Cistanche Deserticola ekstrakto, kuriame gausu feniletanoido glikozido, pernešimo per Caco{1}} ląstelių vienasluoksnį modelį žarnyne įvertinimas

Įvadas

Caco{0}} ląstelių linija, gauta iš žmogaus gaubtinės žarnos adenokarcinomų, pasižymi enterocitus panašiomis savybėmis. Normaliomis sąlygomis Caco-2 ląstelės spontaniškai skiriasi nuo subrendusių ląstelių ir sudaro nepažeistus monosluoksnius [1]. Gretimos ląstelės prilimpa per sandarias jungtis, susidariusias viršūninėje vienasluoksnio sluoksnio pusėje, o tai gali atskirti pasyviai ir aktyviai per epitelio sluoksnį pernešamus vaistus [2]. Dėl morfologinio ir biocheminio panašumo į normalius enterocitus Caco{5}} ląstelių monosluoksniai yra gerai priimtas in vitro modelis tiriant vaistų absorbcijos žarnyne potencialą ir transportavimo charakteristikas [3, 4].

Priešingai nei chemikalai, augalų ekstraktai (PE) yra mišiniai, kurių biologinis aktyvumas ir aktyvios sudedamosios dalys dažnai nėra gerai identifikuojamos [5]. Be to, PE žarnyno transporto savybės, priešingai nei jo sudedamųjų dalių savybės, yra glaudžiai susijusios su klinikiniu naudojimu. Caco{1}} ląstelių vienasluoksnio sluoksnio tiriamojo mėginio srauto matavimai dažniausiai naudojami cheminiais metodais, pvz., HPLC, LC/MS ir kt. Nors šie metodai yra galingi įrankiai, jie yra sudėtingi, atimanti daug laiko, brangūs ir kartais. reikalauja sudėtingos įrangos. Dar svarbiau, kad nei vienas, nei mažumos komponentas negali atspindėti PE kaip visumos. Taigi, norint nustatyti ir įvertinti PE transportavimo charakteristikas, reikia sukurti naują metodą, nepriklausomą nuo sudedamųjų dalių nustatymo.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), holoparazitinis augalas, yra įprasta tradicinė kinų medicina, daugiausia naudojama inkstų nepakankamumui, kūno silpnumui ir vidurių užkietėjimui gydyti, ir šis naudojimas buvo oficialiai įrašytas į Kinijos farmakopėją [6]. Feniletanoidiniai glikozidai (PhG), įskaitantechinakozidas (EC), akteozidas (AC) ir izoakteozidas(IS) ir kt., yra polifenolinių junginių klasė [7]. Jie laikomi vienais pagrindiniųCistanche rūšių biologiškai aktyvios sudedamosios dalys[8]. Farmakologiniai tyrimai parodė, kad PhG biologinis aktyvumas yra įvairus ir apima antioksidacinį [9], nuovargį [10], hepatoprotekcinį [11], imunomoduliacinį [12], priešuždegiminį [7, 13] ir neuroprotekcinį poveikį. 14]. Tačiau PhG žarnyno transporto savybės nebuvo ištirtos. Šiame tyrime mes ištyrėmePhG turtingo ekstrakto (PRE) iš CD pralaidumas žarnynekaip integruota sistema ir trijų pagrindinių PhG (AC, IS ir EC) pralaidumas diferencijuotose Caco{0}} ląstelėse. Mūsų rezultatai parodė, kad PRE pirmiausia yra pernešamas per prastai absorbuotą pasyvią difuziją žemyn koncentracijos gradientu be išsiliejimo, o tai suteikia farmakokinetinį pagrindą klinikiniam PhG pritaikymui CD.

NATŪRALIOS CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE žolės PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Medžiagos ir metodai

Medžiagos

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98 proc. buvo nupirkti iš Must Biotechnology Co. (Čengdu, Kinija). Dulbecco modifikuotą Erelio terpę (DMEM), vaisiaus galvijų serumą (FBS) ir nepakeičiamas aminorūgštis (NEAA) gamino Gibco BRL (Grand Island, NY, JAV). 6-šulinėlių TranswellTM plokštelės (įterptos membranos augimo plotas 4,67 cm2) buvo gautos iš Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, JAV). Žiurkės uodegos kolagenas buvo gautas iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV). Visi reagentai ir cheminės medžiagos, skirtos HPLC analizei, buvo analitinės kokybės.

