Didelės skiriamosios gebos tandeminė masės spektrometrija nustato specifinį gangliozido modelį ankstyvoje 2 tipo cukriniu diabetu sergančių pacientų inkstų ligoje

Santrauka:

Atsižvelgiant į vertingą informaciją, kurią teikia glikosfingolipidai kaipmolekuliniai žymenysir turimi riboti duomenys, leidžiantys juos nustatyti ir apibūdinti pacientams, sergantiems2 tipo diabetinė inkstų liga(DKD), sukūrėme ir įdiegėme puikų metodą, pagrįstą didelės skiriamosios gebos (HR) masės spektrometrija (MS) ir tandemine MS (MS/MS), skirtą gangliozidų kiekiui šlapime nustatyti.DKD sergančių pacientų. Šiame tyrime daugiausia dėmesio buvo skiriama: i) HR MS ir MS/MS pagrįstumo ir našumo kartografavimo ir veiksmingumo testavimui.inkstų gangliozidų sekos nustatymas sergant 2 tipo DMpacientai; ii) pokyčių nustatymasDKD šlapimo gangliozidaspacientųskirtingos ligos stadijos-normo-, mikro- ir makroalbuminurija - lyginamajame tyrime su sveikomis kontrolėmis. Dėl didelės skiriamosios gebos ir masės tikslumo, lyginamoji MS atranka atskleidė, kad gangliozido komponentų sialilinimo būsena; jų modifikavimas O-acetilu, CH3COO−, O-fukozilu ir O-GalNAc; taip pat keramido sudėtis yra galimi žymenys ankstyvam DKD nustatymui, ligos progresavimo įvertinimui ir tolesniam gydymui. Be to, MS/MS struktūrinis tyrimas parodė, kad GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) ir GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) izomerai yra susiję su makroalbuminurija, todėl verta toliau tirti jų vaidmenį sergant DKD.

Raktiniai žodžiai: nanoelektrospray; didelės raiškos tandeminė masės spektrometrija; atranka; fragmentacijos analizė; diabetinė inkstų liga; gangliozidų biomarkeriai

1. Įvadas

Nepaisant mokslo pažangos šioje srityje, 2 tipo cukrinis diabetas (DM) išlieka terapiniu iššūkiu, kurio paplitimas visame pasaulyje nuolat didėja. Dėl niokojančių ilgalaikių makrovaskulinių ir mikrovaskulinių pažeidimų 2 tipo DM padidina mirtingumą. Diabetinė inkstų liga (DKD) yra dažniausia galutinės stadijos inkstų liga (ESRD) išsivysčiusiose ir besivystančiose šalyse [1,2]. Taigi ankstyvas DKD nustatymas ir optimalus 2 tipo DM gydymas yra labai svarbūs siekiant sumažinti komplikacijas, sergamumą ir mirtingumą. Šiuo metu DKD diagnozė ir progresavimas priklauso nuo albuminurijos matavimo ir nuolatinio glomerulų filtracijos greičio (eGFR) sumažėjimo – abu parametrai rodo nedidelę būsimos inkstų būklės prognozę. Natūrali DKD istorija apima keletą klinikinių etapų, įskaitant: ankstyvą glomerulų hiperfiltraciją, mikroalbuminurijos ar makroalbuminurijos atsiradimą, glomerulų filtracijos greičio sumažėjimą ir ESRD. Tačiau naujausi tyrimai mano, kad albuminurija yra būklės blogėjimo požymis [3].

Per pastarąjį dešimtmetį buvo parodytas ypatingas susidomėjimas subtelocentrine koncepcija, pagal kurią proksimalinis kanalėlis ir tubulointersticinis skyrius gali turėti esminį vaidmenį inicijuojant ir progresuojant DKD [4–6]. Šiame kontekste vis daugiau dėmesio sulaukia prognostinių ir nuspėjamųjų glikominių biomarkerių kūrimas, o bėgant metams jis tapo daugelio tyrimų grupių dėmesio centre [7–11].

