Gėlių ekstraktai kaip daugiafunkciniai dažai kosmetikos pramonėje 2 dalis

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Daugelis natūralių produktų yra naudojami tradicinėse medicinos sistemose skausmo ir uždegimo simptomams malšinti, [61] Todėl buvo ištirtas analizuojamų ekstraktų poveikis lipoksigenazės ir proteinazės aktyvumo slopinimui. Analizuotų koncentracijų diapazone (100-500 ug/mL) CTE vandens ekstraktas parodė stipriausią gebėjimą slopinti proteinazę (4 pav.) (57 proc., kai koncentracija 500 ug/mL). Šis aktyvumas buvo lyginamas su gerai žinomu proteinazės inhibitoriumi diklofenaku, naudotu kaip kontrolė (apie 89 proc. slopinimas esant didžiausiai tirtai koncentracijai). Tačiau panašūs rezultatai gauti su GGE ir KTE ekstraktu (atitinkamai apie 56 proc. ir 53 proc., esant didžiausiai koncentracijai). Mažesnis proteinazės slopinimas buvo pastebėtas PRE ir PGE ekstraktams. Atliekant kitą bandymą, kuriuo matuojamas gebėjimas slopinti lipoksigenazę, vandeniniai KTE ir CTE ekstraktai rodo didžiausias vertes (atitinkamai apie 67 proc. ir 64 proc. slopinimo, kai koncentracija 500 ug/mL). Diklofenakas taip pat buvo naudojamas kaip kontrolinis. GGE, PGE ir PRE ekstraktai taip pat pasižymi labai didelėmis vertėmis (atitinkamai 60 proc., 57 proc. ir 54 proc.) Taip pat pastebėta, kad gebėjimas slopinti LOX ir proteinazės fermentus priklauso nuo ekstrakto koncentracijos (5 pav.).

Ankstesni tyrimai parodė, kad daugelis polifenolinių junginių reikšmingai prisidėjo prie daugelio augalų ekstraktų priešuždegiminio poveikio[62]. Tyrimai parodė, kad ROS dalyvauja uždegiminiame procese, o fenoliniai junginiai, tokie kaip galas ir chino rūgštis, gali blokuoti arachidono rūgšties metabolizmą, slopindami lipoksigenazės aktyvumą, arba gali būti naudojami kaip reaktyviųjų laisvųjų radikalų, kurie susidaro veikiant arachidono rūgštimi, šalinimui. [63]. Rezultatai, gauti BenSaad ir kt. rodo, kad ellago rūgštis, galo rūgštis ir punikalaginas A&B, išskirtas iš P. granatum, slopino azoto oksido (NO), prostaglandino E2 (PGE2) ir interleukino 6 (IL-6) gamybą lipopolisacharidų (LPS) sukeltame. RAW 267,4 makrofagai. Vis dar lieka klausimas, ar šie junginiai veikia kaip vieninteliai agentai, ar turi sinerginį poveikį [64]. Kadangi daugelis flavonoidų pasižymi priešuždegiminėmis savybėmis, dėl jiems būdingo antioksidacinio elgesio jie buvo susiję su įvairiais uždegiminiais sutrikimais.flavonoidų ekstrahavimo metodas pdf,Visų pirma, kvercetinas yra įdomiausia molekulė, nes ji trukdo specifiniams biologiniams keliams. Be to, tyrimai rodo, kad taikant skirtingus mechanizmus, jis gali sumažinti uždegiminį procesą, dalyvaujantį keliuose modeliuose[65]. Visų pirma, AMP aktyvuota baltymų kinazė ir histono / baltymo deacetilazės (AMPK / SIRT1) kelias lemia įdomesnį uždegimo valdymą. Taigi AMPK aktyvatoriai gali sumažinti makrofagų uždegimą. Kvercetinas ir kiti flavonoidai, kaip AMPK ir SIRT1 aktyvatoriai, gali sumažinti uždegimą, trukdydami šiam keliui [66]. Taip pat buvo įrodyta, kad kvercetinas ir kvercetino monogliukozidai turi didesnį LOX slopinimo potencialą [67] Nair ir kt. parodė KTE ekstrakto priešuždegimines savybes, įvertinę flavonolių su kvercetino dalimi, pvz., manghaslin Qu 3-[2G] ramnosilrutinozido, Qu 3-O-dirhamnozido ir rutino, buvimą. Šios molekulės stipriai slopina COX{11}} aktyvumą ir iš dalies slopina ROS. Apskritai, polifenoliai, esantys CTE, turėjo priešuždegiminių savybių LPS sukeltame uždegime RAW 264.7 makrofagų ląstelėse[68].