PRE paruošimas iš kompaktinio disko

Oru išdžiovinta CD medžiaga buvo sumalta į miltelius ir ekstrahuojama perkoliuojant 70% etanoliu. PhG turtinga frakcija buvo paruošta taip, kaip aprašyta anksčiau [10] ir ekstrahuota vandens prisotintu n-butilo alkoholiu. Ekstrakto tirpalas sukoncentruotas ir išdžiovintas sumažintame slėgyje. Makroporinės dervos-UV spektrofotometrija [15] išmatavo 78,4 % PhG. Galutinis mėginys sudarė 1,75 % žaliavos sausos masės. Gautas mėginys buvo laikomas –20 laipsnių temperatūroje iki tolesnio naudojimo.

AC, IS ir EC nustatymas HPLC

AC, IS ir EC turiniui PRE tirti buvo naudojama Shimadzu HPLC sistema su LC tirpalo programine įranga. Buvo naudojama atvirkštinės fazės Intersil C18 kolonėlė (4,6 mm × 25{5}} mm, 5 μm), kuri palaikoma kambario temperatūroje. Judančios fazės buvo acetonitrilas ir vanduo, turintis 0,1 % fosforo rūgšties (v/v) su gradiento eliuavimu (1 lentelė), esant 1,0 ml/min srauto greičiui. UV spektrofotometro detektorius buvo nustatytas ties 334 nm. Norėdami tiksliai nustatyti AC ir IS srautą, sukūrėme naują HPLC-fluorescencijos aptikimo (HPLC-FLD) metodą. Atlikę struktūrinę analizę ir nuskaitę fluorescencijos bangos ilgį (duomenys nerodomi), gavome optimalias kintamos srovės (pvz., 338 nm, Em: 448 nm) ir IS (pvz., 320 nm, Em: 434 nm) fluorescencijos aptikimo sąlygas.

HPLC analizės metodas buvo patvirtintas naudojant šias veikimo charakteristikas: stabilumas, tiesiškumas, jautrumas, tikslumas (kintamumas per dieną ir tarp dienų) ir tikslumas. Analitės transportavimo buferyje buvo laikomos 25 laipsnių temperatūroje tamsoje 24 valandas ir buvo išmatuotas jų stabilumas. Analitės buvo labai stabilios esant vitaminui C (0.4%), nes santykinis standartinis nuokrypis (RSD) smailių srityse buvo < 3,5%. Linijinės regresijos lygtis, koreliacijos koeficientas, tiesiškumo diapazonas, LOD ir LOQ AC, IS ir EC parodyta 2 lentelėje. LOD (18–30 nM) ir LOQ (60–100 nM) reikšmės rodo, kad HPLC-FLD ir HPLC-UV metodai yra labai jautrūs. Visos RSD vertės, išreiškiančios metodo tikslumą, buvo < 2% kintamumui per dieną ir tarp dienų, o tai rodo gerą tikslumą. Atkūrimo įvertinimui į transportavimo buferį buvo pridėta AC, IS ir EC, kad būtų gauti trys (aukštos, vidutinės ir mažos) koncentracijos lygiai. Metodo atkūrimo vertės analitims apibendrintos 3 lentelėje. Vidutinės išgavos vertės svyravo nuo 90,0% iki 96,4%, o tai rodo gerą tikslumą. Apibendrinant galima pasakyti, kad nustatyti HPLC metodai yra patenkinami dėl tiesiškumo, jautrumo, tikslumo ir tikslumo, norint kiekybiškai įvertinti AC, IS ir EC transportavimo buferyje.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKTAS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

PRE nustatymas biologinio tyrimo sistema

Biologinis tyrimas (bendras antioksidacinis pajėgumas) buvo pagrįstas FRAP (geležies redukcinės / antioksidacinės galios) tyrimu, kurį anksčiau aprašėme [16] ir patvirtinome tiesiškumo ir tikslumo požiūriu (kintamumas per dieną ir tarp dienų). Biologinio tyrimo metodo tiesiškumas buvo nustatytas remiantis kalibravimo kreivėmis. Tiesiškumo koncentracijos diapazonas buvo 0.0625–40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Nustatyto biologinio tyrimo metodo tikslumas buvo nustatytas atsižvelgiant į dienos ir dienos kintamumą PRE (10,0 ug/ml) analizei. Metodo pakartojamumas per dieną buvo nustatytas remiantis penkiais iš eilės tos pačios dienos nustatymais. Pakartojamumas tarp dienų buvo matuojamas remiantis penkiais iš eilės nustatymais trimis skirtingomis dienomis. Metodo tikslumo RSD vertės buvo atitinkamai 1,014% ir 4,72% kintamumui per dieną ir tarp dienų, o tai rodo gerą tikslumą. Taigi nustatytas biologinio tyrimo metodas yra patenkinamas tiesiškumo, tikslumo ir tikslumo PRE kiekybiniam įvertinimui transportavimo buferyje.

