad FOXO kiekis hemocitų branduolyje ir žarnyno ląstelėse žymiai padidėjo po to, kai krevetės Akt ekspresija buvo numušta (5A ir 5B pav.), praėjus 2 valandoms po užsikrėtimo V. anguillarum (5C ir 5C pav.). Norėdami patikrinti eksperimentinius rezultatus, mes taip pat panaudojome imunocitocheminį tyrimą, kad stebėtume FOXO pasiskirstymą tarpląsteliniame krevečių hemocituose po Akt numušimo. Rezultatai parodė, kad FOXO reikšmingai padidėjo hemocitų branduolyje, kai Akt nukrito praėjus 2 valandoms po užsikrėtimo V. anguillarum (5D ir 5D pav.). Norėdami ištirti, ar patogeno infekcija turi įtakos AKT aktyvumui, mes nustatėme AKT fosforilinimo pokyčius po patogeno infekcijos naudojant žmogaus p-AKT (Ser473) antikūną (krevečių AKT fosforilinimo vieta yra Ser486) ir nustatėme, kad fosforilinto AKT lygis žymiai sumažėjo krevečių hemocitai ir žarnos po 30 min. užsikrėtimo V. anguillarum infekcija (5E ir 5F pav.). Šie rezultatai rodo, kad patogeno infekcija gali sumažinti fosforilinto AKT lygį, kuris slopina fermentų aktyvumą ir sumažina AKT gebėjimą fosforilinti FOXO. Nefosforilintas FOXO patenka į branduolį ir sukelia tikslinių genų ekspresiją. paveikslėlyje nurodyti SD.
cistanche ekstraktas
Patogeno infekcija sumažina AKT aktyvumą ir sukelia FOXO branduolio translokaciją
FOXO atlieka imuninę apsaugą nuo invazinių bakterijų, reguliuodamas antimikrobinių peptidų ekspresiją bakterijomis užkrėstose krevetėse
Norėdami ištirti mechanizmą, kuriuo FOXO paveikia atsaką į krevečių bakterinę infekciją, pirmiausia nustatėme imuninius efektoriaus genus, kuriuos reguliuoja FOXO. Po sėkmingo Foxo numušimo krevečių hemocituose ir žarnyne su V. anguillarum užkrėtimu arba be jo, CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 ir Alf-E1 ekspresijos lygiai gerokai sumažėjo nutildytose krevetėse, palyginti su su kontrolinėje grupėje (6A ir 6B pav.). Norėdami toliau patikrinti rezultatus, mes taip pat nustatėme keturių AMP išraišką po Akt numušimo. Rezultatai parodė, kad keturių AMP ekspresija žymiai padidėjo praėjus 6 valandoms po V. anguil larum infekcijos, palyginti su kontroline grupe (6C ir 6D pav.). Palyginti su padidintais AMP (įskaitant Alf-B1 ir Alf-C1) normaliomis sąlygomis (3I ir 3J pav.), V užkrėstose krevetėse taip pat buvo sureguliuotas papildomas AMP genas (CrusI-3, Alf-E1). anguillarum (6A ir 6B pav.). Mūsų ankstesnis tyrimas parodė, kad RELISH skatino Alf-B1 ir Alf-C1 raišką krevetėse [36]. Šie rezultatai rodo, kad FOXO gali tiesiogiai reguliuoti AMP išraišką, pvz., CrusI-3 ir Alf-E1, nepriklausomai nuo IMD signalizacijos kelio. Norint patvirtinti hipotezę, buvo atliktas ChIP tyrimas, siekiant nustatyti, ar FOXO gali prisijungti prie Alf-E1 promotoriaus. Buvo gauta Alf-E1 promotoriaus seka (S4 pav.) ir buvo numatytos FOXO surišimo vietos (6E pav.). ChIP rezultatas parodė, kad FOXO gali prisijungti prie Alf-E1 promotoriaus (6F pav.). Šie rezultatai rodo, kad FOXO taip pat dalyvauja antibakteriniame imunitete, tiesiogiai reguliuodamas AMP ekspresiją krevetėse.
4 pav. FOXO perkeltas į V. anguillarum užkrėstų krevečių branduolį. (A, B) FOXO pasiskirstymo modeliai krevečių, užkrėstų bakterijomis, žarnyno ląstelių citoplazmoje (A) ir branduolyje (B), analizuojami naudojant Western blot metodą (apatinės A ir B plokštės). Western blot juostos buvo skaitmenizuotos naudojant ImageJ programinę įrangą, nuskaitant juostas iš trijų pakartojimų. Santykiniai FOXO / -aktino arba FOXO / Histono 3 ekspresijos lygiai buvo išreikšti kaip vidurkis ± SD, o kontrolinių krevečių vertė buvo nustatyta kaip viena. (C) FOXO branduolinis perkėlimas krevečių hemocituose praėjus 2 valandoms po V. anguillarum užkrėtimas buvo aptiktas naudojant fluorescencinius imunocitocheminius tyrimus. PBS injekcija buvo naudojama kaip kontrolė. Mastelio juosta=20 μm. (C') C skydelio statistinė analizė FOXO ir DAPI dažytų branduolių kolokalizacija hemocituose buvo ištirta WCIF ImageJ programine įranga. (D) Bakterijų skaičius Foxo-knockdown krevečių hemolimfoje ir žarnyne nustatytas po V. anguillarum injekcijos; Kaip kontrolė buvo naudojama dsGfp injekcija į krevetes po bakterijų injekcijos. (E) Foxo-RNAi krevečių, užkrėstų V. anguillarum, išgyvenamumas. dsGfp injekcija buvo naudojama kaip kontrolė.
