LRRK2 kinazės inhibitorius atjaunina oksidacinio streso sukeltą ląstelių senėjimą neuronų ląstelėse 2 dalis

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

3. Rezultatai

3.1. Rotenonas padidina LRRK2 kinazės aktyvumą ir ląstelių senėjimą dSH ląstelėse.

Ankstesni tyrimai pranešė, kad rotenonas padidina LRRK2 kinazės aktyvumą reguliuodamas LRRK2 ekspresiją [16, 19]. Tačiau šiuose tyrimuose apoptozės greitis buvo didesnis nei kitų su ląstelių senėjimu susijusių fenotipų, nes buvo naudojama didelė rotenono koncentracija. Taigi ląstelės buvo apdorotos maža rotenono koncentracija (1 uM) a

3 FrGURE: Senėjimas skatina lizosomų disfunkciją, padidindamas LRRK2 kinazės aktyvumą diferencijuotame žmogujeneuroblastomaląstelių linija. (a, b) gyvų dSH ląstelių dažymas glikogenu (žalia). GlycoGREEN dažymo intensyvumas buvo normalizuotas iki Hoechst 33342. Normalizuotas intensyvumas gydomoje grupėje buvo išreikštas procentais (procentais), palyginti su nešikliu (dimetilsulfoksidu) apdorota grupe. n =4;ląstelių skaičius =15-40.(c, d)Aktyvios lizosomos, susijusios su rūgštinėmis sąlygomis, buvo nudažytosLysoSensorMėlyna DND-167. Dažymo intensyvumas buvo išreikštas procentais (procentais), palyginti su nešikliu gydytos grupės.n =4; langelių skaičius=17-38.（e, f Reaktyvumo lygiaideguoniesrūšys dSH ląstelėse, apdorotose rotenonu (1 μM) ir GSK-KI (1 uM), buvo išmatuotos naudojant 2',7'-dichlorfluoresceino diacetatą (DCFDA). DCFDA intensyvumas gydymo grupėse buvo normalizuotas iki grupių, gydytų nešikliu. Apskaičiuotas DCFDA intensyvumas buvo išreikštas procentais (procentais ).n =4; langelių skaičius=25-44.

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

pailgėjusi trukmė (48 val.), kaip buvo pranešta anksčiau [15]. Rote-none nereguliavo LRRK2 lygių. Tačiau kartu su rotenonu ir GSK-KI nepadidino LRRK2 lygio reguliavimo (1 (a) ir 1 (b) pav. Gydymas GSK-KI sumažino rotenono sukeltą LRRK2 S1292 fosforilinimą (1 (a) pav.) -1(c)). Panašiai gydymas GSK-KI nežymiai sumažino rotenono sukeltą p53 lygio padidėjimą (1(a) ir 1(d) pav.).LRRK2

FicuRE 4: LRRK2 kinazės inhibitorius sušvelnina rotenono sukeltą sutrikusią autofagiją ir padidina a-sinukleino kaupimąsi diferencijuotoje neuroblastomos ląstelių linijoje, dSH ląstelėse, apdorotose rotenonu, GSK-KI ira-svnukleinasfibrilės (70 nM) buvo paveiktos Western blotting (a). Tikslinių baltymų tankiai buvo normalizuoti iki -aktino (bd ir f). LC3B II tankis buvo normalizuotas iki LC3BI (e). n=3.

FicuRE 5: LRRK2 kinazės slopinimas sušvelnina rotenono sukeltą ląstelių senėjimą ir skatina autofaginį -sinukleino klirensą žiurkės pirminiuose žievės neuronuose. Eksperimentai, atlikti naudojant dSH, apdorotą -sinukleino fibrile (70 nM), rotenonu (1 μM) ir GSK-KI (1 uM) 48 valandas, buvo kartojami su žiurkės pirminiais žievės neuronais.Imunoreaktyvussignalai Western blot (a) buvo vizualizuoti naudojant antikūnus prieš tikslinius baltymus. Visų baltymų, išskyrus LC3B II/I, tankiai buvo normalizuoti iki -aktino (bi). (ji) (a) lizatai buvo paveikti su senėjimu- galaktozidazėveiklos tyrimas.n= 3.

