GRP78 perdėta ekspresija sukelia PINK1-IP3R sukeltą neuroprotekcinę mitofagiją, 3 dalis

3.1.3. Mitofagijos indukcija dėl GRP78 pernelyg didelės ekspresijos tarpininkauja neuroprotekcijai

Iškėlėme hipotezę, kad GRP{0}}tarpininkaujama neuroprotekcija gali būti vykdoma skatinant selektyvią mitochondrijų autofagiją, kad būtų paspartintas defektinių organelių pašalinimas.

Pastaraisiais metais vis daugiau tyrimų parodė, kad mitochondrijos vaidina svarbų vaidmenį formuojant ir palaikant atmintį. Mitochondrijos yra svarbus ląstelių organas, atsakingas už energijos gamybą. Be to, mitochondrijos taip pat dalyvauja reguliuojant visą ląstelių metabolizmą ir redokso reakcijų pusiausvyrą. Naujausi tyrimai taip pat parodė, kad mitochondrijos taip pat gali turėti įtakos ilgalaikės atminties kietėjimui, reguliuodamos neuronų jaudrumo pokyčius.

Mitochondrijos yra atsakingos už oksidacinį metabolizmą ląstelėse, o ląstelių energija daugiausia perduodama per adenozino trifosfatą (ATP) mitochondrijose. Neuronai, kaip žmogaus organizmo informacijos perdavimo vienetai, turi ypač didelį energijos poreikį, todėl normali jų sveikų mitochondrijų veikla yra būtina neuronų fiziologinėms savybėms ir normaliai nervų sistemos veiklai. Tyrėjai išsiaiškino, kad sergant ar senstant mitochondrijų sveikata bus pažeista ir jų funkcija pablogės, dėl to sumažės neuronų funkcija ir pablogės atminties gebėjimas.

Atminčiai formuoti ir palaikyti reikia sudėtingo neuronų, sinapsių ir mitochondrijų koordinavimo tuo pačiu metu. Neuronų gale esančiose sinapsėse mitochondrijos yra tarp neuronų ir glijos ląstelių, palaikančių neuronus. Šios sinapsės turi specifinę struktūrą ir yra labai plastiškos, kurias galima koreguoti pagal atminties ir mokymosi poreikius. Mitochondrijos yra tarsi sinapsių „gamybos centras“, aprūpinančios neuronus ir sinapses jiems reikalinga energija ir medžiagomis, kurios gali greitai reguliuoti neuronų jaudrumą ir išlaikyti ilgalaikį sinapsių plastiškumą bei stabilumą.

Kita tyrimų kryptis, susijusi su mitochondrijomis ir atmintimi, yra ląstelių gydymas naudojant su transformacija susijusius veiksnius (baltymų rūšį). Šis gydymas gali sustiprinti mitochondrijų funkciją, padidinti medžiagų apykaitą ir apsaugoti neuronų bei sinapsių sveikatą. Remiantis šiais tyrimais, teigiama, kad stiprinant mitochondrijų sveikatą galime pagerinti savo atmintį ir intelektinius gebėjimus, kartu sumažinant Alzheimerio ir kitų neurologinių ligų riziką.

Apibendrinant galima teigti, kad mitochondrijos yra neatsiejama atminties formavimo ir palaikymo dalis. Mitochondrijų sveikata yra būtina normaliai neuronų ir sinapsių funkcijai bei ilgalaikiam plastiškumui ir stabilumui palaikyti. Turėtume atkreipti dėmesį į mitybą, mankštą ir gyvenimo būdo įpročius, kad išlaikytume mitochondrijų sveikatą, sumažintume Alzheimerio ir kitų neurologinių ligų riziką, pagerintume savo intelektą ir atmintį. Matyti, kad turime pagerinti atmintį, o Cistanche gali žymiai pagerinti atmintį, nes taip pat gali reguliuoti neuromediatorių pusiausvyrą, pavyzdžiui, padidinti acetilcholino ir augimo faktorių kiekį, kurie yra labai svarbūs atminčiai ir mokymuisi. Be to, Cistanche deserticola gali pagerinti kraujotaką ir skatinti deguonies tiekimą, o tai gali užtikrinti, kad smegenys gautų tinkamą mitybą ir energiją, taip pagerinant smegenų gyvybingumą ir ištvermę.

Spustelėkite žinoti būdus, kaip pagerinti atmintį

Pagrįsdamas šią hipotezę, buvo įrodyta, kad GRP78 skatina makroautofagiją [4] (toliau vadinama autofagija).

