Echinakozido nustatymas vandens ekstrakte Cistanche Herba naudojant HPLC

XU Shanshan1 ,WU Kangyu2 ,TU Xingming2 （1. Guangdžou Kinijos medicinos universiteto trečiasis klinikinės medicinos koledžas, Guangdžou 510405 Guangdong, Kinija; 2. Guangdžou kinų medicinos universiteto trečioji susijusi ligoninė,Guangdžou 510378 Guangdong,Kinija） 

Abstraktus: Tikslas Norint nustatyti, buvo sukurtas HPLC metodasEchinakozidasvandens ekstrakte Cistanche deserticola. MetodaiEchinakozidas buvo nustatytas HPLC. Atskyrimas buvo atliktas naudojant Inertsil ODSSP C18 kolonėlė su judriąja faze sudaryta iš acetonitrilo（A）ir 0.4 procentų fosforo rūgšties tirpalo（B）,gradiento eliuavimo būdu. Aptikimo bangos ilgis buvo nustatytas 333 nm,o kolonėlės temperatūra buvo 30 laipsniai. Srauto greitis buvo 1,0 ml·min-1 ir injekcijos tūris buvo 10 μl.RezultataiEchinakozido tiesinis santykis koncentracijos diapazone 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 buvo geras（r = 0.999 8）. Išieškojimas buvo 94,59 proc. -105,31 proc（RSD= 2,93 proc,n = 9）. Echinakozido kiekis vandens Cistanche herba ekstraktuose buvo 15,527,7.347,12,267 mg·g-1 . 

Išvada: Nustatytas HPLC metodas su geru pakartojamumu yra tikslus,paprastas ir įmanomas. Jis tinka echinakozido kiekiui vandens ekstrakte nustatytiCistanche deserticola ma. 

Raktažodžiai:HPLC;vandens ekstraktas išCistanche deserticola;Echinakozidas;turinio nustatymas

Cistanche deserticolayra plačiai naudojamas tonikas tradicinėje kinų medicinoje klinikinėje praktikoje ir turi reputaciją "dykumos ženšenis". Cistanche deserticola, įtraukta į 2015 m. Kinijos farmakopėjos leidimą, yra džiovintas, žvynuotas, mėsingas Orobaceae augalo Cistanche deserticola YC Ma arba Cistanche tubulosa (Schenk) Wright stiebas. Jis yra šilto pobūdžio, saldaus ir sūraus skonio, priklauso inkstų ir storosios žarnos meridianams. Jis tonizuoja inkstų yang, teigiamai veikia esenciją ir kraują, drėkina žarnyną ir mažina vidurių užkietėjimą. [2]. 

Dykumos ženšenis

„Shennong Materia Medica Classic“ teigia, kad jis gali „maitinti vidurį, maitinti penkis vidaus organus, sustiprinti yin ir maitinti esmę“.Cistanche deserticola daugiausia turi feniletanoidų glikozidų, iridoidų ir glikozidų, lignanų ir glikozidų, polisacharidų, esterių ir alkaloidų [3].Feniletanolio glikozidaiyra pagrindiniai aktyvūs komponentaiCistanche deserticola, tarp kurių ežiuolė ir baseinas yra indikatoriniai komponentai Cistanche deserticola identifikavimui ir kiekiui Kinijos farmakopėjoje. 

Feniletanolio glikozidas yra pagrindinis aktyvus Cistanche deserticola komponentas

Farmakologiniai tyrimai [4] rodo, kad Cistanche deserticolaturi įvairų farmakologinį poveikį, pavyzdžiui, drėkina žarnyną ir mažina vidurių užkietėjimą, apsaugo kepenis, priešinasi osteoporozei, antioksidacija, senėjimą ir nuovargį. Vandeninis ekstraktas išCistanche deserticolagali skatinti žiurkių osteoblastų kaulų morfogenetinio baltymo 2 genus, taip pat tartratui atsparią rūgštinę fosfatazę ir osteokalciną pelių, kurioms pašalintos kiaušidės, serume., taip pat Smad1 ir Smad5 genai bei transformuojantys augimo faktoriai kaulų čiulpuose.anti-osteoporozės poveikis [5-6]. Echinozidas gali skatinti osteoblastų dauginimąsi ir kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių diferenciaciją į osteoblastus in vitro[7-9]. 