Gangliozidai yra tam tikra sudėtingos struktūros glikosfingolipidų klasė, identifikuojama visuose audiniuose ir kūno skysčiuose ir ypač gausu centrinėje nervų sistemoje (CNS) [12]. Kaip pagrindinės neuronų ląstelių dvisluoksnių membranų sudedamosios dalys, gangliozidai atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį smegenų vystymesi, brendimui ir senėjimui, tarpininkauja ląstelių adhezijai, aktyvacijai, proliferacijai, judrumui ir augimui. Gangliozidai susideda iš skirtingos sudėties keramido sfingoidinės bazės atžvilgiu, riebalų rūgščių likučių, įsišaknijusių į išorinį membranos sluoksnį, ir sialilintos oligosacharidų grandinės, dengiančios membraną ir dalyvaujančios specifinėse ir esminėse sąveikose su kitomis supančios aplinkos molekulėmis. Per normalią ląstelių paviršiaus apykaitą, vadinamą "ląstelių paviršiaus išsiskyrimu", gangliozidai tam tikru mastu išsiskiria į tarpląstelinę erdvę.

Kadangi žinoma, kad gangliozidų ekspresija, pasiskirstymas ir struktūra priklauso nuo ląstelių ir audinių tipo ir kinta audinių vystymosi, brendimo, senėjimo ir ypač patologinių būsenų metu [12], gangliozidai laikomi vienais vertingiausių. diagnostiniai žymenys ir numatomi terapiniai agentai.

Inkstų gangliozidų identifikavimui 2 tipo DM pacientams buvo taikomi keli metodai, naudojant serumo arba inkstų biopsijos fragmentus, pavyzdžiui, plonasluoksnis imuninis dažymas [7,8], didelio efektyvumo plonasluoksnė chromatografija (HPTLC) [9], spektrofotometrija [10]. ], ir masės spektrometrija (MS) [11].

Atsižvelgdami į vertingą informaciją, kurią gali pateikti gangliozidai, kaip neuronų audinio molekuliniai žymenys [12], ir į ribotus duomenis apie glikosfingolipidų aptikimą ir apibūdinimą DKD sergančių pacientų šlapime, sukūrėme ir įdiegėme geresnį metodą, pagrįstą. apie nanoelektrospray (nanoESI) didelės raiškos (HR) MS gangliozidų kiekiui DM pacientų šlapime nustatyti. Ši parinktis HR MS buvo pagrįsta šio metodo pranašumais analizuojant sudėtingus gangliozidų mišinius, išskirtus iš žmogaus šlapimo. Didesnė prietaiso skiriamoji geba: i) leidžia aptikti artimų m/z reikšmių jonus, kurie kitu atveju negalėtų būti atskirti nevienalyčiame daugiakomponentiniame mėginyje, kuriame yra įvairaus ilgio ir skirtingos struktūros glikano grandinės rūšys bei skirtingos sudėties keramidas; ii) iš esmės pašalina poreikį mišinį atskirti skysčių chromatografijos arba elektroforezės metodais prieš MS analizę; (iii) užtikrina didelį masės tikslumą, o tai labai padidina konstrukcijos identifikavimo patikimumą; ir (iv) suteikia ne tik geresnį supratimą apie su DM susijusio gangliozidomo sudėtingumą, bet ir duomenis apie rūšis, turinčias galimą biomarkerio vaidmenį, remiantis dideliu pasitikėjimu tiek molekulinių, tiek fragmentų jonų masės nustatymu.

