In vitro ir in Silico įžvalgos apie tirozinazės inhibitorius
Mar 28, 2022
Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com
Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑, Hyung Ryong Moon a
Abstraktus
Tirozinazė yra pagrindinis fermentas, atsakingas už melanino biosintezę ir veiksmingai apsaugo nuo ultravioletinės spinduliuotės sukeltų odos pažeidimų. Vykdydami nuolatines pastangas atrasti stiprius tirozinazės inhibitorius, mes sistemingai sukūrėme ir susintetinome trylika (E)-benzilideno -1- indanono darinių (BID1–13) ir nustatėme jų slopinamąjį aktyvumą prieš tirozinazę. Tarp įvertintų junginių BID3 buvo stipriausias grybų tirozinazės inhibitorius (IC50=0,034 mM, mikofenolato aktyvumas; IC50=1,39 mM, difenolių aktyvumas). Kinetiniai tyrimai atskleidė, kad BID3 parodė mišrų tirozinazės slopinimo tipą, kurio Ki vertė buvo 2, 4 mM, naudojant L-DOPA kaip substratą. In silico molekulinio prijungimo modeliavimas parodė, kad BID3 gali prisijungti prie katalizinių ir allosterinių tirozinazės vietų, kad slopintų fermentų aktyvumą, o tai patvirtino in vitro eksperimentinius BID3 ir tirozinazės tyrimus. Be to, po gydymo BID3 sumažėjo melanino kiekis ir buvo slopinamas ląstelių tirozinazės aktyvumas. Šie stebėjimai atskleidė, kad BID3 yra stiprus tirozinazės inhibitorius ir gali būti naudojamas kaip balinimo priemonė su pigmentacija susijusiems sutrikimams gydyti.
1. Įvadas
Melaniną sintetina epidermio vasaliniame sluoksnyje esantys melanocitai. Paprastai tai yra pigmentų šeima, paprastai žinoma kaip apsauganti žinduolių odą nuo žalingos UV spinduliuotės sukeltos žalos, pašalinant laisvuosius radikalus arba išsklaidant gaunamą UV šviesą [1]. Tačiau gausus melanino susidarymas gali sukelti matomą epidermio hiperpigmentaciją, kuri gali būti akivaizdi kaip melasma, strazdanos, senatvinės dėmės ar senatvinės lentiginės [2].
Tirozinazė (EC 1.14.18.1), vario turintis metalofermentas, yra pagrindinis fermentas, dalyvaujantis melanogeniniuose procesuose. Tirozinazė katalizuoja du greitį ribojančius melanogenezės etapus; tirozino hidroksilinimas (krezolazės arba mikofenolato aktyvumas), kad susidarytų 3,4-dihidroksifenilalaninas (L-DOPA) ir vėlesnis L-DOPA oksidavimas (katecholazės arba difenolių aktyvumas) į atitinkamą DOPA-chinoną. Kai substratas yra L-tirozinas, tirozinazės katalizuojamos reakcijos produktas yra DOPA-chinonas, kuris vėliau paverčiamas melaninu [3]. Šie veiksmai yra labai svarbūs norint apsaugoti odą nuo UV spindulių pažeidimų. Grybų agaricus yra naudojamas dėl savo komerciškai prieinamo ir didelio homologiškumo su žinduolių tirozinazės fermentu, todėl jis puikiai tinka melanogenezės tyrimams [4]. Žmonėms melaninas padeda apsaugoti odą nuo UV spindulių daromos žalos [5]. Tačiau per didelis melanino kiekis gali sukelti įvairius dermatologinius sutrikimus, įskaitant hiperpigmentaciją, melazmą, strazdanas ir amžiaus dėmes [6]. Todėl norint slopinti pernelyg didelę odos pigmentaciją, reikia naudoti niutirozinazės inhibitorius, pasižyminčius panašiomis į vaistus ir odą balinančiomis savybėmis.
1-Indanonas, turintis benzoil-ciklopentanono skeletą, yra laikomas kietu chalkonų pusbroliu, apimančiu chalkonų nesočiųjų ketonų sistemą, sudarantį ciklinį 5 narių žiedą, kuris yra natūraliai randamas komponentas, esantis įvairiuose valgomuosiuose augalų šaltiniuose [7 ]. Keletas tyrimų parodė, kad junginiai, turintys 1-indanono fragmentą, turi farmakologinę reikšmę, nes pasižymi įvairiu naudingu biologiniu aktyvumu, įskaitant priešuždegiminį [8–10], priešvėžinį [11,12], antioksidantą [13], anti-Parkinsono ligą. liga [14], anti-Alzheimerio liga[15–17], antimikrobinės [18], antiimuninę sistemą slopinančios [19] ir antitirozinazės [20] savybės.