FOXO skatina hemocitų fagocitozę prieš bakterijas, skatindama SRC ekspresiją
Ankstesni tyrimai pranešė, kad FOXO tiesiogiai sąveikauja su CXCR2 ir CD11b promotoriaus sritimis, kad reguliuotų žinduolių neutrofilų fagocitozę [26]. Norėdami patikrinti, ar FOXO yra susijęs su hemocitų fagocitoze krevečių antibakteriniu imunitetu, skirtingais metodais ištyrėme fagocitų greitį po trukdžių Foxo. Po Foxo numušimo, Foxo numušimo grupės fagocitų dažnis ir fagocitų indeksas buvo žymiai mažesni nei kontrolinės grupės (dsGfp) (7A ir 7A pav.). Mes taip pat naudojome srauto citometriją, norėdami kiekybiškai įvertinti hemocitų fagocitų greitį po Foxo nutildymo. Rezultatai parodė, kad Foxo-RNAi grupės fago citozės greitis taip pat žymiai sumažėjo, palyginti su dsGfp grupe (7B ir 7B pav.). Norėdami dar labiau patvirtinti šiuos rezultatus, mes taip pat ištyrėme fagocitų greitį po Akt numušimo. Rezultatai parodė, kad, palyginti su kontroline grupe, fagocitų dažnis ir fagocitų indeksas žymiai padidėjo (7C ir 7C pav.). Šie rezultatai rodo, kad FOXO skatina krevečių hemocitų fagocitozę. Norėdami ištirti, kaip FOXO sustiprina krevečių hemocitų fagocitozę, aptikome anksčiau praneštų genų, susijusių su krevečių fagocitoze, ekspresiją. Pranešama, kad B klasės (SRB) ir C klasės (SRC) receptoriai yra susiję su hemocitų fagocitoze [38, 39]. Mes nustatėme, kad Src, o ne Srb, mRNR ekspresijos lygis žymiai sumažėjo nutildžius Foxo hemocituose ir žarnyne (7D ir 7E pav.), o Src ekspresija žymiai padidėjo po Akt numušimo krevetėse (7F pav.). Panašūs rezultatai gauti baltymų lygiu (7G ir 7G pav.). Šie rezultatai rodo, kad FOXO skatina krevečių patogenų hemocitų fagocitozę, skatindama SRC ekspresiją.
FOXO skatina RAB5 ir RAB7 ekspresiją krevečių fagocitozės metu
Ankstesni tyrimai parodė, kad mažos GTPazės RAB5 ir RAB7 yra pagrindiniai naujai endocituotų pūslelių transportavimo į ankstyvąsias ir vėlyvąsias endosomas reguliatoriai [40]. RAB5 yra pagrindinis pradinių sintezės įvykių reguliatorius ir ankstyvųjų endosomų žymuo [41, 42]. RAB7 reikalingas vėlyvajai fagosomų ir lizosomų sintezei ir yra vėlyvųjų endosomų žymuo [43]. Norėdami ištirti, ar RAB5 ir RAB7 yra susiję su patogenų pašalinimu iš krevečių, pirmiausia išanalizavome Rab5 ir Rab7 ekspresijos modelius ir nustatėme, kad dvi mažos GTPazės buvo sureguliuotos krevetėse, užkrėstose bakterijomis (S5A – S5D pav.). Toliau išanalizavome Rab5-RNAi ir Rab7-RNAi krevečių išgyvenamumą po bakterijų užkrėtimo, ir rezultatai parodė, kad Rab5 ir Rab7 numuštų krevečių išgyvenamumas žymiai sumažėjo, palyginti su kontroliniu ( S5E ir S5F pav.). Šie rezultatai rodo, kad RAB5 ir RAB7 atlieka svarbias atsparumo bakterijų patogenams funkcijas. Norėdami ištirti, ar RAB5 ir RAB7 yra susiję su FOXO sukelta fagocitoze, ištyrėme Rab5 ir Rab7 mRNR ekspresijos lygius po trukdžių Foxo ekspresijai krevetėse. Rezultatai parodė, kad Rab5 ir Rab7 ekspresijos lygiai žymiai sumažėjo hemocituose ir žarnyne (8A ir S6A pav.). kadangi Rab5 ir Rab7 ekspresija žymiai padidėjo po Akt numušimo krevetėse (8B pav.). Siekiant dar labiau patvirtinti aukščiau pateiktus rezultatus, taip pat buvo aptiktas RAB5 ir RAB7 baltymų kiekis Foxo arba Akt knockdown krevetėse. Palyginti su dsGfp injekcijų grupe, RAB5 ir RAB7 lygiai taip pat žymiai sumažėjo Foxo-knockdown krevečių hemocituose ir žarnyne, tačiau žymiai padidėjo Akt-knockdown krevečių, praėjus 2 valandoms po V. anguillarum stimuliacijos (8C–8D pav.; S6B). ir S6B'). Šie rezultatai rodo, kad RAB5 ir RAB7 dalyvauja krevečių hemocitų fagų citozėje, kurią sukelia FOXO. Be to, mes nustatėme, kad RAB5 ir RAB7 buvo lokalizuoti kartu su V. anguillarum krevečių hemocituose (9 pav.). Apibendrinant, rezultatai rodo, kad RAB5 ir RAB7 yra susiję su FOXO sukelta krevečių fagocitoze.