Siekėme nustatyti, ar autofagija reikalinga GRP78-sukeltai neuroprotekcijai, naudodami kelis gerai apibūdintus autofagijos moduliatorius: rapamiciną, kuris aktyvina autofagiją slopindamas mTORC1, ir du autofagijos srauto inhibitorius: 3-metiladeniną ({{4). }}MA), III klasės fosfatidilinozitolkinazės PI3K inhibitorius ir LY294002, I klasės PI3K inhibitorius.

Visi trys autofagijos moduliatoriai sumažino išgyvenamumą tiek GFP, tiek GRP78 grupėse Tun-gydytose ląstelėse, palyginti su nešikliu (4A pav.). Šie rezultatai rodo, kad teisingas autofagijos inicijavimas per PI3K-Beclin1 kelią ir vėlyvas srautas buvo būtinas, nors ir nepakankamas, kad būtų užtikrintas GRP78 per didelės ekspresijos poveikis ER paveiktose ląstelėse.

3 paveikslas. Per didelis GRP78 ekspresija išsaugo mitochondrijų disfunkciją įtemptose NSC34 ląstelėse. (A) Imunoblotas ir juostinė diagrama, rodanti GRP78 lygius NSC34 ląstelėse, užkrėstose plazmidiniu vektoriumi, kad per daug ekspresuotų GRP78 arba nesusijusią baltymų kontrolę (GFP). (B) GFP arba GRP{8}}išreiškiančių NSC34 ląstelių išgyvenimo procentas (vidurkis ± SEM) po 24 valandų terpėje, kurioje yra 1 µg/mL tunikamicino (Tun) (kairėje) arba 10 µM nokodazolo (dešinėje) nustatyta naudojant MTT testą (n=4; * p < 0.005,** p < 0,001, palyginti su GFP, Stjudento t testas ). (C) Kiekybinė MitoSOX fluorescencijos analizė ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja GFP arba GRP78 ir buvo apdorotos Tun arba nešikliu (kairėje) arba efavirenzu (EFV) kaip kontrolė arba nešiklis (dešinėje). (D) Kiekybinė TMRM fluorescencijos analizė ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja GFP arba GRP78 ir buvo apdorotos Tun arba nešikliu (kairėje) arba EFV arba nešikliu (dešinėje) (GFP-Veh yra kontrolinė grupė). (E) Kairėje: reprezentatyvi O2 koncentracijos analizė (naudojant Clark tipo O2 elektrodą) kaip laiko funkcija ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja GFP arba GRP78 ir apdorotos Tun. Dešinėje: O2 suvartojimas po 5 valandų apdorojimo ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja GFP arba GRP78 (GFP-Veh yra kontrolinė grupė) (n=4; * p < 0,05, palyginti su Veh-GFP, # p < 0,05 prieš GRP78, vienpusė ANOVA).

4 pav. Mitochondrijų žymėjimas mitofagijai yra privilegijuotas dėl GRP78 pernelyg didelės ekspresijos. (A) GFP arba GRP78 plazmidėmis nukleofekuotų ir Tun arba Tun deriniu su autofagijos moduliatoriais: rapamicinu (RAPA), 3MA arba LY-902, nukleofekuotų GFP arba GRP78 plazmidėmis, procentinės dalies stulpelinė diagrama. kontrolinė priemonė (Veh), nustatyta MTT tyrimu praėjus 24 val. po gydymo (GFP-Veh yra kontrolinė grupė) (n=4–8, * p < 0,05 vs.

Veh-GFP; # p < 0.05 prieš Tun-GFP).(B) Reprezentatyvūs konfokaliniai ląstelių, užkrėstų tik PARK2-HA plazmide (viršutinė, vidurinė plokštės, kontrolinė) arba su nukleoinfekcija, vaizdai GRP78 plazmidė (apatinės plokštės), apdorota nešikliu (Veh) arba Tun (5 val.) ir nudažyta imunine HA (žalia) ir HSP60 (raudona); mastelio juosta=10 µm. (C) Parkino ir Hsp60 bendros lokalizacijos Veh, Tun ir Tun+GRP78 grupių Pirsono koreliacijos koeficiento vidurkis ± SEM (n=4; * p < 0,05, palyginti su Parkin-Veh, # p < 0,05 vs.

