Didelės skiriamosios gebos tandeminė masės spektrometrija nustato specifinį gangliozidų modelį ankstyvoje 2 tipo cukriniu diabetu sergančių pacientų inkstų ligoje Ⅱ

2.2. Išsami polisialilintų rūšių, susijusių su makroalbuminurija HCD MS/MS, struktūrinė analizė

HR-MS atranka parodė, kad makroalbuminurijos pacientų gangliozidui būdingas padidėjęs bendras sialo rūgšties kiekis. A3 mėginyje dideliu masės tikslumu buvo nustatytos ne mažiau kaip keturios GQ1 klasės pentazialo gangliotetraozės. Jonas, kurio m/z 812,7{{10}}68, aptiktas tik A3 atrankos masių spektre, pagal masės skaičiavimą buvo priskirtas trigubai deprotonuotam ir natriam GQ1 (d18:1/18). :0). Norėdami struktūriškai apibūdinti šią rūšį, susijusią su makroalbuminurija, išskyrėme joną esant m / z 812, 7068 ir pateikėme jį HCD MS / MS esant HR neigiamo jonų režimu. Šio tandeminio MS eksperimento tikslai buvo: (i) oligosacharidų grandinės struktūros tyrimas; ii) keramido sudėties patvirtinimas, kuris buvo postuluojamas atsižvelgiant į visų GQ1 molekulių masę; (iii) rinkti konkrečius duomenis apie Neu5Ac monosacharidų lokalizaciją išilgai oligosacharidų pagrindo, dėl kurio atsiranda penkių dažniausiai pasitaikančių GQ1 (d18:1/18:0) struktūrų izomerai (3 pav.), kurių gali būti šlapime. makroalbuminurijos pacientams.

Pavaizduotas [M-4H+Na]3− pirmtako jono, aptikto esant m/z 812,7068, suskaidymo spektras, sukurtas sujungus dvi minutes gautą TIC esant kintamajai susidūrimo energijai 30–80 eV diapazone. 4 paveiksle.

3 pav. Penki dažniausiai pasitaikantys GQ1(d18:1/18:0) izomerai: (A) GQ1a(d18:1/18:{{10}}) izomeras; (B) GQ1b(d18:1/18:{{20}}) izomeras; (C) GQ1c(d18:1/18:0)izomeras; (D) GQ1d(d18:1/18:0) izomeras; (E) GQ1e(d18:1/18:0) izomeras.

„Wecistanche“ – didžiausio cistansų eksportuotojo Kinijoje – pagalbinė tarnyba:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com

WhatsApp / Tel.:+86 15292862950

Įsigykite daugiau specifikacijų:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

SPAUSKITE ČIA, norėdami GAUTI NATŪRALĮ ORGANINIŲ CISTANČIŲ EKSTRAKTĄ, SU 25% ECHINAKOZIDU IR 9% AKTEOZIDU NAUDOJANT INKŠTŲ INFEKCIJĄ

MS/MS duomenys patvirtina (d18:1/18:0) keramido sudėtį pagal Y0, kai m/z 564,8704 ir Y1, kai m/z 726,5845 atitinkantį Glc-Cer seką, taip pat vidinio skilimo joną S, esant m/z 325,1828, atitinkantį C18:0 riebalų rūgštį (5 pav.). Taip pat dokumentuojama bendra molekulės sialinimo būsena. Vadinasi, pagal B1 joną, aptiktą esant m/z 290,0868, ir jo natrio atitikmenį, esant m/z 312,0686, atitinkantį vienos Neu5Ac liekanos atsiskyrimą nuo pirminio jono, kartu su distaliniu elementu, aptiktu ties m/z 581,1807 ir m/z 663. , patvirtinkite Neu5Ac-Neu5Ac jungties atsiradimą.

5 pav. HCD MS/MS suskaidymo schema, kurią patiria [M-4H++Na+ ] 3− pirmtakas, esant m/z 812,7068, ir jonų sekos diagnostika GQ1d struktūriniam izomerui.

