Hiperozidas susilpnina HT22 ląstelių uždegimą per reguliavimą SIRT1 iki Wnt/-Catenin ir Sonic Hedgehog takų veiklos 1 dalis

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Neurouždegimas vaidina svarbų vaidmenį pakitusio neurologinio vystymosi, sensorineurinio klausos praradimo ir tam tikrų neurodegeneracinių ligų patogenezėje ir progresavime. Hiperozidas (kvercetino-3-O- -D-galaktozidas) yra aktyvus junginys, išskirtas iš Hypericum augalų. Šiame tyrime tiriame apsauginį peroksido poveikį neurouždegimui ir galimą jo molekulinį mechanizmą. Lipopolisacharidas (LPS) ir hiperozidas buvo naudojami HT22 ląstelėms gydyti. Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas MTT tyrimu. Ląstelių apoptozės greitis buvo matuojamas srauto citometrijos tyrimu. interleukino-1 (IL-1), interleukino-6(IL-6), interleukino-8(IL-8) mRNR ekspresijos lygiai, ir naviko nekrozės faktorius- (TNF-a) buvo nustatyti kiekybine atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandinine reakcija. Oksidacinio streso indeksų superoksido dismutazės (SOD), reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS), katalazės (CAT), glutationo (GSH) ir malondialdehido (MDA) lygiai buvo išmatuoti rinkiniais. Neurotrofinio faktoriaus raiška ir ryšys tarp hiperozidinio, tylaus poravimosi tipo informacijos reguliavimo 2 homologo-1(SIRT1) ir Wnt/-katenino bei garsinio ežio buvo ištirtas Western blot metodu. LPS sukeltose HT22 ląstelėse hiperozidas skatina ląstelių išlikimą; sumažina IL-1, IL-6, IL-8, TNF-, ROS, MDA, Bax ir kaspazės-3 lygį; ir padidina CAT, SOD, GSH, Bcl-2, BDNF, TrkB ir NGF ekspresiją. Be to, hperozidas padidino SIRT1 ekspresiją. Tolesnis mechaninis tyrimas parodė, kad hiperozidas sumažino LPS sukeltą uždegimą, oksidacinį stresą ir apoptozę padidindamas SIRTl reguliavimą, kad suaktyvintų Wnt / -catenin ir Sonic Hedgehog kelius. Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad hiperozidas veikia kaip neurouždegimo gynėjas.

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

1. Įvadas

Neurouždegimas yra lėtinis smegenų audinio uždegimas, kuris vaidina svarbų vaidmenį pakitusio neurologinio vystymosi, sensorineuralinio klausos praradimo ir tam tikrų neurodegeneracinių ligų patogenezėje ir progresavime[1-5]. Ankstyvosiose centrinio klausos kelio stadijose triukšmo sukeltas klausos praradimas ir laidus klausos praradimas yra susiję su neurouždegimu [6]. Be to, neurouždegimas prisideda prie neuronų mirties ir neurologinio pablogėjimo, nes didina uždegimą sukeliančių veiksnių ir oksidacinio streso gamybą[7]. Daugybė tyrimų parodė, kad hipokampo neuronai yra jautrūs neurouždegiminiams procesams ir sukelia neurologines komplikacijas [8]. Tačiau vis dar nėra veiksmingų priemonių ar metodų, kaip atkurti ir užkirsti kelią neuronų pažeidimams, kuriuos sukelia neurouždegimas. Taigi, labai svarbu nustatyti veiksmingus nuo uždegimo apsauginius agentus.

Hiperozidas (kvercetino3-O- -D-galaktozidas) yra aktyvus junginys, išskirtas iš Hypericum augalų. Jis turi antioksidacinį ir priešuždegiminį poveikį, mažina kalcio perteklių ir slopina apoptozę [9, 10]. Ankstesni tyrimai patvirtino, kad hiperozidas veiksmingai apsaugo nuo neurologinių komplikacijų, kurias sukelia neurouždegimas. Hiperglikemijos sukelto oksidacinio streso ir uždegimo ūminio diabeto modelyje hiperozido vartojimas apsaugojo nuo kognityvinių funkcijų sutrikimų, neurouždegimo ir oksidacinio streso, kurį sukelia DM per TNF-/NF-Bx/kaspazės{9}} signalizacijos kelią [11]. Sergant tokiomis ligomis kaip Parkinsono liga, hiperozidas veikia kaip apsauginis agentas, susilpnindamas LPS sukeltą mikroglijos aktyvaciją [12]. Iki šiol atlikta nedaug tyrimų apie apsauginį hiperozido poveikį neurouždegimui, o mechanizmas nėra iki galo išaiškintas.