Chalkonai (1,3-diaril-2-tikrieji-1-) yra aromatiniai ketonai, sudaryti iš dviejų aromatinių žiedų, sujungtų su trijų anglies a,b-nesočiųjų karbonilo sistema kaip centrine šerdimi [21, 22]. Šie natūraliai randami komponentai, randami įvairiuose valgomuosiuose natūraliuose augaluose ir laikomi pirmtakais flavonoidų ir izoflavonoidų, tokių kaip pirazolinai, pirimidinas, flavanolis, flavonai, flavanonai, izoflavonai, auronai, antocianidinas, dihidroflavanolis ir dihidrohalkonas, pirmtakai] [23–2]. A,b nesočiųjų karbonilo sistema yra svarbiausia biologinio aktyvumo tipui, nes šios sistemos pasiskirsto daugelyje natūralių produktų, tokių kaip chalkonai ir indanonas, kur molekulės yra santykinai plokštesnės, o arilo pakaitų elektroninio poveikio perdavimas yra nukreiptas. į karbonilo grupę [7]. Anksčiau daugelis tyrinėtojų pranešė, kad chalkonai buvo paryškinti kaip nauja tirozinazės inhibitorių klasė keliuose leidiniuose [26–29]. Neseniai Kim ir bendradarbiai [30,31] sukūrė ir susintetino chalkono darinių serijas ir įvertino jų in vitro anti- tirozinazė ir anti-melanogeninis aktyvumas prieš pelių melanocitus.
Remiantis mūsų anksčiau praneštais duomenimis, dariniai su (E)-b-fenil-a, b-nesočiuoju karbonilo karkasu parodė potencirozinazės slopinimą [32–34]. (E)-benziliden-1-indanonai gali būti patraukli anti-melanogeninė medžiaga, nes junginių cheminė struktūra turi (E)-b-fenil-a,b-nesočiųjų karbonilo karkasą. Pažymėtina, kad Radhakrishnan ir kt. (2015) [20]sukūrė ir susintetino eilę benzilideno-1-indanono darinių, turinčių (Z) konfigūraciją, ir įvertino jų antitirozinazės aktyvumą. Nors šie (Z)-benziliden-1-indanono dariniai buvo ištirti, (E)-benziliden-1-indanono darinių antitirozinazės ir anti-melanogeninis aktyvumas dar turi būti kruopščiai ištirtas.
Todėl sukūrėme ir susintetinome trylika 1-indanono skeleto junginių (BID1–13), turinčių (E) formos benzilideną. Tarp šių sintetinių junginių 2,{5}}dihidroksigrupė 1-indanono B žiede parodė didžiausią tirozinazės slopinimą (maždaug 400-kartą veiksmingiau nei kojo rūgštis, teigiama kontrolė). Be to, mes toliau vertiname BID3 tirozinazę slopinantį aktyvumą, taip pat apibūdiname jo reguliavimo vaidmenį melanino sintezėje naudojant B16F10 melanomos ląsteles. Išplėstinių eksperimentų metu įvertinome BID3 anti-melanogeninį potencialą ir siekėme nustatyti fermentų kinetiką ir molekulinius prijungimo tyrimus. Iš eilės eksperimentuose taip pat buvo tiriamas BID3 ląstelių tirozinazės potencialas ir melanino gamyba a-MSH ir IBMX sukeltose B16F10 melanomos ląstelėse.
ANTIOKSIDACIJA IR ODOS APSVEIKIMAS: CISTANCHE EKSTRAKTAS
2. Medžiagos ir metodai
2.1. Reagentai
Grybų tirozinazė (EC 1.14.18.1), alfa melanocitus stimuliuojantis hormonas (a-MSH), 3-izobutil-1-metilksantinas (IBMX), L-tirozinas, L-3,{{ 11}}dihidroksifenilalaninas (L-DOPA), dimetilsulfoksidas (DMSO), kojo rūgštis, ftalio rūgštis ir trans-cinamono rūgštis buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, JAV). Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM), vaisiaus galvijų serumas (FBS), streptomicinas ir amfotericinas buvo įsigyti iš WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, Pietų Korėja). Visi kiti reagentai buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich.
2.2. Chemija
2.2.1. Bendrieji metodai
Visi reagentai buvo gauti komerciškai ir naudojami be tolesnio valymo. Plonasluoksnė chromatografija (TLC) ir kolonėlė chromatografija buvo atliekamos atitinkamai Merck padengtomis 60F245 plokštelėmis ir MP Silica 40–63, 60 Å. Didelės skiriamosios gebos (HR) masės spektroskopijos duomenys buvo gauti naudojant Agilent AccurateMass keturių skrydžio laiko (Q-TOF) skysčių chromatografijos (LC) masės spektrometrą (Agilent, Santa Clara, CA, JAV) ESI teigiamu režimu. Branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektrai buvo įrašyti spektrometru Varian Unity INOVA 400 arba Varian UnityAS500 spektrometru (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV) atitinkamai 1H BMR (400 ir 500 MHz) ir 13C BMR (100 MHz). . DMSO d6, CD3OD ir CDCl3 buvo naudojami kaip BMR tirpikliai BMR mėginiams. Sujungimo konstanta (J) ir cheminio poslinkio reikšmės buvo išmatuotos atitinkamai hercais (Hz) ir milijoninėmis dalimis (ppm). 1H BMR duomenų analizėje naudojamos šios santrumpos: s (singletas), bs (platus singletas), d (dubletas), dd (dubletų dubletas), t (tripletas), TD (dubletų tripletas), q ( kvartetas), andm (daugelis).