Šis bandomasis tyrimas, kurio tikslas - apibūdinti šlapimo gangliozidus, turinčius biomarkerio vaidmenįankstyva DKD diagnostika, buvo sutelktas į: (a) ŠSD ir tandeminės MS (MS/MS) pagrįstumo ir veikimo patikrinimą taikant didelės energijos susidūrimo sukeltą disociaciją (HCD), nustatant 2 tipo DM pacientų inkstų gangliozidus; b) natūralių gangliozidų mišinių ekspresijos pokyčių nustatymas iš 2 tipo DM pacientų šlapimo mėginių lyginamajame tyrime su sveikomis kontrolėmis ir aptiktų biomarkerių apibūdinimas. Šiuo tikslu optimizavome modernią bioanalitinę platformą, pagrįstą nanoESI HR MS, naudojant Orbitrap instrumentą, suderintą veikti neigiamų jonų režimu tiek MS atrankoje, tiek MS / MS suskaidymui, kad būtų galima atlikti išsamią struktūrinę analizę.

2. Rezultatai ir diskusijos

2.1. Lyginamasis mėginių patikrinimas nanoESI HR MS

A1, A2, A3 ir C gangliozidų mėginiai nanoESI buvo suleisti vienas po kito į Orbitrap MS ir tikrinami neigiamų jonų režimu identiškomis instrumentinėmis sąlygomis. Kiekvienu atveju visos jonų srovės (TIC) signalas buvo gautas 2 minutes, sukuriant spektrus iš 100 nuskaitymų. Dėl didelio metodo jautrumo, net ir esant laiko ribojamoms sąlygoms, gauti masės spektrai pasižymėjo dideliu signalo ir triukšmo santykiu bei turtingu molekulinių jonų modeliu.

Įvertinus kartografavimo duomenis, gautus tomis pačiomis sąlygomis, buvo nustatyti reikšmingi gangliozidų komponentų, išreikštų A1, A3 ir C mėginiuose, skaičiaus ir tipo skirtumai, o tarp A1 ir A2 mėginių skirtumų nepastebėta. Šie rezultatai apibendrinti 1 lentelėje, kurioje palyginamas A1, A3 ir C natūraliuose mišiniuose identifikuotos struktūros, kartu pateikiamos aptiktų signalų eksperimentinės m/zexp reikšmės ir siūlomas struktūras atitinkančios teorinės m/ztheor reikšmės.

Didelė naudojamos MS platformos skiriamoji geba ir masės tikslumas pagerino diskriminaciją ir identifikavimą, pagrįstą tiksliais ne mažiau kaip 37 skirtingų šlapimo gangliozido ir fukogangliozido komponentų masės matavimais trijuose mėginiuose. Atrastos rūšys priklauso 15 skirtingų klasių, įskaitant pagrindinės glikano grandinės modifikacijas (2 lentelė), ir joms buvo priskirtas puikus vidutinis masės tikslumas – 4 ppm.

Išsamus 1 lentelėje pateiktų struktūrų įvertinimas atskleidė, kad iš visų mėginių A3 mišinyje, kuris atitinka makroalbuminuriją (taigi, pažengusią DKD stadiją), yra daugiausia skirtingų gangliozidų junginių, ty 19, o po to C pavyzdys su 12 skirtingų rūšių ir A1 pavyzdys su 10.