Ląstelių kultūros

Caco{{0}} ląstelės buvo auginamos 37 laipsnių temperatūroje ir 95 % santykinėje drėgmėje atmosferoje, kurioje yra 5 % CO2 ir terpėje, kurią sudaro DMEM, 10 % FBS, 1 % NEAA, 1 % L-glutamino, penicilino. (100 V/ml) ​​ir streptomicino (100 ug/ml). Terpė buvo keičiama kas antrą dieną ląstelių augimo ir diferenciacijos metu. Ląstelės buvo auginamos 75-cm2 plastikinėse kolbose ir kas 3–5 dienas surenkamos naudojant 0,05 % EDTA-tripsino. Transporto eksperimentams ląstelės buvo pasėtos 1 × 105 ląstelių/cm2 tankiu ant Transwell intarpų, padengtų kolagenu. Praėjus maždaug 21 dienai po sėjos, vienasluoksniai sluoksniai buvo naudojami transportavimo eksperimentams. Jų vientisumas buvo nustatytas matuojant trans-epitelinę elektrinę varžą (TEER) viename sluoksnyje naudojant EVOM su ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., JAV). Caco-2 ląstelių monosluoksnio TEER vertės turėjo viršyti 500 O∙cm2.

Transporto eksperimentai

Vienasluoksnis sluoksnis buvo plaunamas transportavimo buferiu (P-buferis, kuriame yra 10 mM HEPES, 1 mM natrio piruvato, 10 mM gliukozės, 3 mM CaCl2 ir 145 mM NaCl, pH 7,4) ir po to iš anksto inkubuojamas 20 min. esant 37 laipsnių. Pašalinus transportavimo buferį, šviežias transportavimo buferis, kuriame yra tiriamųjų mėginių, buvo įpiltas į viršūninę (AP) kamerą (1,5 ml) AP, kad būtų galima atlikti bazolaterinius (BL) krypties tyrimus, arba BL kamerą (2,5 ml) BL į AP krypties tyrimus. Atliekant AC, IS ir EC tyrimus naudojant HPLC, alikvotinė dalis (300 ul) buvo paimta iš kiekvienos imtuvo kameros skirtingais laiko intervalais (30, 60, 90 ir 120 min.). Imtuvo kamera po kiekvieno mėginio ėmimo buvo papildyta tokiu pat kiekiu šviežio pašildyto (37 laipsnių) transportavimo buferio. Surinkti mėginiai buvo laikomi –20 laipsnių temperatūroje tolesniam naudojimui. PRE nustatymui naudojant biologinį tyrimą, buvo paimti tik mėginiai po 120 min. Dėl PRE, AC, IS ir EC nestabilumo vitamino C buvo 0,4 % (m/t).

buvo pridėta siekiant stabilizuoti mėginius, siekiant nustatyti AC, IS ir EC kiekį HPLC, o PRE biologiniam tyrimui skirti mėginiai buvo tiriami iš karto po mėginių paėmimo. Apskaičiuota kiekvieno mėginio tariamasis pralaidumo koeficientas (Papp arba 'Papp).

Duomenų analizė

Papp reikšmės AC, IS ir EC kryptimis AP BL arba BLAP buvo apskaičiuotos remiantis šia lygtimi: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), kur Papp yra tariamasis pralaidumo koeficientas (cm/s), nustatytas HPLC. (4Q/4t) – bandomojo junginio (AC, IS arba EC) atsiradimo imtuvo pusėje greitis (μmol/s); A – įdėklo paviršiaus plotas (cm2 ); C0 yra pradinė tiriamojo junginio koncentracija donoro pusėje (μmol/ml). Konkrečiai, apskaičiuojant „Papp“ reikšmes, vietoj „μmol“ buvo naudojamas masės vienetas „ug“. Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SD.

