Snukio ir nagų ligos vakcinos kūrimas ir iššūkiai kuriant ilgalaikį imunitetą: tendencijos ir dabartinės perspektyvos

Santrauka:

Snukio ir nagų liga (SNL) yra itin užkrečiama virusinė gyvulių liga, kurią sukelia snukio ir pelių ligos viruso gentis: Aphtovirus, daranti rimtą ekonominį poveikį tiek individualiems ūkininkams, tiek šalies ekonomikai. Daugelis bandymų sukurti vakciną nuo SNL nesukėlė sterilaus imuniteto. Klasikiniai vakcinos gamybos metodai atsirado dėl selektyvaus mutacijų kaupimosi aplink antigenines ir surišimo vietas. Sukėlusio sukėlėjo atstatymas teigiamos atrankos ir kvazirūšinio spiečiaus būdu, šio metodo taikymas netinka naudoti ne endeminėse srityse. Cheminis susilpninimas naudojant dvejetainį etileniminą (BEI), apsaugojo kapsido vientisumą ir sukūrė ryškų imunitetą prieš užkrečiamą štamą.

Snukio ir nagų liga yra virusinė liga, pažeidžianti gyvūno imuninę sistemą. Snukio ir nagų ligos virusas gali įsiskverbti į gyvūnų ląsteles, sunaikinti ląstelių membranas ir vidaus organus, pabloginti gyvūnų imuninę funkciją ir padaryti jį jautrų kitų patogenų infekcijai.

Tuo pačiu metu skiepijimas snukio ir nagų ligos vakcina gali pagerinti gyvūnų imunitetą ir padaryti juos atsparius virusui. Po sėkmingos vakcinacijos gyvūnas gamins antikūnus, o kai vėl bus paveiktas snukio ir nagų ligos viruso, jis galės greitai sukelti imuninį atsaką, veiksmingai užkirsdamas kelią tolesniam viruso užsikrėtimui ir ligos priežastimi. atsirasti.

Todėl gyvūnų imuniteto gerinimas, ypač skiepijant nuo SNL, yra svarbi SNL prevencijos priemonė. Tuo pačiu metu mokslinis šėrimo valdymas ir sanitarijos bei epidemijų prevencijos priemonės taip pat gali padėti sumažinti viruso plitimą ir snukio ir nagų ligos atsiradimą. Šiuo požiūriu turime susimąstyti, ar žmogaus organizmas turi skirti dėmesio imuniteto gerinimui. Cistanche gali žymiai pagerinti žmogaus imunitetą. Cistanche taip pat turi antivirusinį ir priešvėžinį poveikį, kuris gali sustiprinti imuninės sistemos gebėjimą kovoti ir pagerinti organizmo imunitetą.

Click cistanche tubulosa privalumai

Virusiniai antigenai, kurie buvo chemiškai susintetinti arba ekspresuoti virusuose, plazmidėse ar augaluose, buvo išbandyti vakcinuojant gyvūnus. Buvo bandoma imunizuoti gyvūnus DNR vakcinomis, ekspresuojančiomis struktūrinius arba nestruktūrinius baltymų antigenus. Interleukinų naudojimas kaip genetinis DNR vakcinų adjuvantas turi daug žadantį poveikį. Nors sterilaus imuniteto sukėlimo iššūkiai yra nestruktūriniai (NS) FMDV baltymai, kurie yra atsakingi už dendritinių ląstelių apoptozę ir turi neigiamą poveikį limfoproliferaciniams atsakams, dėl kurių atsiranda trumpalaikė imunosupresija. Be to, nestruktūrinių baltymų prekybos šeimininko baltymais sunaikinimas slopino CD8 ir T ląstelių proliferaciją. Šioje apžvalgoje buvo bandoma atkreipti dėmesį į įvairius vakcinų kūrimo bandymų metodus ir sterilaus imuniteto susidarymo kliūtis.

Raktiniai žodžiai:

SNL vakcina, ilgalaikis imunitetas, sterilus imunitetas.

Fonas

Snukio ir nagų liga (SNL) yra ypač užkrečiama virusinė gyvulių infekcija, kurią sukelia Pelės ir snukio ligos virusas, gentis: Aphthovirus ir Picornaviridae šeima; kad padaroma didelių ekonominių nuostolių.1,2 Naminiai ir laukiniai kanopiniai gyvūnai yra labai paveikti SNL.3–5 5S protomerus spontaniškai gamina atskiri subrendę baltymai; VP1, VP3 ir VP0, iš kurių penki surenkami į 12S pentamerį. Nors 75S viruso kapsidas susidaro susijungus 12 pentamerių,6,7 pranešta, kad visas snukio ir nagų ligos viruso (FMDV) 146S antigenas turi labai panašų antigeno specifiškumą kaip viruso kapsidas.8,9 -burnos ligos virusas turi platų šeimininkų spektrą, didelį genetinės variacijos laipsnį ir didelius antigeninius skirtumus, turi septynis serotipus (A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2 ir SAT3) ir daugiau nei 100 serotipų. Dėl kvazirūšinio spiečių kasmet atsiranda ir daug naujų variantų. Septynių serotipų sukelto kryžminio imuniteto nėra. Taip pat yra tik dalinis kryžminis imunitetas tarp įvairių to paties serotipo potipių.11 Dėl SNL kintamumo ir polimorfizmo labai sunku užkirsti kelią SNL ir jos kontrolei.10 Adenoviruso rekombinantinis FMDV, ekspresuojantis skirtingų serotipų P12A ir 3C baltymus, parodytas apsauginis poveikis.12–14

Klasikinės inaktyvuotos vakcinos turi daug trūkumų, įskaitant terminį nestabilumą, trumpalaikį imunitetą, didelę kainą, rekombinacijos su laukinėmis padermėmis riziką ir patogeniškumo atstatymą.11,15,16