Cistanche gali pagerinti imunitetą

buvo pranešta, kad jis fosforilina p53 TXR vietoje [20]. Gydymas rotenonu sustiprino p53 lokalizaciją branduolyje, kuri buvo sumažinta kartu su GSK-KI (2(a)-2(e) pav.). Be to, GSK-KI sumažino rotenono sukeltą p21 reguliavimą (1 (a) ir 1 (e) paveikslai). Rotenonas sumažino Rb fosforilinimą, kuris dalyvauja paskutiniame senėjimo p53-p21 kelio etape. Gydymas GSK-KI sumažino rotenono sukeltą Rb fosforilinimą (1 (a) ir 1 (f) pav.). Kadangi p53-p21 kelias nėra vienintelis signalizacijos kelias, tarpininkaujantis senėjimui, buvo ištirti p21 ir pl6 mRNR lygiai. Gydymas GSK-KI sumažino rotenono sukeltą p21 reguliavimą. P16 mRNR lygiai reikšmingai nesiskyrė tarp rotenonu gydytų ir rotenonu/GSK-KI gydytų grupių (2 pav. (f ). Rotenonas padidino senėjimo žymens -gal aktyvumą, kuris sumažėjo, kai buvo gydomas GSK-KI (2 pav.). 1(a) ir 1(g) pav. Be to, pS1292 LRRK2 ir bendro LRRK2 PLA rezultatai dSH ląstelėse atskleidė, kad rotenonas padidino -gal kiekį ir LRRK2 kinazės aktyvumą (1(h) paveikslas){39 }}i) Šie rezultatai rodo, kad rotenonas skatina ląstelių senėjimą per p53, p21, Rb ir -gal kelius, padidindamas LRRK2 lygį ir jo kinazės aktyvumą, todėl LRRK2 slopinimas sumažino rotenono sukeltą ląstelių senėjimą dSH ląstelėse.

3.2. Ląstelių senėjimo sutrikimai – Syn degradacija dSH ląstelėse ir žiurkės pirminiuose žievės neuronuose, reguliuojant LRRK2 kinazės ekspresiją.

Ląstelių senėjimas pablogina autofagijos-lizosomų kelio aktyvumą [14, 21]. Taigi lizosomų aktyvumas (LysoSensor) buvo tiriamas kartu su senėjimo žymenimis, SA-gal aktyvumu ir ROS lygiais identiškomis eksperimentinėmis sąlygomis (1 pav.). Rotenonas padidino SA-gal aktyvumą (3 (a) ir 3 (b) paveikslai) ir sumažino lizosomų aktyvumą (3 (c) ir 3 (d) pav.), o tai buvo sumažinta kartu su GSK-KI. Be to, GSK-KI sumažino rotenono sukeltą ROS lygio reguliavimą, o tai parodė, kad rotenonas skatina senėjimą, sukeldamas oksidacinį stresą (3 (e) ir 3 (f) paveikslai). Anksčiau įrodėme, kad LRRK2-tarpininkaujantis p53 fosforilinimas, taip pat LRRK2 G2019S mutantas, skatino -syn kaupimąsi [10]. Ląstelių senėjimo poveikis -syn agregacijai, kuris sustiprina PD progresavimą, buvo ištirtas naudojant -syn fibriles. Rotenonas padidino p62 ir LC3BI/I lygius, kurie rodo autofagijos srauto sustabdymą, -syn agregatus (4(a), 4(d) ir 4(f) paveikslai ir LRRK2 kinazės aktyvumą (4(a) pav.). )-4(c))dSH ląstelėse. Gydymas GSK-KI sumažino rotenono sukeltą p62, LC3B I/l ir -syn agregatų reguliavimą, bet neturėjo įtakos LRRK2 lygiui. Be to, gydymas GSK-KI sušvelnino rotenono sukeltą SA padidėjimą

6 PAVEIKSLAS: Rotenonas skatina ląstelių senėjimą pelės vidurinėse smegenyse, reguliuodamas LRRK2 kinazės ekspresiją. a ) Pelės modelio eksperimento schema. b) Pavaizduoti kritimo iš rotarodinio strypo laiko matavimai. Kiekvienos eksperimentinės grupės pelės kritimo laikas (n =4) buvo užfiksuotas tris kartus. Vidurinių smegenų lizatams buvo atliktas su senėjimu susietas -galaktozidazės aktyvumo tyrimas (c), Western blot (de) ir su fermentais susietas imunosorbentas. gijinio oligomero -sinukleino (f), n =4 nustatymo tyrimas. * nurodo dvipusės dispersijos analizės (ANOVA), po kurios seka Tukey post hoc testą, rezultatus. # nurodo vienpusės ANOVA, o po to Tukey post hoc testo rezultatus."*p<0.01 and="" p=""><0.001. β-gal="" and="" downregulation="" of="" lysosomal="" enzyme(cathepsin="" d)activities="" (supplementary="" figure="" 1).="" to="" determine="" the="" mechanism="" underlying="" rotenone-mediated="" lrrk2="" kinase="" activation="" and="" cellular="" senescence,="" the="" experiments="" performed="" with="" dsh="" cells="" were="" repeated="" using="" rat="" primary="" cortical="" neurons.="" rotenone="" and="" gsk-ki="" exerted="" similar="" effects="" on="" lrrk2="" kinase="" activity(figures="" 5(a)-5(c)),="" p53-p21="" pathway="" activation="" (figures="" 5(a),="" 5(d),="" and="" 5(e)),β-gal="" levels="" (figures="" 5(a)="" and="" 5(f)),="" autophagy(figures="" 5(a),5(g),="" and="" 5(h)),="" α-syn="" aggregation(figures="" 5(a)="" and="" 5(i)),and="">