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

2.5. Citotoksiškumo įvertinimas

Kuriant naujas kosmetikos žaliavas, viena iš svarbiausių savybių yra jų naudojimo saugumas. Medžiagos, skirtos naudoti kosmetikoje, turi būti netoksiškos, ypač odos ląstelėms, pvz., keratinocitams ir fibroblastams. Išanalizuotų ekstraktų toksiškumui HaCaT ir BJ ląstelėms nustatyti buvo naudojami dviejų tipų bandymai.flavonoidųPirmasis tyrimas, naudojant neutralios raudonos spalvos įsisavinimo tyrimą, leidžia įvertinti ląstelių, apdorotų analizuojamais ekstraktais, gyvybingumą. Šis dažiklis patenka į gyvos ląstelės lizosomas ir išsiskiria į negyvų ląstelių citoplazmą. Pastebėta (6 pav.), kad CTE ekstraktas turi didžiausią gebėjimą padidinti tiek HaCaT, tiek BJ ląstelių proliferaciją. Palyginti su kontroliniu, šis ekstraktas pasiekė maždaug 20 procentų ir 40 procentų didesnes vertes nei tiriamas parametras, kai koncentracija buvo atitinkamai 250 μL/mL (HaCaT ir B】) ir 500 μL/mL (BJ ląstelės). GGE ekstraktas, kurio koncentracija yra 100 ir 250 μL / ml, ir KTE ekstraktas, kurio koncentracija yra 500 μL / ml, pasižymėjo nedideliu toksišku poveikiu BJ ląstelėms. Kiti ekstraktai turėjo teigiamos įtakos šių ląstelių gyvybingumui. 100 μL/mL koncentracijos PRE ir PGE ekstraktai reikšmingai nesiskyrė nuo kontrolinių ir padidino BJ ląstelių proliferaciją maždaug 10-15 proc., palyginti su kontroline 250 ir 500 μL/ koncentracija. ml. Keratinocitų atveju ląstelių gyvybingumas nesumažėjo. PGE, PRE ir CTE ekstraktų atveju buvo pastebėtas proliferacijos padidėjimas didėjant koncentracijai, o ląstelių gyvybingumo sumažėjimas buvo parodytas didėjant KTE ir GGE ekstraktų koncentracijai.

Antrasis bandymas, atliktas tirtų ekstraktų citotoksiškumui nustatyti, buvo resazurino testas (Alamar Blue). Buvo parodyta (7 pav.), kad ląstelių gyvybingumas priklauso nuo ekstrakto, su kuriuo ląstelės buvo inkubuojamos, koncentracijos. Fibroblastų atveju PRE, PGE ir CTE ekstraktai sukelia didesnį ląstelių proliferaciją, padidėjus jų koncentracijai. Esant didžiausiai analizuotai koncentracijai (500 μL/mL), buvo pastebėta apie 20 procentų didesnė proliferacija, palyginti su kontroline medžiaga.hesperidino vartojimasKTE ir GGE ekstraktų atveju pastebėtas ląstelių gyvybingumo mažėjimas, padidėjus ekstraktų koncentracijai. Šie ekstraktai parodė nedidelį toksinį poveikį BJ, kai koncentracija buvo 250 ir 500 μL / ml. Keratinocitų atveju buvo pastebėtas panašus tirtų ekstraktų poveikis odos ląstelėms, tačiau jų gebėjimas daugintis nebuvo toks stiprus kaip fibroblastų. Didžiausias gebėjimas padidinti keratinocitų proliferaciją buvo pastebėtas CTE ekstraktui visame analizuojamų koncentracijų diapazone. Panašios vertės gautos PRE ekstraktui, kai koncentracija yra 250 μL/mL, ir PGE ekstraktui, kai koncentracija 500 μL/mL. KTE ekstraktas parodė žymiai didesnį toksinį poveikį HaCa ląstelėms nei GGE ekstraktas.

Analizuotų ekstraktų toksiškumas odos ląstelėms anksčiau nebuvo nuodugniai ištirtas. Yra tik keli ekstraktų arba jų pagrindinių veikliųjų medžiagų citotoksiškumo tyrimai, ypač su vėžinėmis ląstelėmis. Ankstesnių tyrimų autoriai nurodė, kad šie ekstraktai paprastai neturi toksinio poveikio odos ląstelėms, o jų gebėjimas padidinti ląstelių dauginimąsi dažniausiai siejamas su dideliu polifenolių, antocianinų ir flavonoidų kiekiu [45, 69-73 ]. Kai kurie autoriai taip pat nurodė, kad atskiri ekstraktuose esantys komponentai gali turėti toksinį poveikį odos ląstelėms, o visas ekstraktas – ne. Ali Hijazi ir kt. [69] parodė, kad iš Punica granatum išgauti alkaloidai yra toksiški normalioms ir vėžio ląstelių linijoms, o visas ekstraktas yra mažiau toksiškas. Nasiri ir kt. tyrimas. [70] rodo, kad Punica granatum gėlių ekstraktas gali būti naudingas greitinant žaizdų gijimo procesą, nes jis gali padidinti odos ląstelių dauginimąsi. Ankstesniuose mūsų tyrimuose [45] buvo įrodyta, kad vandens-etanolio ekstraktai, gauti iš analizuojamų augalų, pasižymi didesniu gebėjimu padidinti BJ ląstelių dauginimąsi, o KTE ir GGE ekstraktai parodė mažesnį toksinį poveikį šioms ląstelėms. .prarasta imperija cistancheVandens-etanolio ekstraktų poveikis HaCaT ląstelėms buvo panašus į grynų vandeninių ekstraktų, tačiau su etanoliu gautų ekstraktų atveju pastebėtos šiek tiek palankesnės proliferacijos savybės nei vandeninių ekstraktų. Dėl abiejų analizuojamų ekstraktų tipų sudėties skirtumų gali skirtis jų toksiškumas. Kaip parodyta, vandens ekstraktuose nėra tiek daug biologiškai aktyvių ingredientų, kiek vandens ir etanolio ekstraktuose. Didžiausi rutino ir izokvercitrino kiekio skirtumai.

Cistanche gali kovoti su senėjimu

2.6.Apsaugos nuo saulės faktoriaus nustatymas

Nepalankus UV spinduliuotės poveikis odai gali išryškėti tiek netrukus po poveikio, tiek net po metų. Saulės spinduliuotė turi imunosupresinį poveikį, kuris pagreitina odos senėjimo procesą ir visas su juo susijusias pasekmes, įskaitant padidėjusią kancerogenezę[74]. Šiuo metu stebimos tendencijos rodo, kad didėja poreikis kurti produktus, pasižyminčius ne tik labai aukštu naudojimo saugos lygiu, bet ir daugiafunkciškumu ta prasme, kad produktai turės odos antiradiacinę apsaugą, kurios veikimo sritis bus platesnė nei buvo iki šiol. Šiuo aspektu neįkainojamą vaidmenį atlieka kai kurios augalinės medžiagos, kurios gali ne tik apsaugoti nuo saulės, bet ir neutralizuoti jau esamą neigiamą saulės spinduliuotės poveikį odai [75-77]. Atlikti tyrimai parodė, kad analizuojami augalų ekstraktai PRE, PGE, KTE, CTE, GGE pasižymi aukštais SPF koeficientais.