Nepaisant 90 metų trukusių tyrimų, nėra veiksmingos vakcinos, kuri sukurtų sterilų ir tvirtą imunitetą nuo SNL, tačiau ši liga išlieka enzootiška didelėse pasaulio vietose. Daugeliu bandymų sukurti vakciną nuo SNL nepavyko sukurti sterilaus imuniteto, turinčio mažą kryžminio serotipo apsaugą ir nepakankamą imuniteto trukmę.17 Klasikiniai vakcinos gamybos metodai, pvz., serijinis viruso perdavimas ląstelių kultūroje18, neleistinoje aplinkoje. gyvūnai, o jo natūralus šeimininkas sugebėjo susilpninti virusą. Taip yra dėl selektyvaus mutacijų kaupimosi aplink antigenines ir surišimo vietas.19–21 Tačiau sukėlėjo reversijos taikymas teigiamos atrankos ir kvazirūšinio spiečiaus metodu netaikomas naudoti ne endeminėse srityse.22 DNR ir baltymų technologijos pagerino tyrimus modifikuojant integrino receptorius23, naudojant sintetinius peptidus, kurie gali sukelti aiškų imuninį atsaką gyvūne.24 T pagalbinių ląstelių epitopai, būdingi G-H kilpos regionui, yra stiprūs B ląstelių epitopai, kurie sukelti humoralinį imunitetą.25 Rekombinantinio interferono (IFN ) ir galvijų interleukino 18 (IL-18) naudojimas kaip adjuvantas sustiprino ilgalaikį laboratorinių gyvūnų imunitetą.26,27

Pastaruoju metu rekombinantinės gyvos vektoriaus DNR vakcinos yra stiprūs citotoksinių T limfocitų (CTL) induktoriai.28,29 Norint, kad šis poveikis būtų išreikštas sergant SNL, būtinas tinkamas adjuvantas.30 Kad šis poveikis būtų pašalintas, rekombinavus šeimininko Ig superšeimą ir SNL epitopą, pagerėjo humoralinis epitopas. ir gyvūno ląstelinis imuninis atsakas.

Sterilaus ir ilgalaikio imuniteto sukelimo kliūties problemą apsunkina nestruktūrinių (NS) baltymų, ypač 3A, judėjimo šeimininko baltymais sunaikinimas, todėl tai nesukelia klasterio diferenciacijos 8 teigiamo (CD8 plius) T-ląstelių atsako dėl silpnas CTL, o virusas išlieka gyvūne.31 Integrino receptoriai, kurie tarpininkavo kaulų čiulpų kilmės dendritinių ląstelių (DC) apoptozei, trukdė įgimtam šeimininko imunitetui.32 Guzman ir kt.33 ir Joshi ir kt.34 išanalizavo pakaitinius atsakus į CTL žudymą, pvz., proliferaciją. arba IFN gamyba CD8 ekspresuojančiose ląstelėse, tačiau daugelis CD8 plius ekspresuojančių limfocitų, kurie nėra CTL, gamina IFN, įskaitant natūralias žudikų (NK) ląsteles ir gama delta (δ) T-ląstelių pogrupius. 35–37

Pasak Oh ir kt.38, IFN atsakas gali būti iš naujo stimuliuojamas vakcinuotiems galvijams, kurių užkrėtimo dieną kraujyje buvo didelis virusą neutralizuojančių antikūnų titras, o tai tiesiogiai susiję su vakcinos sukelta apsauga IFN. - ir neutralizuojantis antikūnas. Be to, CD4 plius T ląstelės yra pagrindinis klestintis fenotipas ir IFN gaminančios ląstelės. Tačiau natūralios infekcijos atveju buvo limfopenija, kuri sutapo su didžiausia viremija ir serumo IFN atsaku, o in vivo plazmocitų DC (pDC) skaičius ir pDC IFN sekrecija in vitro trumpam sumažėjo per 2 dienas nuo užsikrėtimo.39 IFN gamyba iš Ūminėje kiaulių infekcijos fazėje yra slopinamas monocitų kilmės DC (MoDC) ir odos DC (odos DC). 40 Taip pat FMDV sukėlė apoptozę nesubrendusiose dendritinėse ląstelėse. padidinus antikūnų gamybą ir T-ląstelių proliferaciją, didesnis CTL aktyvumo ir IFN ekspresijos lygis CD8 T ląstelėse buvo pasiektas sintetiniais oligonukleotidais, kaip gleivinės vakcinos adjuvantais.41 Pagrindinis šio straipsnio tikslas – apžvelgti SNL vakcinų kūrimo tendencijas ir iššūkiai, sukeliantys sterilų ir ilgalaikį imunitetą.

Susilpninta ir inaktyvuota vakcina

Buvo daug bandymų patobulinti gyvas susilpnintas FMD vakcinas įprastais metodais, tokiais kaip nuoseklus pasėjimas neleistiniems gyvūnams arba ląstelių kultūra. Susilpnėjimas buvo pasiektas pasėjus nejautrioms rūšims, tokioms kaip pelės, triušiai ir embrionuoti kiaušiniai, kol galvijai prarado virulentiškumą. Serijiniai FMDV C-S8c1 pasėjimai esant dideliam infekcijos dažniui ląstelių kultūroje lėmė genomo defektą (C-S8p260), kuris visiškai apsaugojo peles nuo mirtino užkrėtimo FMDV C-S8c1 ir buvo saugus kiaulėms po vakcinacijos viena doze. C-S8p260.42 Jis taip pat sukėlė aukštus neutralizuojančių antikūnų titrus ir suaktyvino kiaules T-ląsteles.42

Serijinis labai patogeniško, kiaulėms pritaikyto O Taiwan 97 izoliato perdavimas kiaulėms žymiai sumažina virulentiškumą po 14-ojo kiaulių pasėjimo ir panaikina jį po 16-ojo pasėjimo.43 Aminorūgščių pokyčiai in vivo pasažų metu buvo labai tylus pakeitimas ir VP1 pokyčiai. (1D) buvo laikini. Sukūrus SNL vakciną neleistiniems šeimininkams, agentas gali panaudoti kitus ląstelių receptorius, išskyrus Arg-GlyAsp (RGD), apnašų testas atliekant BHK 21 testą gali pasirodyti neigiamas, kol virusas nepažeistas.43 Aminorūgščių pakeitimas šoninės grandinės, esančios šalia kapsidų tarpsubvieneto kitos aminorūgšties, gali sukurti naujus disulfidinius ryšius arba elektrostatinę sąveiką tarp subvienetų sąsajų ir yra numatomos arba inicijuotos būti naudojamos infekcijai, padidinant vakcinos padermių atsparumą karščiui44, naudojant dabartines SNL vakcinų procedūras. kurie mažiau priklauso nuo idealios šaldymo grandinės. FMDV C-S8p260 padermės yra suskirstytos į segmentus ir yra atsparios replikacijai, o tai gali būti vakcinų susilpninimo su dviem saugos barjerais pagrindu.45