Rezultatai

AC, IS ir EC sudėtis PRE iš CD

Kadangi AC, IS ir EC laikomi pagrindiniais bioaktyviaisCistanche rūšių PhG[8], mes analizavome jų turinį PRE per HPLC-UV. Tipinė chromatograma parodyta 1 pav. Šių sudedamųjų dalių identifikavimas buvo pagrįstas sulaikymo trukmės ir UV spektro palyginimu su autentiškų standartų esant 334 nm bangos ilgiui. AC, IS ir EC kiekis PRE buvo atitinkamai 26,60%, 1,84% ir 32,83%. Taigi šie trys junginiai sudaro 61,27 % PRE; be to, aukščiau pateikti rezultatai rodo, kad PhG kiekis PRE yra 78,4%. Todėl AC, IS ir EC sudaro maždaug 80% PRE PhG.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA INKSTU FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Bendras PRE, AC, IS ir EC antioksidacinis pajėgumas

Buvo pranešta apie CD PhG antioksidacinio aktyvumo tyrimus [9], o AC, IS ir EC sudaro maždaug 80 % PRE PhG. Taigi, bendras PRE, AC, IS ir EC antioksidacinis pajėgumas buvo ištirtas ir išreikštas naudojant FRAP reikšmes (× 10–6 mmol). Kaip parodyta 2 pav., kai FRAP vertė buvo 8 × 10–6 mmol, galutinės PRE, AC, IS ir EC koncentracijos buvo 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml ir 4,89 ug. /ml, o tai rodo, kad bendras šių keturių mėginių antioksidacinis pajėgumas buvo toks: AC > EC > PRE > IS. PRE biologinis aktyvumas priskiriamas jo veikliųjų medžiagų grupėms (AIG). Maždaug 60 % PRE, AC ir EC parodė stipresnį bendrą antioksidacinį aktyvumą nei PRE ir IS. Kadangi IS (1,84%) sudaro labai nedidelę PRE dalį, kiti komponentai, tokie kaip silpnai antioksidacinė IS, taip pat yra aiškiai aktyvūs PRE. Keista, bet bendras antioksidacinis aktyvumas tarp AC ir jo izomero IS skyrėsi beveik 7- kartus, o tai rodo, kad ne tik fenolio hidroksilo grupių skaičius [9], bet ir fenolio hidroksilo grupių padėtis molekulėje turėjo įtakos antioksidacinis poveikis.

Caco{0}} monosluoksnių patvirtinimas

Norint patvirtinti Caco-2 ląstelių vienasluoksnę sistemą, buvo nustatytos propranololio (gerai pernešamo žymeklio) ir Liuciferio geltonojo (blogai transportuojamo žymeklio) Papp vertės iš AP į BL per Caco-2 vienasluoksnius sluoksnius. nustatytas atitinkamai kaip 1,51 × 10–5 cm/s ir 2,8 × 10–7 cm/s, ir šios vertės sutapo su ankstesnėse ataskaitose paskelbtomis vertėmis [17, 18]. Šarminės fosfatazės aktyvumo tyrimas taip pat patvirtino, kad Caco-2 ląstelių monosluoksniai buvo kokybiškai panašūs į plonosios žarnos epitelį [19].

AC, IS ir EC pralaidumas

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), o prastai rezorbuojamų vaistų – mažas (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2 [20]. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

PRE pralaidumas

Pirmiau pateikti rezultatai rodo, kad bendras PRE antioksidacinis pajėgumas yra bent jau dėl 61,27% AIG iš PRE. Taigi, įvertinome PRE TR pagal jo bendro antioksidacinio pajėgumo koncentracijos ir poveikio kreivę ir apskaičiavome „Papp vertes, kad atspindėtų PRE transportavimo charakteristikas. AP!BL ir BL!AP PRE vertės „Papp“ buvo (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s ir (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, atitinkamai, tai rodo, kad šis junginys buvo prastai pralaidus. Be to, ištekėjimas ar aktyvus pernešimas nebuvo akivaizdus, ​​nes PRE santykis „Papp BL“ ir „AP“ / „Papp AP“ ir „BL“ buvo 1,45 [20]. Be to, dvikryptis PRE TR tiesiškai padidėjo maždaug nuo 300 iki 900 ug/ml (5 pav.). Rezultatų krypties pasirinkimo trūkumas rodo, kad pasyvi difuzija yra pagrindinis PRE transportavimo mechanizmas.

Diskusija

Palyginti su labai išgrynintais vaistiniais preparatais, PE paprastai yra mišiniai, susidedantys iš šimtų sudedamųjų dalių, turinčių labai skirtingas fizikines ir chemines savybes. Todėl PE dėl sudėtingo AIG [21] daro sistemingą, daugiataškį ir daugiakanalią sinerginį poveikį, kuris trukdo analizuoti PE transportavimo charakteristikas. Siekdami moksliškiau įvertinti PE transportavimo savybes, kai kurie tyrėjai nustatė kelis PE komponentus, o ne vieną komponentą [22–24]. Nepaisant to, ribotas sudedamųjų dalių skaičius negali atspindėti visos PE kaip visumos. Tačiau visų PE komponentų nustatyti neįmanoma. Be to, jei skirtingi PE komponentai turi visiškai skirtingas transportavimo charakteristikas, bus sunku nustatyti visapusiškas PE transportavimo charakteristikas.