2.2.2. BID1–13 sintezės procedūra
Benzaldehido (1,1–1,2 ekv.) ir 1-indanono (100 mg, 0,76 mmol) tirpalas 1 M HCl acto rūgštyje (0,4 ml) maišomas kambario temperatūroje. 4-48 val. Įpylus vandens, nuosėdos filtruojamos ir plaunamos vandeniu ir heksanu:etilacetatu (1:1), heksanu:dichlormetanu (4:1-1:1) arba dichlormetano ir metanolio mišiniu, priklausomai nuo likusių benzaldehidų savybių. duoti (E)-benziliden-1-indanonų (BID1–13) 32,8–99,1 proc. Sintetintų junginių struktūrinis apibūdinimas (1H ir 13C BMR ir visų BID masės duomenys) pateikiamas papildomoje informacijoje.
2.2.2.1. (E)-2-(4-Hidroksibenzilidenas)-2,3-dihidro-1H-inden-1-one (BID1).
Geltona kieta; derlius, 93,4 proc.; reakcijos laikas, 6 val.; molekulinė formulė, C16H12O2; lyd., 224,7–225,9 C; 1H BMR (400 MHz, DMSO d6) d 10,10 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,64–7,58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7,43 (s, 1H, vinilo H), 7,39 (t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 6,87 (d, 2H, J=8,0 Hz, 30-H, {{46) }}H), 3,99 (s, 2H, CH2); 13C BMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 160,1, 150,4, 138,3, 135,1, 134,0, 133,6, 132,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, (127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, (mz) H) plius apskaičiuota 237,0910, pastebėta 237,0911.
2.2.2.2. (E)-2-(3,4-Dihidroksibenzilidenas)-2,3-dihidro-1H-inden-1-onas (BID2).
Geltona kieta; pajamingumas, {{0}},6 proc. ; reakcijos laikas, 5 val.; molekulinė formulė, C16H12O3; lyd., 251,2–252,4 °C; 1H BMR (4{55}}{79}} MHz, DMSO d6) d 9,65 (s, 1H, OH), 9,24 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7 0,6 Hz, 7-H), 7,66–7,61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7,42 (t, 1H, J {{35) }},2 Hz, 6-H), 7,35 (s, 1H, vinilinis H), 7,19 (s, 1H, 20-H), 7.{89}}8 (d, 1H) , J=8,0 Hz, 60-H), 6,83 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 3,98 (s, 2H, CH2) ); 13C BMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,8, 150,4, 148,7, 146,3, 138,3, 135,1, 134,5, 132,0, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 127,0,1,7,1,8,1,2,1,2. HRMS (ESI plius) m/z C16H13O3 (M plius H) plius išskaičiuota 253,0859, pastebėta 253,0857.
2.2.2.3. (E)-2-(2,4-Dihidroksibenzilidenas)-2,3-dihidro-1H-inden-1-onas (BID3).
Geltona kieta; pajamingumas, 5{{20}},9 proc. ; reakcijos laikas, 10 val.; molekulinė formulė, C16H12O3; lyd., 198,5–199,9 °C (skilimas); 1H BMR (500 MHz, CD3OD) d 8,17 (s, 1H, vinilo H), 7,82 (d, 1H, J=8,0 Hz, 60-H), 7,67–7,63 (m, 3H) , 4-H, 5-H, 7-H), 7,45 (t, 1H, J=7,0 Hz, 6-H), 6,45 (d , 1H, J=8,5 Hz, 50-H), 6,39 (s, 1H, 30-H), 4,01 (s, 2H, CH2); 13C BMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 161,6, 160,4, 150,3, 138,6, 134,8, 131,7, 130,3, 128,7, 128,3, 128,7, 128,1, 128,7, 128,1, 128,7, 128,1, 128,7, 128,1, 128,7, 1,3,1,8,1,127,2. HRMS (ESI plius) m/z C16H13O3 (M plius H) plius išskaičiuota 253,0859, pastebėta 253,0858.
2.2.2.4. (E)-2-(4-Hidroksi-3-metoksibenzilidenas)-2, 3-dihidro-1Hinden-1-onas (BID4).
Geltona kieta; derlius, 52.0 proc ; reakcijos laikas, 4 val.;molekulinė formulė, C17H14O3; lyd., 186,9-187,4 C; 1H BMR (400 MHz, DMSO d6) d 9,71 (s, 1H, OH), 7,73 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,67–7,62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7,45 (d, 1H, J=2.{50}} Hz , 20-H), 7,43 (t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 7,31 (s, 1H, vinilinis H), 7,24 (dd, 1H, J=8,0,2,0 Hz, 60-H), 6,87 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 4,05 (s, 2H, CH2) ), 3,84 (s, 3H, OCH3); 13C BMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 150,5, 149,7, 148,5, 138,3, 135,2, 134,4, 132,3, 128,2, 132,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 1,5,1,5,1,1,1,2,1,5,1,1. HRMS (ESI plius) m/z C17H15O3 (M plius H) plius apskaičiuota 267,1016, pastebėta 267,1016.