Dauguma tyrimų rodo, kad gyvūnų modelio FMDV inaktyvacija, naudojant aminorūgščių pakeitimą 2C, nebuvo aptikta C-S8c1, bet buvo nedidelė dalis jūrų kiaulyčių, pritaikytų FMDV.46 Šis aminorūgščių pakeitimas greitai tapo svarbiu virusų populiacijoje po to, kai jūrų kiaulytėms pritaikyto viruso pakartotinis patekimas į kiaules. Šie radiniai rodo, kaip mažumos variantų virusų įvedimas į dirbtinį šeimininką gali tapti jų dominavimu, kai pirminė šeimininko rūšis vėl užsikrečia.47 Be šios teigiamos atrankos ir kvazirūšinio spiečių, vakcinos padermė gali virsti patogenine štama. 22

Viruso inaktyvavimas naudojant formaliną ir endonukleazę, atitinkamai nepadeda inaktyvuoti viruso ir suardyti antigenines vietas.48 Viruso susilpninimui taip pat buvo naudojamas dvejetainis etileniminas (BEI), išlaikant kapsidės vientisumą.15,49 BEI- inaktyvuoti SNL ląstelių receptoriai, integrinai, naudojami prisijungimui ir internalizavimui į kultivuojamas ląsteles, sąveiką tarpininkauja aminorūgšties liekana, esanti VP1 kapsidės baltymo GH kilpoje.49 FMDV specifiniai monokloniniai antikūnai arba sintetinis peptidas jungiasi su BEI- inaktyvuoti FMD buvo internalizuojami kartu su žymeniniu baltymu lokalizuojantis į BHK-21, tarpininkaujant integriną rišančiam motyvui RGD.50 Be to, BEI inaktyvacija neturi įtakos GH kilpos antigeniškumui.20,51 BEI inaktyvacija, išsaugota virionų architektūra ir receptoriai skatina viruso internalizavimą į kultivuojamas ląsteles, taip pat in vivo, yra tarpininkaujama integrino atpažinimo būdu, 47, 52, 53, tačiau viso viruso kiekybinis įvertinimas rodo minimalų rezultatą, palyginti su formalinu. inaktyvacija (65–71,6 proc.), o BEI inaktyvacija yra 44,2 proc.

Kiaulių ir jūrų kiaulyčių nuoseklus C tipo FMDV pasėjimas ir palaikomas kiaulėms bei žindančioms pelėms sukelia aminorūgščių pakeitimų (I2483T 2C, Q443R 3A ir L1473P VP1). Pakeista aminorūgštis (L1473P), šalia integriną rišančio RGD motyvo, panaikino viruso augimą skirtingose ​​ląstelių linijose ir pakeitė jo antigeniškumą.47 Kitas Burman ir kt. atliktas tyrimas20 atskleidė, kad RGD pakeitus vieną aminorūgštį. plius 1 ir RGD plius 4 vietos slopina viruso prisirišimą ir infekciją, kurią palengvina v 6 arba v 8, tačiau virusas naudoja v 3 ląstelėms prijungti. Pakeitimai metioninu arba argininu jungimosi vietoje yra veiksmingi v 6 inhibitoriai. Dvi leucino liekanos RGD plius 1 ir RGD plius 4 dėmėse stabilizavo jungimąsi, priklausomą nuo struktūros C terminalo iš karto prie RGD.20,54 EDTA atsparus prisijungimas prie v 6 yra skiriamasis požymis, ir tikimasi, kad stabilus kompleksas su ląsteliniu receptoriumi sukels didelį FMDV užkrečiamumą.21

Alanino pakeitimas leucinais pirmoje ir ketvirtoje padėtyse RGD plius 1 ir RGD plius 4 vietose slopina viruso prisijungimą ir viruso prisirišimą prie v 6 arba v 8. Tačiau virusas naudoja v 3, kad patektų į ląsteles.20 kadangi ląstelių kultūrai pritaikytos padermės kaip alternatyvų receptorių naudoja heparano sulfato proteoglikanus (HSPG). Jų ektodomenų patvirtinimas ir integrinų ligandų surišimo būsena yra svarbus virusų tropizmo veiksnys.

Heparano sulfatą surišantys virusai efektyviai internalizavo DC, bet nepateikė antigeno limfocitams, sukeldami FMDV specifinį IgG atsaką.55 Šie rezultatai rodo, kad SNL DC internalizavimas yra efektyviausias vakcinos virusams, turintiems HS surišimo gebą, tačiau HS surišimas nėra išskirtinis reikalavimas.

Selektyvus spaudimas, kurį daro šeimininko humoralinis imuninis atsakas, turi svarbų vaidmenį tiek atrenkant, tiek stabilizuojant antigeninius FMDV variantus, o tai lemia ląstelių tropizmo pokyčius. In vitro bandymai atskleidė, kad lygiagretus FMDV pasėjimas, esant subneutralizuojantiems homologiniams serumams, lėmė mutantų išsaugojimą.56 Tačiau A24 tipo FMD, kurios ląstelės receptorių surišimo vietoje buvo SGD seka, dauginimasis buvo inokuliuotas į galvijus. , virusas silpnai augo BHK-21 ląstelėse, o seka stabiliai išliko dauginant BHK-21 ląstelėse, ekspresuojančiose galvijų V 6 integriną (BHK3 V 6), taip pat eksperimentiniu būdu inokuliuotuose ir kontaktiniuose galvijams. .56

Dviejų nepriklausomų galvijų perdavimo grandinių genominiai pokyčiai atsiranda dėl nuoseklaus perėjimo prie BHK{0}}ląstelių pritaikytos (sujungiančios heparano sulfatą) FMDV padermės. Laukinio tipo variantas su aminorūgščių mutacija VP1 356 buvo greitai atrinktas viruso replikacijai in vivo.57

Ištrynimo genai koduoja NS baltymą, kuris nėra labai svarbus viruso replikacijai in vitro, yra alternatyvus būdas sukurti gyvas susilpnintas vakcinas. Tačiau, kad šis delecijos virusas būtų naudingas kaip vakcina, jis vis tiek turi sugebėti daugintis jautriuose gyvūnuose. Šio metodo pranašumas, palyginti su klasikiniu susilpninimo metodu, kuris paprastai įveda mutacijas ribotame vietų skaičiuje, yra tas, kad žymiai sumažėja virulentiškumo grįžimo rizika58, o NS baltymai yra stiprūs T ląstelių epitopai.