Koeficientų (SPF) analizė atlikta gautiems vandens ekstraktams iš minėtų augalų, kurių koncentracija 10 ir 50 mg/mL. Kiekvienam tirtam augalui didesnė ekstrakto koncentracija lėmė žymiai didesnę SPF vertę.mikronizuota išgryninta flavonoidų frakcija 1000 mgEkstraktų palyginimas rodo, kad didžiausios SPF vertės buvo stebimos KTE ekstraktui, kuris galioja abiem tirtoms koncentracijoms. Kitas įdomus pastebėjimas yra tas, kad net esant žemesnei iš tirtų koncentracijų KTE ekstraktas vis dar pasižymėjo dideliu SPF, o kitų ekstraktų vertės pastebimai sumažėjo. Tai aišku, kai analizuojame, kiek KTE rezultatas buvo didesnis nei kitų ekstraktų. 50 mg/ml koncentracijai SPF buvo 1,2 karto didesnis (palyginti su PGE, CTE) iki beveik 1,9 koeficiento (lyginant su PRE, GE). Tas pats 10 mg/ml koncentracijos skaičiavimas duos veiksnius nuo 1,4 (palyginus su PGE) iki diapazono faktorių 2-3 (lyginant su CTE, GGE), net iki tokių veiksnių kaip 10, lyginant su PRE. Sutelkiant dėmesį į KTE ekstraktą, galima pastebėti, kad 5 faktoriumi mažėjant ekstrakto koncentracijai (nuo 50 mg/mL vertės iki 10 ml/mL vertės), SPF vertė sumažėja 3,4 faktoriumi. o tai reiškia, kad SPF mažėja lėčiau nei koncentracija. Tai, kas išdėstyta pirmiau, rodo, kad KTE ekstraktas gali būti efektyvus net tada, kai naudojamas mažomis koncentracijomis (8 pav.).

2.7. Transepiderminio vandens netekimo (TEWL) ir odos hidratacijos matavimai

Dėl plataus augalinių žaliavų biologinio ir farmakologinio aktyvumo, ekstraktuose esančios augalinės medžiagos daro didelę įtaką odos būklei. Visų pirma čia kalbame apie antrinių metabolitų įtaką mūsų odos būklei [78,79].

Kitame tyrimo etape buvo atliekamos hidratacijos ir TEWL analizės. Buvo įvertintas tirtų ekstraktų poveikis odai. Matavimai buvo atlikti du kartus po 60 ir 360 min., kai ekstrakto koncentracija buvo 10 mg/ml. Atliekant TEWL matavimą, didžiausias procentinis sumažėjimas buvo parodytas PGE ekstraktui, kur kontrolinė vertė 13,9 sumažėjo iki 8,71, todėl procentas sumažėjo 37 procentais. Taip pat verta analizuoti KTE ekstraktą iš šios perspektyvos, nes tai buvo didžiausias SPF vertės. KTE ekstrakto TEWL kontrolinė vertė sumažėjo iki 10,22, o tai reiškia, kad sumažėjo 26 procentais (9A pav.).

Tačiau antrojo instrumentinio matavimo atveju buvo įrodyta, kad analizuoti ekstraktai padidina drėkinimą, palyginti su kontroliniu mėginiu, tiek po 60, tiek po 360 min.

Atlikus analizes buvo nustatyta, kad analizuoti PRE, PGE, KTE, CTE ir GGE ekstraktai didina odos drėkinimą (9B pav.). Pastebėtas drėkinamųjų savybių padidėjimas kartu su ekstrakto koncentracijos preparatuose padidėjimu. Stipriausios drėkinamosios savybės pastebėtos PRE ir PGE ekstraktams – 32 proc. ir 29 proc. po 60 min. ir 21 proc. ir 22 proc. po 360 min. Tačiau mažiausias odos drėkinimo lygis nustatytas KTE ekstraktui – 18 proc. po 60 min. ir beveik 3 proc. po 360 min.

2.8. Taikymo analizė

2.8.1. Ekstraktų spalvinių parametrų nustatymas

Dėl natūralios spalvos augalų žiedų veikliosios medžiagos gali būti naudojamos kaip natūralūs dažai daugelyje komercinių produktų, tokių kaip kosmetika ir maistas. Gautiems ekstraktams atlikta spalvų analizė (5 lentelė).

Nustatyta, kad PRE, KTE ir CTE ekstraktai turi didžiausią potencialą kaip natūralūs kosmetikos pigmentai. Tačiau didžiausios chromos vertės (C*) buvo pastebėtos CTE. Remiantis h laipsnio parametro verte, buvo nustatyta, kad būtent geltona šio ekstrakto spalva yra stebima ir matoma plika akimi. KTE ir PRE ekstraktų atveju, nepaisant mažos C* vertės (2,8), šių ekstraktų spalva gali būti aiškiai matoma plika akimi ir buvo nurodyta kaip raudonai violetinė PRE ir mėlynai violetinė KTE ekstraktui. PGE ir GGE vandens ekstraktai buvo rausvos ir šiek tiek oranžinės spalvos, o gautos chromos vertės buvo 1,3 lygio. Šios spalvos atveju šios vertės nebuvo pastebimos plika akimi.