2.3. Biologinis įvertinimas
2.3.1. Grybų tirozinazės slopinimo tyrimas
Tirozinazės slopinimo aktyvumo tyrimas buvo atliktas naudojant grybų tirozinazę, kaip aprašyta anksčiau, su nedideliais pakeitimais [35, 36]. Trumpai tariant, 10 ml nurodytos koncentracijos kiekvieno junginio (0,0005–50 mM) ir 20 ml grybų tirozinazės (1000 vienetų/ml) 50 mM fosfatiniame buferyje (pH 6,5) buvo pridėta prie 170 ml reakcijos. mišinys 96-šulinėlių mikroplokštelėje (Corning, JAV). 1 mM L-tirozino arba L-DOPA tirpalo, 50 mM kalio fosfato buferio (pH 6,5) ir distiliuoto vandens santykis buvo 10:10:9. Reakcijos mišiniai buvo inkubuojami 37 C temperatūroje 30 min. Po to kiekviename šulinyje pagaminto dopachromo kiekis buvo išmatuotas spektrofotometrine analize esant 492 nm (OD492), naudojant mikroplokštelių skaitytuvą. Tirozinazės slopinimo greitis (procentais) buvo apskaičiuotas kaip (1 Absample/Abscontrol) 100 procentų. Mėginio slopinimo laipsnis buvo išreikštas kaip koncentracija, reikalinga 50 procentų slopinimui (IC50).
2.3.2. Fermentų kinetinė analizė su tirozinaze
Kinetiniams slopinimo mechanizmams nustatyti buvo naudojami du vienas kitą papildantys kinetikos metodai: Lineweaver–Burk ir Dixonplots [37–39]. Naudojant Lineweaver-Burk diagramas (dvigubas reciprokalas), BID3 slopinimo tipas buvo nustatytas naudojant įvairias L-DOPA koncentracijas (0.125, 0.25, 0.5 ir 1). mM), kaip substratus, nesant ir esant įvairioms BID3 koncentracijoms (1, 2 ir 4 lM). Diksono diagrama (vienos abipusės diagramos) tirozinazės slopinimui buvo gauta esant įvairioms L-DOPA koncentracijoms (0.125, 0.25, 0.5 ir 1 mM). ). BID3 koncentracijos buvo 1, 2 ir 4 mM. Fermentines procedūras sudarė anksčiau aprašyti tirozinazės tyrimo metodai. Inhibavimo konstanta (Ki) buvo nustatyta interpretuojant Diksono diagramas.
2.3.3. Tirozinazės molekulinio prijungimo modeliavimas
Norėdami nustatyti fermento inhibitorių komplekso struktūrą ir užtikrinti prijungimo rezultatų tikslumą, pakartojamumą ir patikimumą, panaudojome AutoDock4.2 programinę įrangą. Grybų tirozinazės baltymo taikinio kristalinės struktūros buvo gautos pagal baltymų sekų išlyginimą (Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40]. Buvo atlikti automatiniai prijungimo modeliai. tarp tirozinazės ir kojinės rūgšties, ftalio rūgšties, cinamono rūgšties arba BID3. Prijungimo procedūrai: 2D pavertimas 3D struktūromis, apskaičiuoti krūviai ir pridėta vandenilio atomų naudojant ChemOffice programą (http://www.cam bridgesoft.com) [41 LigandScout 4.1.5 buvo naudojamas galimai ligandų ir tirozinazės sąveikai prognozuoti ir farmakoforams identifikuoti.
2.3.4. Ląstelių kultūra ir ląstelių gyvybingumo tyrimas
Pelės melanomos B16F10 ląstelės buvo įsigytos iš Korean Cell Line Bank (KCLB, Seulas, Korėja) ir kultivuojamos DMEM, papildytu 10 procentų FBS ir 1 procento streptomicino, o po to inkubuojamos 37 C temperatūroje, drėkinamos 5 procentais atmosferos CO2. Ląstelių gyvybingumo analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau [42]. Trumpai tariant, ląstelės 24 valandas pasėjamos 1 104 ląstelių/šulinėlių tankiu į 96-šulinėlių plokštelę. Kitą dieną ląstelės buvo veikiamos skirtingomis BID3 koncentracijomis ir atitinkamai inkubuojamos 24 arba 48 valandas. Tada į kiekvieną šulinėlį įpilama 10 ml EZ-Cytox tirpalo ir ląstelės buvo inkubuojamos 2–4 valandas. Absorbcija buvo nustatyta naudojant ELISA, kai bangos ilgis 450 nm. Kiekvienas tyrimas buvo atliktas trimis egzemplioriais.