Poveikis buvo įrodytas genetiškai modifikuotų FMDV vakcinos padermių, kurių antigeninėse vietose buvo pakeistos tam tikros aminorūgštys, augimo savybės, panašios į laukinio viruso, kurios, kaip įrodyta, visiškai apsaugo gyvūną nuo užkrėtimo, tačiau turi galimybę daugintis in vitro.60

Skubioji dviguba alyva su adjuvantu FMD vakcina sumažino viremiją ir viruso šešėliavimą ir neparodė jokių klinikinių požymių. Paskiepytų gyvūnų organizme buvo nuosekliai aptikta IL-6, IL-8 ir IL-12.61 Tuo tarpu kiti citokinai IL-1, IL-2, TNF , TGF ir interferonai nebuvo aptikti; Tai rodo, kad vakcina nesukėlė sisteminio uždegiminio atsako ir sisteminio T limfocitų aktyvumo padidėjimo, kuris yra susijęs su trumpalaike apsauga nuo SNL.61

Rekombinantinis žmogaus IL-2 yra stiprus humoralinis imuninės sistemos induktorius pelių modelio SNL vakcinoje.62 Paskiepyti gyvūnai išlieka teigiami serokonversija 7–8 mėnesius ir sisteminis citokinų (IL-6, IL{{5) lygis. }}, ir IL-12) padidėjo po vakcinacijos.63

Tuščios virusinės kapsidės

Tuščios virusinės kapsidės, taip pat žinomos kaip į virusą panašios dalelės (VLP), apima visą imunogeninių vietų, randamų nepažeistuose virusuose, repertuarą, tačiau jose trūksta infekcinių nukleino rūgščių ir jose klonuojamas viruso genomas, būtinas viruso sintezei, apdorojimui ir surinkimui. struktūrinius baltymus į tuščias virusines kapsides (P1-2A ir 3Cpro koduojantys genai; 1 pav.).64 Tuščios kapsidės natūraliai gaminamos in vitro ląstelių kultūroje, yra antigeniškai panašios ir yra imunogeniškos.65

Tuščios kapsidinės vakcinos naudojimas yra perspektyvus kandidatas, nes taip išvengiama viruso naudojimo vakcinų gamyboje ir išsaugoma epitopų konformacija.45 Be to, nėra viruso atsinaujinimo ir rekombinacijos su laukinėmis padermėmis rizikos. Suspensijoje augančios žinduolių ląstelės be serumo buvo naudojamos trumpalaikei genų ekspresijai (TGE) rekombinantinėms FMDV tuščioms kapsidėms.66 Naudojant šiuo metu turimą technologiją lengva identifikuoti vakcinuotus nuo užsikrėtusių ar sveikstančių gyvūnų.67–69

Subvieneto vakcina

Subvienetinėje vakcinoje yra virusų antigenų, surinktų chemiškai ekstrahuojant arba biologiškai išreiškiant minimalų kiekį nevirusinių antigenų auginimo terpėje.70 Tyrėjai atskleidė, kad VP1 yra vienas iš FMDV kapsidų baltymų, kurių paviršius XX a. aštuntajame dešimtmetyje buvo labai paveiktas. , ir naujausi struktūrinės virusologijos pasiekimai.71

Neseniai bandant sukurti susilpnintas vakcinas, genų inžinerija buvo naudojama genomo dalims mutuoti arba VP1 baltymus koduojančiam regionui panaikinti. Naudojant rekombinantinę DNR, buvo sukurtas virusas su RGD receptorių surišimo vieta ant VP1 pašalinto FMDV.72 7-–10-dienų senumo pelėms ar kiaulėms šis virusas negalėjo prisitvirtinti prie ląstelių ir neprilipo. sukelti infekciją.73

FMDV VP1 kapsidės baltymas ir VP1 karboksigalinė sritis turi G-H kilpą, kuri yra labai imunogeniška, atitinkanti B ląstelių epitopus. Chemiškai susintetintas peptidas, susidedantis iš virusą dengiančio baltymo (VP1) iš FMDV serotipo O regionų (likučių nuo 141 iki 158), sukėlė didelį neutralizuojančių antikūnų kiekį ir apsaugojo galvijus nuo intradermolingualinio infekcinio viruso inokuliacijos24, o tai rodo G svarbą. -H kilpa, sukelianti humoralinį imuninį atsaką. VP1 taip pat turi hiperkintamą sritį ir imunogeninę vietą; vietos išnaudojimas būtų plataus imunogeniškumo pagrindas.74

IFN įtraukimas kaip genetinis adjuvantas lėmė uždelstą klinikinių požymių ir viremijos atsiradimą.75 Rekombinantinis šilkaverpių bakulovirusas, koduojantis FMDV Asia 1 P1-2A ir 3C proteazę, sugebėjo gaminti specifinius antikūnus. vakcinuotiems gyvūnams ir apsaugoti po užkrėtimo virulentiniu homologiniu virusu, o klinikiniai požymiai buvo palengvėję ir uždelsti.64

Buvo sukelta viena defektinio adenoviruso 5 (Ad5), turinčio A serotipo FMDV (Ad5A24) P1 ir 3C koduojančią sritį, dozė, neutralizuojanti antikūnus ir apsauganti kiaules nuo homologinio užkrėtimo.76 Tačiau poveikis ląstelinei imuninei grupei nebuvo ištirtas. .

Tiek vakcinijos viruso, tiek bakuloviruso sukeltai tuščių A serotipo kapsidų ekspresijai; turinčios racionaliai suplanuotas mutacijas, eukariotinių ląstelių stabilumas buvo padidintas.77 Šis vakcinos antigeno gamybos metodas turi keletą perspektyvių pranašumų, palyginti su dabartinėmis technologijomis, atsižvelgiant į gamybos sąnaudas, infekcijos riziką ir termotolerantišką vakciną.45

Žmogaus adenoviruso 5 tipo vektorius, ekspresuojantis kapsido baltymą (P1-2A ir mutavusią virusinę 3C proteazę), suteikia reikšmingą humoralinį, ląstelinį ir gleivinį imunitetą, sukeltą BALB/c pelėms. Skiepijant jūrų kiaulytes, atsirado daug neutralizuojančių antikūnų ir antikūnų prieš FMDV imunoglobulino A (IgA), 100 procentų apsaugodami jūrų kiaulytes nuo užkrėtimo.

Rekombinantinis šunų 2 tipo adenovirusas (CAV2), ekspresuojantis kapsidų baltymus (P1/3C) (1 pav.), galėjo sukelti stiprų humoralinį imuninį atsaką jūrų kiaulytėms. Tačiau šunų 2 tipo adenovirusą (CAV2) ekspresuojantis VP1 baltymas nesukėlė ilgalaikio antikūnų atsako jūrų kiaulytėms ar pelėms.79

Kiaulės, paskiepytos adenovirusu 5 su citomegaloviruso stiprikliu, koduojančiu A24-2B (Ad5-CI-A24-2BC), nustatė didžiausią neutralizuojančių antikūnų atsaką 7–14 dpv ir padidino IgM gamybą 7 dpi.14 Modifikuotas citomegaloviruso promotorius padidino vektoriaus veiksmingumą ir padidino ląstelių infekciją ląstelių kultūroje, grupė, kuri gavo vakciną, buvo visiškai apsaugota po užkrėtimo.14

Pelių inokuliacija į raumenis rekombinantais, FMDV bakuloviruso rekombinantiniu kapsidės baltymu, klonuotu citomegaloviruso greitu ankstyvuoju stiprikliu kaip promotoriumi (CMV-IE), ir T-ląstelių imunogeną koduojančia sritimi su T ląstelių epitopais, buvo veiksmingai indukuoti neutralizuojantys antikūnai ir gama interferonas ( IFN- ).80 P1- 2A ir 3C koduojantys FMD serotipo A regionai, išreikšti šilkaverpių lėliukėse (Bombyx mori), galėjo sukelti aukštus specifinių antikūnų titrus ir visiškai apsaugoti nuo virulentinio homologinio viruso užkrėtimo.81

Daugialypė antigeninė peptidų sistema yra labai imunogeniška, palyginti su vienu linijiniu SNL vakcinos antigenų peptidu.82 Sintetiniai dendrimeriniai peptidai, kuriuose yra dvi pagrindinės FMDV antigeninės B ląstelių antigeninės vietos [VP1 (140–158)] kopijos, kovalentiškai susietos. Įrodyta, kad į heterotipinę T-ląstelių antigeninę vietą iš nestruktūrinio baltymo 3A [3A (21–35)], apsaugo kiaules nuo viruso poveikio.83 Dendrimero peptidas, atkuriantis heterotipinį ir labai konservuotą FMDV 3A (21–35) T-ląstelių epitopas taip pat pagerino neutralizuojančių antikūnų ir IFN atsaką.84 70 procentų B2T vakcinuotų kiaulių visiška apsauga – nebuvo jokių klinikinių ligos požymių – užkrėtus virusą 25 dieną po imunizacijos.84

DNR vakcinos

Encefalomiokardito viruso (EMCV) vidinė ribosomos įėjimo vieta (IRES) buvo pašalinta, o L genas, dalyvaujantis ląstelių uždaryme dėl eIF46,85 proteolizės, buvo pašalintas, o EMCV IRES, kuris, kaip įrodyta, padidina ekspresijos efektyvumą, buvo pašalintas. buvo įterpti prieš P1 sekas.86 DNR vakcina, koduojanti P1-2A ir GM-CSF kaip adjuvanto sukeltas tvirtas FMDV specifinis ir neutralizuojantis antikūnas, taip pat indorsuojantys citokinai IL-8 ir IFN gamyba kiaulėse.87

DNR vakcinos, pagrįstos virusiniais mini genais, atitinkančiais tris pagrindinius B ir T ląstelių FMDV epitopus VP1 (aminorūgščių seka 133–156) -3A (aminorūgščių seka 11–40) ir VP4 (20–34) apsaugoti peles, kai užkrėtimo metu nėra specifinių antikūnų.88

Intranazalinis FMDV DNR vakcinos skyrimas; Naudojant chitozaną kaip tiekimo priemonę ir IL{0}} kaip molekulinį adjuvantą, buvo sukeltas gleivinės ir sisteminis imuninis atsakas su sustiprintu ląstelių sukeltu imunitetu (CMI), kaip rodo didesnis T ląstelių proliferacijos lygis, CTL atsakas, ir IFN ekspresija tiek CD4 plius, tiek CD8 plius T ląstelėse. 73

Pelės, vakcinuotos plazmide, ekspresuojančia VP1 ir IL9 kaip genetinį adjuvantą ir suaktyvinus antiapoptozės mechanizmą, sukūrė stiprų humoralinį atsaką, didelį IFN ir perforino kiekį CD8 ir T ląstelėse, bet ne IL{6} } šiose T ląstelėse. IL-9 padidino Beclin geno ekspresijos reguliavimą ir užkirto kelią T-ląstelių apoptozei.89

Kitas tyrimas atskleidė, kad VP1 DNR vakcina, ekspresuojanti interleukiną-6 ir IFN, naudojama kaip molekuliniai adjuvantai, pagerino antigenui specifinį ląstelių atsaką. Jis taip pat sukėlė aukštą IgG2a/IgG1, IFN-, IL-4 titrą ir dendritinių ląstelių brendimą.90

Naudojant IL-2 kaip genetinį adjuvantą DNR vakcinoje, koduojančiame, du FMDV VP1 epitopai (aminorūgščių liekanos 141–160 ir 200–213), apimantys kelis epitopus, turi sukelti kiaulių T ląstelių proliferaciją ir neutralizuojantį antikūną prieš SNL. naudojant IL-2 kaip genetinį adjuvantą.91,92

Kiaulės, imunizuotos anti-FMDV DNR vakcinos plazmide, koduojančia P1-2A3C3D, ir plazmide, ekspresuojančia kiaulių „B ląsteles aktyvinantį faktorių, priklausantį TNF šeimai“ (BAFF), skatino B ląstelių brendimo aktyvaciją ir imunoglobulino klasės pasikeitimą.93

DNR vakcinos replikos su reguliariu pastiprinimu pasiūlė veiksmingą vakcinos strategiją nuo FMDV.94 Įvairių antigeninių taikinių įtraukimas į DNR vakcinas yra puikus būdas pagaminti antigenų kokteilį vienoje vakcinos formulėje. Pelės, imunizuotos trimis plazmidėmis, koduojančiomis snukio ir nagų ligos viruso (FMDV), pseudorabies viruso (PRV) ir klasikinio kiaulių maro viruso (CSFV) antigeną, parodė daug žadančius rezultatus.95

