Smegenų audinio proteomikos iš viršaus į apačią gerinimas naudojant FAIMS 1 dalis

Anotacija

Alzheimerio ir Parkinsono ligos proteominiai tyrimai suteikė vertingų įžvalgų apie neurodegeneracinius sutrikimus. Iki šiol šie tyrimai daugiausia apsiribojo metodu iš apačios į viršų, o tai trukdo apibūdinti baltymo „nepažeistą“ būseną.

Alzheimerio liga yra neurodegeneracinė liga, kuri negrįžtamai paveikia žmogaus atmintį ir pažinimo gebėjimus. Nors žmonės negali visiškai išgydyti ligos, kruopštaus gydymo ir profilaktikos dėka galima kiek įmanoma sulėtinti ligos progresavimą ir išlaikyti paciento fizinę ir psichinę sveikatą.

Atmintis yra vienas iš akivaizdžiausių Alzheimerio liga sergančių pacientų aspektų. Jie dažnai gali pamiršti svarbią informaciją, pavyzdžiui, savo vardą, artimųjų vardus, svarbias datas ir pan. Be to, kai kurie pažangūs savarankiško mokymosi žodynai, tokie kaip abstrakčios sąvokos ir sinonimai, taip pat gali būti pamiršti. Tačiau kai kuriais kognityviniais mokymais ir gydymu Alzheimerio liga sergantys pacientai vis tiek gali išlaikyti savo atmintį kai kuriais aspektais.

Nors Alzheimerio liga gali turėti neigiamų pasekmių, turėtume į ją žiūrėti teigiamai. Pirma, didindami informuotumą ir supratimą apie ligą galime geriau užkirsti kelią ir gydyti. Antra, Alzheimerio liga sergančių pacientų globėjai ir šeimos nariai taip pat gali išmokti efektyviai su jais bendrauti ir bendrauti, kad padėtų pacientams išlaikyti orumą ir gyventi kuo laimingiau.

Apskritai, nors Alzheimerio liga gali sukelti negrįžtamą poveikį atminčiai ir pažintiniams gebėjimams, turėtume išlaikyti optimistišką požiūrį ir stengtis sulėtinti ligos progresavimą gydymo ir prevencinėmis priemonėmis. Kartu turėtume suteikti daugiau pagalbos ir paramos tiems, kurie rūpinasi Alzheimerio liga sergančiais pacientais, kartu kurti šiltesnę ir interaktyvesnę bendruomenę. Matyti, kad turime gerinti atmintį. Cistanche gali žymiai pagerinti atmintį, nes tai tradicinė kinų vaistinė medžiaga, turinti daug unikalių poveikių, vienas iš kurių – gerinti atmintį. Cistanche poveikį lemia įvairios jame esančios veikliosios medžiagos, įskaitant tanino rūgštį, polisacharidus, flavonoidinius glikozidus ir kt. Šie ingredientai gali įvairiais būdais skatinti smegenų sveikatą.

Spustelėkite žinoti 10 būdų, kaip pagerinti atmintį

Proteomika iš viršaus į apačią (TDP) įveikia šį apribojimą; tačiau paprastai galima stebėti tik gausiausias santykinai mažo dydžio proteoformas.

Todėl, siekiant sumažinti mėginio sudėtingumą, dažniausiai naudojami frakcionavimo metodai. Čia mes tiriame tegas fazės frakcionavimą per didelio lauko asimetrinės bangos formos jonų mobilumo spektrometriją (FAIMS) TDP.

Naudodami didelio sudėtingumo mėginį, gautą iš Alzheimerio ligos (AD) smegenų audinio, aprašome, kaip FAIMS pridėjimas prie TDP gali tvirtai pagerinti proteomų aprėpties gylį.

Pavyzdžiui, įdiegus FAIMS, kai išorinė kompensacinė įtampa (CV) yra –50, –40 ir –30 CV, gali daugiau nei dvigubai padidinti vidutinį neperteklinių proteoformų, genų ir proteomų sekos aprėpties skaičių, palyginti su be FAIMS.

Mes taip pat nustatėme, kad FAIMS gali paveikti proteoformų ir jų įkrovos apvalkalų perdavimą pagal jų dydį. Svarbu tai, kad FAIMS leido identifikuoti nepažeistas amiloidbeta (A ) proteoformas, įskaitant agregacijai linkusį A 1–42 variantą, kuris yra stipriai susijęs su AD.

Neapdoroti duomenys ir susiję failai buvo perkelti į ProteomeXchange konsorciumą per MassIVE duomenų saugyklą su duomenų rinkinio identifikatoriumi PXD023607.