Parkin-Tun, vienpusė ANOVA). (D) Kairėje, Western blot'ai nurodytiems baltymams mitochondrijų (mito) ir citozolinių (cito) sujungtų frakcijų iš GFP- arba GRP78-per daug ekspresuojančių ląstelių, apdorotų nešikliu arba Tun 5 valandas. Išanalizuoti baltymai yra OPA-1, CV-, PDI, GRP78, Ubikvitintos liekanos, LC3 ir aktinas. Dešinėje, stulpelių diagramos, rodančios vidutinį GRP78 kartojimo pokytį abiejose sujungtose frakcijose ir LC{{1{{20}}}II mitochondrijų frakcijoje, palyginti su aktinu (citozoliu) arba komplekso V beta subvienetu (CV-B) (mitochondrijos) GFP grupėje. (E) Gyvybingų ląstelių procentinės dalies diagrama (vidurkis ± SEM), kurios per daug ekspresuoja GFP arba GRP78 baltymus ir buvo apdorotos vien Tun arba kartu su CCCP, CSA arba BAPTA-AM, nustatyta MTT tyrimu praėjus 24 valandoms po gydymo, susijusio su kontroliniu tirpikliu. ląstelių. (F) Panaši ląstelių gyvybingumo diagrama ląstelių, apdorotų tapsigarginu (THA) su CCCP arba be jo (GFP-Veh yra kontrolinė grupė) (n=4–8, 3 skirtinguose eksperimentuose, * p < 0,05 vs. Control-Veh;# p < 0,05, palyginti su GRP{25}}Tun).

Parkinas ne visada dalyvauja mitofagijoje, nes ją taip pat gali sukelti alternatyvūs mechanizmai [46]. Norėdami išsiaiškinti, ar Parkinas yra susijęs su GRP78-tarpininkaujamu poveikiu, nustatėme HA žymėto Parkino, išreikšto NSC34 ląstelėse su ER stresu ir be jo, vietą tarpląstelėje.

Atlikdami konfokalinę mikroskopiją pastebėjome, kad Parkin pasiskirstė visoje NSC34 ląstelėje po 5 valandų gydymo nešikliu arba Tun (4B pav.), Priešingai, ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja GRP78, Parkin lokalizacija padidėjo kartu su HSP60, mitochondrijų baltymu. , o tai rodo, kad ši organelė formitofagija (4B, C pav.).

Be to, išskyrėme mitochondrijų ir citozolines frakcijas iš ląstelių, kurios per daug ekspresavo GFP arba GRP78, ir praėjus 5 valandoms po įžeidimo buvo gydomos Tun arba nešikliu. Sujungtų mitochondrijų frakcijų grynumas buvo patvirtintas analizuojant OPA1 ir CV buvimą bei ER reziduojančio baltymo, proteindisulfido izomerazės (PDI) nebuvimą (4D pav.).

Įdomu tai, kad mes taip pat pastebėjome tendenciją didinti GRP78 gausą sujungtose ER paveiktų ląstelių mitochondrijų frakcijose, palyginti su kontrole. Atkreipkite dėmesį, kad nors Tun stimulas taip pat gali sukelti GRP78 lygio padidėjimą citozolyje, mitochondrijų frakcijoje tai nebuvo pastebėta.

Priverstinė per didelė GRP78 ekspresija paskatino tendenciją padidinti PINK1 ir Parkino kaupimąsi jų tochondrinėje frakcijoje (4D pav. ir S4 pav.). Pranešama, kad Parkin buvimas sustiprina Ub kaupimąsi ir sustiprina mitofagiją, palyginti su vien PINK buvimu [42, 47]. Atitinkamai, Ubikvitino (Ub) imunoblotavimas atskleidė jo profilio skirtumus mitochondrijų frakcijose iš GRP78- ekspresuojančių ląstelių, palyginti su GFP grupe (4D pav.).

Esant įtemptoms sąlygoms, mitochondrijų baltymų ubiquitilinimas sukelia autofagosomų mechanizmų komponentų susikaupimą, kuris prasideda nuo lipiduotų LC3 ir LC3II izoformų kaupimosi [42, 48].

Mitochondrijų frakcijoje buvo pastebėtas gausus LC3II baltymas, turintis tendenciją didinti stresą patiriančiose ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja GRP78, palyginti su GFP turinčiomis panašiomis sąlygomis (4D pav.) Kartu šie duomenys rodo, kad priverstinė GRP78 ekspresija gali palengvinti mitochondrijų translokaciją ir mitofagijos žymėjimas.