Palyginti su A1 ir C pavyzdžiais, A3 taip pat: i) apima daugiausiai rūšių, turinčių ilgiausią O-glikano grandinę, priklausančią G1 klasei, ir ryškiausią keramidų kompozicijų įvairovę; (ii) pateikia didžiausią gangliozidų klasių skaičių, išreikštą -12 klasėmis, palyginti su tik 6 A1 mėginyje ir 6 C mėginyje; iii) turi daugiausiai gangliozidų, kurių sacharidinė šerdis yra pakeista ne angliavandenių O-acetilo, taip pat angliavandenių O-fukozilo ir O-GalNAc biologiškai svarbių modifikacijų; (iv) yra vienintelis šlapimo ekstraktas, kuriame yra gangliozidų struktūrų, modifikuotų O-GalNAc prisijungimu, būtent GalNAc-GS1(t18:1/18:0), aptiktas kaip keturių sluoksnių deprotonuota ir natriota molekulė, esant m/z 1176,8266 , ir GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), kaip dvigubai deprotonuota molekulė, kai m/z 1310.1271. Kaip matyti 1a–c paveiksluose, kuriuose parodyta trijuose mėginiuose išreikšta gangliozidų klasių dalis, ir lyginamojoje histogramoje, pavaizduotoje 2 paveiksle, A3 ekstraktas rodo ypatingą sialilinimo būseną, kurioje dominuoja polisialo junginiai. Išskyrus monosialilintą gangliotetraozę GM1 (d18:1/16:1), aptiktą kaip [M-2H+ ] 2−, kai m/z 756,9078, ir monosialilintą GM3 (d18:0/24: 0) aptikta kaip dvigubai deprotonuota molekulė, esant m/z 645,3956, visos 17 kitų rūšių turi daugiau nei vieną Neu5Ac liekaną savo glikano fragmente. Be to, kadangi buvo aptikti ne mažiau kaip septyni trisialo GT1, keturi pentazialo GQ1 ir net heptazialintas GS1, akivaizdu, kad šalia padidinto struktūrų skaičiaus ir įvairovės, glikanų šerdies ilgio ir jų periferinių modifikacijų, didelis bendras sialilinimas. turinys yra dar viena makroalbuminurijai būdinga savybė.

1 lentelė. Gangliozidų rūšys buvo identifikuotos A1, A3 ir C mėginiuose atliekant (-) nanoESI Orbitrap MS atranką. d: dihidroksilinta sfingoidinė bazė; t: trihidroksilinta sfingoidinė bazė.

Kliniškai reikšmingas stebėjimas taip pat išplaukia iš A1 ir C lyginamojo tyrimo. Tuo tarpu kontroliniame mėginyje C didžiausias aptiktų gangliozidų sialilinimo laipsnis yra keturi, identifikuoti per dvi tetrasialilintas gangliotetraozes GQ1, kurios skiriasi savo lipidinio aglikono sudėtimi, o A1 mėginyje didžiausias sialilinimo laipsnis yra keturi. Šalia di-, tri- ir tetrasialilintų gangliozidų, A1 mišinyje yra pentazialo gangliotetraozė GP1 (d18:1/18:0), aptikta kaip [M-4H+ ] 4− jonas m/z 676,5569, kuriam buvo priskirtas puikus 2,95 ppm masės tikslumas. Tokie duomenys, susiję su tirtų mėginių sialilinimo būkle, rodo, kad inkstų gangliozidų sialilinimo laipsnis atitinka požymį C DKD progresavimasirgydymo veiksmingumas.

2 lentelė. Lentelinis identifikuotų šlapimo gangliozidų klasių vaizdas kartu su jų skirtinga išraiška A1, A3 ir C mėginiuose. Simboliai: x=klasė buvo aptikta; -=klasė nebuvo aptikta.

Išsamus aglikono konstitucijos patikrinimas atskleidžia, kad, išskyrus ryškius glikano grandinės sudėties skirtumus, trijuose mėginiuose išreikšti gangliozidai taip pat pasižymi keramidų struktūros skirtumais. Ryškiausi lipidinės dalies pakitimai yra susiję su retesniu sfingoidų bazių trihidroksilinimo procesu, kuris vyksta A1 ir A3 gangliozidų mišiniuose, ir neįprastu riebalų rūgščių grandinių ilgiu, esančiu tik A3. Nustatyta, kad kiekviename iš A1 ir A3 mėginių yra dvi rūšys su trihidroksilintomis keramido sfingoidinėmis bazėmis. Taigi GT1(t18:0/18:0) ir GT1(t18:0/20:0) buvo aptikti A1 pavyzdyje, o daugiau A3 mėginyje aptiktos kompleksinės trihidroksilintos GT1(t18:1/24:3) ir Fuc-GT3(t18:1/18:3) struktūros.