5 pav. Patogeno infekcija sumažino AKT aktyvumą, o tai skatino FOXO branduolio translokaciją krevečių hemocituose ir enterinėse ląstelėse. (A, B) Akt-RNR efektyvumas krevečių hemocituose ir žarnyne, nustatytas qPCR, naudojant geometrinę vidutinę -aktino ir Ef-1 ekspresiją kaip endogeninius kontrolinius genus (A) ir Western bloting (B). (C) FOXO kiekis citoplazmoje ir žarnyno branduolyje iš Akt-knockdown krevečių buvo ištirtas Western blot metodu. dsGfp buvo naudojamas kaip kontrolė. (C') (C) grupės statistinė analizė. „ImageJ“ programinė įranga buvo naudojama juostoms skaitmeninti, nuskaitant tris pasikartojančias nuotraukas. (D) FOXO branduolinė translokacija Akt-knockdown krevečių hemocituose buvo aptikta praėjus 2 valandoms po V. anguillarum užkrėtimo naudojant fluorescencinį imunocitocheminį tyrimą. dsGfp buvo naudojamas kaip kontrolė. Mastelio juosta=20 μm. (D') (D) statistinė analizė. WCIF ImageJ programinė įranga buvo naudojama bendrai lokalizacijai analizuoti anti-FOXO (žalia) ir DAPI dažyto branduolio (mėlyna) fluorescencijos intensyvumo santykį hemocituose po ekspozicijos vertės fiksavimo. (E, F) Fosforilinto AKT (p-AKT) kiekio pokytis V. anguillarum užkrėstų krevečių hemocituose (E) ir žarnyne (F). Apatinėse plokštėse yra skaitmeniniai (E) ir (F) skaičiai, pagrįsti atitinkamai Western blot ir statistinės analizės juostomis.
Cistanche arbata
Diskusija
FOXO, kaip labai svarbus transkripcijos faktorius, dalyvauja daugelyje fiziologinių ir metabolinių funkcijų [44,45]. Šiame tyrime mes nustatėme FOXO iš krevečių (M. japonicus) ir nustatėme, kad jis dalyvauja hemolimfos ir enterinės mikrobiotos homeostazės reguliavime, reguliuodamas AMP ekspresiją normaliomis sąlygomis. FOXO gali būti aktyvuotas dėl krevečių bakterinės infekcijos ir perkeltas į branduolį, kur jis tiesiogiai ir netiesiogiai (IMD keliu) reguliuoja AMP ekspresiją. FOXO padidino su fagocitoze susijusių genų, tokių kaip SRC ir mažos GTPazės, RAB5 ir RAB7, ekspresiją, kad skatintų hemocitų fagocitozę prieš patogenus. Todėl krevetės FOXO vaidina skirtingą vaidmenį sisteminiame ir vietiniame (enteriniame) imuniniame atsake prieš patogenus (10 pav.). Palyginti su žmogaus FOXO, krevetės FOXO turi santykinai konservuotą aminorūgščių seką ir AKT fosforilinimo vietas; tačiau antroji krevečių FOXO AKT fosforilinimo vieta yra treoninas, o ne serinas. FOXO AKT fosforilinimas kontroliuoja FOXO branduolinį ir citoplazminį transportavimą [9]. Šiame tyrime mes nustatėme, kad AKT yra susijęs su FOXO branduolinio patekimo kontrole. Po V. anguillarum infekcijos fosforilinto AKT lygis buvo reikšmingai sumažėjęs, o tai rodo, kad patogenais užkrėstose krevetėse sumažėjo AKT aktyvumas, todėl padidėjo FOXO branduolio sulaikymas arba branduolio translokacija, o vėliau sukelta tikslinių genų ekspresija. pvz., Relish ir Amp, kad atsispirtų patogeninei infekcijai. Ankstesni tyrimai parodė, kad FOXO dalyvauja Drosophila žarnyno mikrofloros homeostazėje, slopindamas peptidoglikano atpažinimo baltymo SC2 (neigiamo IMD kelio reguliatoriaus) ekspresiją, kad suaktyvintų AMP ekspresijos kelią [14]. RELISH buvo pranešta kaip pagrindinis FOXO tikslinis genas kontroliuojant hipoksijos toleranciją Drosophila [46]. Kaip ir kitų gyvūnų, krevečių virškinimo trakte yra gana didelė ir pastovi mikrobiota. Vis daugiau įrodymų taip pat atskleidžia, kad kai kurių sveikų vandens bestuburių, įskaitant krevetes, hemolimfoje taip pat yra stabilus bakterijų kiekis [47]. Mūsų ankstesnis tyrimas parodė, kad C tipo lektinas dalyvauja hemolimfos mikrobiotos homeostazės reguliavime, palaikydamas AMP ekspresiją [34], tačiau nežinome, kokie signalų keliai yra susiję su AMP ekspresijos reguliavimu. Čia mūsų rezultatai rodo, kad FOXO dalyvauja hemolimfos ir enterinės mikrofloros homeostazės reguliavime per IMD signalus normaliomis sąlygomis. Neužkrėstose krevetėse Foxo numušimas žymiai sumažino Relish ekspresiją, o krevečių išgyvenamumas labai sumažėjo, net ir be bakterinės infekcijos. Įprastų krevečių ląstelių branduolyje taip pat radome nedidelį kiekį FOXO. Todėl manome, kad FOXO dalyvauja hemolimfos ir enterinės floros homeostazės reguliavime normaliomis sąlygomis skatindamas Relish ekspresiją ir po to sustiprindamas AMP ekspresiją IMD keliu. Šie rezultatai rodo, kad FOXO dalyvauja vietiniame ir sisteminiame imunitete, skatindamas krevečių hemolimfos ir virškinimo trakto mikrobiotos homeostazę. Humorinis imunitetas vaidina lemiamą