Atsižvelgiant į dažniausiai pasitaikančią Neu5Ac likučių sujungimo padėtį vidinėje arba išorinėje Gal, yra penki galimi struktūriniai GQ1 (d18:1/18:0) kandidatai, kaip parodyta 3 paveiksle. Tačiau jonas m/z 1032,3662, sudarytas iš dvigubos jungties ir vidinio kryžminio žiedo skilimo ir priskirtas Z4 /Y0/ 2,4A2, kartu su jonu, aptiktu m/z 936,7894 kaip Y2 / 3,5A1, palaiko visų keturių Neu5Ac likučių prijungimą prie vidinės Gal. Nors negalima visiškai atmesti kitų struktūrinių izomerų atsiradimo, šie du fragmentų jonai rodo, kad struktūrinis motyvas atitinka (D) kandidatą, kuris atitinka GQ1 d izomerą (d18:1/18:0). , tikrai yra A3 pavyzdyje. 5 paveiksle pateikta schema vaizduoja fragmentacijos kelią, kurį patiria pirmtakų jonas, atitinkantis GQ1d (d18:1/18:0).

Kitas su makroalbuminurija susijęs polisialinis kandidatas detaliai struktūrinei analizei yra [M-3H+ ] 3− jonas, aptiktas tik A3 mėginio atrankos masės spektre esant m/z 708,3379 ir priskirtas remiantis tiksliu masės skaičiavimu, iki GT1(d18:1/18:0). Šis jonas buvo izoliuotas ir pateiktas suskaidymo analizei tandem MS naudojant HCD. Produkto jonų spektras, sukurtas susumavus nuskaitymus, gautus per 2 minutes esant kintamoms susidūrimo energijoms nuo 30 iki 80 eV, kartu su šios rūšies chemine struktūra ir pagrindinių signalų priskyrimu pateiktas 6 paveiksle. Suskaidymo mechanizmas naudojamomis MS/MS sąlygomis kartu su diagnostiniais fragmento jonais pavaizduotas 7 paveiksle. Siekiant pagerinti visų priskirtų produktų jonų matomumą, 3 lentelė papildo 6 paveiksle pateiktą identifikuotų signalų spektre sąrašą.

6 pav. Struktūrinė analizė naudojant (−) nanoESI HR HCD MS/MS [M-3H+ ] 3− pirmtako jono, aptikto A3 mėginyje esant m/z 708,3379, kuris pagal masės skaičiavimui, atitinka GT1(d18:1/18:0). Įsigijimo laikas: 2 min; kintamos susidūrimo energijos 30–80 eV ribose. Įdėta: GT1b(d18:1/18:0) izomero struktūra, nustatyta iš MS/MS duomenų.

Dėl HCD suskaidymo atsirado keletas sekų jonų, kurie atsirado dėl glikozidinių ryšių ir kryžminio žiedo skilimo. Šie jonai yra labai naudingi priskiriant visą angliavandenių seką, identifikuojant GT1 padėties izomerus ir patvirtinant keramido aglikono sudėtį.

D18:1/18:0 keramido tipą atskleidžia Y0 jonas, kurio m/z yra 564,5353, ir palaiko Glc-Cer seka, identifikuojama per Y1, kai m/z yra 726,5879. Be to, jonų priskyrimas rodo, kad yra GT1 izoforma. Jonas, kurio m/z yra 493,1669, su NeuAc – GalNAc sudėtimi, gali atsirasti tik iš GT1 , kuriam būdingas GalNAc liekanos sialinimas. Likę fragmentų jonai rodo, kad A3 mėginyje yra GT1b struktūrinis izomeras. GT1b struktūrą palaiko visi jonai, atsirandantys iš neredukuojančio molekulės galo, užfiksuoti Y tipo serijomis, kartu su dviem Z jonais, iš kurių vienas yra mažesnis (6 pav.). Tačiau Y2 /B2, aptiktas kaip nemažo gausumo jonas, esant m/z 888,6405, rodo Gal – Glc – Cer seką, galbūt kilusią iš GT1a arba GT1b izomero po atitinkamo desialinimo Neu5Ac arba Neu5Ac-Neu5Ac atsiskyrimu. vidinio Gal arba iš izomero, turinčio nepakeistą vidinį Gal, pvz., GT1d.