ĮVADAS

Per pastaruosius 2 dešimtmečius neurodegeneracinių ligų paplitimas visame pasaulyje išaugo daugiau nei dvigubai, o Alzheimerio liga (AD) yra labiausiai paplitusi forma.1 Dvi baltymų rūšys, amiloido beta (A ) peptidai ir su fosforilintas mikrotubulais susijęs baltymas tau(tau), 2–5 yra stipriai susiję su AD.

Todėl detalus AD proteomeapibūdinimas buvo ypač svarbus.6,7 Masių spektrometrija vaidino pagrindinį vaidmenį šiuose tyrimuose8, daugiausia taikant metodus iš apačios į viršų.9–16

Tačiau proteazių virškinimas, reikalingas analizei iš apačios į viršų, trukdo užfiksuoti visą baltymo būseną, kuri gali skirtis dėl genetinių alelių, alternatyvaus sujungimo, proteolitinio apdorojimo ir potransliacinių modifikacijų (vadinamų „proteoformomis“).17– 20

Kadangi proteominiai metodai iš viršaus į apačią (TDP) analizuoja nepažeistus baltymus, su tam tikromis patologijomis susijusių proteoformų užfiksavimo tikimybė yra didesnė ir leidžia užmegzti stipresnį, tiesioginį ryšį tarp genotipo ir fenotipo.20–22

Pavyzdžiui, TDP ypač tinka fiksuoti endogeninius proteolitinius fragmentus, gautus iš baltymų, tokių kaip tau, kurie buvo susiję su Alzheimerio liga. 23–26 Keletas ankstesnių TDP programų buvo daug žadančios atskleisti regioninį smegenų proteomų heterogeniškumą ir neuronų pokyčius reaguojant į įvairius dirgiklius. .27–30

Tačiau sudėtingų mėginių TDP paprastai reikalauja neprisijungus naudojamų frakcionavimo metodų, kad būtų sumažintas mėginio sudėtingumas, nes žmogaus proteomas yra kelių dydžių ir gausumo kategorijų, o baltymai paprastai nėra gerai išskiriami naudojant atvirkštinės fazės aukštos kokybės skysčių chromatografiją (LC).31

Šį neprisijungusį frakcionavimą galima atlikti naudojant geliu eliuuotą skystųjų frakcijų gaudymo elektroforezę, dydžio išskyrimo chromatografiją, jonų mainų chromatografiją arba afininį gryninimą. 22,32–35

Deja, frakcionavimas neprisijungus paprastai sumažina išeigą ir pralaidumą, nes reikalauja ilgesnio mėginio apdorojimo.36 Dujinės fazės jonų judrumo atskyrimas yra patraukli frakcionavimo alternatyva, kurią galima įvesti tarp LC ir MSdimensions, nereikalaujant papildomų mėginio apdorojimo etapų.

Didelio lauko asimetrinės bangos formos jonų mobilumo spektrometrija (FAIMS) yra ypač gerai pritaikyta šiai užduočiai, nes neseniai buvo pristatytas FAIMS Pro įrenginys, kurio modulinė konstrukcija leidžia lengvai įtraukti jonų mobilumą į kelis srovės Orbitrap prietaisus.

FAIMS, dar vadinama diferencialinio judrumo spektrometrija, atskiria jonus nešančiosiose dujose, remdamasi tokių veiksnių, kaip dydis, krūvis arba forma, deriniais, įvedant asimetrinę bangos formą su dideliu ir mažu elektriniu lauku.38 Siekiant išvengti jonų susidūrimo su elektrodo, jonų kelio nuokrypis įvedamas taikant nuolatinės srovės kompensavimo įtampą (CV)39, leidžiančią pasirinktinai perduoti tą joną.38

FAIMS taikymas nepažeistų baltymų analizei iš esmės apsiribojo atskirų baltymų konformerių arba mažų baltymų derinių atskyrimu; 40–45

tačiau FAIMS neseniai buvo taikomas nepažeistų ir natūralių baltymų analizėms, naudojant skysčių ekstrahavimo paviršiaus analizę.46–50Čia mes taikome FAIMS-TDP analizę viso audinio mėginiui iš Alzheimerio liga sergančio paciento medialinės priekinės žievės (MFC).

Nuskaitymas CV diapazone nuo –50 iki –20 CV su išoriniu žingsniu leido mums nustatyti, kaip FAIMS CV moduliavimas įtakoja jonų, perduodamų per cilindrinį FAIMS bloką, charakteristikas ir kaip šis ryšys gali būti panaudotas tikslinėms proteoformoms pagal dydį.

FAIMS-TDP daugiau nei dvigubai padidino proteoformų identifikavimą viename CV, palyginti su be FAIMS, ir leido giliau ištirti proteoformas, susijusias su neurodegeneracinėmis ligomis, įskaitant -, - ir -sinukleinus, PARK7, tau susiliejimo izoformas ir keletą nepažeistų A proteoformų.