Norėdami nustatyti galimą mitofagijos indukcijos svarbą neuroprotekciniam poveikiui, kurį sukelia GRP78 per didelė ekspresija, įvertinome mitofagijos aktyvatorių ir inhibitorių sukeltus pokyčius. Naudojome karbonilo cianido m-chlorfenilhidraziną (CCCP), kad chemiškai atsietume oksidacinį fosforilinimą ir sukeltume mitofagiją, suardydami mitochondrijų membranos potencialą [49, 50], taip pat du mitofagijos inhibitorius: BAPTA-AM, ląstelėms prasiskverbiantį intracelulinį chelatorių. 2+ ir ciklosporinas A (CSA), jų tochondrijų pralaidumo pereinamųjų porų (mPTP) inhibitorius, blokuojantis Ca2+ ištekėjimą iš mitochondrijų [51].

Nors CCCP gydymo NSC34 nepakako, kad žymiai sumažintų gyvybingumą, kaip plačiai pranešta, mes nustatėme, kad tas pats gydymas ER paveiktose ląstelėse padidino jo išgyvenamumą, nepaisant to, ar GRP78 buvo per daug išreikštas (4E pav.).

Svarbu tai, kad neuroprotekcinis poveikis, skatinamas per didelės GRP78 ekspresijos ER paveiktose ląstelėse, buvo panaikintas esant CSA arba BAPTA-AM (4E pav.). Šie radiniai rodo, kad mitofagijos indukcija leidžia ląstelėms susidoroti su ER stresu ir Ca{4}} srautu. yra svarbus GRP78 skatinamam neuroprotekciniam poveikiui.

Viena iš galimybių GRP78 sukelti mitofagiją gali būti palengvinti būtiną Ca2+-tarpininkaujantį veiksmą, galbūt veikiant ER reziduojančiam inozitolio 1,4,5 trifosfato receptoriui (IP3R), kurio atidarymas leidžia tekėti Ca2+. iš ER į mitochondrijas. Norėjome ištirti šią galimybę, trukdydami aktyvuoti IP3R, naudodami thapsigarginą (THA), Ca2+ ATPazės inhibitorių [52].

Taip pat žinoma, kad tapsigarginas sukelia ER stresą ląstelėse, nes šis gydymas išeikvoja Ca2+ atsargas iš ER ir todėl padidina GRP78 ekspresiją kaip kanoninio išsiskleidusio baltymo atsako dalį [53]. 4F paveiksle parodyta, kad thapsigarginas veikia ląstelių gyvybingumą panašiai kaip gydymas tunicamicinu GFP kontrolės ląstelėse ir kad kartu vartojamas CCCP gydymas apsaugo nuo ląstelių mirties, kaip pastebėta naudojant Tun.

Tačiau priverstinis per didelis GRP78 ekspresija negalėjo blokuoti žalingo thapsigargino poveikio, kaip tai buvo padaryta su tunicamicino įžeidimu. Šis stebėjimas patvirtina būtiną Ca 2+ srauto įsitraukimą į neuroprotekcinį GRP78 poveikį, tikriausiai per IP3R.

3.1.4. GRP78 tarpininkaujama neuroapsauga priklauso nuo PINK1 ir IP3R

Norėdami pradėti GRP78 neuroprotekcinio poveikio tarpininkų identifikavimą, naudojome shRNR technologiją. Pirma, patikrinome, ar pasirinkta shRNR sumažino atitinkamai GRP78, PINK1 arba IP3R ekspresiją (S4A – C pav.) ir ar jos nepakenkė kontrolinių ląstelių gyvybingumui (S4D pav.). Pirmiausia patvirtinome, kad pati GRP78 ekspresija buvo būtina tiek GRP78-, tiek CCCP sukeltai neuroprotekcijai, kad būtų galima susidoroti su Tun sukeltu ER stresu (5A pav.).

Tada PINK1 arba IP3R nutildymas blokavo neuroprotekcinį poveikį, kurį skatina GRP78 per didelė ekspresija arba gydymas CCCP (5A pav.). Be to, mes nustatėme, kad GRP78 poslinkis, paprastai pasiskirstęs sklandžiu dėmėtu pasiskirstymu aplink branduolį, buvo lokalizuotas IP3R dėmių židiniuose, kai jis buvo pernelyg išreikštas (5B pav.).

Kartu šie rezultatai leido manyti, kad GRP78 moduliuoja apsauginę mitofagiją mūsų in vitro modelyje ir tai daro šią neuroapsaugą PINK1- ir IP3R priklausomu būdu.

4. Diskusija

Sustiprinus endogeninius neuroprotekcijos mechanizmus, galima gauti veiksmingų terapinių priemonių, skirtų užkirsti kelią neurodegeneraciniams procesams po trauminių pažeidimų ar ligų [3,54,55]. ER reziduojantis chaperonas GRP78 yra kelių iš šių mechanizmų, skatinančių neuroprotekciją, kai yra per daug išreikštas sergant keliomis ligomis, kryžkelėje. modeliai [4].