Kita vertus, Y2, aptiktas esant m/z 734.5701, pagrindžia disialo Neu5AcNeu5Ac elemento lokalizaciją vidinėje Gal, konfigūraciją, atitinkančią GT1b izomerą. Distalinės grupės buvimą taip pat liudija B2 jonas, kurio m/z yra 581,1828.

HCD MS/MS keli signalai yra susiję su daliniu molekulės desialinimu, pavyzdžiui, Y4 ir (arba) Y3 jonai, atitinkantys desialilintą Gg4Cer seką; tačiau šie jonai negali nurodyti Neu5Ac prisijungimo vietų prie neutralios Gg4 glikano šerdies. Be to, signalas, esantis m/z 364,1243, atitinkantis Gal – GalNAc seką, priskirtą GT1b vidinio skilimo B3 / B1 jonui, yra priskiriamas GT1c izomerui, nes šioje glikoformoje yra nepakeistas galinis Gal – GalNAc disacharidas. Taigi, išskyrus Y2, kuris yra susijęs su GT1b, visi jonai gali atsirasti iš kitų Neu5Ac padėties izomerų, tokių kaip GT1a, GT1 , GT1c arba net retai pranešama GT1d. Kita vertus, pats Y2 gali būti mažos tikimybės įvykio rezultatas, kuris taip pat pašalino Neu5Ac iš bandymų elemento, susieto su vidiniu Gal.

Atsižvelgiant į tai, kad, išskyrus GT1 atskleidimą, MS / MS duomenys, susiję su glikozidinių jungčių skilimu, negalėjo vienareikšmiškai priskirti kitų GT1 izomerų A3 mišinyje, mes atidžiau išanalizavome žiedo skilimo jonus, kad atrastume galimą vidinį suskaidymą, palaikantį GT1b. Pastebėjome mažo intensyvumo trigubai įkrautą joną esant m/z 634,6067, o tai atitinka 0,2 tipo kryžminį žiedo skilimą vienoje iš galinių sialo rūgšties liekanų, kurios GT1b rūšių atveju, gali atsirasti iš 0, 2X4 arba 0,2X3 arba abiejų. Kadangi GT1b izomeras paprastai yra labiau paplitęs nei GT1 , 6 ir 7 paveiksluose parodytas jonų priskyrimas ir suskaidymo schema, būdinga GT1b.

Dėl Gal-GalNAc-Gal grandinės simetrijos nėra galimybės visiškai atmesti kitų struktūrinių izomerų. Nors HCD MS/MS duomenys rodo, kad egzistuoja GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) ir GT1b(d18:1/18: 0) A3 mėginyje negalima atmesti galimo kitų GQ1 ir GT1 izomerų atsiradimo. Tačiau mūsų išvados rodo, kad trys izomerai – GQ1d(d18:1/18:0), GT1b(d18:1/18:{{30}}) ir GT1 (d18:1) /18:0) neabejotinai yra A3 mėginyje ir gali būti toliau tiriami kaip makroalbuminurijos molekuliniai žymenys.

3. Medžiagos ir metodai

3.1. Dalyko priėmimo kriterijai

Siekiant sukurti ir patvirtinti metodą, skerspjūvio bandomajame tyrime buvo įvertinta 2 tipo DM pacientų ir sveikų kontrolinių asmenų atrankos grupė. Iš viso 30 2 tipo DM pacientų, lankiusių Ambulatorinį Nefrologijos skyrių ir Ambulatorinį Diabeto ir medžiagų apykaitos ligų skyrių, buvo suskirstyti į 3 grupes pagalšlapimo albuminas/kreatinino santykis(UACR) taip: 10 pacientų, sergančių normoalbuminurija (A1, apibrėžiama kaip UACR < 30 mg/g), 10 sergančių mikroalbuminurija (A2, UACR 30–300 mg/g) ir 10 pacientų su makroalbuminurija (A3, UACR > 300 mg/g). g). Dešimt amžių ir lytį atitinkančių sveikų kontrolinių asmenų (C), lankiusių bendrosios praktikos gydytojo kabinete įprastiniam patikrinimui, be žinomos inkstų ligos istorijos ir nesergančių DM (išskyrus HbA1c reikšmę Mažiau arba lygi 5,6 %), taip pat buvo įtraukta į šią programą. studijuoti