vaidmenį atsparumui patogenų infekcijai atvirkštiniu greičiu gaminant AMP bateriją [21,48]. Humoralinis atsakas apima indukuojamą AMP sintezę ir sekreciją, kurios išskiriamos į hemolimfą kaip sisteminis atsakas arba į epidermio paviršių arba virškinamojo trakto ertmę kaip vietinis atsakas [19]. AMP ekspresiją daugiausia reguliuoja Toll/Dif ir IMD/Relish signalizacijos keliai vaisinėse muselėse [49]. Šiuo metu krevetėse buvo nustatytos kelios AMP šeimos, įskaitant crustinus, anti-lipopolisacharidinius faktorius (Alfs) ir penaidinus [50]. Šis tyrimas parodė, kad FOXO gali tiesiogiai arba netiesiogiai (per IMD/Relish signalizaciją) reguliuoti AMP, įskaitant CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 ir Alf-E1, raišką. Manėme, kad žemas FOXO aktyvavimas krevečių hemocituose ir žarnyne normaliomis sąlygomis gali reguliuoti pagrindinį tikslinį Foxo geną, ty Relish, palaikyti in vivo mikrobiotos homeostazę. Infekcijos metu įsiveržę patogenai suaktyvina FOXO, kurio dauguma perkeliama į branduolį, kur, be Relish, reguliuoja daugiau tikslinių genų, įskaitant kai kuriuos AMP, tokius kaip Alf-E1 ir CrusI{31}}. Apskritai, FOXO dalyvauja reguliuojant hemolimfos ir žarnyno mikrobiotos homeostazę sveikose krevetėse, aktyvuodama bazinio lygio IMD signalizaciją hemolimfoje ir virškinimo trakte. Patogeninė infekcija suaktyvina FOXO mažindama AKT aktyvumą ir tiesiogiai bei netiesiogiai skatina AMP raišką sisteminiame imunitete ir vietiniame (žarnyno) imunitete. Fagocitozė yra nuo receptorių priklausomas, nuo aktino ir ATP priklausomas reiškinys, kurį sukelia dalelių arba patogenų prisijungimas prie specifinių citomembranų receptorių, ir yra svarbus imuninis procesas, per kurį šeimininkas gali apsisaugoti nuo patogenų [24]. Mažos GTPazės, tokios kaip RAB5 ir RAB7, dalyvauja nuolatiniame membranos remodeliavime ir vezikulų sraute fagocitozėje. Ankstesnis tyrimas parodė, kad krevečių receptoriai SRB ir SRC dalyvauja hemocitų fagocitozėje kaip receptoriai [38, 39]. Šiame tyrime mes nustatėme, kad po Foxo numušimo Src ekspresija žymiai sumažėjo, o hemocitų fagocitozės greitis žymiai sumažėjo, o tai rodo, kad Src yra tikslinis FOXO genas ir kad FOXO dalyvauja SRC sukeltoje patogeninių bakterijų fagocitozėje. FOXO taip pat galėtų skatinti dviejų mažų GTPazių, RAB5 ir RAB7, ekspresiją. Šios mažos GTPazės dalyvauja nuosekliame ankstyvųjų ir vėlyvųjų fagosomų pernešime ir yra pagrindiniai veiksniai, lemiantys jas [51]. Fagosomos migruoja iš ląstelės periferijos į tarpląstelinį regioną, o transportavimo metu RAB5 pakeičiamas RAB7, o galutinės prekės transportuojamos į lizosomą skaidymui [52,53]. Mes taip pat nustatėme, kad RAB5 ir RAB7 gali lokalizuotis kartu su patogenais hemocituose, o tai rodo, kad patogenai buvo fagocituojami krevečių hemocitų, praeinant per ankstyvąsias ir vėlyvąsias fagosomas, kol galiausiai suskaidomi lizosomose. Todėl FOXO dalyvauja ląstelių imuniniame atsake, skatindamas hemocitų fagocitozę. Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad FOXO ne tik dalyvauja mikrobiotos homeostazės reguliavime normaliomis sąlygomis, bet ir patogeninių bakterijų klirensu užkrėstose krevetėse, skatindamas AMP ekspresiją ir hemocitų fagocitozę.
6 pav. FOXO atlieka savo antibakterinį vaidmenį krevetėse, reguliuodamas AMP ekspresiją. (A, B) Amps ekspresija Foxo-knockdown krevečių hemocituose (A) ir žarnyne (B), nustatyta qPCR, naudojant -aktino ir Ef-1 geometrinę išraišką kaip endogeninius kontrolinius genus; Kaip kontrolė buvo naudojama dsGfp injekcija į krevetes. Duomenys statistiškai analizuoti naudojant Mann-Whiteny U testą. (C, D) Amps ekspresija Akt knockdown krevečių hemocituose (C) ir žarnyne (D) buvo ištirta qPCR, naudojant -aktino ir Ef-1, kaip endogeninių kontrolinių genų, geometrinį vidutinį ekspresiją; Kaip kontrolė buvo naudojama dsGfp injekcija į krevetes. Reikšmingi skirtumai buvo analizuojami naudojant vienpusę ANOVA. (E) Numatytų FOXO surišimo vietų Alf-E1 promotoriuje schema. (F) ChIP ir RT-PCR buvo naudojami FOXO prisijungimui prie Alf-E1 promotoriaus sekos aptikti naudojant pradmenis (Alf-E1-F ir Alf-E1-R, 1 lentelė). RT-PGR taip pat buvo naudojamas amplifikuoti Alf-E1 koduojančią sritį RT-PCR pradmenimis (Alf-E1-RT-F ir Alf-E1-RT-R. 1 lentelė), naudojant ChIP. gavo DNR kaip šabloną. IgG antikūnas buvo naudojamas kaip kontrolė, o normalus genomo DNR amplifikuotas fragmentas buvo naudojamas tikslinei juostai patvirtinti.