2.3.5. Melanino kiekio tyrimas
Melanino kiekis buvo nustatytas, kaip aprašyta anksčiau [43]. B16F10 melanomos ląstelės (2 105 ląstelės šulinėlyje) buvo pasėtos į 6-šulinėlių auginimo plokšteles. Norint nustatyti BID3 slopinamąjį poveikį melanogenezei, šviežia terpė buvo pakeista terpe, kurioje yra BID3 (1, 5 ir 10 lM) arba kojinės rūgšties (10 mM) kaip teigiama kontrolė 1 val., o po to stimuliuojama a-MSH (5 lM). ) ir IBMX (200 mM) 48 val. Du kartus plaunamos PBS, ląstelės buvo atskirtos inkubuojant tripsine / EDTA, o granulės ištirpintos 100 ml 1 N NaOH, o po to inkubuojamos 60 ° C temperatūroje 1 ranką, kad ištirptų melaninas. Melanino kiekis buvo nustatytas matuojant absorbciją esant 405 nm, naudojant ELISA skaitytuvą (TECAN, Sunrise, Austrija). Melanino kiekis buvo apskaičiuotas naudojant šią lygtį: (mėginys/kontrolė) - 100 proc. Visi nustatymai buvo atlikti trimis egzemplioriais.
2.3.6. Ląstelių tirozinazės aktyvumas
Ląstelių tirozinazės aktyvumas buvo įvertintas, kaip aprašyta anksčiau, su nedideliais pakeitimais [44, 45]. Trumpai tariant, 2 105/ląstelės buvo dedamos į 6-šulinėlių indus ir inkubuojamos per naktį. Ląstelės 1 valandą buvo veikiamos įvairių koncentracijų BID3 (1, 5 ir 10 mM) orkojinės rūgšties (10 mM), o vėliau 48 valandas stimuliuojamos a-MSH (5 mM) ir IBMX (200 mM). Du kartus perplovus PBS, ląstelės buvo lizuojamos 100 ml lizės tirpalo, kuriame yra 50 mM fosfato buferio (pH 6,5), 0,1 mM fenilmetilsulfonilfluorido (PMSF) ir 1 procento Triton X -100, ir užšaldomos 80 C temperatūroje 30 min. Lizatai buvo atšildyti ir centrifuguojami 12, 000 aps./min. greičiu 30 min 4 C temperatūroje. Tada supernatantas (80 ml) buvo sumaišytas su 2 mg/ml L-DOPA (20 ml) 96-šulinėlių plokštelėje. . Po 30 minučių inkubacijos 37 C temperatūroje optinis tankis ties 492 nm buvo matuojamas naudojant ELISA skaitytuvą (TECAN, Zalcburgas, Austrija). Baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant BCA baltymų tyrimo reagentą, naudojant BCA kaip standartą (Thermo Scientific, Rockford, IL, JAV).
Cistanche ekstrakto nauda: slopina tirozinazę.
2.3.7. Statistinė analizė
Visi duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida (SEM). Duomenys buvo analizuojami naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), siekiant nustatyti gydymo skirtumus, o po to buvo atliktas Bonferroni posthoc testas. Reikšmė p < 0,05="" buvo="" laikoma="" statistiškai="">
3. Rezultatai ir diskusija
3.1. Chemija
(E)-benzilideno-1-indanonų dariniai (BID1–13) buvo susintetinti pagal 1 bendrąją schemą. Šiame tyrime buvo susintetinti trylika (E)-2-benzilideno-1-indanono darinių ir jų tirtos tirozinazę slopinančios savybės. Taikinio (E)-2-benzilideno-1-indanono dariniai buvo susintetinti rūgštinėmis (1 M HCl acto rūgštyje) sąlygomis. Šios reakcijos susidarė tikslinis (E)-2-benzilidenas-1- indanono dariniai 32,8–99,1 proc. Atrodo, kad tik 2-benzilideno-1-indanonų E-izomerai buvo sukurti dėl A padermės, žinomos kaip 1,3-alilo kamienas. A-padermė (stericidrikcija) tarp fenilo žiedo ir karbonilo grupės Z-izomere yra akivaizdžiai didesnė nei tarp fenilo žiedo ir metileno grupės E-izomere. Sintetinių junginių struktūros buvo patikrintos 1H ir 13C BMR bei masės spektrometrija, kaip aprašyta eksperimentinėje dalyje (S1–S38 pav.). Visų pirma, olefininio protono cheminis poslinkis yra ekranuotas 2- E-izomere. benzilidenas dėl karbonilo grupės anizotropinio poveikio ir atrodo žemiau (daugiau kaip 7 ppm), palyginti su Z izomeru (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">
Schema 1. (E)-2-benzilideno-1-indanonų sintezė.
3.2. Tirozinazę slopinančios junginių savybės
(E)-benziliden-1-indanonų darinių tirozinazės slopinimo potencialas buvo ištirtas naudojant grybų tirozinazę. Šiems eksperimentams kaip substratai buvo naudojami mikofenolatas (L-tirozinas) ir difenoliai (L-DOPA) [35]. Fermentų reakcijos buvo atliktos su tirozinaze, substratu ir tiriamaisiais inhibitoriais. Visi išbandyti junginiai parodė nuo koncentracijos priklausomą slopinimą. (E)-benzilideno-1-indanono darinių IC50 reikšmės pateiktos 1 lentelėje.
Tiek L-tirozino, tiek L-DOPA substratuose BID3 pasižymėjo stipriu slopinamuoju aktyvumu, o IC50 vertės buvo 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM ir 1,39 ± 0.00004 mM, atitinkamai, palyginti su teigiama kontroline kojo rūgštimi, kurios IC50 vertės buvo atitinkamai 13,77 ± 0,20 mM ir 33,14 ± 0,93 mM (1A pav.). Be to, BID6 parodė stiprų aktyvumą L-tirozino ir L-DOPA atžvilgiu, kai IC50 vertės buvo atitinkamai 5,00 ± 0,91 mM ir 53,11 ± 2,79 mM. BID1 parodė reikšmingą tirozinazės slopinimą per L-tirozino ir L-DOPA kelius, kai IC50 vertės buvo atitinkamai 39,74 ± 3,71 mM ir 130,0 ± 5,39 mM. BID4 ir BID11 parodė vidutinį tirozinazę slopinantį aktyvumą. Kiti dariniai buvo neaktyvūs. Panašiai BID2 parodė reikšmingą aktyvumą L-tirozino ir L-DOPA atžvilgiu, o IC50 vertės buvo 41,27 ± 3,03 mM ir 52,93 ± 2,62 mM. Be to, pranešta apie mišraus tipo inhibitorius, ftalio rūgštį ir cinamono rūgštį. poveikis esant 200 mm koncentracijai [47].
Remiantis struktūros ir aktyvumo ryšio (SAR) tyrimų išvadomis, dariniai, turintys (E)-benzilideno-1- indanono pakaitų fenilo žiede, pastebimai paveikė potencialų tirozinazės slopinimą. BID3, kuris stipriausiai slopino tirozinazę, turi 2-hidroksi grupę, kai yra 4-hidroksi grupė, ir labai slopina tirozinazės aktyvumą (BID1 vs BID3). Šie rezultatai rodo, kad 2,4-dihidroksi grupė (rezorcinolio dalis) fenilo žiedo struktūroje gali būti atsakinga už sustiprintą tirozinazės slopinimą. Įdomu tai, kad ankstesniame galimų sintetinių tirozinazės inhibitorių tyrime parodėme, kad 2,4-dihidroksi pakaitalas stipriai slopina tirozinazės aktyvumą [48, 49]. Be to, mūsų SAR duomenys taip pat parodė, kad 3-hidroksi grupės įvedimas, kai yra 4-hidroksi grupė, turi įtakos tirozinazės slopinimui. Šiuos reiškinius įrodė išvada, kad 4-metoksi-3-hidroksifenilas padidino slopinamąjį aktyvumą prieš tirozinazę, o 3,4-dihidroksi grupės (katecholio fragmento) įvedimas sumažino tirozinazės slopinamąjį aktyvumą. BID2 ir BID6) [35]. Šie rezultatai rodo, kad 3-hidroksi-4-metoksi grupė taip pat yra atsakinga už tirozinazės slopinamąjį aktyvumą. Nepaisant to, mūsų dabartiniame tyrime BID9 ir BID11, kuriuose yra 2,4-dimetoksifenilo arba 3,5-dimetoksifenilo grupės, parodė vidutinį tirozinazę slopinantį aktyvumą. Remiantis IC50 vertėmis per L-tirozino ir L-DOPA kelią, BID3 parodė stipriausią tirozinazės slopinimo aktyvumą, todėl toliau tyrėme šio slopinamojo poveikio mechanizmą. Radhakrishnan ir kt. (2015) [20] pranešė, kad hidroksilu pakeisti (Z)-benziliden-1-indanono junginiai yra stiprūs tirozinazės inhibitoriai. Nors ankstesni tyrimai parodė, kad hidroksilu pakeistas (Z)-benzilideno-1-indanono darinys pasižymi antitirozinazės aktyvumu, mūsų žiniomis, nebuvo gauta pranešimų apie (E)-benzilideno sukeliamą tirozinazės slopinimą-1- indanono dariniai naudojant ląstelių eksperimentus.
1 lentelė. Pakeisto 2,3-dihidro-1H-inden-1-one (1-indanono) chalkono tipo grybų tirozinazės slopinimo potencialas
dariniai (BID1–13).
1 pav. Nuo koncentracijos priklausomas grybų tirozinazės aktyvumo slopinimas BID3 ir kojo rūgštimi (teigiama kontrolė) (n=3).
3.3. Tirozinazės slopinimo fermentų kinetinė analizė
Kadangi BID3 buvo stipriausias inhibitorius, toliau tyrėme mechanizmą, kuriuo grindžiamas jo slopinamasis poveikis. Bandant paaiškinti fermentų slopinimo būdą, buvo atliekamos kinetinės analizės esant įvairioms L-DOPA ir įvairioms BID3 koncentracijoms. Dixon ir Lineweaver-Burk diagramos buvo sudarytos naudojant duomenis, gautus iš kinetinių tyrimų, siekiant patvirtinti slopinimo modelį, o slopinimo konstantos (Ki) buvo nustatytos interpretuojant Dixon diagramas (2A ir B pav.). L-DOPA koncentracija žymima taip: 1, 2, 4 mM. Sankirta yra kairėje pusėje, o tai rodo mišraus tipo tirozinazės slopinimą, kurio Ki vertė yra 2,4 mM (2B pav.). Ki reikšmė rodo koncentracijas, reikalingas fermentų inhibitorių kompleksui susidaryti, todėl inhibitorius, turintis mažesnę Ki reikšmę, rodo didesnį tirozinazės slopinimo aktyvumą.
Molekulinis prijungimas daugelį metų suteikė svarbių įžvalgų apie narkotikų atradimą. Tačiau prijungimo procedūromis siekiama nustatyti teisingas ligandų padėtis aproteino surišimo kišenėje ir numatyti ligando ir baltymo afinitetą. Kitaip tariant, prijungimas apibūdina procesą, kurio metu dvi molekulės susilieja trimatėje erdvėje. Norint nustatyti, ar BID3 jungiasi su aktyviąja tirozinazės vieta, buvo atlikta molekulinė prijungimo analizė, siekiant nustatyti galimas BID3 surišimo vietas grybų tirozinazės kristalinėje struktūroje (PDB ID: 2Y9X) (3A pav.). Šie rezultatai buvo apskaičiuoti naudojant AutoDock4.2. programa. Stabiliausia surišimo padėtis buvo ta, kurios balas buvo žemiausias [50]. Neseniai Hassani ir kt. [47] pranešė, kad cinamono rūgštis ir ftalio rūgštis buvo mišraus režimo tirozinazės inhibitoriai. Taigi, pagalbinė medžiaga, cinamono rūgštis ir ftalio rūgštis buvo panaudotos prijungimo rezultatams patvirtinti [51]. BID3 ir kojinės rūgšties (gerai žinomo konkurencinio tipo inhibitoriaus) molekuliniai prijungimo modeliai tirozinazės katalizinėje vietoje pavaizduoti 3B pav. [52] ]. Tirozinazės-BID3 inhibitorių kompleksas suteikė 6,28 kcal/mol jungimosi energiją, įskaitant du vandenilio ryšius su tirozinazės ASN260 ir MET280 liekanomis, ir buvo pastebėta hidrofobinė sąveika tarp BID3 ir tirozinazės likučių VAL248, PHE264, o tai dar labiau stabilizavo VAL28 vietą. grybtirozinazės (2 lentelė ir 3E bei H pav.). Be to, BID3, ftalio rūgšties (allosterinis inhibitorius 1) ir cinamono rūgšties (allosterinis inhibitorius 2) molekuliniai prijungimo modeliai dviejose allosterinėse vietose yra iliustruoti 3C ir 3D pav. Ftalio rūgštis ir cinamono rūgštis buvo laikomos etaloniniais ligandais atitinkamai 1 ir 2 allosterinėse vietose [47, 51]. Kaip parodyta 3F ir I pav., BID3 ir ftalio rūgštis parodė vandenilinį ryšį su tirozinazės TRY140 liekana ir tris hidrofobinės sąveikos liekanas su tirozinazės LEU24, PHE147 ir ILE148 atitinkamoje alosterinės ligoninės rūgšties B3 ir cinamino rūgšties ID3 ir 1 sąveikoje. tirozinazės allosterinėje vietoje2 buvo vandenilio jungtys tarp tirozinazės ASP312 ir LYS376, o THR308 sąveikavo hidrofobiškai su 2 alosterine vieta (3G ir J pav.). Be to, nustatyta, kad BID{51}}tirozinazės surišimas sukelia jungimosi energiją abiejose alosterinėse tirozinazės vietose (atitinkamai 4,38 ir 5,68 kcal/mol), o tai rodo didelį jungimosi afinitetą su abiem alosterinėmis vietomis. Remiantis fermentų kinetiniais tyrimais, BID3 veikė mišraus tipo slopinimą, o BID3 jungiamumas ir su katalizine vieta, ir su dviem allosterinėmis vietomis patvirtino mišraus tipo tirozinazės slopinimą.
2 pav. Lineweaver-Burk (A) ir Dixon diagramos (B), skirtos grybų tirozinazės slopinimui BID3 naudojant L-DOPA kaip substratą.
3.4. Biologinis aktyvumas
Norėdami išnaudoti BID3 antitirozinazės poveikį ląstelių kultūros modelyje, ištyrėme jo citotoksinį poveikį B16F10 ląstelėms. Ląstelės buvo apdorotos skirtingomis BID3 koncentracijomis (1–20 mM) 48 valandas ir įvertintos naudojant EZ-Cytox testą. Rezultatai parodė, kad BID3 neturėjo reikšmingo citotoksinio poveikio B16F10 melanomos ląstelėse iki 20 mM (4A ir B pav.). Todėl vėlesni eksperimentai buvo atlikti naudojant BID3 iki 20 mM.
2 lentelė BID3 surišimo vietos ir prijungimo balai grybų tirozinazėje (PDB ID: 2Y9X), nustatyti naudojant AutoDock4.2 programą.
Melanogenezę reguliuoja tirozinazės fermentų kaskada. Dėl šios priežasties buvo sukurti keli odą balinantys junginiai, mažinantys tirozinazės aktyvumą. Kojic rūgštis, tirozinazės inhibitorius, buvo naudojama kaip teigiama kontrolė [53]. Taigi, norint ištirti BID3 poveikį cAMP padidėjimo sukeltai hiperpigmentacijai, B16F10 ląstelės buvo apdorotos a-MSH ir IBMX esant BID3 (1, 5 ir 2{{20}} mM) 48 val., buvo nustatytas melanino kiekis ir ląstelių tirozinazės aktyvumas (4C ir D pav.). Gydymas a-MSH ir IBMX žymiai padidino (P < 0,001#)="" melanino="" kiekį="" (4c="" pav.)="" ir="" ląstelių="" tirozinazės="" aktyvumą="" (4d="" pav.)="" b16f10="" ląstelėse,="" palyginti="" su="" neapdorota="" kontrole.="" tačiau="" gydymas="" bid3="" reikšmingai="" (p)="">< 0,01**;="" p="">< 0,001***)="" ir="" nuo="" koncentracijos="" priklausomas="" sumažėjęs="" melanino="" kiekis="" ir="" ląstelių="" tirozinazės="" aktyvumas="" b16f10="" ląstelėse,="" palyginti="" su="" a-msh="" arbaibmx="" apdorotomis="" ląstelėmis,="" o="" tai="" rodo,="" kad="" ląstelių="" melanino="" sumažėjimas="" gali="" būti="" dėl="" tirozinazės="" aktyvumo="" slopinimo="" .="" taigi="" šie="" radiniai="" aiškiai="" rodo,="" kad="" bid3="" darė="" anti-melanogeninį="" poveikį,="" slopindamas="" tirozinazės="" aktyvumą="" ir="" melanino="" sintezę="" b16f10="" ląstelėse,="" nesukeldamas="">
Indanonas yra viena iš privilegijuotų medicininės chemijos struktūrų ir paprastai siejama su įvairiais farmakologiškai aktyviais junginiais [54]. Indanono dalis yra įvairiuose fiziologiškai aktyviuose natūraliuose produktuose. Atsižvelgiant į tai, Okpekonet al. [55] pranešė apie naują 1-indanono junginį, išskirtą iš Uvarijos šaknų. Šis junginys yra pirmasis 1-indanono darinys, išskirtas iš augalų. Nagle ir kt. [56] pranešė, kad iš marinecyanobacterium buvo išskirtas naujas metilintas indano aldehidas kaip naviko angiogenezės reguliatorius. Be to, nuo biologinės indanono šerdies svarbos, pastaruosius kelerius metus mokslininkai daugiausia dėmesio skyrė farmakologiškai aktyvių indanono analogų, kaip terapinių agentų, kūrimui. Struktūrinė 1-indanonų įvairovė reiškia įvairius biologinius atsakus ir šie junginiai gali būti naudojami žemės ūkyje ir medicinoje. Įvairūs indanono junginiai buvo sukurti kaip anti-Alzheimerio liga [16,57–59], priešvėžiniai vaistai [60– 62], antimikrobiniais [63, 64] ir antivirusiniais vaistais [65, 66]. Dėl plataus pritaikymo potencialo 1-indanonai buvo įdomūs tolesnių tyrimų objektai, todėl pageidautina sukurti naujas jų sintezės klases.
cistanche tubolosa: kovoja su senėjimu
4. Išvada
Norėdami nustatyti naujus stiprius tirozinazės inhibitorius, sukūrėme ir susintetinome trylika (E)-benzilideno-1-indanono darinių. Tarp šių junginių yra (E)-2-(2,4-dihidroksibenzilidenas){ {6}},3-dihidro-1H-viename (BID3) stipriai slopino tirozinazės aktyvumą (IC50=0.034 ir 1,39 mM, L-tirozinui ir L-DOPA), kuris buvo geresnis už etaloninį junginį, kojo rūgštį (atitinkamai IC50=13,77 mM ir 33,14 mM). Struktūros ir aktyvumo ryšys atskleidė, kad dihidroksilo grupė 2 ir 4-(E)-benziliden-1-indanono skeleto padėtyje pagerino aktyvumą prieš tirozinazę. Fermento fermentinio slopinimo būdas, nustatytas Lineweaver-Burk ir Dixon diagramomis, parodė, kad BID3 yra mišraus tipo inhibitorius. Molekulinio prijungimo tyrimai rodo, kad jungimasis aktyvioje ir allosterinėse vietose yra svarbūs mechanizmai, skatinantys tirozinazę slopinantį aktyvumą. Remiantis šiais rezultatais, atrodė, kad BID3 yra stiprus tirozinazės inhibitorius gydant odos sutrikimus, tokius kaip hiperpigmentacija.
dykumos cistanche privalumai: slopina melanino susidarymą