2.8.2. Kosmetikos spalvinių parametrų nustatymas pagal ekstraktus

Pastaraisiais metais buvo didelis poreikis kurti naujus natūralios kilmės dažus, ypač maisto ir kosmetikos pramonėje. Palyginti su dažikliais, gautais sintetiniu būdu, jie gali turėti mažesnį neigiamą poveikį žmonių sveikatai ir aplinkai [80]. Gauti ekstraktai buvo panaudoti micelinio makiažo valiklio skysčio formavimui. Kiekvienoje formulėje jie buvo naudojami 1 proc. Modelinės kosmetikos spalvinių parametrų rezultatai pateikti 6 lentelėje.

Pastebėta, kad 1 procento vandens ekstraktų iš PRE, PGE, CTE ir GGE pridėjimas reikšmingai paveikė makiažo valiklio spalvą. Kiekvienas mėginys buvo aiškiai matomas plika akimi. PRE ekstraktas pakeitė kosmetikos spalvą į oranžinę, o PGE, CTE ir GGE ekstraktas – į geltoną.

Galimybę naudoti analizuojamus ekstraktus kaip galimus dažus patvirtina santykinai didelės △Makiažo valiklis su ekstraktu/bazinis makiažo valiklis, o tai rodo reikšmingą modelio kosmetikos spalvos pasikeitimą pridėjus palyginamo ekstrakto. prie pagrindinio mėginio (nepridedant ekstraktų). Literatūros duomenys [73] rodo, kad jei AE reikšmės yra didesnės nei 5, spalva yra suvokiama nuogas išvakarėse ir suvokiama kaip spalvos efektas. Makiažo valiklių, kurių sudėtyje yra PRE, KTE ir CTE ekstraktų, AE vertės buvo atitinkamai 8,83, 9,17 ir 8,14. Produktų su PGE ir GGE ekstraktais atveju reikšmingos ekstrakto įtakos preparato spalvai nepastebėta. AE reikšmės yra 2 diapazone.{12}}.82. Tai reiškia, kad spalvų skirtumą gali pastebėti tik patyręs stebėtojas [80,81].

3. Medžiagos ir metodai

3.1. Augalinės medžiagos ir gavybos procedūra

Tyrime naudota augalinė medžiaga – sausi P. rhoeas L., P.granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. ir G.globosa L. žiedai, gauti iš vietinės vaistažolių parduotuvės. . Ekstrahavimo procesas buvo atliktas ultragarsinėje vonioje (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berlynas, Vokietija), kuris buvo atliktas Yang ir kt. aprašytu metodu.[82]. Tirtų augalų vandens ekstraktams ruošti panaudota 10 gramų sausų gėlių ir 100 g vandens. Procesas buvo atliktas 20 minučių kambario temperatūroje. Gauti ekstraktai buvo surinkti ir tris kartus filtruojami per Whatman Nr. 1 filtravimo popierių. Po filtravimo ekstraktai išgarinami sumažintame slėgyje 40 °C temperatūroje. Iš džiovintų ekstraktų buvo paruoštas 100 mg/ml koncentracijos pradinis tirpalas ir laikomas tamsoje 4 laipsnių temperatūroje iki tolesnės analizės. Naudojamos šios santrumpos: PRE – Papaver rhoeas ekstraktas, PGE – Punica granatum ekstraktas, GGE – Gomprena globosa ekstraktas, CTE – Carthamus tinctorius ekstraktas, KTE – Clitoria ternatea ekstraktas.

3.2. Bioaktyvių junginių nustatymas HPLC-UV-ESI-MS

Gauti ekstraktai buvo analizuojami, siekiant nustatyti jų pagrindinius biologiškai aktyvius junginius naudojant HPLC (DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA), su masės spektrometru (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Kanada), su elektropurškimo jonizacijos šaltiniu (ESI) ir trigubo kvadrupolio jonų gaudyklės mase analizatorius. Chromatografinis atskyrimas buvo pasiektas naudojant gradiento atvirkštinės fazės sistemą. Be to, iš Phenomenex įsigyta 100 × 4,6 mm chromatografinė kolonėlė Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A su izobutilo šoninėmis grandinėmis ir stacionariąja faze su TMS galo dangteliu, naudojama su panašios sudėties apsaugine kolonėle, ir palaikoma 30 laipsnių . Dvejetainė tirpiklių sistema, kurią sudaro 0,1 % (o/v) vandeninės skruzdžių rūgšties kaip tirpiklio A ir metanolio kaip tirpiklio B, buvo naudojama gradiento režimu 19,1 min. Taikytos šios eliuavimo sąlygos: 0.0-15.0 min 25-100 proc. B,15.0-17.0 min 100 proc. B,17.0-17.1 min. 100-25 proc. B,17.1-19.1 min. 25 proc. B. Judančios fazės srautas buvo 0,6 ml/min., o injekcijos tūris – 10 μL. Eliuentas buvo stebimas elektropurškimo jonų masės spektrometru (ESI-MS) neigiamų jonų režimu ir nuskaitomas nuo m/z 20 iki 1000 Da. Kiekybinei analizei trigubas kvadrupolis MS detektorius veikė kelių reakcijų stebėjimo (MRM) nuskaitymo režimu. Eksperimentiškai nustatytos optimalios masės analizatoriaus sąlygos ir produktų jonų parinkimas atskiriems junginiams. Šiuo tikslu naudojant infuzinę pompą, veikiančią nuolatinio mėginio tiekimo režimu, buvo įvesti standartiniai tiriamų junginių tirpalai (1 ng/mL) judriosios fazės kompozicijoje. Įsitikinus, kad buvo pasirinktas teisingas pirmtako jonas, kiekvienam MRM perėjimui buvo optimizuotas išskaidymo potencialas (DP), įėjimo potencialas (EP), susidūrimo elemento išėjimo potencialas (CXP) ir susidūrimo energija (CE) (S1 lentelė). Buvo stebimi du MRM perėjimai, vienas – kiekybiniam įvertinimui, kitas – patvirtinimui. MS parametrai buvo nustatyti taip: kapiliarinė temperatūra 600 C, užuolaidinės dujos 35 psi, purkštuvo dujos 60 psi ir džiovinimo dujos 50 psi. Bioaktyvių junginių nustatymui taikyta neigiamo jonizacijos režimo šaltinio įtampa -4500 V. Azotas buvo naudojamas kaip uždanga ir susidūrimo dujos. Duomenų analizė buvo apdorota Analyst 1.5.1 programine įranga. Pasirinktų junginių identifikavimas buvo atliktas pagal kiekvieno atskiro junginio molekulinę masę ir anijonų fragmentą ir patvirtintas MS2 suskaidymu. Devynių junginių tapatybės buvo nustatytos kartu su jų chemine formule, deprotonuotais molekuliniais jonais ir kiekvienos atskiros smailės būdingais fragmento jonais. Šeši junginiai buvo kiekybiškai įvertinti remiantis kalibravimo kreive, sukurta naudojant intensyviausių analizės standartų MRM perėjimų smailių plotus. Detektoriaus atsako tiesiškumas kiekybiškai įvertintiems junginiams buvo parodytas suleidus kalibravimo etalonus aštuoniais koncentracijos lygiais nuo 0,01 ug/mL iki 2 ug/mL. Kalibravimo kreivės buvo tiesinės, o koreliacijos koeficientai (R) buvo didesni nei 0,99. Jei mėginiai nepatenka į CMS detektoriaus tiesinį diapazoną, mėginiai buvo atskiesti.