7 pav. FOXO sustiprina krevečių patogenų hemocitų fagocitozę, skatindamas SRC ekspresiją. (A) V. anguillarum hemocitų fagocitozė, pastebėta naudojant fluorescencinį imunocitocheminį tyrimą fluorescenciniu mikroskopu. V. anguillarum buvo paženklintas FITC (žalia spalva), o ląstelių branduoliai buvo nudažyti DAPI (mėlyna). Raudona rodyklė rodo fagocitinius hemocitus. Mastelio juosta=20 μm. (A') Foxo-knockdown krevečių fagocitų greičio ir fagocitų indekso statistinė analizė. dsGfp injekcijos grupė buvo naudojama kaip kontrolė. Kiekviename eksperimente fluorescenciniu mikroskopu buvo suskaičiuoti penki šimtai hemocitų. Duomenys statistiškai analizuoti Stjudento t-testu. (B) Hemocitų bakterinė fagocitozė, analizuojama naudojant srauto citometriją. Fagocituoti hemocitai, kuriuose yra bakterijų (R2), buvo atskirti nuo nefagocituotų hemocitų (R3), remiantis pažymėtų bakterijų hemocituose fluorescenciniu signalu, naudojant IDEAS Application v6.0 programinę įrangą. (B') Hemocitų fagocitų greitis, pagrįstas srauto citometrijos duomenimis. Kiekvienai analizei buvo suskaičiuoti trys tūkstančiai hemocitų ir atlikti trys pakartojimai. dsGfp grupė buvo naudojama kaip kontrolė. (C) V. anguillarum hemocitų fagocitozė Akt knockdown krevetėse stebima fluorescenciniu mikroskopu. Mastelio juosta=10 μm. (C') Statistinė fagocitų skaičiaus ir fagocitų indekso analizė, pagrįsta (C) skydelio duomenimis. (D) Srb ir Src mRNR ekspresijos lygis hemocituose iš Foxo knockdown krevečių, analizuojamas qPCR, naudojant geometrinį -aktino ir Ef{11}} ekspresijos vidurkį kaip endogeninius kontrolinius genus. dsGfp injekcija buvo naudojama kaip kontrolė. (E) Srb ir Src mRNR ekspresija Foxo-RNAi krevečių žarnyne, analizuota qPCR, naudojant geometrinę vidutinę -aktino ir Ef{14}} ekspresiją kaip endogeninius kontrolinius genus. (F) Src mRNR ekspresija Akt-RNAi krevečių hemocituose, analizuota qPCR, naudojant geometrinį vidutinį -aktino ir Ef{17}} ekspresijos vidurkį kaip endogeninius kontrolinius genus. (G) SRC baltymų kiekis Foxo-RNAi arba Akt-RNAi krevečių hemocituose, analizuojamas naudojant Western blot metodą. dsGfp injekcija naudojama kaip kontrolė. (G') Statistinė analizė, pagrįsta trijų (G) grupės pakartojimų duomenimis.
medžiagos ir metodai
Etikos pareiškimas
Visi eksperimentai su gyvūnais buvo atlikti laikantis Kinijos nacionalinių direktyvų (GB 14922.2–2011 ir GB 14925–2010). Tyrimo eksperimentai su triušiais, skirti paruošti antikūnus, buvo atlikti pagal Šandongo universiteto gyvybės mokslų mokyklos (SYDWLL-2021-54) Gyvūnų priežiūros ir gerovės komiteto patvirtintus protokolus. Patvirtinimas pagal krevečių naudojimo mūsų tyrime taisykles nebuvo būtinas, nes mūsų tyrime buvo naudojamas ribotas įprastų krevečių, kurias dažnai vartoja platesnė bendruomenė, skaičius.
Gyvūnai
Sveikos krevetės (Marsupenaeus japonicus), sveriančios apie 6–10 g, buvo gautos iš Kinijos Šandongo provincijos Čingdao vandens produktų rinkos. Prieš eksperimentą krevetės buvo auginamos mažiausiai 1 dieną krevečių auginimo sistemoje su gazuotu jūros vandeniu 23–25 °C temperatūroje, kad priprastų prie naujos aplinkos.
8 pav. RAB5 ir RAB7 dalyvauja krevečių hemocitų fagocitozėje, kurią sukelia FOXO. (A, B) qPCR buvo naudojamas Rab5 ir Rab7 mRNR ekspresijos lygiams analizuoti Foxo-knockdown krevečių (A) ir Akt-knockdown krevečių (B) hemocituose su bakterine infekcija ir be jos. qPCR naudojo geometrinę vidutinę -aktino ir Ef-1 ekspresiją kaip endogeninius kontrolės genus. (C) RAB5 ir RAB7 baltymų kiekis Foxo-knockdown krevečių hemocituose praėjus 2 valandoms po V. anguillarum užkrėtimo, nustatytas naudojant Western blot metodą. (C') Statistinė analizė, pagrįsta trijų (C) grupės pakartojimų duomenimis. (D) Baltymų lygis RAB5 ir RAB7 Akt-knockdown krevečių hemocituose 2 val. po V. anguillarum užkrėtimo, nustatytas naudojant Western blot metodą. (D') Statistinė analizė, pagrįsta trijų (D) grupės pakartojimų duomenimis.