Echinozidas, pagrindinis Cistanche deserticola cheminis komponentas

Spustelėkite čia norėdami pamatyti Natural Cistanche Echinacoside produktus

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Pastaraisiais metais buvo gauta daug pranešimų apie echinakozido ir baseino kiekio nustatymą Cistanche deserticola alkoholio ekstrakte ir jo sudėtiniuose preparatuose [10-12], tačiau yra nedaug pranešimų apie echinakozido ir baseino kiekio nustatymą. Cistanche deserticola vandens ekstrakto indikatoriniai komponentai. Šiame tyrime didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC) buvo naudojama echinakozido kiekiui Cistanche deserticola vandens ekstrakte nustatyti.

1. Medžiaga

1.1 Aparatas

LC-20AT didelio efektyvumo skysčių chromatografija, SPD-20A detektorius, SIL-20Automatinis mėginių ėmiklis, CTO-10ASvp kolonėlės temperatūros dėžė, LCsolution skysčių chromatografijos darbo stotis, Shimadzu Corporation Japonijos; MES125P-OCE-DU elektroninis analitinis balansas, Sartorius, Vokietija; SHZ-D (III) cirkuliacinis vandens daugiafunkcis vakuuminis siurblys, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd;

1.2RC2BSO25 rotacinio garintuvo aušinimo cirkuliacinė sistema, RV10DS96 rotacinis garintuvas, IKA, Vokietija; DK-S26 elektrinė termostatinė vandens vonia, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; UPR serijos itin gryno vandens aparatas, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Vaistinės medžiagos ir reagentai

Meat Rong vaistinė medžiaga, įsigyta iš Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., partijos numeris: 18010011806001, 181001. Išdžiovinti, žvynuoti, mėsingi Leobaceae augalo Cistanche deserticola stiebai, kuriuos nustatė vyriausiasis kinų atstovas. Guangdžou tradicinės kinų medicinos universiteto ligoninė yra saugoma Guangdžou tradicinės kinų medicinos universiteto trečiosios dukterinės ligoninės vaistų inspekcijos kambaryje; Echinozido etaloninė medžiaga, kiekis 89,7 proc., Kinijos maisto ir vaistų kontrolės kontrolės institutas, partijos numeris: 111670-201706; Acetonitrilas yra chromatografiškai grynas (Merck, Vokietija); Metanolis ir fosforo rūgštis yra analitiškai gryni (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Vanduo yra itin grynas vanduo.

2. Metodai ir rezultatai

2.1 Vandens ekstrakto iš Cistanche deserticola paruošimas

Paimkitecistanche milteliai, įpilkite 1 0 karto daugiau nei distiliuoto vandens, pakaitinkite ir virkite su grįžtamu šaldytuvu, kad ištrauktumėte du kartus, kiekvieną kartą po 1 valandą. Filtruokite, sumaišykite filtratą ir sukamuoju garintuvu sukoncentruokite filtratą iki 0,100 g · mL-1 neapdoroto vaisto kiekio. Laikyti 4 laipsnių temperatūroje budėjimo režimui. 2.2 Chromatografinės sąlygos ir sistemos tinkamumas Chromatografinė kolonėlė: InertsilODS SPC18 kolonėlė (150 mm × 4,6 mm, 5 μm）; judrioji fazė: acetonitrilas (A) - 0,4 proc. fosforo rūgšties tirpalas (B), gradiento eliuavimas: 0~ 5 min., 17 proc. A; 5–25 min., 20 proc. A; 25–30 min., 17 proc. A; aptikimo bangos ilgis: 333 nm; kolonėlės temperatūra: 30 laipsnių; srauto greitis: 1,0 ml · min-1; įpurškimo tūris: 10 μ L. Esant tokioms chromatografinėms sąlygoms, skiriamoji geba tarp ežiuolės smailių ir gretimų komponentų yra didesnė nei 1,5, o teorinis ežiuolės smailių stulpelių skaičius neturi būti mažesnis nei 4000. Chromatograma parodyta 1 paveiksle.