Analitiniai chino rūgšties, galo rūgšties, kavos rūgšties, kafeoilchino rūgščių (CQA, du izomerai: 3- ir 5-CQA) ir kvercetino analitiniai standartai buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV ). Visi naudojami etalonai buvo analitinės kokybės (2 grynumas didesnis arba lygus 99 proc.).

Standartiniai pradiniai tirpalai buvo paruošti tiksliai pasveriant ir ištirpinant 20 mg kiekvieno etalono 10 ml LC-MS laipsnio metanolio, kad būtų gauta 2 mg/ml koncentracija. Serijiniai skiedimai po 2.{10}} ug/mL, 1,5 ug/mL, 1.0 ug/mL, 0,5 ug/mL,0 Tada naudojant LC-MS metanolio tirpalą buvo pagaminti 0,1 ug/mL, 0,05 ug/mL, 0,02 ug/mL ir 0,01 ug/mL. Kiekybinio nustatymo riba (LOQ) buvo apibrėžta kaip 0,01 ug/ml.

LC-MS/MS tyrimas buvo atliktas trimis egzemplioriais. Gauti duomenys pateikti kaip vidurkiai ± standartiniai nuokrypiai.

3.3. Antioksidacinių savybių nustatymas

3.3.1.ABTS· plius praplovimo tyrimas

Pirmiausia ABTS tirpalas buvo paruoštas sumaišant 19,5 mg ABTS ir 3,3 mg kalio persulfato su 7 ml fosfatiniu buferiu (pH{5}},4) ir tirpinamas 16 valandų tamsoje. Tada tirpalas buvo praskiedžiamas iki maždaug 1 0 absorbcijos. Sugertis buvo matuojama esant bangos ilgiui 入{10}} nm. Tada 20 ml KTE, PGE, PRE, CTE ir GGE ekstraktų (10 100 250 500 ug / ml) buvo sumaišyti su 980 ml praskiesto ABTSe ​​plius tirpalo ir inkubuojami 10 minučių tamsoje. Kitame etape paruoštų mėginių absorbcija buvo matuojama esant 入=734 nm, naudojant UV/VIS spektrofotometrą Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Kaip ruošinys buvo naudojamas distiliuotas vanduo. ABTS plius praplovimas buvo apskaičiuotas pagal (1) lygtį:

čia: As – mėginio sugertis; Ac – kontrolinio mėginio absorbcija. Kiekvieno ekstrahuoto mėginio matavimai buvo atlikti trimis egzemplioriais. Procedūrą aprašė Gawel-Beben ir kt. [83].

3.3.2. DPPH radikalų pašalinimo tyrimas

Ekstraktų gebėjimas sunaikinti laisvuosius radikalus buvo atliktas naudojant Brand-Williams et al. [84]. Jis pagrįstas 1,1-difenil-2-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalo naudojimu. Pirmiausia 33 μL ekstraktų vandeninių tirpalų, kurių koncentracija yra 100 ug/ml, buvo sumaišyti su 167 μL metanolio DPPH (4 mM) tirpalu ir perkelti į 96- šulinio plokštelę, tada sumaišyti purtant. Vėliau mėginių absorbcija buvo išmatuota esant 517 nm bangos ilgiui. Matavimai buvo atliekami kas 5 min. 30 min UV-VIS Filter Max入=5 spektrofotometru (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Kiekvienam ekstraktui buvo atlikti trys nepriklausomi pakartojimai. Vanduo su DPPH tirpalu buvo naudojamas kaip kontrolė. Antioksidacinis pajėgumas buvo išreikštas DPPH slopinimo procentais, naudojant (2) lygtį:

čia: As – mėginio sugertis; Ac – kontrolinio mėginio absorbcija. Kiekvieno ekstrahuoto mėginio matavimai buvo atlikti trimis egzemplioriais.