Bioinformatinė analizė
Foxo viso ilgio cDNR seka buvo gauta iš M. japonicus (BGI, Šendženas, Kinija) hemocitų ir žarnyno transkripcijos tomo sekvenavimo. Atviras Foxo skaitymo rėmelis (ORF) buvo sustiprintas naudojant pradmenų porą (Foxo-EX-F ir Foxo-EX-R; 1 lentelė), kad būtų patvirtinta seka. Atitinkama cDNR buvo konceptualiai išversta, norint gauti išvestą baltymų seką naudojant ExPASy-Translation įrankį (//cn.expasy.org/). Panašumo analizė buvo atlikta naudojant BLAST (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), o domeno architektūros numatymas buvo atliktas naudojant SMART (//smart.emblheidelberg.de). Naudojant MEGA 6.0 programą buvo sukurtas skirtingų rūšių FOXO filogenetinis medis [54].
9 pav. RAB5 ir RAB7 lokalizuojasi kartu su V. anguillarum. RAB5 ir RAB7 lokalizavimas kartu su FITC pažymėtu V. anguillarum krevečių hemocituose, analizuojamas naudojant fluorescencinį imunocitocheminį tyrimą. Bakterijos buvo paženklintos FITC (žalia) ir sušvirkštos į krevetes. Hemocitai buvo surinkti iš penkių krevečių praėjus 30 min. ir 1 val. po bakterijų injekcijos ir inkubuojami su anti-RAB5 arba anti-RAB7 antikūnais. Antrinis antikūnas buvo antitriušio IgG Alexa{13}} (raudona). Branduoliai buvo nudažyti DAPI (mėlyna). Bendra lokalizacija hemocituose rodoma baltomis rodyklėmis. Mastelio juosta=10 μm.
10 pav. Scheminis FOXO dalyvavimo krevečių vietiniame ir sisteminiame įgimtame imunitete vaizdavimas. (A) Neinfekuotomis sąlygomis FOXO palaiko hemolimfos ir žarnyno mikrobiotos homeostazę, skatindamas Relish ir vėliau AMP ekspresiją. (B) Užkrėstomis sąlygomis AKT fosforilinimas sumažėja dėl patogeno infekcijos, todėl branduolyje padidėja FOXO kiekis. FOXO tiesiogiai skatina Relish ir AMP ekspresiją, kad pašalintų invazinius patogenus; kita vertus, FOXO skatina patogenų fagocitozę per SRC sukeltą fagocitozės kelią.
Iššūkis bakterijoms ir mėginių paėmimas
Vibrio anguillarum (ATCC 43305), gautas iš Šandongo universiteto Jūrų koledžo (Wei hai, Kinija) ir dabar saugomas mūsų laboratorijoje. V. anguillarum buvo kultivuojamas per naktį 37 ˚C temperatūroje LB terpėje ir antrą dieną pakartotinai kultivuojamas 4 valandas pasėjus santykiu 1:100. Bakterijos logaritminėje augimo fazėje buvo surinktos centrifuguojant 5000 x g 5 minutes 4 °C temperatūroje ir du kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl ir 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4). V. anguillarum resuspenduotas fosfatiniu buferiniu tirpalu krevetėms užkrėsti. Maždaug 2 × 107 kolonijas formuojančių vienetų (CFU) / krevetės buvo sušvirkšti į kiekvienos krevetės pilvą naudojant mikrošvirkštą. Kontrolinei grupei buvo sušvirkštas toks pat kiekis PBS. Hemocitai, širdis, hepatokasa, žiaunos, skrandis ir žarnos buvo paimti iš mažiausiai trijų krevečių RNR ir baltymų ekstrahavimui. Hemocitams surinkti hemolimfa buvo ištraukta iš ventralinio sinuso, naudojant švirkštą, pripildytą 0, 8 ml antikoaguliantų buferio (10% natrio citrato), o po to greitai centrifuguojama 700 × g 8 minutes 4 ° C temperatūroje hemocitams izoliuoti.
RNR ir baltymų ekstrakcija bei cDNR sintezė
Visa RNR buvo išgauta iš krevečių hemocitų ir skirtingų organų naudojant TRIzol (ET101, Transgenas, Pekinas, Kinija). Baltymai iš skirtingų organų buvo ekstrahuoti naudojant radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lizės buferį (P0013B, Beyotime, Jiangsu, Kinija). Pirmosios krypties cDNR sintezė buvo atlikta naudojant cDNA sintezės rinkinį (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vankuveris, Kanada), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis.
1 lentelė. Šiame tyrime naudotų pradmenų sekos.
MasterMix; Applied Biological Materials – ABM, Vankuveris, Kanada), vadovaudamiesi gamintojo instrukcijomis.
Rekombinantinė ekspresija ir antikūnų paruošimas
Foxo cDNR seka buvo amplifikuota atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandinine reakcija (RT-PCR), naudojant pradmenis Foxo-EX-F ir Foxo-EX-R (1 lentelė). Išgryninti PGR produktai buvo suardomi naudojant restrikcijos fermentus ir surišti į plazmidę pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, JAV). ir sukonstruotos plazmidės buvo transformuotos į Escher ichia coli Rosseta (DE3) ląsteles. Baltymų ekspresija buvo sukelta naudojant 1 mM izopropil- - D-tio-galaktopiranozido 37 °C temperatūroje. Rekombinantiniams baltymams buvo atlikta afininė chromatografija, naudojant glutationo (GST) dervą (C600031, BBI, Šanchajus, Kinija), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. Triušio antiserumai prieš FOXO buvo paruošti pagal anksčiau aprašytą metodą [55].