Dešimtajame dešimtmetyje antimikrobinių medžiagų TR buvo naudojamos biologinių tyrimų sistemos [25]. Iki 2005 m. Eguchi ir jo kolegos [26] įvertino morkų ekstrakto antioksidacinį aktyvumą, naudodami BL terpę iš diferencijuotų Caco{5}} ląstelių; šis metodas labiau tinkamas in vivo situacijoms atspindėti.

Remiantis ankstesne PhG aktyvumo ataskaita [9] ir mūsų rezultatais (2 pav.), AIG TR PRE gali būti įvertintas nustatant bendrą imtuvo kameroje esančios terpės antioksidacinį pajėgumą. Po transportavimo eksperimentų nustatėme, kad PRE TR buvo panašus abiem kryptimis, o šis pernešimas buvo nesotus ir prastai absorbuojamas („Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s) [3] ir jis nenurodė ištekėjimo, o tai rodo, kad pasyvi difuzija žemyn koncentracijos gradientu yra pagrindinis PRE transportavimo mechanizmas (5 pav.). Be to, PRE transportavimo charakteristikos atitinka AC, IS ir EC, veiksmingų komponentų, kurie pasižymi antioksidaciniu aktyvumu PRE, charakteristikas (4 pav. ir 4 lentelė). Šis rezultatas buvo tikimasi ir parodė, kad dabartinė biologinio tyrimo sistema yra tinkama ir patikima vertinant AIG transportavimo charakteristikas PRE diferencijuotose Caco{12}} ląstelėse.

Skirtingai nuo kanoninės Papp vertės, kuri dažniausiai naudojama vieno junginio pernešimui atspindėti, 'Papp vertė, gauta iš TR, remiantis koncentracijos ir poveikio kreive, gali ne tik atspindėti komponentus, kurie prasiskverbia į nepažeistos struktūros monosluoksnius, bet. taip pat apima kitus veiksnius, susijusius su tiksline veikla, pvz., komponentų metabolitai, chemiškai suskaidyti produktai ir net kai kurie citokinai, išskiriami iš Caco-2 ląstelių reaguojant į stimuliaciją, galinčią paveikti tikslinį biologinį aktyvumą. Taigi, pirmiau minėtas daugiafaktorius, o ne tik transportuojami nepažeisti komponentai, nustato „Papp“ vertę. Todėl „Papp gali stipriau koreliuoti su in vivo situacijomis nei kanoninė Papp reikšmė [26]. Šiame tyrime mes išsiaiškinome pasyviai išsklaidytą ir prastai absorbuotą PRE pobūdį, remdamiesi jo „Papp“ verte, ir šis pobūdis gali būti susijęs su didelėmis dozėmis ir ilgu klinikinio CD gydymo laikotarpiu [27]. Nepaisant to, šios išvados suteiks gydytojams sistemingesnių nurodymų, kaip taikyti CD, kai buvo nustatytos tik daugumos AIG CD, o ne tik PhG, transportavimo charakteristikos.

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE EKSTRAKTAS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tačiau pasirinktas biologinio aktyvumo elementas turi būti pakankamai jautrus, kad būtų aptiktas imtuvo kameros terpėje, o tai yra iššūkis kuriant biologinio tyrimo sistemą, skirtą PE transportavimo savybėms įvertinti. Be to, biologinis aktyvumas taip pat turėtų priklausyti nuo kuo daugiau komponentų. Mūsų tyrime bendro antioksidacinio pajėgumo tyrimas buvo tinkamesnis nei keli kiti metodai (S1 pav.). Tačiau net ir tokiu atveju mūsų tyrimas gali aptikti PRE TR tik 120 min.

Šiuo tyrimu bendrai buvo sukurta nauja biologinio tyrimo sistema, skirta įvertinti PRE žarnyno pralaidumą diferencijuotose Caco{0}} ląstelėse. Gauti rezultatai parodė, kad prastai absorbuojama pasyvi difuzija žemyn koncentracijos gradientu be ištekėjimo yra pagrindinis PRE transportavimo mechanizmas (5 pav.), kuris suteikia farmakokinetinį pagrindą klinikiniam PhG pritaikymui CD. Naujos biologinio tyrimo sistemos naudojimas siekiant įvertinti TR ir taip apskaičiuoti „Papp vertes, kad būtų galima įvertintižarnyno transporto savybėAIG PĮ yra įmanomas. Šis metodas taip pat gali būti tinkamas kitoms PE, jei yra atitinkamas biologinis aktyvumas.