Visi į tyrimą įtraukti pacientai turėjo mažiausiai 5-metų DM, stabili inkstų funkcija mažiausiai 2 metus, gera kraujospūdžio kontrolė (<130/80 mmHg), negative urinary sediment, and a negative urine culture. The exclusion criteria were represented by other causes of proteinuria (other glomerular diseases, neoplasia, or autoimmune diseases), hematuria, poor control of DM (HbA1c > 10%), liver diseases, and pregnant or lactating women. The patients had no indication for inkstų biopsija(hematurijos ir kitų proteinurijos priežasčių nebuvimas, greitas GFR mažėjimas).

3.2. Etikos pareiškimas

Tyrimas atliktas pagal Helsinkio deklaraciją, o protokolą patvirtino Institucijos tyrimų etikos komitetas (Žmogaus studijų taryba – Timisoara medicinos ir farmacijos universitetas „Victor Babes“, Nr. 2016-09-15/12). ;Apskrities greitosios medicinos pagalbos ligoninė, Nr.100/2016-11-23). Visi pacientai ir kontrolinės grupės sutiko dalyvauti tyrime pasirašydami informuoto sutikimo formą.

3.3. Laboratoriniai vertinimai

30 2 tipo DM pacientų šlapimo gangliozidas buvo tiriamas atliekant skerspjūvio bandomąjį tyrimą, lyginamuoju tyrimu su 10 sveikų kontrolinių asmenų. Biocheminiai parametrai buvo susiję su serumo karbamidu ir kreatininu, 24 valandų proteinurija, UACR, šlapimo nuosėdomis ir šlapimo kultūra. Visi pacientai buvo neigiami dėl šlapimo takų infekcijų. Natūralių gangliozidų mišinių sudėtis buvo nustatyta iš 24 val. paimtų šlapimo mėginių. Pacientų ir kontrolinių asmenų šlapimo mėginiai buvo trumpai laikomi –20 ◦C temperatūroje ir prieš tyrimą atšildyti.CKDbuvo apibrėžtas pagal KDIGO vertinimo gaires irlėtinės inkstų ligos gydymas. eGFR buvo apskaičiuotas naudojantlėtinė inkstų ligaepidemiologijos bendradarbiavimo lygties formulė (CKD-EPI kreatinino 2009 lygtis) [16].

3.4. Gangliozido ekstrahavimas ir valymas

Gangliozidas ekstrahuojamas pagal Svennerholmo ir Fredmano [17] sukurtą metodą, kurį modifikavo Vukeli´c ir kt. [18]. Anksčiau šį protokolą pritaikėme gangliozidų išskyrimui ir gryninimui iš kūno skysčių ir pritaikėme smegenų skysčio (CSF) gangliozidams. Šis metodas išsamiai aprašytas mūsų ankstesniame tyrime, susijusiame su CSF gangliozidų profiliavimu ir fragmentacijos analize masių spektrometrijos metodu [19]. Trumpai tariant, lipidai buvo ekstrahuojami du kartus naudojant chloroformo (C)/metanolio (M)/vandens (W) mišinį iki bendro tūrio santykio 1:2:0,75 C/M/W, o "W" atitinka. į šlapimą; todėl mišinyje buvo 4 ml C, 8 ml M ir 3 ml šlapimo mėginio. Analitinės kokybės chloroformas ir metanolis buvo įsigyti iš Merck (Darmstadt, Vokietija) ir naudojami be tolesnio valymo. Po visiško fazių atskyrimo, vadovaujantis [19] aprašytomis procedūromis, buvo surinkta viršutinė fazė, kurioje yra polinių glikosfingolipidų.

Surinkti neapdoroti gangliozidai buvo išvalyti keliais etapais [19]: nusodintų baltymų ir druskos kompleksų pašalinimas, po to centrifugavimas, gelio filtravimas Sephadex G-25 kolonėlėje (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, JAV ), kad būtų pašalinti mažos molekulinės masės teršalai, ir galiausiai per naktį 4 ◦C temperatūroje atliekama dializė prieš vandenį. Gangliozidai buvo ekstrahuoti vienodomis sąlygomis iš visų šlapimo alikvotinių dalių, todėl gaunami A1 (normoalbuminurija), A2 (mikroalbuminurija), A3 (makroalbuminurija) ir C (kontrolinė) mišiniai.