Western blotingas
Baltymai, ekstrahuoti iš skirtingų organų ar hemocitų, buvo atskirti naudojant 10% natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezę (SDS-PAGE). SDS-PAGE gelių baltymai buvo perkelti į celiuliozės nitrato membraną, naudojant pernešimo buferį (25 mM Tris-HCl, 20 mM glicino, 0,037 % mM SDS ir 20 % etanolio). ir inkubuojamas 5% nugriebto pieno arba 3% galvijų serumo albumino (BSA) Tris buferiniame fiziologiniame tirpale (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,0) 1 valandą švelniai purtant kambario temperatūroje. Tada membranos buvo inkubuojamos su pirminiu antiserumu: Anti-FOXO praskiedimu 1:100, anti-RAB5 - 1:25, anti-Rab7 - 1:25, anti-beta aktinu (ACTB) - 1:250 (paruošta mūsų laboratorijoje). ); Histono-3 polikloniniai antikūnai (A2348, ABclonal, Uhanas, Kinija, 1:2500); anti-fosforilintų (p)-AKT polikloninių antikūnų (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, China, 1:500) ir švelniai suplakti per naktį 4 °C temperatūroje. Tris kartus nuplovus TBST (į TBS pridėta 0,1 % Tween-20), membranos buvo inkubuojamos su antriniu antikūnu (ZB2308 ZSGB-Bio, Pekinas, Kinija, 1:5, 000) arba ( ZB2301 ZSGB-Bio, Pekinas, Kinija, 1:5, 000) 3 val. kambario temperatūroje, švelniai purtant. Imunoreaktyvių baltymų juostos buvo sukurtos naudojant nitrotetrazolio mėlynojo chlorido (A610379, BBI) ir P-toluidino druskos (A610072, BBI) tirpalą tamsiomis sąlygomis arba naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją (ECL). -aktinas arba Histonas-3 buvo naudojami kaip nuorodas.
Audinių pasiskirstymas ir ekspresijos modeliai krevetėse, kurias užkrėtė bakterijos
Foxo / FOXO pasiskirstymas audiniuose hemocituose, širdyje, žiaunose, skrepliuose, skrandyje ir žarnyne buvo analizuojamas naudojant RT-PGR su pradmenimis Foxo-F ir Foxo-R (1 lentelė) ir Western blot metodu su anti-FOXO antikūnais, atitinkamai. PGR procedūra susideda iš pradinės inkubacijos 94 °C temperatūroje 3 min.; po to 35 ciklai 94 ˚C 30 s, 50 ˚C 30 s ir 72 ˚C 30 s; po to 72˚C 10 min. PGR produktai buvo analizuojami naudojant agarozės gelio elektroforezę (1,5 % agarozės). Kaip vidinė kontrolė buvo naudojamas -aktino genas (-actin-F ir -actin-R; 1 lentelė). Foxo/FOXO ekspresijos laike modeliai, esant RNR ir baltymų lygiams krevetėse, užkrėstose V. anguillarum, buvo analizuojami naudojant kiekybinę realaus laiko PGR (qPCR) terminiame cikleryje (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Vokietija) ir Vakarų blotavimas, atitinkamai. qPCR procedūra apėmė: 95˚C 10 min.; 40 ciklų esant 95 ˚C 10 s ir 60 ˚C 50 s; ir tada lydymosi laikotarpis nuo 65 ˚C iki 95 ˚C. Foxo ekspresijos pro failai buvo sukurti naudojant 2-ΔΔCT metodą [56], normalizuojant dviejų vidinių kontrolės genų – aktino ir Ef-1 geometrinį vidurkį. Pradmenų poros efektyvumas qPCR buvo analizuojamas taikant MIQE metodą [57] su logaritminiu kDNR mišinio praskiedimu 10- kartus, kad būtų sukurta tiesinė standartinė kreivė.
Branduolinių ir citoplazminių baltymų išskyrimas
Žarnyno audinys buvo išpjaustytas iš krevečių ir tris kartus plaunamas PBS. Baltymų ekstrahavimas buvo atliktas naudojant branduolinį ir citoplazminį baltymų ekstrahavimo rinkinį (R0050, Solarbio, Pekinas, Kinija), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. Baltymų ekstrakcijai buvo naudojamos mažiausiai trys krevetės, kad būtų pašalinti individualūs skirtumai.
RNR trukdžių tyrimas
Norėdami analizuoti genų funkciją, atlikome RNR trukdžių (RNAi) tyrimus. Kelios pradmenų poros, turinčios T7 promotoriaus seką (Foxo-RI-F ir Foxo-RI-R; Rab5-RI-F ir Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F ir Rab7 -RI-R; Akt-RI-F ir Akt-RI-R. 1 lentelė) buvo sukurti taip, kad sustiprintų dsRNR sintezės šablonus. Naudodami T7 RNR polimerazę (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV) ir cDNR šabloną, susintetinome dsRNR fragmentus. Dvigubos grandinės žalias fluorescencinis baltymas dsGfp RNR buvo kontrolė, kuri buvo amplifikuota naudojant Gfp-RI-F ir Gfp -RI-R (1 lentelė) kaip pradmenis dsGfp sintezei. Tada dsRNR fragmentai (50 ug/kiekvienas) buvo suleisti į M. japonicus pilvo segmentą naudojant mikrošvirkštą ir po 12 valandų buvo atlikta antra injekcija naudojant tą pačią dozę. RNR trukdžių efektyvumas buvo analizuojamas naudojant kiekybinę realaus laiko atvirkštinės transkripcijos PGR (qRT-PCR, apimančią atvirkštinę RNR transkripciją, kad susidarytų cDNR, kuri vėliau buvo naudojama kaip šablonas qPCR tyrime) arba Western blot 24 valandas po antrosios injekcijos. -aktinas buvo naudojamas kaip vidinė nuoroda.