Norėdami nustatyti pagrindinius mechanizmus, naudojome stuburo šaknų avulsijos modelį [55], kuris sutrikdo motoneuronų ryšį ir sukelia retrogradinį neurodegeneracinį procesą [20].

Motoneurono mirtis šiame modelyje pasižymi ER stresu, blokuotu autofagijos srautu ir nėra apoptotinė, nes nebuvo pastebėta jokių aktyvių kaspazės 3 ar 12 formų, o tai rodo, kad apoptozė nėra galutinis neuronų žūties vykdytojas [20]. Atitinkamai, mes anksčiau patikrinome proteomikos metodus, kad antiapoptoziniai požymiai atsiranda lygiagrečiai su apoptoziniais po RA, blokuodami veiksmingą apoptozės vykdymą [25].

Šiame neurodegeneraciniame kontekste pernelyg didelė GRP78 ekspresija veikė motorinę neuroprotekciją [20, 26, 27]. Iš pradžių mes naudojome nešališką lyginamąją ir kiekybinę proteomo analizę, kad atskleistume pagrindinį šios neuroprotekcijos pagrindą.

Netikėtai pagrindinis taikinys buvo mitochondrijos, kurių sumažėjęs organelių baltymų kiekis kartu su apimtų mitochondrijų dekoracijomis į pažeistų motoneuronų pūsleles, kurios per daug ekspresavo GRP78.

Šie stebėjimai rodo, kad mitofagija yra pagrindinis neuroprotekcijos elementas. Deeperin vitro eksperimentai patvirtino šią hipotezę, nes GRP78 tarpininkavo neuroprotekcijai (i) atstatydamas mitochondrijų kvėpavimą ir ROS lygį, (ii) stimuliuodamas PINK1 / PARKIN mitochondrijų perkėlimą, pažymėdamas organelę mitofagijai ir (iii) priklausomai nuo IP3R funkcijos kaip esminio tarpininko.

Mūsų žiniomis, tai yra pirmasis tyrimas, parodantis, kad GRP78 per didelė ekspresija skatina apsauginę mitofagiją. Be GRP78 vaidmens, skatinančio klaidingai susilankstančius baltymus ir kitas mėnulio šviesos funkcijas, kaip kalcį surišantį baltymą [4,56], mes pridėjome jo aktyvų poveikį stimuliuoja mitofagiją. Be to, mūsų tyrimas prisijungia prie naujausių tyrimų, siejančių ER stresą su mitochondrijų disfunkcija [57–59].

Mes nustatėme mitofagijos požymius in vivo, kai GRP78 buvo pernelyg išreikštas ir skatino neuroprotekciją. Tas pats buvo pastebėtas naudojant in vitro modelius, kurie imituoja kai kuriuos neurodegeneracinio proceso, atsirandančio po RA, požymius, pvz., ER stresą [20, 26].

Mitochondrijų kokybės kontrolė mitofagijos būdu yra labai svarbi norint stebėti mitochondrijų turinį ir metabolizmo homeostazę. Literatūroje vis dar ginčijamasi, ar mitofagijos indukcija skatina daugelio ligų išgyvenimą ar ląstelių mirtį dėl plataus perėjimo su apoptozės signalais [60], nors buvo aprašyta, kad pažeistų mitochondrijų klirensas turi esminį vaidmenį gydant neurodegeneracines ligas, tokias kaip Alzheimerio liga. , Parkinsono liga arba senėjimas [61].

Anksčiau buvo pranešta, kad GRP78 slopina apoptozę, kurią sukelia ER stresas, užkertant kelią CHOP indukcijai [62, 63], kaspazės 7 aktyvavimui [5] arba aktyvuodamas PI3K-AKT-mTOR signalizacijos ašį [4]. Taip pat buvo įrodyta, kad jis palaiko žemą oksidacinio streso ir DNR pažeidimo lygį [4,64]. Visų pirma, vėžio ląstelėse buvo įrodyta, kad GRP78 susilpnina ROS, aktyvuodamas baltymų kinazės RNR panašios endoplazminės tinklelio kinazės (PERK)-NRF2 signalus [65, 66], todėl suaktyvėja su antioksidantais susijusių genų reguliavimas, taip pat padidėja baltymų kiekis glikolitiniai fermentai [67].