1 pav. Echinakozido (A) ir Cistanche herba (B) vandens ekstrakto HPLC chromatogramos

2.3 Tirpalo ruošimas

2.3.1 Etaloninis tirpalas

Pasverkite atitinkamą kiekįEchinacetinasetaloninę medžiagą, tiksliai pasverkite, įdėkite į 10 ml matavimo kolbą, įpilkite metanolio, kad ištirptų, ir įpilkite 898,794 echinacetino viename mililitre μG etaloninio tirpalo, laikomo 4 laipsnių temperatūroje budėjimo režimui.

Cistanche deserticola echinozidas

2.3.2 Bandomasis tirpalas

Tiksliai išmatuokite 2.0 mL Cistanche deserticola vandeninio ekstrakto, išgarinkite vandens vonioje, ištirpinkite metanolyje, įpilkite į pastovų tūrį 10 mL matavimo kolboje, gerai suplakite, 0,22 μM mikroporų. membraninis filtravimas, būtent.

2.4 Tiesinio ryšio tyrimas

Tiksliai išmatuokite {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2,50, ir 3.{11}} mL etaloninio tirpalo pagal 2.3.1 ir supilkite juos į 5 ml matavimo kolbą, įpilkite metanolio iki pastovaus tūrio ir gerai suplakite, kad gradiento koncentracija būtų 44,9397, 89,8794, 179,7588, 359,5176, 9049,36. , ir 539,2764 μG · mL-1 etaloninio tirpalo, 0,22 μM Mikroporinė membraninė filtracija. Nustatymas atliekamas pagal 2.2 punkte nurodytas chromatografines sąlygas ir užrašomas smailės plotas. Naudojant etaloninės medžiagos masės koncentraciją kaip abscises (X, μ G · mL-1), smailės plotas yra ordinatės (Y), ir gaunama tiesinės regresijos lygtis: Y=13185. 0X-32273.0, r=0.9998. Rezultatai parodė, kad ežiuolės svyravo nuo 44,9397 iki 539,2764 μ Linijinis ryšys g · mL-1 koncentracijos diapazone yra geras.

2.5 Tikslumo testas

Paimkite 539,2764 μG · mL-1 etaloninio tirpalo, mėginį nepertraukiamai įpurkškite 6 kartus pagal 2.2 punkte nurodytas chromatografines sąlygas ir užrašykite smailės plotą. Rezultatai Ežiuolės smailės ploto RSD buvo 1,81 proc., o tai rodo gerą instrumento tikslumą.

2.6 Stabilumo testas

Tiksliai išmatuokite 2.{1}} mlCistanche deserticolavandeninį ekstraktą, išgarinti iki sausumo vandens vonioje, ištirpinti metanolyje, 10 ml matavimo kolboje supilti iki pastovaus tūrio, gerai sukratyti, 0.22 μ Filtruoti su mikroporine membrana, įpurkšti 0, 2, 4, 8, 12 ir 24 valandoms nustatyti mėginiai pagal 2.2 punkte nurodytas chromatografines sąlygas ir užrašomas smailės plotas. Rezultatai Ežiuolės smailės ploto RSD buvo 1,16 proc., o tai rodo, kad tiriamasis tirpalas buvo geras stabilumas per 24 valandas.

2.7 Pakartojamumo testas

Tiksliai išmatuokite 6 porcijas po 2.{2}} ml vandeninio tirpaloCistanche deserticola ekstraktas, lygiagrečiai paruoškite 6 tiriamojo tirpalo dalis pagal 2.3.2 punkte aprašytą metodą, sušvirkškite mėginius nustatymui pagal 2.2 punkte aprašytas chromatografines sąlygas ir užregistruokite smailės plotą. Rezultatai Ežiuolės masės koncentracijos RSD buvo 1,28 proc., o tai rodo, kad metodas buvo gerai pakartojamas.