Nuorodos
1. Calnan DR, Brunet A. FoxO kodas. Onkogenas. 2008 m.; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.
2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS ir kt. DNR atstatymo kelias, skatinamas šakės galvutės transkripcijos faktoriaus FOXO3a per Gadd45 baltymą. Mokslas. 2002 m.; 296 (5567): 530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.
3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Tegyvuoja FOXO: FOXO baltymų vaidmens senėjimui ir ilgaamžiškumui atskleidimas. Senėjimo ląstelė. 2016 m.; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.
4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Triple layer control-phosphorylation, acetylation and ubikvitination of FOXO proteins. Ląstelių ciklas. 2005 m.; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. FoxO transkripcijos faktorių reguliavimas acetilinimo ir baltymų ir baltymų sąveikos būdu. Bba-Mol Cell Res. 2011 m.; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.
6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. FOXO transkripcijos faktoriai: jų klinikinė reikšmė ir reguliavimas. Biomed Res Int. 2014 m.; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.
7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J ir kt. Genai, veikiantys po DAF-16 ir turintys įtakos Caenorhabditis elegans gyvavimo trukmei. Gamta. 2003 m.; 424(6946):277–284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Insulino/IGF{12}}R, SIRT1 ir FOXO keliai – intriguojanti kaulų ir osteosarkomos sąveikos forma. Priekinis endokrinolis (Lozana). 2019 m.; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.
9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS ir kt. Akt skatina ląstelių išgyvenimą fosforilindamas ir slopindamas šakės galvutės transkripcijos faktorių. Ląstelė. 1999 m.; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.
10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA ir kt. Skp2 slopina FOX01 naviko slopinimą per ubikvitino sukeltą skaidymą. P Natl Acad Sci USA. 2005 m.; 102(5):1649–1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.
11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA ir kt. Šakės galvutės transkripcijos faktorius DAF-16 perduoda į insuliną panašius metabolinius ir ilgaamžiškumo signalus C. elegans. Gamta. 1997 m.; 389 (6654): 994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.
12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Intestinal FoxO signaling reikalingas norint išgyventi burnos infekciją Drosophila. Gleivinės imunolis. 2016 m.; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.
13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO reguliuoja RNR trukdžius Drosophila ir apsaugo nuo RNR viruso infekcijos. P Natl Acad Sci USA. 2015 m.; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.
14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 skatina žarnyno imuninę homeostazę, kad apribotų bendrąją disbiozę ir pailgintų gyvenimo trukmę. Ląstelė. 2014 m.; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.
15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P ir kt. Nuo FOXO priklausomas įgimtos imuninės homeostazės reguliavimas. Gamta. 2010 m.; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.
16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M ir kt. FOXO transkripcijos faktoriai reguliuoja įgimtus imuninius mechanizmus kvėpavimo takų epitelio ląstelėse. J Immunol. 2013 m.; 190(4):1603–1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.
17. Graves DT, Milovanova TN. Gleivinės imunitetas ir FOXO1 transkripcijos faktoriai. Priekinis imunolis. 2019 m.; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.
18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Antimikrobiniai peptidai: nuo bestuburių iki stuburinių. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.{8}}.2004.0124.x PMID: 15199962.
19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Drosophila melanogaster imunitetas – nuo mikrobų atpažinimo iki viso organizmo fiziologijos. Nat Rev Immunol. 2014 m.; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.
20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Drosophila įgimtas imunitetas: evoliucinė perspektyva. Nat Immunol. 2002 m.; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.
21. Hultmark D. Drosophila imunitetas: keliai ir modeliai. Curr Opin Immunol. 2003 m.; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.
22. Li FH, Xiang JH. Naujausi tyrimai dėl įgimto krevečių imuniteto Kinijoje. Dev Comp Immunol. 2013 m.; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.
23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. C tipo lektino spiralinės spiralės domeno prisijungimas prie Domeless receptorių tiesiogiai suaktyvina JAK/STAT kelią krevečių imuniniame atsake į bakterinę infekciją. PLoS Patogas. 2017 m.; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.
24. Gordon S. Fagocitozė: imunobiologinis procesas. Imunitetas. 2016 m.; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.
25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ ir kt. FoxO1-tarpininkaujama autofagija reikalinga NK ląstelių vystymuisi ir įgimtam imunitetui. Nat Commun. 2016 m.; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.
26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J ir kt. FOXO1 reguliuoja bakterijų sukeltą neutrofilų aktyvumą. Priekinis imunolis. 2017 m.; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.
27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. C tipo lektinas jungiasi prie beta-Integrin, skatindamas bestuburių hemocitinę fagocitozę. J Biol Chem. 2014 m.; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.
28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Krevečių savigynos mokymas kovoti su infekcijomis. Tendencijos Biotechnol. 2019 m.; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.
29. Flegel TW. Istorinis krevečių patogenų atsiradimas, poveikis ir dabartinė būklė Azijoje. J Invertebr Pathol. 2012 m.; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.
30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Antivirusinė krevečių apsauga: nuo įgimto imuniteto iki virusinės infekcijos. Antivir Res. 2014 m.; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.
31. Obsil T, Obsilova V. FOXO transkripcijos faktorių reguliavimo struktūros/funkcijos ryšiai. Onkogenas. 2008 m.; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.