7 PAVEIKSLAS. LRRK2 kinazės inhibitoriaus vaidmuo skatinant ląstelių senėjimą Parkinsono ligos progresavimo metu. Scheminis šio tyrimo išvadų vaizdas. LRRK2 kinazės inhibitorius sušvelnina rotenono sukeltą ląstelių senėjimą, sutrikusią autofagijos-lizosominį kelią ir sustiprina -sinukleino agregaciją dopaminerginiuose neuronuose.

-gal aktyvumas (5 (j) pav.) žiurkės pirminiuose žievės neuronuose, kaip ir stebimas dSH ląstelėse. Taigi, rotenono sukeltas ląstelių senėjimas skatina LRRK2 kinazės reguliavimą ir pablogina autofagijos-lizosomų veiklą, o tai padidina -syn agregaciją.

3.3.LRRK2 kinazės slopinimas palengvina rotenono sukeltą ląstelių senėjimą pelės vidurinėse smegenyse.

Norint patikrinti in vitro radinius, buvo atliktas in vivo tyrimas. Pelėms kartą per du buvo švirkščiama rotenono (0,75 mg/kg kūno svorio) ir MLi-2(1 mg/kg kūno svorio), kraujo ir smegenų barjerui pralaidžio LRRK2 kinazės inhibitoriaus. dienų dvi savaites (6 paveikslas (a)). Eksperimentuose, atliktuose naudojant dideles rotenono koncentracijas, apoptozė buvo vyraujantis su ląstelių senėjimu susijęs fenotipas. Taigi, dSH ląstelės ir žiurkės pirminiai neuronai buvo ilgą laiką gydomi mažomis rotenono koncentracijomis. Rotenonas nežymiai sumažino pelių judėjimo aktyvumą, kaip rodo sutrumpėjęs kritimo nuo sukamojo strypo laikas (6 (b) pav.). Tačiau rotenonas padidino SA-gal aktyvumo reguliavimą vidurinėse smegenyse, o tai žymiai sumažėjo, kai buvo gydoma MLi-2 (6 paveikslas (c)). Be to, gydymas MLi-2 nežymiai sumažino rotenono sukeltą LRRK2 kinazės ir p53-p21 kelio aktyvavimą vidurinėse smegenyse (6(d) ir 6(e) pav.). Be to, rotenonas žymiai padidino -gal koncentraciją, kuri buvo sumažinta kartu su MLi-2. ELISA buvo atlikta siekiant išmatuoti fibrilinių sintetinių oligomerų kiekį vidurinėje smegenų lizate[17]. Gydymas MLi-2 sumažino rotenono sukeltą fibrilinių sintetinių oligomerų reguliavimą (5 pav. f). Taigi, intraperitoninis mažų dozių rotenono vartojimas paskatino ląstelių senėjimą pelės vidurinėse smegenyse, dėl ko tarpinėse smegenyse susidarė -sin agregacija. Gydymas LRRK2 kinazės inhibitoriumi sumažino rotenono sukeltą ląstelių senėjimą vidurinėse smegenyse.

4. Diskusija

Dopaminerginių neuronų ląstelių senėjimo mechanizmas nebuvo išaiškintas. Senėjimas yra PD rizikos veiksnys. Taigi reikia atsižvelgti į ryšį tarp senėjimo ir ląstelių senėjimo. Naujausi tyrimai parodė, kad su PD susijęs ląstelių senėjimas yra susijęs su ląstelių funkcijų praradimu [14, 22, 23), pvz., LRRK2 funkcijos praradimu neuronuose, atsirandančiais dėl autofagijos-lizosomų kelio reguliavimo panaikinimo [24, 25]. . Anksčiau mes įrodėme, kad G2019s LRRK2 mutantas sutrikdė autofagiją pelės dopaminerginėje ląstelių linijoje, fosforilindamas leucino-tRNR sintetazę [26]. Sutrikęs autofagijos-lizosomų kelias skatina -syn agregaciją [1l,27]. Taigi LRRK2 aktyvumas gali tarpininkauti -syn agregacijai. -syn agregacijos slopinimas arba prevencija naudojant anti- -syn antikūnus yra galima terapinė PD strategija [28-30]. Tačiau anti- -sin antikūnas nepadarė ryškaus gydomojo poveikio žmonių PD. Tai gali būti dėl nepilno -syn agregatų, įskaitant fibriles, protofibriles ir toksiškus oligomerus, klirenso. Konformacijai specifiniai antikūnai, skirti -syn oligomerams, gali nepašalinti visų toksiškų ar į LB linkusių oligomerų pacientų, sergančių PD, smegenyse. LRRK2 kinazės slopinimas gali suaktyvinti autofagijos-lizosomų kelią ir skatinti a-syn klirensą. Taigi, kartu vartojant LRRK2 kinazės inhibitorių ir anti- -syn antikūną, PD veikia sinergiškai.