Vietoj to, mes nustatėme, kad GRP78 per daug ekspresuoja glikolitinius fermentus (pvz., ENO1 ir ENO2) (papildomos lentelės). Šie rezultatai gali reikšti, kad mūsų modelyje pastebėtas ROS susilpnėjimas gali būti labiau susijęs su padidėjusia mitofagija, nors reikia toliau tirti susijusio mechanizmo detales. Mitochondrijų disfunkcija yra dažna neurodegeneracinių ligų būklė [68], o mitofagija buvo įtraukta. sergant Parkinsono [49, 69], Hantingtono [70, 71] ir Alzheimerio ligomis bei tauopatijomis [72].

Keletas autorių nurodė, kad tinkamai reguliuodamas mitofagijos kelius, organizmas gali išvengti žalingų oksidacinių rūšių ir sureguliuoti redokso pusiausvyrą bei homeostazę [73]. Taigi, pernelyg didelė GRP78 ekspresija dėl šios kontroliuojamos mitofagijos indukcijos gali būti laikoma neuroprotekcine strategija sergant šiomis ligomis. Atrodo, kad GRP78 per didelės ekspresijos skatinama neuroprotekcija priklauso nuo Ca2+ srauto, nes jį blokavo BAPTA-AM. Ca2+ BAPTA-AM kompleksonas gali įsikišti keliais skirtingais etapais autofaginio srauto kelyje, blokuodamas ne tik autofagijos sužadinimą, bet ir slopindamas autofagosomų susidarymo ir apdorojimo etapus [74].

Priešingai, kitos medžiagos, veikiančios Ca2+ srautą, pvz., astapsigarginą, naudojimas davė nuostabių rezultatų. Thapsigarginas blokuoja sarko-endoplazminio tinklelio Ca2+ ATPazes (SERCA), palaikydamas citozolinio Ca2+ padidėjimą, bet taip pat sukelia ER stresą dėl lėtinio intracelulinių Ca2+ atsargų išeikvojimo ir išsiskleidusių baltymų kaupimosi.

Esant tokiai situacijai, mes pastebėjome, kad per didelė GRP78 ekspresija negalėjo išgelbėti mirštančių ląstelių, ir įtarėme, kad taip gali būti dėl to, kad tapsigarginas taip pat trukdo IP3R veikimui [52]. Bazinis IP3R aktyvumas ir nuolatinis žemo lygio Ca2+ srautas iš ER į mitochondrijas. yra būtinas skatinant mitochondrijų kvėpavimą ir ląstelių bioenergetiką [75].

GRP78 sąveikauja su MAM su kompleksu, kurį sudaro sigma-1 receptorius (SIGR1) ir IP3R [76,77]. Esant ER stresui, SIGR1-GRP78 sąveika sumažėja dėl Ca2+ išeikvojimo, o vėliau per IP3R padidėja Ca2+ srautas iš ER į mitochondrijas [76]. Be to, taip pat buvo įrodyta, kad IP3R buvo būtinas Parkino sukeltai mitofagijai, ypač siekiant sudaryti sąlygas mitochondrijų grupavimui pasroviui Parkin įdarbinti [78].

Mūsų rezultatai sutinka su tuo, nes IP3R sumažinimas naudojant shRNR technologiją panaikino neuroprotekciją, kurią sukelia GRP78 per didelė ekspresija ER paveiktose ląstelėse. Taip pat įdomus pastebėjimas, kad GRP78 gali padidėti pačioje mitochondrijų frakcijoje. GRP78 buvo aptiktas vidinėje membranos tarpinėje erdvėje ir mitochondrijų matricoje, nors jo funkcija ten dar turi būti išaiškinta [79].

Nepaisant to, atsižvelgdami į keletą jo funkcijų, spėjame, kad tai gali būti buferinis Ca2+. Jei taip būtų, padidėjęs jo buvimas mitochondrijose ER paveiktose ląstelėse, kai jos yra per daug ekspresuojamos, gali susilpninti didžiulį Ca2+ antplūdį, kad būtų išvengta apoptozės. Tolimesnis eksperimentas būtų labai vertingas.

Studijų apribojimai ir ateities tyrimai

Šis tyrimas atveria kelią būsimoms GRP{0}}priklausomos mitofagijos neuroprotekcinio vaidmens neuronų mirčiai po neurotraumos analizei. Pirmasis šio tyrimo apribojimas yra tas, kad mitofagija buvo analizuojama tam tikru laikotarpiu po RA, o kadangi mitofagija yra dinamiškas procesas, būtų įdomu iššifruoti jo srautą ir kurios molekulės yra susijusios.