Pažymėtina, kad A3 mėginys taip pat rodo rūšis, kuriose yra labai ilgos grandinės riebalų rūgščių (VLCFA). VLCFA laikoma retai pasitaikančia lipidų struktūra, apimančia 23–27 anglies atomus riebalų rūgščių grandinėje. A3 mėginyje buvo aptiktos keturios tokios neįprastos VLCFA rūšys, kurių riebalų rūgščių grandinėje yra 24 anglies atomai: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1). /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0) ir Fuc-GT1(d18:0/24:0), iš kurių viena struktūra taip pat pasižymi neįprastu sfingoidinės bazės trihidroksilavimu ir trimis dvigubomis jungtimis riebalų rūgščių grandinėje, tuo tarpu dvi struktūros yra atitinkamai prijungtos prie O-Ac ir fukozilo grupės glikano šerdies.

Šios A1 ir A3 mėginių keramido dalių charakteristikos, kurių kontroliniame mėginyje nebuvo; A1 ir A2 panašumai; ir ryškūs skirtumai, nustatyti A3, rodo, kad, be angliavandenių sudėties ir sialinimo būsenos, lipidų fragmento struktūra inkstų ganglioziduose yra dar vienas galimas ankstyvojo DKD žymuo. Be to, atrodo, kad keramido sudėties pokyčiai priklauso nuo albuminurijos stadijų; sudėtingi keramidai, turintys sfingoidinės bazės trihidroksilinimą ir VLCFA, atrodo, yra susiję su pažengusiomis albuminurijos stadijomis. Atsižvelgiant į tai, kad nedažnas trijų dvigubų jungčių skaičius riebalų rūgščių grandinėje buvo aptiktas tik A3 mėginyje per dvi skirtingas rūšis, Fuc-GT3 (t18:1/18:3) ir GT1 (t18:1/24:3), atrodo, dvigubų jungčių susidarymo mechanizmas taip pat yra susijęs su DKD progresavimu.

Neigiamas poveikis, kurį sukelia lipidų kaupimasis inkstuose, tiek glomerulų, tiek kanalėlių lygiu, yra būdingas ląstelėms. Be to, lipotoksiškumas yra susijęs su įvairių tipų lipidais, tarp kurių gangliozidai atlieka pagrindinį vaidmenį [13].

DN pelės modelyje gangliozidų kiekis inkstuose, be kitų lipidų klasių, padidėjo podocituose, taip pat proksimalinėse kanalėlių ląstelėse [14]. Proksimaliniai kanalėliai gali būti veikiami dideliu šlapimo lipidų kiekiu, įskaitant gangliozidus, dėl padidėjusio riebalų rūgščių kiekio vienoje albumino molekulėje DKD pradžioje [15]. Tiesioginės lipidų kaupimosi nefrono segmentuose pasekmės yra susijusios su struktūriniais ir funkciniais pakeitimais, dėl kurių pablogėja albumino apdorojimas 2 tipo DM pradžioje.

Didžioji dauguma tyrimų, kuriuose pagrindinis dėmesys skiriamas inkstų gangliozido apibūdinimui, remiasi eksperimentiniais diabetinės nefropatijos modeliais. Mūsų žiniomis, tai yra pirmasis žmogaus transliacijos tyrimas nuo pagrindinių tyrimų iki klinikinio pritaikomumo, siekiant pranešti apie tam tikrą šlapimo gangliozidų modelį pacientams, sergantiems 2 tipo DM. Praktinė mūsų tyrimo reikšmė yra šlapimo gangliozidų sialilinimo laipsnio ir jų keramidų struktūros sąsajos su ankstyvuoju DKD, nustatyto albuminurijos lygiu, demonstravimas.

„Wecistanche“ – didžiausio cistansų eksportuotojo Kinijoje – pagalbinė tarnyba:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp / Tel:+86 15292862950

Įsigykite daugiau specifikacijų:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

GAUKITE NATŪRALIŲ EKOLOGIŠKŲ CISTANČŲ EKSTRAKTO SU 25% ECHINAKOZIDU IR 9% AKTEOZIDU NAUDOJANT INKŠTŲ INFEKCIJĄ