Lipopolisacharidas (LPS) plačiai naudojamas įgimtai imuninei sistemai suaktyvinti. Ankstesni tyrimai parodė, kad LPS dažniausiai naudojamas neurouždegimo modeliams, kuriuos sukelia uždegiminės reakcijos, paruošti [13,14]. Šiame tyrime HT22 ląsteles paveikėme LPS, kad imituotų ląstelių neurouždegimo modelį. Kartu su šiuo modeliu buvo tiriamas apsauginis hiperozido poveikis neurouždegimui ir galimas jo molekulinis mechanizmas. Mes nustatėme, kad hiperozidas apsaugo HT22 ląsteles nuo LPS sukelto uždegimo; oksidacinis stresas ir apoptozė yra glaudžiai susiję su SIRT1 lygiais. Tolesnė analizė parodė, kad hiperozidas sumažino LPS sukeltą uždegimą, oksidacinį stresą ir apoptozę padidindamas SIRT1 reguliavimą, kad suaktyvintų Wnt / -catenin ir Sonic Hedgehog kelius.

2. Medžiagos ir metodai

2.1.Reagentai ir vaistai. LPS, hiperozidas ir 3-(4,5- bromiddimetil-2-tiazolilas)-2,5-difeniltetrazolis

(MTT) buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV). Dulbecco modifikuota Eagle terpė, kurioje yra 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS), buvo įsigyta iš Gibco (Carls-bad, JAV). 100 V/ml penicilino ir 100 mg/ml streptomicino buvo nupirkta iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV). LiCl ir Sonic Hedgehog agonistas SAg buvo įsigyti iš Merck (San Diego, CA, JAV). Pirminiai antikūnai prieš Bcl-2, Bax, kaspazė-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wnt1, -catenin, Shh, Patch ir GAPDH bei antriniai antikūnai buvo įsigyti iš Cell Signaling (Boston, MA, JAV). 2.2. Ląstelių kultūra ir gydymas. HT22 pelių neuronų ląstelių linija buvo įsigyta iš Kinijos mokslų akademijos Kunmingo ląstelių banko (Kunming, Kinija). HT22 ląstelės buvo pasėtos po 2 × 104 ląstelių/šulinėlių į 6-šulinėlių plokštelę ir kultivuojamos DMEM su 10 procentų galvijų vaisiaus serumo, 100 V/ml penicilino ir 100 ug/ml streptomicino 37 °C temperatūroje 5 procentų CO aplinkoje, sudrėkintos. inkubatorius. Kai po 24 valandų HT22 pasiekė 70 procentų susiliejimą, buvo atlikta ląstelių transfekcija, iš anksto apdorota skirtingomis hiperozido ir LPS koncentracijomis (1 ug/ml).

Cistanche gali pagerinti imunitetą

2.3.Ląstelių gyvybingumas. Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas MTT tyrimu.

Trumpai tariant, HT22 ląstelės buvo pasėtos į 24-šulinėlių plokšteles, kurių tankis 2 × 104 ląstelės/ml 24 valandas. Ląstelės buvo badaujamos per naktį, o po to 24 valandas iš anksto apdorotos skirtingomis hiperozido koncentracijomis, o po to dar 24 valandas inkubuojamos su LPS (1 ug / ml). Terpė buvo atnaujinta ir inkubuojama su 50 ul MTT (5 mg/ml, paruošto fosfatiniu buferiniu tirpalu) 4 valandas 37 °C temperatūroje. Tada tirpalas buvo pašalintas ir į plokšteles pridėta DMSO. Absorbcija ties 570 nm buvo išmatuota naudojant plokštelių skaitytuvą.

2.4. Vakarų blotingas.

RIPA buferis buvo pridėtas prie HT22 ląstelių (Invitrogen; JAV), kad būtų surinktas visas baltymas; tada baltymų koncentracijos buvo nustatytos BCA metodu (Invitrogen, JAV).

Baltymų mėginiai buvo sumaišyti su 5x pakrovimo buferiu ir denatūruoti verdant. Baltymai buvo atskirti 15 procentų SDS-PAGE ir perkelti ant polivinilidenfluorido membranų. Tada membranos buvo inkubuojamos su pirminiais antikūnais (Bcl-2, Bax, kaspazė-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wntl, -catenin, Shh, Patch ir GAPDH) 4Covernight. Tada kitą dieną membranos buvo plaunamos PBS ir 1 valandą inkubuojamos su antriniais antikūnais. Galiausiai baltymų juostos buvo išmatuotos naudojant „ImageJ“ programinę įrangą. Duomenys buvo surinkti iš mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų.

2.5.qRT-PGR. Bendra HT22 ląstelių RNR buvo išskirta naudojant TRIzol RNR ekstrahavimo rinkinį (Invitrogen, Grand Island, NY, JAV), o išskirta bendra RNR buvo atvirkštine transkripcija į cDNR naudojant atvirkštinės transkripcijos rinkinį (Takara, Kiotas, Japonija). SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Kiotas, Japonija) buvo naudojamas qRT-PCR amplifikacijai atlikti. IL-1, I-6 ir TNF amplifikacijos pradmenys buvo tokie: IL-1 ,5'-GATGGTCGCATTAGCTCC-3'ir 5'-GGCTGTAGCTGTAGCGTC{{15} }';IL-6,5'-ATTG CGGCGGCTGACGCGTAG-3'ir 5'-GTCTGTTGCGC GAGCTGGTA-3';IL-8,5'-GTCGAGCTGCCGCGTAGCG T{{26} }'ir 5'-CGCGATGCGTGCAGC-3'; ir TNF-a,5'-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3'ir5'-CGGACTCCG CAAAGTCTAAG-3'. Santykinė mRNR ekspresija buvo analizuojama naudojant 2-Act metodą.

2.6.SOD, GSH ir MDA tyrimas. Mes išmatavome deguonies rūšių (ROS), katalazės (CAT), superoksido dismutazės (SOD), glutationo (GSH) ir malondialdehido (MDA) aktyvumą, naudodami atitinkamus tyrimo rinkinius (Nanjing Jian-cheng Bio Company, Kinija).

2.7.Srauto citometrija.

Remiantis ankstesne ataskaita [15], ląstelių apoptozės greičiui matuoti buvo naudojamas srauto citometrijos tyrimas. Kiekvienos grupės HT22 ląstelės buvo surinktos ir pakartotinai suspenduotos. Apoptotinės ląstelės buvo dvigubai pažymėtos aneksinu V-FITC ir PI, naudojant aneksino V-FITC / PI apoptozės aptikimo rinkinį (Beyotime Biotechnology, Kinija) 30 minučių kambario temperatūroje tamsoje. Tada ląstelių fluorescencijos intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas srauto citometrija.

2.8. Statistinė analizė.

Šiame tyrime skirtumas tarp dviejų grupių buvo lyginamas naudojant t testą, o tarp grupių – taikant vienpusę dispersinę analizę (ANOVA). Visi duomenys pateikti kaip vidutinės reikšmės±

1 paveikslas: Hiperozidas sumažino apoptozę ir uždegimą LPS sukeltose HT22 ląstelėse. HT22 ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas MTT tyrimu. Ląstelių gyvybingumas buvo stebimas mikroskopu (100x) (a, b). Bcl-2, Bax ir kaspazės-3 ekspresija HT22 ląstelėse buvo išmatuota Western blot metodu (c). HT22 ląstelių apoptozės greitis buvo matuojamas srauto citometrijos tyrimu (d). IL-1 ,IL-6 lygiai. IL-8 ir TNF-mRNR HT22 ląstelėse buvo išmatuoti art-PCR(e);* buvo laikomas reikšmingu, palyginti su kontroline medžiaga (*P<0.05);# was="" considered="" significant="" compared="" to="" lps="" ("p=""><>

Šis straipsnis ištrauktas iš Hindawi Neural Plasticity Volume 2021, straipsnio ID 8706400, 10 puslapių https://doi.org/10.1155/2021/8706400