3.5. Mėginio paruošimas masių spektrometrijai

Išgryninti A1, A2, A3 ir C gangliozido ekstraktai buvo išgarinti iki visiško sausumo SpeedVac Concentrator SPD 111 V sistemoje (Savant, Diuseldorfas, Vokietija), sujungtoje su vakuuminiu siurbliu. Atliekant MS atranką, kiekvienas sausas ekstraktas buvo ištirpintas gryname metanolyje, kad būtų gautas pradinis tirpalas, ir laikomas –20 ◦C temperatūroje. Prieš atliekant MS analizę, pradiniai tirpalai buvo centrifuguojami Sigma 2–16 modelio centrifugoje (Sartorius AG, Getingenas, Vokietija). Orbitrap MS infuzijai darbiniai mėginiai, kurių koncentracija gryname metanolyje buvo 5 pmol · µL -1, buvo gauti praskiedus pradinio tirpalo alikvotas. Gangliozido koncentracija infuzuojamame tirpale buvo apskaičiuota, kai vidutinė molekulinė masė yra 2000 g mol-1.

3.6. Orbitrap masės spektrometrija su nanoESI

MS eksperimentai buvo atlikti naudojant LTQ Orbitrap Velos Pro™ masės spektrometrą (Thermo Fisher Scientific, Bremenas, Vokietija), turintį neprisijungusį nanoES šaltinį ES 259 ​​(Thermo Fisher, Brėmenas, Vokietija).

Prietaisas yra hibridinis masės spektrometras, jungiantis du skirtingus masės analizatorių tipus ir suteikiantis daugybę privalumų: didelį jautrumą ir tikslumą, gerą duomenų kokybę ir analizės greitį, galimybę aptikti smulkius komponentus sudėtinguose mišiniuose, mažas mėginio suvartojimas, ir vengti kryžminio tyrimo bei perkėlimo iš mėginio į mėginį.

Pirmasis analizatorius yra dvigubo slėgio linijinis kvadrupolio jonų gaudyklė, galinti išskirti joną, turintį tam tikrą masės ir krūvio santykį (m/z), ir jį suaktyvinti, į joną įvesdama kinetinę energiją, kurios konkrečia m/z. sukelti susidūrimo sukeltą disociaciją. Antrasis analizatorius yra Orbitrap, kurį sudaro cilindrinis išorinis elektrodas ir cilindrinis vidinis elektrodas, sulaikantys jonus apskritomis orbitomis aplink vidinį elektrodą. Jis turi puikią skiriamąją gebą ir suteikia galimybę atlikti sudėtingų joninių rūšių seką kelių etapų MS (MSn ) eksperimentuose naudojant efektyvius suskaidymo būdus.

Borosilikatiniai kapiliarai (10 cm ilgio) buvo ištraukti Sutter p-97 mikropipetės traukikliu, kad būtų sukurti elektropurškiami kapiliarai, kurių antgalio dydis yra 10 µm, o kūgio ilgis - 4 mm. Į emiterio galinę dalį buvo įvestas 10 µL tirpalo, kurio koncentracija metanolyje yra 5 pmol · µL –1, ir į tirpalą įdėta 0,25 mm platinos viela. Platinos vielai ir kūgiui taikomos potencialo vertės buvo nuolat reguliuojamos, kad būtų pasiekta efektyvi komponentų jonizacija. NanoESI procesas buvo inicijuotas nustatant instrumentinius parametrus taip: nanoESI įtampa, 0,80 kV; kūgio įtampa, 40–60 V; desolvatacijos temperatūra, 80 ◦C; S objektyvo RF lygis, 60%. Šios MS parametrų vertės padidino jonizaciją ir nuolatinį purškimą ir tuo pačiu sumažino labilios Neu5Ac liekanos, pritvirtintos prie gangliozido molekulės oligosacharido šerdies, suskaidymą šaltinyje.