Jūrų kiaulytėms į raumenis pasėjus DNR plazmidėmis, ekspresuojančiomis FMDV, turinčiomis inokuliuoto kiaulių IgG geno signalinę seką, buvo nustatytas neutralizuojantis antikūnų atsakas, o blužnies ląstelių proliferacija padidėjo po sustiprinimo, tačiau gyvūnai nebuvo apsaugoti nuo viruso poveikio.96

DNR vakcina, koduojanti T-ląstelių epitopą ir B-ląstelių epitopus iš VP1 135–167 vietų, o 1 vieta apima 141–160 regionų (G-H kilpa) ir FMDV O tipo VP1 karboksilo galą, sukėlė stiprų ląstelinį imuninį atsaką kaip buvo pastebėta naudojant T ląstelių proliferacijos tyrimą.97

Į nosį įvedant FMDV DNR vakciną, koduojančią kapsido baltymą, katijoninį PLGA (poli(laktido-ko-glikolidą) kaip nešiklį ir galvijų IL-6, kaip genetinį adjuvantą, vakcinuotų gyvūnų gleivinės ir sisteminis imuninis atsakas sustiprėjo.98

DNR vakcina, ekspresuojanti kapsido baltymą (P1-2A, 3C ir 3D), pradėta naudoti pGM-CSF ir sustiprinta inaktyvuotu FMDV antigenu, parodė didelį vakcinuotų kiaulių kryžminio serotipo reaktyvumo lygį. Virusų neutralizavimo ir ELISA testų metu buvo pranešta apie reikšmingą kryžminio serotipo reaktyvumo lygį prieš A, C ir Asia1.99 Tačiau DNR vakcina, ekspresuojanti VP1 baltymą ir gaminanti antisensinę RNR, nukreiptą į FMDV 5'UTR, sukėlė specifinį imuninį atsaką paskiepytiems žmonėms. pelės.72

DNR vakcina, ekspresuojanti VP1 kartu su IL-15 (molekuliniu adjuvantu), padidino gleivinės išskiriamą IgA ir serumo IgG bei ląstelių sukeltą imunitetą (CMI), ką įrodo didesnis antigenui specifinių T ląstelių proliferacijos lygis, citotoksinis T limfocitas. (CTL) atsakas ir didesnė IFN ekspresija tiek CD4 plius, tiek CD8 plius T ląstelėse, informuojančiose blužnies ir gleivinės vietas.73

Rekombinantinės vakcinos gaminamos rekombinuojant šeimininkų Ig superšeimą, o viruso epitopai pagerino vakcinuotų gyvūnų humoralinį ir ląstelinį imuninį atsaką. RNR vakcinos yra stiprūs IgG klasės keitikliai, be to, didelis IgM titras buvo pastebėtas vakcinuotoms pelėms.100 Plazmidinės DNR, turinčios FMDV epitopų, pelių audiniuose pasiskirstymas yra idealus.101

Ilgalaikio imuniteto sukūrimo iššūkiai

Po užsikrėtimo skirtingais FMDV serotipais labai pakinta T-limfocitų subpopuliacijos, funkcinė kompetencija ir gausa.102 BoCD4 plius ir boCD8 plius T ląstelės sumažėja iki 48 valandų po užsikrėtimo (pi). Tačiau stebimas boWC1 ir T-ląstelių sumažėjimas iki 48 AG su FMDV serotipu O. Limfocitai iš vakcinuotų gyvūnų parodė reikšmingą boCD4 plus , boCD8 plus ir boWC1 plus T ląstelių reguliavimą po kontakto su FMDV. 102

Po natūralios infekcijos labai padidėja 3A-NS baltymo ekspresija limfocituose, kurie skiriasi skirtingomis ligos eigomis, o tai lemia laikina CD4 plius ir CD8 plius T ląstelių imuninės sistemos slopinimą. 34

NS baltymų, ypač 3A, apyvartos šeimininko baltymų sunaikinimas visiškai sutrikdo, todėl nesukelia CD8 plius T ląstelių atsako31. Dėl silpnos CTL virusas gyvūne išliko. Integrino receptoriai tarpininkauja kaulų čiulpų DC apoptozei, trukdydami įgimtam šeimininko imunitetui.32 Kitas svarbus reiškinys, trukdantis šeimininko imunitetui, yra Lbpro, labai konservuotas domenas, kuris vaidina svarbų vaidmenį slopindamas pagrindinių signalinių molekulių ubikvitinaciją aktyvuojant tipą. I IFN atsakas, pvz., retinoinės rūgšties indukuojamas genas I (RIG-I), TANK surišanti kinazė 1 (TBK1), su TNF receptoriais susijęs faktorius 6 (TRAF6) ir TRAF3.103 Tai sumažina greito ir ankstyvo IFN inicijavimo lygį. iRNR ir IFN stimuliuojami genų produktai.102 Be to, 3Cpro blokuoja pernešimą Golgi viduje, skaidydamas baltymą, reikalingą pernešimui Golgi viduje.

Guzman ir kt.33 ir Joshi ir kt.34 išanalizavo pakaitinius atsakus į CTL žudymą, pvz., proliferaciją arba IFN gamybą CD8 ekspresuojančiose ląstelėse, apie kurias buvo pranešta, bet daug CD8 ir ekspresuojančių limfocitų, kurie nėra CTL, gaminantys IFN, įskaitant NK ląsteles ir δ T pogrupius. - ląstelės. 35–37,39,104

CTL aktyvumas, įvertintas praėjus 10 dienų po užkrėtimo Ad5-FMDV-3C, parodė reikšmingą CTL aktyvumo padidėjimą praėjus 10 dienų po užkrėtimo, palyginti su padidinto poveikio lygiu, tačiau po 17 dienų grįžo į pradinį lygį. iššūkis.17 Tačiau mėginant įvertinti CTL aktyvumą 4 dieną nepavyko gauti pakankamai ląstelių. Tai įvyko dėl limfopenijos ir imunopatologijos, kurią sukėlė FMDV. Tarp IFN atsako ir vakcinos sukeltos apsaugos yra teigiamas ryšys, be to, sumažėja ilgalaikis SNL viruso išlikimas.38

Pasak Oh ir kt., 38 CD4 plius T ląstelės yra pagrindinis dauginantis fenotipas ir IFN gaminančios ląstelės.

Nepriklausomai nuo FMDV serotipo, serumo IFN didžiausias buvo 2–3 dienas po užsikrėtimo, limfopenija atitiko didžiausią viremiją ir serumo IFN atsaką, o cirkuliuojančių plazmocitų dendritinių ląstelių (pDC) skaičius ir in vitro pDC IFN gamyba laikinai sumažėjo po 48 valandų. Nepriklausomai nuo suleisto FMDV serotipo ar paveikto gyvūno amžiaus, limfocitų ar pDC infekcija niekada nebuvo nustatyta.39

Ūminės kiaulių infekcijos fazės metu slopinamas IFN susidarymas iš monocitų DC (MoDC) ir odos DC (odos DC). Šis poveikis pasireiškia kartu su padidėjusiais viruso titrais kraujyje, tačiau šios ląstelės nėra produktyviai užkrėstos. Įdomu tai, kad šių DC gebėjimas paimti daleles ir apdoroti antigenus nesikeičia, o tai rodo, kad antigenai neturi įtakos jų gebėjimui paimti daleles ir apdoroti antigenus.

Išvada

Remdamasi aukščiau pateikta literatūra ir tyrimų spraga, ji pateikia šias rekomendacijas. Turėtų būti ištirtas tradicinių vakcinų ląstelių internalizavimas, glikozilinimo modelis, antigeno pateikimas ir teigiamos atrankos (patogeninės padermės vystymosi) mechanizmai. Vakcinos sukeltas CD8 plus T CMI sustiprina ilgalaikį imuninį atsaką ir kryžminę apsaugą. δ T-ląstelių receptoriai yra svarbūs imuninei patogenezei, patvarumui ir CTL gamybai, kuriuos reikėtų išsamiai ištirti. Rekombinantinis baltymas, naudojant srauto citometrą ir ELISpot ELISA, skirtas vakcinos dalelių internalizavimo, antigeno pateikimo ir antigeną pateikiančių ląstelių kryžminio pokalbio analizei.

Reikėtų sukurti naujus internetinius įrankius, kurie parodytų šoninių grandinių poveikį B arba T ląstelių epitopui. Reikėtų aiškiai siekti naudoti gyvūnų modelio infekciją ir vakcinų kūrimo bei veiksmingumo tyrimus, nes laboratorinių gyvūnų integrino receptoriai labai skiriasi, taip pat yra kiaulių ir atrajotojų. Kompiuterinis viso genomo CTL epitopų įvertinimas integruojant epitopų spėliojimo įrankius apskaičiuojant daugybę virusų sekų ir vėliau įvertinant in vivo, turi didelį pranašumą gaminant vakcinas su ilgalaike apsauga ir kryžmine apsauga.

Santrumpos

3A, nestruktūrinis baltymas; Ad5, adenoviruso 5 vektorius; 3Cpro, 3C proteazė (Nestruktūrinis baltymas); BEI, dvejetainiai etilenominai; BHK ląstelė, žiurkėno kūdikio inkstų ląstelė; CD4 plius , Klasterio diferenciacijos faktorius keturi teigiamas; CD8 plius , Klasterio diferenciacijos faktorius aštuoni teigiamas; cDNR, komplementarioji DNR; CTL, citotoksinės T ląstelės; DC, dendritinė ląstelė; ELISA, su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas; FMD, snukio ir nagų liga; FMDV, snukio ir nagų ligos virusas; GM-CSF, granulocitų ir monocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius; IFN-, interferonas alfa; IFN-, gama interferonas; Ig, imunoglobulinas; IL, interleukinas; LTR, ilgas terminalo kartojimas; NK ląstelės, natūralios žudikų ląstelės; NS baltymas, nestruktūrinis baltymas; P1-2A, struktūrinio baltymo pirmtako genas; P1-2A3C3D, viruso struktūrinio baltymo pirmtakas P1–2A ir nestruktūriniai baltymai 3C ir 3D; PBMC, periferinis kraujas, turintis vieną branduolį; RT-PGR, atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija; SAT, Pietų Afrikos tipas; TGE, trumpalaikė genų ekspresija; TGF, naviko augimo faktorius; TNF, naviko nekrozės faktorius; Th ląstelės, T pagalbinės ląstelės; VP1, viruso baltymas 1; δ T ląstelės, gama delta T ląstelės.

Duomenų bendrinimo pareiškimas

Šioje apžvalgoje naudojami duomenys yra antriniai ir yra įtraukti į straipsnį.

Pripažinimas

Esu labai dėkingas Gondaro universiteto Tyrimų ir bendruomenės tarnybos viceprezidento biurui už suteiktą medžiagą ir finansinę paramą. Taip pat dėkoju Gondaro universiteto Veterinarinės medicinos ir gyvūnų mokslų kolegijai už papildomą pagalbą.

Finansavimas

Autorius dėkoja Gondaro universitetui, tyrimų ir bendruomenės paslaugų viceprezidentui.

Atskleidimas

Autorius pareiškia, kad šiame darbe nėra interesų konfliktų.

Nuorodos

1. Kitching P, Hammond J, Jeggo M ir kt. Pasaulinė FMD kontrolė – ar tai galimybė? Vakcina. 2007;25(30):5660–5664. doi:10.1016/j. vakcina.2006.10.052

2. Raza S, Siddique K, Rabbani M ir kt. Keturių aftoviruso serotipų struktūrinių baltymų mikrobų patogenezės in silico analizė atskleidė reikšmingus B ir T ląstelių epitopus. Mikrobų patogas. 2019;128 (2018 m. rugpjūčio mėn.):254–262. doi:10.1016/j.micpath.2019.01.007

3. Arzt J, Belsham GJ. Snukio ir nagų ligos perdavimas iš nuolat užsikrėtusių galvijų nešiotojų į naivius galvijus per burnos ir ryklės skystį. Vet pasaulis. 2018; 3:318. doi:10.1128/ mSphere.{8}}

4. Arzt J, Pacheco JM, Stenfeldt C. Virulentinio ir susilpninto galvijų snukio ir nagų ligos viruso patogenezė. Vet pasaulis. 2017;14:89. doi: 10,1186/s12985-017-0758-759

5. Sobhy NM, Bayoumi YH, Mor SK, El-Zahar HI, Goyal SM. Snukio ir nagų ligos protrūkiai Egipte: molekulinė epidemiologija, evoliucija ir širdies biomarkerių prognostinė reikšmė. Int J Vet Sci Med. 2018;6(1):22–30. doi:10.1016/j. tik.2018.02.001

6. Senthilkumaran C, Yang M, Bittner H ir kt. Genomo, antigeno ir antikūnų aptikimas snukio ir nagų ligos virusu užsikrėtusių kiaulių burnos skysčiuose. Can J Vet Res. 2017;81:82–90.

7. Palinski RM, Bertram MR. Pirmoji snukio ir nagų ligos viruso serotipo O porūšio genomo seka Ind2001e iš Pietų Vietnamo. Microbiol Resour Nounc. 2019;8: e01424–18. doi:10.1128/mra.{10}}

8. Pulido MR, Sobrino F, Borrego B ir kt. Susilpninta snukio ir nagų ligos viruso RNR, turinti deleciją 3′ nekoduojančiame regione, gali sukelti kiaulių imunitetą. J Virol. 2009;83(8):3475–85. doi:10.1128/JVI.{11}}

9. Saravanan P, Iqbal Z, Selvaraj DPR, Aparna M, Umapathi V. Cheminių ekstrahavimo metodų palyginimas 146S kiekio nustatymui snukio ir nagų ligos aliejine adjuvantuota vakcina. J Appl Microbiol. 2019; 1 (Rueckert 1985): 1–9. doi:10.1111/jam.14465

10. Jamal SM, Belsham GJ. Snukio ir nagų liga: praeitis, dabartis ir ateitis. Vet Res. 2013;44(1):1–14. doi:10.1186/1297-9716- 44-116

11. Robinson L, Knight-Jones TJ, Charleston B ir kt. Pasaulinis snukio ir nagų ligos tyrimų atnaujinimas ir spragų analizė: 7 - patogenezė ir molekulinė biologija. Transbound Emerg Dis. 2016;63(1):63–71. doi:10.1111/tbed.12520

12. Sreenivasa BP, Mohapatra JK, Pauszek SJ ir kt. Rekombinantinis žmogaus adenovirusas{1}}, ekspresuojantis snukio ir nagų ligos viruso Indijos vakcinos padermių kapsidų baltymus, sukelia veiksmingą antikūnų atsaką galvijams. Vet Microbiol. 2017;203:196–201. doi:10.1016/ j.vetmic.2017.03.019

13. Neilan JG, Schutta C, Barrera J ir kt. Adenoviruso pernešto snukio ir nagų ligos viruso serotipų A subvieneto vakcinos veiksmingumas galvijams naudojant tiesioginio kontakto perdavimo modelį. BMC Vet Res. 2018;14(1):1–9. doi:10.1186/s12917-018- 1582-1

14. Pena L, Pires M, Koster M ir kt. Snukio ir nagų ligos viruso tuščio kapsidės subvieneto antigeno su nestruktūriniu baltymu 2B pristatymas pagerina kiaulių apsaugą. Vakcina. 2008;26 (45): 5689–5699. doi:10.1016/j.vaccine.2008.08.022

15. Barteling SJ, Cassim NI. Labai greitas (ir saugus) snukio ir nagų ligos viruso ir enterovirusų inaktyvavimas dvejetainio etilenimino ir formaldehido deriniu. Dev Biol (Bazelis). 2004;119:449–455

16. Rweyemamu MM, Umehara O, Giorgi W, Medeiros R, Neto DL, Baltazar M. Formaldehido ir dvejetainio etilenimino (BEI) poveikis snukio ir nagų ligos viruso kapsido vientisumui. Rev Sci Tech. 1989;8(3):747–764. doi:10.20506/rst.8.3.425

17. Patch JR, Kenney M, Pacheco JM, Grubman MJ, Golde WT. Citotoksinės T limfocitų funkcijos apibūdinimas po snukio ir nagų ligos viruso infekcijos ir vakcinacijos. Virusinis imunolis. 2013;26(4):239–249. doi:10.1089/vim.2013.0011

18. Rodriguez-Calvo T, Ojosnegros S, Sanz-Ramos M, Garcia-Arriaza J, Escarmis C, Domingo E, Sevilla N. Naujas vakcinos dizainas, pagrįstas defektiniais genomais, kurie jungia susilpnintų ir inaktyvuotų vakcinų savybes. PLoS One. 2010;5(4):1–11. doi:10.1371/ journal.pone.0010414

19. Núñez JI, Baranowski E, Molina N ir kt. Rūgščių pakeitimas nestruktūriniame baltyme 3A gali tarpininkauti snukio ir nagų ligos virusui prisitaikyti prie jūrų kiaulytės. J Virol. 2001. doi:10.1128/JVI.75.8.3977-3983.2001

20. Burman A, Clark S, Abrescia NGA ir kt. Snukio ir nagų ligos viruso VP1 GH kilpos specifiškumas v 6 integrinams. J Virol. 2006;80(19):9798–9810. doi:10.1128/JVI.{12}}

21. Dicara D, Burman A, Clark S ir kt. Snukio ir nagų ligos virusas sudaro labai stabilų, EDTA atsparų kompleksą su pagrindiniu receptoriumi, integrinu v 6: pasekmės užkrečiamumui. J Virol. 2008;82(3):1537–1546. doi:10.1128/JVI.{12}}

22. Domingo E, Sheldon J, Perales C ir kt. Virusinė kvazirūšių evoliucija. Microbiol Mol Biol Rev. 2012;76(2):159–216. doi:10.1128/MMBR.{8}}

23. Mckenna TS, Lubroth J, Rieder E ir kt. Receptorius surišančios vietos pašalintos snukio ir nagų ligos (SNL) virusas apsaugo galvijus nuo SNL. J Virol. 1995;69(9):5787–5790. doi:10.1128/ jvi.69.9.{14}}.1995

24. Dimarchi R, Brooke G, Gale C, Cracknell V, Doel T, Mowat N. Galvijų apsauga nuo snukio ir nagų ligos sintetiniu peptidu. Mokslas. 1986 m.; 232:639–641. doi:10.1126/science.3008333

25. Gómez N, Salinas J, Escribano JM ir kt. Apsauginis imuninis atsakas į snukio ir nagų ligos virusą su VP1, išreikštu transgeniniuose augaluose, apsauginis imuninis atsakas į snukio ir nagų ligos virusą su VP1, išreikštu transgeniniuose augaluose. J Virol. 1998;72:2–5.

For more information:1950477648nn@gmail.com