Cistanche deserticola eksperimentas

2.8 Mėginio papildymo atkūrimo testas

Tiksliai išmatuokite 9 porcijas po 1.{2}} mlCistanche deserticolavandeninio ekstrakto, įpilkite {{0}}.8, 1.0 ir 1,2 ml etaloninio tirpalo (101,552 mg · ml - 1), išgarinkite vandens vonioje, ištirpinkite metanolio ir supilkite iki žymės į ml matavimo kolbą; Gerai sukratykite, 0,22 μ Filtras su mikroporine filtro membrana, kad paruoštumėte didelės, vidutinės ir mažos koncentracijos tiriamąjį tirpalą. Paruoškite lygiagrečiai 3 dalis kiekvienos koncentracijos, išmatuokite pagal 2.2 chromatografines sąlygas, užregistruokite smailės plotą ir apskaičiuokite mėginio priklausomybės atsigavimą. Rezultatai pateikti 1 lentelėje.

2.9 Mėginio kiekio nustatymas

Tiksliai išmatuokite 3 porcijas po 2.{2}}mlvandens ekstraktas iš Cistanche deserticola, išgarinti iki sausumo vandens vonioje, ištirpinti metanolyje, iki pastovaus tūrio 10 ml matavimo kolboje, gerai sukratyti, 0,22 μ Filtruoti su mikroporine membrana, išmatuoti pagal 2.2 punkte nurodytas chromatografines sąlygas, užrašykite smailės plotą ir apskaičiuokite ežiuolės kiekį. Rezultatai pateikti 2 lentelėje.

1 lentelė Echinakozido regeneravimo tyrimų rezultatai

2 lentelė Echinakozido kiekio nustatymo Cistanche herba vandens ekstrakte rezultatai

3.Diskusija

3.1 Bandomojo gaminio paruošimo būdas

Vandeninis ekstraktas išCistanche deserticolasudėtyje yra įvairių cheminių komponentų, pvz., fenilo etanolio glikozidų ir polisacharidų, kurie sukelia tam tikrus trikdžius tiriamiems komponentams. Šiame tyrime buvo tiriamos dvi skirtingos tirpiklių koncentracijos – 50 procentų metanolis ir metanolis. Rezultatai parodė, kad smailių atskyrimo efektas bandomojo produkto chromatogramoje, naudojant kaip tirpiklį 50 procentų metanolį, buvo prastas tarp ežiuolės ir gretimų komponentų; Naudojant metanolį kaip tirpiklį, ežiuolės glikozido smailės skiriamoji geba yra gera, o kitų priemaišų smailių netrukdo. Todėl metanolis buvo pasirinktas kaip tiriamojo tirpalo tirpiklis. Naudojant metanolį kaip tirpiklį, Cistanche deserticola vandens ekstraktas buvo išgarintas iki sausumo vandens vonioje. Buvo naudojami du apdorojimo metodai: tirpinimas metanoliu, pastovaus tūrio purtymas ir metanolio ultragarsinis (10 min.) tirpinimas. Rezultatai parodė, kad reikšmingo skirtumo tarp dviejų metodų nebuvo. Šis metodas buvo pasirinktas ruošiant tiriamąjį tirpalą dėl paprasto metanolio tirpinimo ir pastovaus tūrio kratymo.

Kinijos žolelių cistanche

3.2 Judančios fazės pasirinkimas

Šiame tyrime buvo daroma nuoroda į judriąją fazę (metanolį -0,1 proc. skruzdžių rūgšties), naudotą Cistanche deserticola kiekiui nustatyti Kinijos farmakopėjoje (I tomas) (2015 m.). Rezultatai parodė, kad ežiuolės glikozido smailė išsiplėtė ir atsirado priekinio krašto reiškinys, kuris gali būti susijęs su silpnu judriosios fazės eliuavimo gebėjimu; Remiantis atitinkama literatūra [12-13], acetonitrilas-0,5 procentų acto rūgštis buvo naudojama kaip judri fazė, tačiau ežiuolės smailės forma buvo prasta ir buvo uodegos reiškinys. Atsižvelgiant į judriosios fazės pH vertę, kaip judrioji fazė galiausiai buvo panaudota acetonitrilo -0,4 proc. fosforo rūgštis. Dėl to teorinis ežiuolės smailių plokštelių skaičius buvo didesnis nei 4000, o skiriamoji geba tarp ežiuolės ir gretimų komponentų smailių buvo didesnė nei 1,5. Smailės forma buvo simetriška, be priemaišų smailių trukdžių, o bazinė linija buvo stabili. Todėl šiame tyrime acetonitrilas - 0,4 proc. fosforo rūgštis buvo naudojama kaip chromatografinė judri fazė ežiuolės kiekiui nustatyti. Šiame tyrime,HPLC metodas buvo naudojamas ežiuolės Cistanche deserticola vandeniniame ekstrakte nustatyti.

Cistanche ekstrakto milteliai

Metodas yra paprastas, tikslus ir atkuriamas. Jis tinka ežiuolės nustatymui cistanche deserticola vandeniniame ekstrakte ir gali būti naudojamas kaip cistanche deserticola vandeninio ekstrakto kokybės kontrolės metodas.Šis tyrimas nustatė tik ežiuolės kiekį vandens Cistanche deserticola ekstrakte.Ateityje,planuojama nustatyti ežiuolės kiekį sudėtiniame Cistanche deserticola nuovire, siekiant ištirti įvairių veiksnių įtaką ežiuolės kiekiui, suteikiant nuorodą Cistanche deserticola turinčio nuoviro kokybės kontrolei.

nuoroda:

[1] Zhong Ping dykumos ženšenis ir cistanche [J] Forest and Human Beings, 2004, 24 (11): 25

[2] Kinijos Liaudies Respublikos nacionalinės farmakopėjos komisijos farmakopėja (I dalis) [M] Pekinas: Kinijos medicinos mokslo ir technologijų leidinys, 2015 m.:135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei ir kt. Cistanche deserticola [J] narkotikų vertinimo tyrimas, 2013 m., 36 (6): 469-475

[4] Fang Jian pažanga Cistanche deserticola [J] Guangmingo tradicinė kinų medicina, 2017 m., 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo Cistanche deserticola vandeninio ekstrakto poveikis kaulų morfogenetinio baltymo 2 geno ekspresijai žiurkių osteoblastuose [J] China AnimalŽuvininkystė ir veterinarinė medicina, 2013, 40 (1): 17-21

[6] LIANG H, YU F, TONG Z ir kt. Cistanches herba vandeninis ekstraktas, turintis įtakos serumo BGP ir TRAP bei kaulų čiulpų Smad1 mRNR, Smad5 mRNR, TGF- 1 mRNR ir TIEG1 mRNR ekspresijos lygiams sergant osteoporoze [J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40 (2):757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming ir kt., Echinozido, skatinančio žiurkių osteoblastų dauginimąsi aktyvinant ERK/BMP, stebėjimas-2 Signal Pathway [J] Grassroots Medical Forum, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] Tian Yuan tyrimas dėl kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių diferenciacijos į osteoblastus, sukeltus echinazido ir jo mechanizmo [D] Shenyang: Liaoning tradicinės kinų medicinos universitetas, 2015 m.

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan ir kt. Echinozido sukeltos kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių diferenciacijos į osteoblastus tyrimas [J] Farmakologija ir tradicinės kinų medicinos klinika, 2017 m., 33 (2): {{4}

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie ir kt. Echinozido ir pilozido nustatymas Cistanche deserticola mikromilteliuose HPLC [J] Anhui Agricultural University, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Yang Sude, Hu Junhua, Li Jiachun ir kt., Echinozido, pilozido ir izopilozido lygiagretusis echinozido, pilozido ir izopilozido nustatymas HPLC metodu [J] World Science and Technology – Modernization of Traditional Chinese Medicine, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Xu Xiaoxue farmakodinaminiai ir metabonominiai Cistanche deserticola ir jos veiksmingų komponentų poveikio osteoporozei tyrimai [D] Yinchuan: Ningxia medicinos universitetas, 2017 m.

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan ir kt. Echinozido ir pilozido nustatymas Qirong Runchang geriamajame skystyje naudojant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją [J] Sindziango medicinos universiteto žurnalas, 2018 m., 41 (7): 886-888892