Apibendrinant, šiame darbe aprašoma, kaip galima pasiekti didesnį proteoformų identifikavimą ir proteomų aprėptį atkuriamai frakcionuojant dujų fazę su FAIMS TDP.

METODAI

Mėginio paruošimas

MFC mėginys buvo gautas iš Rush universiteto Alzheimerio ligos centro. Dalyviai buvo klinikoje dirbantys vyresnio amžiaus žmonės, kurie nuo 1992 iki 2005 m. dalyvavo dėl atminties sutrikimų ir (arba) ordemencijos.

Jie buvo įvertinti Rush Memory klinikoje dėl galimos demencijos ir sutiko su smegenų donoryste kaip Rush Alzheimerio ligos pagrindinio centro klinikinio branduolio dalimi. Tyrimą patvirtino Rush universiteto medicinos centro institucinė peržiūros taryba.

Po mirties artimieji davė sutikimą atlikti skrodimą. Bendra paciento kognityvinės diagnostikos kategorija buvo Alzheimerio demencija be kitų pažinimo sutrikimo priežasčių51, o pomirtinis intervalas buvo 230 min.

Visi mėginių apdorojimo veiksmai buvo atlikti laikantis BSL{{0}} atsargumo priemonių. 33 mg MFC audinio, laikomo -80 laipsnių temperatūroje, buvo perkelti į 1,5 ml LoBind Eppendorf mėgintuvėlius (Eppendorf, kat. Nr. 022431081), pridedant 0,5 ml homogenizacijos buferio, susidedančio iš 8 M karbamido, 10 mAmonio bikarbonato (ABC) ir tris(2-karboksietil)fosfinas (TCEP), kai pH 7,5.

Homogenizavimas buvo pasiektas fiziškai suardant, naudojant rankinį varikliu varomą granulių grūstuvą 3 0 s (BioVortexer su SpiralPestle; Biospec 1083 ir 1017), prieš įdedant 0,5 ml homogenizacijos buferio kambario temperatūroje.

Tada mėginys buvo inkubuojamas 37 laipsnių temperatūroje 60 minučių 1200 aps./min., naudojant ThermoMixer, kad būtų galima ekstrahuoti ir denatūruoti ląstelių baltymus. Karbamido netirpi medžiaga buvo susmulkinta centrifuguojant 18, 000 g 20 min. 22 laipsnių temperatūroje, o gautas supernatantas įpilamas į 3 ml plovimo buferio (WB; 8 M karbamidas, 10 mM ABC, pH 7). .5) per 4 ml 100 kDa molekulinės masės ribinės vertės (MWCO) filtrą, kad pašalintumėte dideles MW rūšis.

Po 1 valandos centrifugavimo 22 laipsniais ir 5000 g, sulaikytasis tūris buvo 200 μ, o filtrato tūris buvo 3, 8 ml. 3,8 ml filtrato buvo perkelta į 3 kDa MWCO filtrą, kad būtų pašalinti mažos molekulės teršalai ir mažos MW peptidai.

3 kDa MWCO filtras buvo centrifuguojamas 22 laipsnių ir 7300 g 1 valandą, todėl sulaikomas tūris buvo 200 μL. 200 μl retentato iš 100 kDa MWCO filtro buvo dar kartą išplauti, praskiedžiant iki 4 ml su WB ir vėl filtruojant per tą patį filtrą.

Šis pratekėjimas buvo pridėtas prie to paties 3 kDa MWCO filtro, kaip minėta aukščiau, ir dar kartą sukoncentruotas.

Paskutiniai 200 μl retentato iš 3 kDa MWCO filtro plovimo buvo perkelti į 1,5 ml LoBindEppendorf mėgintuvėlį. Norint parūgštinti mėginį, buvo pridėta 10 μL 10% skruzdžių rūgšties (FA), todėl galutiniame mėginyje FA koncentracija buvo 0,5%.

Mėginys buvo centrifuguojamas 18,000g 15 min., kad būtų pašalinta nuosėdų medžiaga, prieš matuojant baltymų koncentraciją naudojant bicinchonino rūgšties (BCA) tyrimą.

Galvijų serumo albumino standartai buvo paruošti naudojant 8 M šlapalą, 10 mM ABC ir 0,5% FA, kad būtų atsižvelgta į bet kokį galimą buferio indėlį į BCA tyrimą. Baltymų koncentracija BCA tyrimu buvo nustatyta kaip 1,1 mg/mL, atitinkanti galutinę 0,22 mg bendro išgauto baltymo išeigą ~200 μL mėginyje. atskiestas iki 0,5 mg/ml WB, turinčiu 0,5% FA, ir laikomas –80 laipsnių temperatūroje iki LC-MS analizės.