P53-p21 kelias dalyvauja keliuose ląstelių procesuose, įskaitant apoptozę ir senėjimą [31]. Rb fosforilinimas yra ląstelių senėjimo signalizacijos kelio blokavimo žingsnis [32]. Be to, p16 ekspresijos aktyvinimas tarpininkauja ląstelių senėjimui [33]. P16 ir p21 ekspresijos lygiai yra sureguliuoti pelių, kurioms buvo sušvirkšta cisplatina, nugaros šaknies gangliono neuronuose [34]. Be to, pomirtinė pacientų, sergančių amiotrofine šonine skleroze / motorinių neuronų liga, analizė parodė, kad p16 ir p21 ekspresija buvo sureguliuota priekinės žievės astrocituose. Tačiau neuronai padidino p21 reguliavimą su neaptinkamais p1635 lygiais]. Šio tyrimo išvados parodė, kad ląstelių senėjimą daugiausia lėmė p53-p21 kelias, o ne sureguliuotas pl6 (1, 2 ir 4 paveikslai). Uždegiminės reakcijos taip pat yra susijusios su senėjimu. Astrocitai dalyvauja smegenų neurouždegime [36]. Astrocitų senėjimas prisideda prie pažinimo anomalijų progresavimo [37]. Taigi, neurouždegimas gali būti susijęs su astrocitų senėjimu. Būsimi tyrimai turi ištirti ryšį tarp neurouždegimo ir ląstelių senėjimo bei jo skirtingų signalizacijos kelių.

Šiame tyrime rotenonas padidino LRRK2 kinazės aktyvumą. Tačiau šis tyrimas neparodė LRRK2 kinazės inhibitoriaus poveikio G2019S mutantui. Ląstelių senėjimas buvo ištirtas po G2019SLRRK2 mutanto transfekcijos dSH ląstelėse ir žiurkės pirminiuose neuronuose. Ilgalaikė G2019S LRRK2 ekspresija dSH ląstelėse ir žiurkės pirminiuose neuronuose žymiai padidino -gal lygį ir SA -gal aktyvumą. G2019S LRRK2-transfekuotų ląstelių gydymas LRRK2 kinazės inhibitoriumi arba D1994A LRRK2 ekspresija nereguliavo -gal lygių ir SA -gal aktyvumo (papildomas 2 paveikslas). Anksčiau pranešėme, kad -gal ir -syn agregatų kiekis 24-savaičių senumo G2019S ekspresuojančių pelių smegenų lizatuose buvo didesnis nei atitinkamo amžiaus vados [10]. Gydymas LRRK2 inhibitoriumi reikšmingai nesumažino mažų rotenono dozių sukelto pelių ląstelių senėjimo. Tačiau farmakologinė pažanga gali sustiprinti terapinį LRRK2 kinazės inhibitorių poveikį pelėms (6 pav.). Būsimuose tyrimuose pagrindinis dėmesys turėtų būti skiriamas LRRK2 kinazės inhibitorių farmakologinio poveikio ir saugumo profilio gerinimui. LRRK2 kinazės inhibitoriaus skyrimas gali būti tinkama terapinė PD su dideliu LRRK2 kinazės aktyvumu strategija, nes gali sušvelninti oksidacinį stresą arba toksinį LRRK2 mutantų poveikį (7 pav.). LRRK2 kinazės aktyvumas žmogaus bioskysčiuose, pvz. serumas, cerebrospinalinis skystis ir šlapimas gali būti prognostinis biomarkeris, leidžiantis nustatyti optimalų gydymą pacientams, sergantiems PD, kuriems būdingas padidėjęs LRRK2 kinazės aktyvumas.

5. Išvados

Šio tyrimo išvados rodo, kad gydymas LRRK2 kinazės inhibitoriais sumažina ląstelių senėjimą, kurį sukelia švelnus ir ilgalaikis rotenono dozavimas. Šis tyrimas parodė kritinį LRRK2 vaidmenį p53-p21 kelyje, kuris tarpininkauja ląstelių senėjimui, ir suteikė naujų įžvalgų kuriant PD terapiją naudojant LRRK2 kinazės inhibitorius.

Šis straipsnis ištrauktas iš Hindawi Oksidacinė medicina ir ląstelių ilgaamžiškumas 2021 m., Straipsnio ID 9969842, 16 puslapių https://doi.org/10.1155/2021/9969842