3.3.3. Reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) tarpląstelinio lygio aptikimas

Norint nustatyti analizuojamų ekstraktų gebėjimą generuoti intracelulinę reaktyviųjų deguonies rūšių gamybą HaCaT ir BJ ląstelėse, buvo naudojami fluorogeniniai H, DCFDA dažai. Šis junginys turi galimybę patekti į ląsteles pasyvios difuzijos būdu, kur yra deacetilinamas tarpląstelinių esterazių į nefluorescencinį junginį. Jei ląstelėje yra reaktyviųjų deguonies rūšių, šis junginys paverčiamas labai fluorescenciniu DCF. Norint nustatyti tarpląstelinį ROS lygį HaCaTs ir BJ, ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles. Tada ląstelės buvo auginamos inkubatoriuje 24 valandas. DMEM terpė buvo pašalinta ir pakeista 10 μM H2DCFDA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, JAV), ištirpinta DMEM terpėje be serumo. HaCaT ir BJ ląstelės buvo inkubuojamos H, DCFDA 45 minutes, o po to inkubuojamos su ekstraktais, kurių koncentracija ∶ 100, 250 ir 500 ug/ml. Ląstelės, apdorotos 1 mM vandenilio peroksidu (H2O2), buvo naudojamos kaip teigiamos kontrolės. Kontroliniai mėginiai buvo ląstelės, neapdorotos tiriamais ekstraktais. DCF fluorescencija buvo matuojama kas 90 minučių, naudojant FilterMax F5 mikroplokštelių skaitytuvą (Thermo Fisher Scientific), esant maksimaliam 485 nm sužadinimui ir 530 nm emisijos spektrui [85].

3.4. Matricos metalopeptidazių slopinimo įvertinimas

3.4.1.Antielastazės aktyvumo nustatymas

Norint nustatyti matricos metaloproteinazės, neutrofilų elastazės (NE) slopinimo galimybę, buvo pritaikytas fluorometrinis rinkinys (Abcam, ab118971). Bandymas buvo atliktas pagal instrukcijas, pridėtas prie rinkinio, ir metodiką, aprašytą Niziol-Lukaszewska ir kt. [86]. Analizė buvo atlikta standartinėje 96-šulinėlių plokštelėje su skaidriu plokščiu dugnu. Analizei buvo naudojami 100 ir 250 ug/ml koncentracijos augalų ekstraktai. Iš pradžių NE fermentų tirpalai, NE substratas ir inhibitorių kontrolė (SPCK) buvo paruošti pagal instrukcijas. Praskiestas NE tirpalas buvo įpiltas į visas šulinėles, o po to į kitus šulinėlius įpilami tiriamieji mėginiai, inhibitorių kontrolė ir fermento kontrolė (tyrimo buferis). Po to mėginiai buvo sumaišyti ir inkubuojami 37 laipsnių temperatūroje 5 minutes. Tuo tarpu reakcijos mišinys buvo paruoštas sumaišant tyrimo buferį ir NE substratą. Mišinys įpilamas į kiekvieną šulinėlį ir gerai išmaišomas. Fluorescencija buvo išmatuota nedelsiant, kai sužadinimo bangos ilgis 入=400 nm ir emisija 入=505 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). mėginiai buvo apskaičiuoti pagal (3) lygtį:

Galutinis rezultatas buvo trijų nepriklausomų matavimų aritmetinis vidurkis.

3.4.2. Antikolagenazės aktyvumo nustatymas

Norint įvertinti gautų ekstraktų gebėjimą slopinti kolagenazės aktyvumą, buvo pritaikytas fluorometrinis rinkinys (Abcam, Cambridge, UK, ab211108). Bandymas buvo atliktas pagal instrukcijas, pridėtas prie rinkinio, ir metodiką, aprašytą Niziol-Lukaszewska ir kt. [86]. Analizės buvo atliktos standartinėje 96-šulinėlių plokštelėje su skaidriu plokščiu dugnu. Analizei buvo naudojami 100 ir 250 ug/ml koncentracijos augalų ekstraktai. Pirmiausia kolagenazė (COL) buvo ištirpinta kolagenazės analizės buferyje (CAB). Tada analizuoti mėginiai buvo įtraukti į COL ir CAB. Inhibitoriaus kontroliniai mėginiai buvo paruošti sumaišius kolagenazės inhibitorių (1,10-fenantroliną (80 mM) su kolagenaze ir CAB buferiu. Fermentų kontroliniai šulinėliai buvo paruošti sumaišant praskiestą COL su CAB. CAB buferis buvo naudojamas kaip fono kontrolė Tada mėginiai buvo inkubuojami kambario temperatūroje 15 min. Kolagenazės substratą sumaišant su CAB buvo paruoštas reakcijos mišinys. Taip paruoštas reakcijos mišinys buvo supilamas į visus analizuotus mėginius ir kruopščiai išmaišomas. Po to buvo išmatuota fluorescencija ties sužadinimo bangos ilgis 490 nm ir emisija 520 nm Matavimas atliktas kinetiniu režimu 60 min 37 C temperatūroje. Gautų ekstraktų gebėjimas slopinti COL aktyvumą apskaičiuojamas pagal (4) lygtį:

3.5. Priešuždegiminių savybių nustatymas

3.5.1. Baltymų denatūracijos slopinimas

Proteinazę slopinantis PRE, PGE, KTE, CTE ir GGE ekstraktų aktyvumas buvo atliktas pagal Sakat ir kt. metodą[87], kurį modifikavo Gunathilake ir kt.[88]. Trumpai tariant, reakcijos tirpalą (2 ml) sudarė 1 ml 1 procento tripsino 2{{10}} mM Tris-HCl buferyje (pH 7,4) ir 1 ml tiriamojo mėginio ({{17} }.02 mL ekstraktas 0.980 mL vandens). Tirpalas buvo inkubuojamas (37 laipsnių 5 min.), po to pridedama 1 ml 0,8 procento (m/v) kazeino ir mišinys toliau inkubuojamas 20 min. Inkubavimo pabaigoje buvo pridėta 2 ml 70% perchloro rūgšties, kad reakcija būtų užbaigta. Mišinys buvo centrifuguotas, o supernatanto absorbcija buvo išmatuota esant 210 nm, lyginant su buferiu kaip tuščias mėginys. Fosfato buferinis tirpalas buvo naudojamas kaip kontrolė. Procentinis baltymų denatūravimo slopinimas buvo apskaičiuotas pagal šią formulę:

kur A1= kontrolinio mėginio absorbcija ir A2= tiriamojo mėginio absorbcija.