Taigi, norint iššifruoti, ar stebimas poveikis in vivo visiškai priklauso nuo mitofagijos, reikia atlikti papildomus eksperimentus, moduliuojančius mitofagiją (farmakologiniais ar genetiniais metodais).

Tai leis mums patvirtinti, kad per didelė GRP78 ekspresija skatina MN išgyvenimą per mitofagiją. Kadangi tarp mitochondrijų ir apoptozės yra gerai aprašytas kryžminimas, tolesni in vitro ir in vivo manipuliacijos yra būtinos norint iššifruoti, kuris mirties mechanizmas sukelia MN mirtį mūsų modelyje. Tai padės išsiaiškinti, ar GRP78 tiesiogiai moduliuoja tą ląstelių mirties mechanizmą, jį blokuodamas, ar jo buvimas leidžia MN susidoroti su juo ir išgyventi.

5. Išvados

Šis tyrimas buvo pirmasis, kuris aprašė naują GRP78 vaidmenį moduliuojant mitofagiją, kad būtų pasiekta motoneuroninė apsauga. Mūsų rezultatai rodo, kad GRP78 gali paskatinti mitofagiją, kad paskatintų degeneruojančių motorinių neuronų apsaugą po sunkaus trauminio nervo pažeidimo, atkurdamas pažeistą mitochondrijų funkciją neuronų ląstelėse. Be to, ši GRP78-tarpininkaujama neuroprotekcija priklauso nuo PINK1 ir IP3R. Todėl tiksliai sureguliuotos mitofagijos aktyvinimas, taikant genų terapiją su GPR78 ar kitais kandidatais, gali būti naudojamas kaip naujas terapinis metodas trauminiams nervų sistemos pažeidimams gydyti. .

Papildoma medžiaga: Šią informaciją galima rasti internete adresu https://www.mdpi.com/article/10.3390/biomedicines9081039/s1. S1 pav. Bioinformatinė analizė. S2 paveikslas: endogeninis GRP78 lygis po gydymo Tun. S3 paveikslas: Tun ir EFV sukelia mitochondrijų disfunkciją NSC34 ląstelėse. S4 pav. Pavadinimo nėra. S5 paveikslas: Ląstelių gyvybingumo analizė po shRNR nukleofekcijos Papildomoje medžiagoje taip pat yra lentelės su visais proteominės analizės metu aptiktais baltymais.

Autoriaus indėlis: TL-R. ir DR-G. suprojektavo ir atliko eksperimentus, analizavo rezultatus ir parašė dalį rankraščio. MH-G. o JF padėjo atlikti in vivo eksperimentus.PM-G. ir JML atliko mitochondrijų gryninimą. MP, CB ir NA padėjo atlikti mitochondrijų funkcinę analizę. VP ir AB paruošė visas naudojamas GRP78 plazmides ir viruso vektorius. CC sumanė, suprojektavo, prižiūrėjo ir analizavo visus eksperimentus ir parašė rankraštį. Visi autoriai perskaitė ir sutiko su paskelbta rankraščio versija.

Finansavimas: šį darbą daugiausia rėmė Ispanijos ekonomikos ministerija (#SAF 2014-59701) ir Marató de TV3 (#201607.10). Taip pat esame dėkingi už paramą iš CIBERNED ir Generalitat de Catalunya finansavimo. CB yra Miguelio Serveto sutarties (CP19/00077) iš Carlos III sveikatos instituto gavėjas.

Institucinės peržiūros tarybos pareiškimas: visas procedūras, kuriose buvo naudojami gyvūnai, patvirtino Universitat Autònoma de Barcelona ir Generalitat de Catalunya ir jos atitiko Europos Bendrijos Tarybos direktyvą 2010/63/ES.

Informuoto sutikimo pareiškimas: Netaikoma.

Duomenų prieinamumo pareiškimas: visi šio tyrimo metu sukurti arba išanalizuoti duomenys yra įtraukti į šį paskelbtą straipsnį ir jo papildomos informacijos failus.

Padėka: Dėkojame Martai Monserrat, Ariadnai Aransanz, Migueliui Chillónui, Juliai Lorenzo, Sarai Marmolejo ir UAB „Neuroplastiškumo ir regeneravimo grupei“. Ypač dėkojame Carlosui Guillemui (Madrido Complutense universitetas) už malonų PARK{0}}HA plazmidės suteikimą ir Elenai Galea bei Esther Dalfo iš UAB dėl antikūnų.

Interesų konfliktai: autoriai pareiškia, kad nėra interesų konflikto.

Specialus pareiškimas: Autoriai nori skirti ypatingą paminėjimą Caty Casas, įtakingos mokslininkės ir nuostabios ir drąsios asmenybės, kuri mirė per anksti, sulaukusi 54 metų amžiaus, atminimui. Buvo garbė ir privilegija pasidalinti jos dalimi. gyvenimą, jos profesinius gebėjimus ir etines bei žmogiškąsias vertybes.

Nuorodos

1. Conforti, L.; Gilley, J.; Coleman, MP Wallerio degeneracija: atsirandantis aksono mirties kelias, jungiantis sužalojimą ir ligą. Nat.Rev. Neurosci. 2014, 15, 394–409. [CrossRef]

2. Romeo-Guitartas, D.; Forés, J.; Herrando-Grabulosa, M.; Valsas, R.; Leiva-Rodriguez, T.; Galea, E.; González-Pérez, F.; Navarro, X.;Petegnief, V.; Bosch, A.; ir kt. Neuroprotekcinis vaistas nuo nervų traumų, atskleistas naudojant dirbtinį intelektą. Sci. Rep. 2018, 8,1879. [CrossRef]

3. Romeo-Guitartas, D.; Forés, J.; Navarro, X.; Casas, C. NeuroHealin padidino regeneraciją ir sumažino denervuotų raumenų atrofiją – ikiklinikinį juosmens šaknų avulsijos modelį su uždelsta reimplantacija. Sci. Rep. 2017, 7, 12028. [CrossRef]

4. Casas, C. Grp78 neurodegeneracijos ir vėžio stadijos centre. Priekyje. Neurosci. 2017, 11, 1–15. [CrossRef]

5. Reddy, RK; Mao, C.; Baumeisteris, P.; Ostinas, RC; Kaufmanas, RJ; Lee, AS Endoplazminio tinklo chaperono baltymas GRP78 apsaugo ląsteles nuo apoptozės, kurią sukelia topoizomerazės inhibitoriai. ATP surišimo vietos vaidmuo slopinant kaspazės -7aktyvaciją. J. Biol. Chem. 2003, 278, 20915–20924. [CrossRef] [PubMed]

6. Wang, M.; Kaufman, RJ Klaidingas baltymų susilankstymas endoplazminiame tinkle kaip žmogaus ligų kanalas. Gamta 2016, 529 326–335. [CrossRef] [PubMed]7. Printsevas, I.; Curiel, D.; Carraway, KL membranos baltymų kiekio kontrolė endoplazminiame tinkle. J. Membr. Biol. 2016,250, 1–14. [CrossRef] [PubMed]

8. Shu, C.-W.; Sun, F.-C.; Cho, J.-H.; Linas, C.-C.; Liu, P.-F.; Chen, P.-Y.; Chang, MD-T.; Fu, H.-W.; Lai, Y.-K. GRP78 ir Raf{11}}bendradarbiaujant suteikia atsparumą endoplazminio tinklo streso sukeltai apoptozei. J. Cell. Physiol. 2008, 215, 627–635. [CrossRef]

9. Virėjas, KL; Clarke, R. Šilumos šokas 70 kDa proteinas 5/gliukozės reguliuojamas baltymas 78 „AMP“, skatinantis autofagiją. Autofagija 2012, 8, 1827–1829. [CrossRef]

10. Li, Z.; Wang, Y.; Niutonas, IP; Zhang, L.; Ji, P.; Li, Z. GRP78 yra susijęs su naviko aerobinės glikolizės moduliavimu, skatindamas autofaginį IKK skaidymą. Ląstelė. Signalas. 2015, 27, 1237–1245. [CrossRef]

11. Cha-Molstadas, H.; Yu, JE; Lee, SH; Kimas, JG; Sung, KS; Hwang, J.; Yoo, YD; Lee, YJ; Kimas, ST; Lee, DH; ir kt. SQSTM1/p62 aktyvumo moduliavimas endoplazminio tinklo chaperono HSPA5/GRP78/BiP N-galo arginilinant. Autofagija 2016,12, 426–428. [CrossRef]

12. Cha-Molstadas, H.; Sung, KS; Hwang, J.; Kimas, KA; Yu, JE; Yoo, YD; Jang, JM; Han, DH; Molstadas, M.; Kimas, JG; ir kt. Amino-galinis arginilinimas nukreiptas į endoplazminį retikulinį chaperoną BiP autofagijai per p62 surišimą. Nat. Cell Biol.2015, 17, 917–929. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com