Visi masės spektrai (MS ir tandem MS) buvo gauti HR režimu, neigiamų jonų režimo aptikimu ir 200–2000 m/z diapazone. MS nuskaitymai buvo gauti su nustatyta 60 000 skiriamąja geba. Masės spektrometras buvo valdomas ir valdomas LTQ Tune Plus v2.7 (Thermo Scientific, Brėmenas, Vokietija), o MS duomenų surinkimas ir apdorojimas buvo atliktas naudojant Xcalibur 3.0.63 programinę įrangą (Thermo Scientific, Bremenas, Vokietija).

MS/MS eksperimentai buvo atlikti LTQ naudojant CID susidūrimo kameroje, naudojant helio 5.{1}} grynumą esant 50 psi slėgiui kaip susidūrimo dujas. MS / MS nuskaitymai buvo gauti, kai skyra nustatyta į 20,000. Jonų atranka ir suskaidymas buvo atlikti rankiniu būdu. Pirmtakų jonai buvo atrinkti 1 m / z vieneto izoliacijos pločiu ir suskaidyti HCD, naudojant kintamą susidūrimo energiją 30–80 eV diapazone, kad būtų padidintas fragmentų jonų aprėptis.

TIC ir masės spektrai, gauti sujungiant sukauptus skenavimus, buvo apdoroti naudojant Xcalibur 2.1 programinę įrangą (Thermo Scientific, Waltham, MA, JAV), kuri leidžia išgauti spektrus, taip pat juos išlyginti ir atimti.

Prieš pradedant eksperimentus, m/z skalė buvo išoriškai kalibruojama naudojant specialią etaloninę medžiagą, komerciškai žinomą kaip Pierce® ESI Negative Ion Solution iš Thermo Scientific (Waltham, MA, JAV). Neigiamų jonų režimu šis standartas suteikė spektrą su teisinga jonų aprėptis m/z diapazone, nuskaityta tiek MS, tiek tandeminiuose MS eksperimentuose.

NanoESI MS ir MS/MS sąlygų optimizavimui neigiamų jonų režimu, palyginimui ir duomenų vertinimui buvo išmatuotos šios standartinės gangliozidų frakcijos, kurios yra parduodamos: GM1 (galvijų smegenys); GD1a, GD1b, GT1b ir GQ1b (kiaulių smegenys); ir GM3 ir GD3 (galvijų pienas) iš Avanti Polar Lipids (Birmingemas, AL, JAV), taip pat visas gangliozido ekstraktas iš galvijų smegenų, komerciškai žinomas kaip Cronassial mišinys, iš Abano Terme (Paduja, Italija).

3.7. Gangliozidų santrumpa

Gangliozidų priskyrimui santrumpų sistema, kurią 1980 m. pristatė Svenner-Holm [20], kartu su IUPAC-IUB Biocheminės nomenklatūros komisijos 1998 m. rekomendacijomis [21] buvo taikoma taip:

LacCer-Gal 4Glc 1Cer; GM3-II3 - -Neu5Ac-LacCer; GD3-II3 - -(Neu5Ac)2-LacCer; GT3-II3 - -(Neu5Ac)3-LacCer; GM2-II3 - -Neu5Ac-Gg3Cer; GD2-II3 - -(Neu5Ac)2-Gg3Cer; GM1a arba GM1-II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GalNAc-GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg5Cer; GD1a-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GD1b-II3 - -(Neu5Ac)2- Gg4Cer; GT1b-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -(Neu5Ac)2-Gg4Cer; GQ1b-IV3 - -(Neu5Ac)2, II3 - - (Neu5Ac)2-Gg4Cer; nLM1 arba 30 -nLM1-IV3 - -Neu5Ac-nLc4Cer; LM1 arba 30 -isoLM1-IV3 - - Neu5Ac-Lc4Cer; nLD1-disialo-nLc4Cer.

3.8. MS duomenų interpretavimas

Kadangi iki šiol nėra jokios specialios kompiuterinės programinės įrangos, duomenų bazių ar kitų IT paslaugų, padedančių interpretuoti gangliozidų atranką ir tandeminius masės spektrus, šiame tyrime aptikti molekuliniai jonai buvo priskirti gangliozidų rūšims tiksliai apskaičiuojant masę ir remiantis. anksčiau gautos informacijos apie šio tipo glikosfingolipidus ir žinomus biosintezės būdus. Aiškinant MS ir MS / MS duomenis bei masės skaičiavimus, mums padėjo didelis gangliozido molekulinių ir fragmentų jonų, kuriuos iki šiol nustatėme ir apibūdinome įvairiuose žmogaus audiniuose ir skysčiuose, naudojant pažangius MS metodus, inventorius. Šios struktūros yra mūsų originalios duomenų bazės, kurios buvo įtrauktos į anksčiau paskelbtus tyrimus [12, 19, 22–31]. Šiame darbe aprašytos naujos rūšys užbaigia mūsų esamą gangliozidų įrašą.

HCD MS/MS sugeneruotų oligosacharidų stuburo sekos jonų priskyrimas pagal visuotinai priimtą nomenklatūrą [24,25].

4. Išvados

Šiame tyrime mes sukūrėme metodą, pagrįstą HR MS ir tandem MS, skirtą gangliozidui nustatyti sergant DKD lyginamuoju šlapimo ekstraktų iš normos, mikro ir makroalbuminurijos pacientų, taip pat sveikų kontrolinių grupių, tyrimu, atliktu identiškame tirpale. ir instrumentines sąlygas. Galutinis mūsų tyrimo tikslas buvo nustatyti inkstų gangliozidų sudėties ir struktūros pokyčius, išreikštus DKD lyginant su kontrolinėmis grupėmis ir skirtingose ​​ligos stadijose.

Didelis jautrumas, atkuriamumas, skiriamoji geba ir masės tikslumas, kurį užtikrina šiam tikslui optimizuota MS platforma, leido mums nustatyti, kad išreikštų rūšių sialinimo laipsnis vaidina svarbų vaidmenį progresuojant ligai, o tai yra DKD žymuo. , net esant 2 tipo DM pacientų normoalbuminurijos stadijai. Be to, pastebėti Cer sudėties pakeitimai rodo, kad, be glikano struktūros, lipidų dalis taip pat gali būti laikoma molekuliniu pirštų atspaudu DKD stadijoms.

Pažangesniame tyrimo etape MS / MS pagal HCD buvo naudojamas rūšių, turinčių galimą biomarkerio vaidmenį, struktūrinei analizei. A3 mėginio atveju molekuliniai jonai, kurie, skaičiuojant masę, atitinka GQ1(d18:1/18:0) ir GT1(d18:1/18:{{1). 0}}), atitinkamai buvo izoliuoti ir suskaidyti instrumento susidūrimo kameroje. Šių eksperimentų tikslas buvo surinkti informaciją apie išsamią molekulės struktūrinę konfigūraciją. Optimizuotos sekos nustatymo sąlygos, ypač susidūrimo energijos diapazonas ir susidūrimo dujų slėgis, sukėlė specifinius glikozidinių jungčių skilimus, dėl kurių susidarė fragmentų jonai, aptikti kaip svarbūs signalai tandemo masės spektruose. Kai kurie jonai buvo diagnozuoti tam tikriems izomerams, susijusiems su Neu5Ac fragmentų lokalizacija gangliozido molekulės angliavandenių grandinėje. Remdamiesi šiais struktūriškai informatyviais sekos jonais, nustatėme, kad GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) ir GT1b(d18:1/18: 0) izomerų yra A3 mėginyje ir jie yra susiję su makroalbuminurija.

Gauti rezultatai reikalauja toliau patvirtinti kai kurias hipotezes išilginiuose tyrimuose, atliktuose su didesnėmis grupėmis, siekiant įrodyti priežastinį ryšį tarp gangliozidų, aptiktų šlapime, sudėtingumo.DKD sergančių pacientųir labai ankstyvas inkstų pažeidimas sergant 2 tipo DM, net esant normoalbuminurijos stadijai. Tačiau manome, kad šios išvados atveria tyrimų kryptį tiriant gangliozidų sialinimo, O-acetilinimo ir O-fukozilinimo vaidmenį ligos progresavime, taip pat jų modifikacijas O-GalNAc ir CH3COO−. Kitas naudingas šių rezultatų aspektas yra galimas ankstyvos DKD diagnostikos procedūrų, pagrįstų gangliozidų profiliavimu, naudojant pažangią masės spektrometriją, kūrimas.

Nuorodos

1. Ghaderianas, SB; Beladi-Mousavi, SS Cukrinio diabeto ir hipertenzijos vaidmuo sergant lėtine inkstų liga.J. Renas. Inj. Ankstesnis2014, 3, 109–110. [CrossRef] [PubMed] 

2. Johansenas, KL; Chertow, GM; Foley, RN; Gilbertsonas, DT; Hercogas, Kalifornija; Ishani, A.; Israni, AK; Ku, E.; Tamura, MK; Li, S. JAV inkstų duomenų sistemos 2020 m. metinė duomenų ataskaita: Inkstų ligų epidemiologija Jungtinėse Valstijose.Esu. J. Inkstas Dis.2021, 77, A7–A8. [CrossRef] [PubMed] 

3. Linas, YC; Chang, YH; Yang, SY; Wu, KD; Chu, TS Diabetinės inkstų ligos patofiziologijos ir gydymo atnaujinimas.J. Med. doc.2018, 117, 662–675. [CrossRef] [PubMed] 

4. Vallonas, V.; Thomson, SC Inkstų funkcija diabetinės ligos modeliuose: kanalėlių sistema diabetinio inkstų patofiziologijoje.Annu. kun. Physiol.2012, 74, 351–375. [CrossRef] 

5. Milas, O.; Gadaleanas, F.; Vladas, A.; Dumitrascu, V.; Velciovas, S.; Gluhovskis, C.; Bobas, F.; Popescu, R.; Ursoniu, S.; Jianu, Kolumbija; ir kt. Priešuždegiminiai citokinai yra susiję su podocitų pažeidimu ir proksimaline kanalėlių disfunkcija ankstyvoje diabetinės inkstų ligos stadijoje 2 tipo cukriniu diabetu sergantiems pacientams.J. Diabas. Sudėtinga.2020, 34, 107479. [CrossRef] 

6. Petrica, L.; Ursoniu, S.; Gadaleanas, F.; Vladas, A.; Gluhovskis, G.; Dumitrascu, V.; Vladas, D.; Gluhovskis, C.; Velciovas, S.; Bobas, F.; ir kt. Su šlapimo podocitais susijęs mRNR lygis koreliuoja su proksimalinių kanalėlių disfunkcija ankstyvoje 2 tipo cukrinio diabeto diabetinėje nefropatijoje.Diabetolis. Metab. Sindr.2017, 9, 31–43. [CrossRef] 

7. Kwak, DH; Rho, YI; Kwon, OD; Ahanas, SH; Daina, JH; Choo, YK; Kimas, SJ; Choi, BK; Jung, KY Gangliozido GM3 sumažėjimas streptozocino sukeltuose žiurkių diabetiniuose glomeruluose.Life Sci.2003, 72, 1997–2006. [CrossRef] 

8. Masson, E.; Troncy, L.; Ruggiero, D.; Wiernsperger, N.; Lagarde, M.; El Bawab, S. a serijos gangliozidai tarpininkauja pažangių glikacijos galutinių produktų poveikiui pericitų ir mezangialinių ląstelių dauginimuisi: dažnas tinklainės ir inkstų mikroangiopatijos tarpininkas?Diabetas2005, 54, 220–227. [CrossRef] 

9. Zadoras, Z.; Deshmukh, GD; Kunkel, R.; Radinas, NS; Shayman, JA Glikosfingolipidų kaupimosi vaidmuo streptozocino sukelto cukrinio diabeto inkstų hipertrofijoje.J. Clin. Ištirti.1993, 91, 797–803. [CrossRef]

10. Enė, CD; Penescu, M.; Anghel, A.; Neagu, M.; Budu, V.; Nicolae, I. Diabetinės nefropatijos stebėjimas cirkuliuojančiais gangliozidais.J. Imunoass. Imunochem.2016, 37, 68–79. [CrossRef]