Turėtume atkreipti dėmesį, kad pradiniai eksperimentai (duomenys neskelbtini), naudojant tradicinį proteazės / fosfatazės inhibitorių kokteilį mūsų homogenizacijos buferyje, lėmė klaidinančius BCAassay ir LC-MS rezultatus, nes 3KMWCO filtras sulaikė kelis kokteilio komponentus.

Be to, daugelis dažniausiai naudojamų fosfatazės ir proteazės inhibitorių yra chemiškai nesuderinami su redukuojančiais agentais, tokiais kaip TCEP. Atsižvelgdami į šiuos nesuderinamumus ir į tai, kad stipriai denatūruojančios 8 M šlapalo ir 10 mM TCEP sąlygos turėtų inaktyvuoti daugumą proteazių, manėme, kad tokiomis sąlygomis proteolitinis skilimas vis tiek bus sumažintas.

LC-MS/MS analizės ir FAIMS nustatymai

Mėginiai buvo analizuojami naudojant Waters NanoACQUITY UPLC sistemą su mobiliosiomis fazėmis, susidedančiomis iš {{0}},2 % FA H2O (judrioji fazė A) ir 0,2 % FA ACN (judrioji fazė B).

Tiek gaudymo kolonėlė (100 μm vid., 5 cm ilgio), tiek analizės kolonėlė (75 μm vid., 50 cm ilgio) buvo suspensijos, supakuotos su C2 pakavimo medžiaga (5 ir 3 μm gaudyklėms/analitikai, atitinkamai, 300 Å, atskyrimo technologija). . Mėginiai buvo įkelti į 5 μLloop, atitinkantį 2,5 ug pakrautos medžiagos kiekio, ir įšvirkšti į gaudymo kolonėlę izokratiniu 5% b srautu 3 μL/min greičiu per 20 min.

Atskyrimas buvo atliktas naudojant 5–50% b gradientą per 180 min., esant 300 nL/min. Baltymų MS/MS analizei NanoACQUITY sistema buvo sujungta su Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid masės spektrometru, turinčiu FAIMS Pro sąsają.

Šaltinio parametrai apėmė 2,2 kV elektropurškimo įtampą, 275 laipsnių perdavimo kapiliarinę temperatūrą ir 60% jonų piltuvo radijo dažnio amplitudę. FAIMS buvo nustatyta į standartinę skiriamąją gebą be papildomo vartotojo valdomo nešančiųjų dujų srauto ir –5 kV dispersijos įtampos (atitinka –33,3 kV/cm dispersijos lauką),50, o CV kinta priklausomai nuo eksperimento (vadinamas „išoriniu žingsniu“). “).

„Fusion Lumos“ buvo nustatytas „nepažeisto baltymo“ taikymo režimu, kuris sumažina didesnės energijos C-trap disociacijos (HCD) ląstelės N2 slėgį iki 2 mTorr, o duomenys buvo renkami kaip visas profilis. MS1 ir MS2 duomenys buvo gauti 120k ir 60k skiriamąja geba, 3 ir 2 mikro nuskaitymai 500–2, 000 m/z ir 400–2, 000 m/z diapazone ir AGC taikiniai atitinkamai 5 × 106 ir 5 × 105.

MS1 ir MS2 taip pat buvo įsigyti su maksimaliu 400 ms įpurškimo laiku. Nuo duomenų priklausomi nustatymai apėmė 6 didžiausių intensyviausių jonų pasirinkimą, mažesnių nei įkrovos būsenų 5+ jonų pašalinimą, nenustatytų įkrovimo būsenų įtraukimą ir dinaminį išskyrimą po vieno stebėjimo 30 s.

MS2 pasirinkti jonai buvo izoliuoti per ±1,5 m/z langą ir suskaidyti per susidūrimo sukeltą disociaciją (CID), kai susidūrimo energija buvo 35%. Vietoj HCD naudojome CID dėl mažesnės normalizuotos susidūrimo energijos priklausomybės, kad būtų galima interpretuoti baltymų fragmentacijos spektrus, todėl pirmenybė teikiama mūsų proteoformų stebėjimų platumui, o ne sekos aprėpčiai.52

Duomenų rinkiniai kiekvienam FAIMS CV buvo surinkti trimis egzemplioriais. Visi neapdoroti failai buvo patalpinti į MassIVE duomenų saugyklą ir juos galima pasiekti per prisijungimą MSV000086696 arba naudojant PXD023607 „ProteomeXchange“.

For more information:1950477648nn@gmail.com