3.5.2. Lipoksigenazės aktyvumo slopinimas

Gautų ekstraktų gebėjimas slopinti lipoksigenazės aktyvumą buvo nustatytas Sarvesvaran ir kt. aprašytu metodu. 【89】. Pirmiausia 10 μL skirtingų koncentracijų (100, 250 ir 500 ug/mL) augalų ekstraktų buvo sumaišyti 96-šulinėlių plokštelėje su 160 μL 100 mM PBS ir 20 μL sojų lipoksigenazės tirpalo (167 U/). ml) Mėginiai buvo inkubuojami 25 laipsnių temperatūroje 10 minučių, o po šio laiko buvo pridėta 10 μL natrio linolo rūgšties, kad būtų pradėta reakcija. Tada mėginių absorbcija buvo išmatuota esant 234 nm per 3 minutes kas minutę, naudojant FilterMax F5microplate skaitytuvą (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Diklofenakas buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. Lipoksigenazės aktyvumo slopinimo procentas buvo apskaičiuotas pagal (6) lygtį:

čia: Kaip yra tiriamojo mėginio absorbcija, Ac yra neigiamos kontrolės absorbcija.

Galutinis rezultatas buvo trijų nepriklausomų matavimų aritmetinis vidurkis.

3.6. Citotoksiškumo analizė

3.6.1. Ląstelių kultūros

Šiame tyrime buvo naudojamos dvi odos ląstelių linijos: normalūs žmogaus keratinocitai (HaCaT) ir fibroblastai (BJ). HaCaT buvo gauti iš CLSCell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Vokietija) ir BJ iš American Type Culture Collection. Manasas, VA, JAV). Ląstelės buvo auginamos Dulbecco Modification of Eagle's Medium (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, JAV) su natrio piruvatu, L-glutaminu ir dideliu gliukozės kiekiu (4,5 g/l). Terpė taip pat buvo praturtinta 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (Gibco, Waltham, MA, JAV) ir 1 procentu antibiotikais (100 V/mL penicilino ir 1000 ug/ml streptomicino, Gibco), kad būtų išvengta mikrobinio užteršimo. Ląstelės buvo auginamos inkubatoriuje 37 laipsnių temperatūroje drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 95 procentai oro ir 5 procentų anglies dioksido.

3.6.2. Alamar Blue Assay

Kai kultivuojamos ląstelės (HaCaT ir BJ) pasiekė norimą santaką, DMEM terpė buvo išsiurbta į auginimo kolbas. Apačioje pritvirtintos ląstelės du kartus plaunamos steriliu fosfatu buferiniu tirpalu. Ląstelių sluoksnis buvo atskirtas tripsinu, o po to ląstelės buvo dedamos į šviežią DMEM terpę. Ląstelės buvo padengtos 96-šulinėlių plokščiadugnėse plokštelėse (VWR, Radnor, PE, JAV) ir pritvirtinus prie plokštelių dugno, ląstelės buvo apdorotos ekstraktais (100, 250 ir 500 ug/mL). Ląstelės buvo inkubuojamos 24 valandas.

Citotoksiškumo testas buvo atliktas naudojant Alamar Blue testą (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Nyderlandai). Po inkubacijos į šulinėlius buvo įpiltas 60 uM koncentracijos resazurino tirpalas, tada plokštelės 2 valandoms buvo dedamos į inkubatorių 37 laipsnių temperatūroje. Praėjus šiam laikui, buvo išmatuota fluorescencija (入=570nm). Kiekviena ekstrakto koncentracija buvo atlikta trimis pakartojimais.

3.6.3. Neutralios raudonos spalvos įsisavinimo tyrimas

Neutral Red Uptake Assay yra antrasis testas, naudojamas PRE, PGE, KTE, CTE ir GGE citotoksiškumui nustatyti. Pirmiausia, kaip aprašyta ankstesniame skyriuje, buvo paruoštos96-šulinėlių plokščiadugnės plokštės. Po 24 valandų, kai ląstelės buvo paveiktos ekstraktais, jos buvo išsiurbtos ir pakeistos neutraliu raudonu dažikliu (40 ug / ml) ir inkubuojamos 2 valandas. Po šio laiko ląstelės buvo plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu. Kitame etape į šulinėlius buvo įpiltas spalvos pašalinimo buferis (150 μL). Tada neutralios raudonos dve įsisavinimas buvo nustatytas matuojant optinį tankį (OD) esant 540 nm. Kiekviena ekstrakto koncentracija buvo atlikta trimis pakartojimais.

3.7. Apsaugos nuo saulės faktoriaus nustatymas (in vitro)

Apsaugos nuo saulės faktorius (SPF) buvo nustatytas išmatuojant 10 ug/mL ir 50 ug/mL koncentracijų ekstraktų vandeninio tirpalo absorbciją bangos ilgių diapazone nuo 290 iki 320 nm 5- nm intervalais. Iš gautų rezultatų SPF buvo apskaičiuotas pagal Mansur lygtį [90]: kur∶ EE（λ） — eriteminio poveikio spektras, I（入） — saulės intensyvumo spektras, ABS（入） — apsaugos nuo saulės produkto absorbcija, CF- pataisos koeficientas (=10), E (N) × I (λ) – naudotos Sayre'o nustatytos reikšmės [91].

3.8. Transepiderminio vandens praradimo (TEWL) ir odos drėkinimo matavimai

TEWL ir odos hidratacijos matavimai buvo atlikti naudojant zondą TEWAmeter TM 300 ir Corneometer CM 825 zondą, prijungtą prie MPA adapterio (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Vokietija). Tyrime dalyvavo penki savanoriai. Ant dilbio. oda, pažymėtos šešios sritys (2 × 2 cm dydžio) Penkiose vietose užteptas 0,2 mL tirtų augalų ekstraktų kiekis, šeštoje vietoje kontrolinė (neapdorota jokiais mėginiais).Po 60 ir 360 min. , buvo atlikti hidratacijos lygio ir TEWL matavimai Galutinis rezultatas buvo penkių nepriklausomų matavimų (odos hidratacija) ir 20 matavimų (TEWL) aritmetinis vidurkis (iš kiekvieno savanorio).

3.9. Modelinės kosmetikos (makiažo valiklio) su ekstraktais paruošimas

Parengta modelinė kosmetika (makiažo valiklis). Visi naudojami komponentai atitiko EcoCert ir COSMOS reikalavimus. Formulė parodyta 7 lentelėje.

Produktas buvo pagamintas maišant ingredientus (nuo 1 iki 6 punkto) kambario temperatūroje, kol gaunamas vienalytis skystis. Paskutiniame etape buvo pakoreguotas preparato pH. Makiažo valiklis buvo padalintas į porcijas. Į kiekvieną porciją įpilama 1 procento pradinių ekstrakto tirpalų ir gerai išmaišoma.

3.10. Ekstraktų ir kosmetikos priemonių (makiažo valiklių), kurių sudėtyje yra ekstraktų, spalvos parametrų nustatymas

Ekstraktų ir kosmetikos su ekstraktais mėginiai buvo tiriami kambario temperatūroje, praėjus 48 val. po paruošimo. CHROMA METER CR-400(Konica Minolta, Sensing Inc., Tokijas, Japonija) buvo naudojamas spalvų parametrams (CIELAB koordinatėms) įvertinti. CIELAB sistemą 1978 m. apibrėžė Tarptautinė apšvietimo komisija. Ji pagrįsta trimis spalvų atributais: L*, a*, b, kur L* yra šviesumo kintamasis, proporcingas Munsell sistemos reikšmei, ir a* bei b* yra chromatinės koordinatės. A* ir b* koordinatės nurodo pozicijas atitinkamai raudonos/žalios ir geltonos/mėlynos ašyse ( plius a=raudona, -a=žalia; plius b=geltona, - b =mėlyna).

Remiantis gautais duomenimis: L*, a* ir b*, buvo apskaičiuoti šie spalvų parametrai: chroma (C*) ir atspalvis (h). Buvo naudojamos šios lygtys:

4. Išvados

Remiantis gautais rezultatais, galima daryti išvadą, kad išbandyti augalų ekstraktai turi keletą teigiamų savybių, kurių dėka jie gali būti naudojami kosmetikos gamyboje kaip saugus ir bioaktyvus ingredientas. Įrodyta, kad šie augalai yra gausus polifenolių šaltinis, suteikiantis jiems antioksidacinių savybių. PRE parodė geriausią gebėjimą sunaikinti laisvuosius radikalus, tikriausiai todėl, kad jame yra daugiausia polifenolių, palyginti su kitais augalais. PGE ir PRE parodė geriausią gebėjimą sumažinti ROS gamybą ląstelėse. Be to, augalai nerodo jokio citotoksinio aktyvumo. Visi tirti ekstraktai parodė slopinamąjį poveikį elastazės ir kolagenazės fermentams, o didžiausią slopinamąjį poveikį turėjo P. granatum ir GGE. Tai gali reikšti, kad šie augalai gali būti naudojami kosmetikoje kaip medžiagos, lėtinančios senėjimo procesus. Be to, gauti rezultatai rodo, kad šie augalai turi priešuždegiminių savybių. Šiuo atveju CTE ir KTE pasirodė geriausi. KTE ir PGE parodė apsauginį poveikį nuo UV spinduliuotės, net esant mažoms koncentracijoms. Didesnėmis koncentracijomis visi augalai turėjo UV apsauginį poveikį. Be to, augalai turėjo teigiamą poveikį odos drėkinimui ir sumažino transepiderminį vandens praradimą. PRE, KTE ir CTE ekstraktai gali būti naudojami kaip veiksmingi dažikliai kosmetikos gaminiuose. Modelinis makiažo šalinimo skystis, kurio sudėtyje yra aukščiau minėtų ekstraktų, pasižymėjo intensyvia ir laikui bėgant stabilia spalva. Kosmetikos su PGE ir GGE ekstraktais spalvą gali pastebėti tik patyrę stebėtojai ir jos ženkliai nesiskiria nuo tuščiojo kosmetikos mėginio, nepridedant ekstrakto. Įvertinus visus gautus rezultatus, darytina išvada, kad Papaver rhoeas, Clitoria ternatea ir Carthamus tinctorius gali būti sėkmingai naudojami kaip geltonos, oranžinės, mėlynos ir violetinės spalvos dažų šaltiniai gaminant kosmetiką, kuri bus saugi naudoti, ir be to, turės teigiamą poveikį odai.

Šis straipsnis ištrauktas iš Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules